Summary
Este método de purificación bioquímica con análisis proteómico basado en espectrometría de masas facilita la caracterización robusta de los núcleos de fibrilla amiloide, lo que puede acelerar la identificación de objetivos para prevenir la enfermedad de Alzheimer.
Abstract
Las inclusiones fibrilares proteínicas son características patológicas clave de múltiples enfermedades neurodegenerativas. En las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer (EA), los péptidos beta amiloides forman protofibrillas en el espacio extracelular, que actúan como semillas que crecen gradualmente y maduran en grandes placas amiloides. A pesar de esta comprensión básica, el conocimiento actual de la estructura de la fibrilla amiloide, la composición y los patrones de deposición en el cerebro es limitado. Una barrera importante ha sido la incapacidad de aislar fibrillas amiloides altamente purificadas de los extractos cerebrales. La purificación por afinidad y los enfoques basados en microdisección de captura láser se han utilizado anteriormente para aislar amiloides, pero están limitados por la pequeña cantidad de material que se puede recuperar. Este protocolo novedoso y robusto describe la purificación bioquímica de los núcleos de placa amiloide utilizando solubilización de dodecil sulfato de sodio (SDS) con ultracentrifugación y ultrasonido de gradiente de densidad de sacarosa y produce fibrillas altamente puras de pacientes con EA y tejidos cerebrales modelo de EA. El análisis proteómico ascendente basado en espectrometría de masas (EM) del material purificado representa una estrategia sólida para identificar casi todos los componentes proteicos primarios de las fibrillas amiloides. Estudios proteómicos previos de proteínas en las coronas amiloides han revelado una colección inesperadamente grande y funcionalmente diversa de proteínas. En particular, después de refinar la estrategia de purificación, el número de proteínas copurificantes se redujo en más de 10 veces, lo que indica la alta pureza del material insoluble SDS aislado. La tinción negativa y la microscopía electrónica de inmuno-oro permitieron confirmar la pureza de estas preparaciones. Se requieren más estudios para comprender los atributos espaciales y biológicos que contribuyen a la deposición de estas proteínas en inclusiones amiloides. En conjunto, esta estrategia analítica está bien posicionada para aumentar la comprensión de la biología amiloide.
Introduction
El amiloide es una disposición supramolecular extremadamente estable que se encuentra en un panel diverso de proteínas, algunas de las cuales conducen a cambios patológicos1. La acumulación de agregados amiloides intra o extracelulares se observa en varias enfermedades neurodegenerativas2. Los agregados amiloides son heterogéneos y están enriquecidos con un gran número de proteínas y lípidos3. En los últimos años, el interés en el proteoma amiloide ha generado un interés sustancial entre los neurocientíficos básicos y traslacionales. Se han desarrollado varios métodos para extraer y purificar agregados amiloides de tejidos cerebrales humanos de ratón y post mortem. La microdisección de captura láser, la inmunoprecipitación, la descelularización y el aislamiento bioquímico de agregados amiloides son métodos ampliamente utilizados para extraer y purificar placas amiloides, fibrillas y oligómeros 4,5,6,7. Muchos de estos estudios se han centrado en determinar la composición proteica de estos depósitos fibrilares estrechamente empaquetados utilizando EM semicuantitativa. Sin embargo, los resultados disponibles son inconsistentes, y el número sorprendentemente grande de proteínas co-purificadoras previamente reportadas son difíciles de interpretar.
La principal limitación de la literatura existente que describe el proteoma del núcleo amiloide en los cerebros modelo de ratón con EA y EA es que el material purificado contiene un número inmanejable de proteínas copurificantes. El objetivo general de este método es superar esta limitación y desarrollar una purificación bioquímica robusta para aislar los núcleos de fibrillas amiloides. Esta estrategia emplea un método bioquímico basado en la ultracentrifugación de gradiente de densidad de sacarosa previamente descrito para el aislamiento de fracciones amiloides enriquecidas insolubles de SDS de tejidos cerebrales humanos y de ratón post mortem AD 8,9. Este método se basa en la literatura existente, pero va más allá con la ultrasonicación y los lavados SDS para eliminar la mayoría de las proteínas asociadas a amiloides unidas libremente, lo que lleva al aislamiento de fibrillas amiloides altamente purificadas (Figura 1). Las fibrillas purificadas por este protocolo superan varios desafíos existentes que se encuentran con frecuencia en los estudios estructurales de fibrillas amiloides aisladas de extractos cerebrales. La visualización de estas fibrillas con microscopía electrónica de transmisión (TEM) confirma la integridad y pureza del material purificado (Figura 2). En este estudio, las fibrillas aisladas se solubilizan y se digieren en péptidos con tripsina, y el análisis de EM sin etiqueta puede revelar fácilmente la identidad de las proteínas que forman el núcleo de la fibrilla. En particular, algunas de estas proteínas tienen una tendencia inherente a formar ensamblajes supramoleculares en orgánulos no unidos a la membrana. Además, muchas de las proteínas identificadas en el análisis de las fibrillas beta-amiloides (Aβ) también están asociadas con otras enfermedades neurodegenerativas, lo que sugiere que estas proteínas pueden desempeñar un papel clave en múltiples proteinopatías.
Es poco probable que este método SDS / ultrasonido altere o interrumpa la estructura de los núcleos de la fibrilla. El material purificado también es adecuado para una amplia gama de enfoques de análisis proteómico de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba y estrategias adicionales de análisis estructural basadas en EM, como la reticulación química o el intercambio de hidrógeno-deuterio. La recuperación general utilizando este método es relativamente alta y, por lo tanto, es adecuada para estudios estructurales detallados, que requieren microgramos a miligramos del material purificado. El material purificado también es adecuado para estudios estructurales utilizando crioEM y microscopía de fuerza atómica. Este protocolo, en combinación con el etiquetado isotópico estable de mamíferos, puede facilitar los estudios de resonancia magnética nuclear (RMN) en estado sólido de la estructura amiloide10.
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Protocol
Este protocolo implica el uso de tejidos cerebrales humanos o vertebrados. Toda la investigación se realizó de conformidad con las directrices institucionales aprobadas por la Universidad Northwestern. El flujo de trabajo actual está estandarizado utilizando APP-knock in (AppNL-G-F / NL-G-F) extractos de la región cerebral cortical e hipocampal del cerebro11. Este protocolo ha sido optimizado para extractos cerebrales de ratones a los 6-9 meses de edad, y puede purificar eficazmente los amiloides de animales machos y hembras.
Nota : para una mejor comprensión del procedimiento experimental general, consulte la Figura 1 para obtener un esquema del flujo de trabajo.
1. Recolección de tejidos y purificación amiloide
NOTA: Idealmente, las fibrillas amiloides deben aislarse de regiones cerebrales recién diseccionadas. Sin embargo, este método también funciona bien con tejidos cerebrales congelados a presión o flash. A continuación se muestra un breve resumen de los tejidos cerebrales de congelación instantánea para su almacenamiento para su uso en un momento posterior.
- Recolección y almacenamiento de tejido cerebral: Diseccione los cerebros de los ratones y recolecte rápidamente las regiones cargadas de amiloide (es decir, la corteza y el hipocampo), seguidas de una congelación instantánea en nitrógeno líquido o un baño de alcohol en hielo seco.
NOTA: La congelación instantánea ayuda a preservar los atributos estructurales de los componentes del tejido. Los ratones son sacrificados por isoflurano y luxación cervical12,13. Se recomienda evitar el uso de CO2, ya que puede comprometer la integridad del proteoma cerebral. - Después de la disección, corte y almacene los tejidos frescos en pequeños bloques (por ejemplo, 5 mm x 5 mm), ya que esto facilita una homogeneización más eficiente antes de la extracción de amiloide. Transfiera el tejido al vial criogénico estéril, apriete su tapa y sumérjalo rápidamente.
- Mantenga los tejidos congelados en condiciones ultrafrías (es decir, -80 °C o nitrógeno líquido). Si la extracción se va a realizar unos días más tarde, almacene los tejidos a -20 °C y evite los ciclos de congelación y descongelación. Descongele los tejidos congelados en hielo húmedo cuando esté listo para la extracción y purificación.
NOTA: El contacto directo de los tejidos con nitrógeno líquido puede causar daño tisular y proteico. Tenga en cuenta que un baño de alcohol puede eliminar los marcadores permanentes de las etiquetas del tubo.
2. Enriquecimiento de material insoluble SDS
NOTA: Realice todos los pasos sobre hielo y centrífuga a 4 °C, a menos que se indique lo contrario. Los detalles de todos los búferes y soluciones utilizados en este protocolo se proporcionan en el archivo complementario 1. Los fabricantes y los números de catálogo de productos químicos e instrumentos se proporcionan en la Tabla de materiales.
- Comience con regiones de tejido cerebral recién diseccionadas o congeladas (descongeladas en hielo) colocadas en un tubo de 2 ml que contiene 6-8 perlas de cerámica y tampón de homogeneización helada recién preparado (1 ml para 0.25-1 g de masa de tejido húmedo).
- Transfiera los tubos al homogeneizador del molino de perlas y muela el contenido del tejido a 4000 rpm, con dos ciclos de 30 s cada uno y un intervalo de 30 s entre ellos.
NOTA: Alternativamente, se pueden utilizar sistemas de agitador motorizado u homogeneizador para moler y homogeneizar los tejidos. - Agregue 9 ml de tampón de homogeneización en frío a 1 ml de tejido cerebral entero homogeneizado en tubos de 15 ml, selle con tiras de película de cera de laboratorio y gire de extremo a extremo durante la noche a 4 ° C para garantizar una solubilización robusta.
NOTA: Para eliminar los desechos celulares grandes no deseados y los lípidos, a la mañana siguiente, gire los tubos a 800 x g a 4 ° C durante 10 minutos y recoja el sobrenadante en un tubo fresco. Vuelva a suspender el pellet restante en 2 ml de tampón de homogeneización helado, mezcle bien, gire nuevamente durante 10 minutos a 4 ° C y combine los dos sobrenadantes. - Agregue lentamente sacarosa sólida a la suspensión de extracto de tejido a una concentración final de 1.2 M, mezcle bien y centrífuga a 250,000 x g durante 45 min a 4 ° C.
- Retire con cuidado y deseche el sobrenadante con una pipeta. Resuspend el pellet en 2 mL de tampón de homogeneización que contiene 1,9 M de sacarosa por trituración, seguido de centrifugación a 125.000 x g durante 45 min a 4 °C.
NOTA: El volumen del búfer se puede ajustar en función de la cantidad de material recuperado del paso anterior. En general, 10 volúmenes de búfer de homogeneización (V/V) es ideal para este paso. - Recoja la capa sólida blanca superior con una pipeta, transfiérala a un tubo fresco y solubilice en 1 ml de tampón de lavado helado mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces, sin introducir burbujas de aire.
- Además de la capa superior, el pellet también está enriquecido con fibrillas amiloides. Para un mayor rendimiento, combine las dos fracciones y proceda. Retire con cuidado la capa acuosa media con una pipeta y deséchela.
- Centrifugar las fracciones combinadas a 8000 x g durante 20 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Agregue 1 ml de tampón de digestión helada al pellet lavado, resuspenda e incube a temperatura ambiente (RT) durante 3 h.
- Centrifugar a 8000 x g durante 20 min a 4 °C y retirar el sobrenadante con una pipeta.
- Vuelva a suspender y lavar (igual que el Paso 2.8.) el pellet digerido dos veces en 1 ml de tampón Tris helado.
- Resuspend el pellet lavado en 1 mL de tampón de solubilización que contiene 1% de SDS y 1.3 M de sacarosa mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Centrifugar rápidamente a 200.000 x g durante 60 min a 4 °C.
NOTA: Aunque las fibrillas amiloides son altamente resistentes a los detergentes y desnaturalizantes, las exposiciones muy largas al detergente (1% SDS) pueden afectar la integridad de las fibrillas o eliminar las proteínas estrechamente unidas, lo que comprometerá los análisis posteriores. Por lo tanto, inmediatamente después de resuspender los gránulos, proceda a la centrifugación. - Guarde el pellet y aumente el volumen del sobrenadante restante agregando un tampón Tris de 50 mM (en relación 1:0.3) para reducir la concentración de sacarosa de 1.3 a 1 M y centrifugar una vez más a 200,000 x g durante 45 min a 4 °C.
- Disolver los dos pellets en 100 μL de tampón Tris que contiene 0,5% SDS y pool para la purificación de amiloide. Los gránulos visibles son pequeños y deben aparecer opacos y blanquecinos (ver Figura 2A).
3. Purificación amiloide
NOTA: Combinar los dos pellets, solubilizar mediante pipeteo hasta obtener una solución uniforme y proceder con los siguientes pasos de purificación amiloide.
- Para una solubilización completa del material rico en amiloide presente en los gránulos, someta el tubo a un cizallamiento mecánico producido por ondas de ultrasonido en un dispositivo de sonicación de baño que funciona durante 30 s ON y 30 s OFF a una frecuencia de rango medio durante 20 ciclos.
- Centrifugar inmediatamente el material a 20.000 x g durante 30 min a 4 °C y volver a suspender el pellet en 500 μL de tampón SDS Tris al 0,5%.
- Repita el paso 3.1. y paso 3.2. cuatro veces para un total de cinco lavados. El número de lavados se puede aumentar para mejorar la pureza.
NOTA: Los pasos de sonicación y lavado se optimizan al 0,5% de SDS, ya que las concentraciones más altas pueden afectar la estructura, la integridad o la composición proteica de las fibrillas. No se recomienda aumentar la concentración de SDS en este paso. - Después de la etapa final de centrifugación, lave el pellet en 200 μL de agua ultrapura y centrífuga a 20.000 x g durante 30 min a 4 °C para eliminar el detergente restante. El pellet lavado que contiene fibrillas amiloides purificadas parece de color semitransparente y a veces es difícil de ver.
- Disolver el pellet final que contiene fibrillas amiloides purificadas en 100 μL de agua ultrapura. Continúe con el siguiente paso inmediatamente para el procesamiento posterior o guarde la suspensión de la fibrilla a -20 ° C para un análisis posterior. Si está congelado, descongele en hielo antes de comenzar la precipitación.
4. Precipitación de cloroformo de metanol
NOTA: Si el objetivo final es realizar un análisis de proteínas, se recomienda desalinizar y eliminar impurezas no proteínicas adicionales.
- Agregue 400 μL de metanol a los 100 μL purificados de fibrillas amiloides en un tubo de 1.5 ml y un pozo de vórtice.
- Agregue 100 μL de cloroformo al tubo y al vórtice bien.
- Agregue 300 μL de agua ultrapura y vórtice a fondo. Esto vuelve la mezcla turbia debido a la precipitación de proteínas.
- Centrifugadora a 12.000 x g durante 2 min a RT.
- Retire con cuidado la capa acuosa (es decir, la parte superior) sin perturbar la capa de interfaz que contiene la escama de proteína.
- Añadir de nuevo el mismo volumen de metanol y centrifugar a 12.000 x g durante 2 min a RT.
- Deseche el sobrenadante con una pipeta y seque al aire el pellet en RT. Evite el secado excesivo; La fracción amiloide es difícil de redisolver si se seca en exceso.
5. Digestión de tripsina
- Disolver el pellet en 50 μL de tampón de clorhidrato de guanidina (GuHCl). Sonicar en un baño de agua helada y calentar a 95 °C durante 5 min, si es necesario.
- Vórtice a fondo en RT durante 45 min a 1 h para disolverlo por completo. El pellet no será visible después de este paso, y la solución se ve clara en apariencia.
- Añadir el mismo volumen de solución de surfactante al 0,2%. Solubilizar en RT con vórtice durante 60 min. Este paso mejora la actividad enzimática de tripsina.
- Añadir 1 μL de tris-2-carboxietilfosfina (TCEP) de la solución madre de 500 mM. Incubar durante 60 min.
- Añadir 2 μL de yodoacetamida (IAA) de 500 mM e incubar en la oscuridad durante 20 min.
- Apague el IAA con 5 μL de solución de TCEP durante 15 min.
- Agregue el volumen requerido de 50 mM de solución de bicarbonato de amonio al tubo para reducir la concentración de guanidina a 1.5 M.
- Añadir una solución de surfactante al 1% al tubo (1 μL/50 μg de proteína).
- Añadir tripsina (1 μg/100 μg de proteína) y dejar la mezcla del tubo a 37 °C durante la noche.
6. Limpieza de péptidos
- A la mañana siguiente, acidifique la solución peptídica digerida reduciendo el pH a 2.0 agregando ácido fórmico.
- Active la columna de espín C18 (n-octadecil) en un tubo receptor de 2 ml agregando 200 μL de solución de metanol al 50% y gire a 1500 x g durante 2 minutos en RT. Repita el paso de activación.
- Equilibre los lechos de resina de columna C18 agregando 200 μL de tampón de equilibrio e girando durante 2 min con las mismas condiciones. Repita este paso.
- Cargue la solución peptídica acidificada en la columna C18 y centrífuga a 1500 x g durante 2 min en RT. Recoja el flujo y vuelva a cargarlo una vez más. Descarta el segundo flujo.
- Lave los péptidos unidos a la resina C18 con el tampón de lavado 2x, como se hace en el Paso 6.3. Utilice el mismo tampón de equilibrio para lavar la columna.
- Eluya los péptidos agregando 40 μL de tampón de elución seguido de centrifugación a 1500 x g, durante 2 min en RT. Repita el paso de elución tres veces para aumentar el rendimiento de los péptidos recuperados.
- Seque los péptidos en un concentrador de vacío de velocidad evaporando la solución acuosa. Los pellets secos se pueden guardar a -20 °C durante unas semanas antes del análisis de EM.
7. Configuración del espectrómetro de masas para el análisis de péptidos
NOTA: Para los parámetros de MS, consulte el Archivo suplementario 1 (adaptado de una publicación anterior del laboratorio)14.
- Antes de cargar las muestras de péptidos para el análisis de EM, disuelva los gránulos de péptidos secos en 20 μL de tampón de carga de muestras y realice micro BCA para cuantificar la concentración de péptidos recuperados.
- Transfiera los péptidos disueltos en un vial de vidrio y cargue 3 μg (cuantificados a partir de micro BCA) de péptidos en el muestreador automático del sistema UPLC.
- Cargue las muestras en una columna de trampa ventilada (columna C18 HPLC, 0,075 mm x 20 mm) con un caudal de 250 nL/min.
- Coloque la columna de trampa de acuerdo con una columna analítica (0.075 μm x 500 mm) y ensamble una punta emisora a la fuente de ionización por electropulverización (ESI) sometida a un voltaje de pulverización de 2000 V.
NOTA: En este estudio, se realiza ESI, en el que la fase móvil se somete a ionización de alto voltaje en la fase gaseosa. El spray creado por esto se dirige a la cámara de vacío de la EM a través de un capilar calentado. Mientras está bajo vacío, la dessolvatación de gotas y la eyección de iones se produce en presencia de calor y voltaje. A partir de entonces, los iones se aceleran hacia el analizador de masas en presencia de un entorno de alto voltaje. - Analizar las muestras con tiradas de adquisición de 2 h. Este estudio se realiza utilizando la adquisición dependiente de datos con el paradigma de selección de iones precursores más intenso de los 20 principales.
NOTA: En la adquisición dependiente de datos, se detecta un número limitado de péptidos precursores en la exploración MS1 y se someten a fragmentación para el análisis MS2. Sin embargo, la exclusión dinámica es problemática aquí, ya que los péptidos Aβ altamente abundantes se omitirán para la fragmentación y darán lugar a una subestimación de su cantidad. - Para la cuantificación absoluta de los péptidos Aβ, ejecute las mismas muestras una vez más utilizando el método MS/MS dirigido. Para este estudio, se prepara una lista exhaustiva de todas las proporciones m/z para varios posibles péptidos Trípticos Aβ para los modelos de ratón KNOCK-in APP (ver Tabla suplementaria 1). Otros grupos deben preparar una lista similar de acuerdo con el modelo de ratón disponible y los posibles péptidos generados a partir de la proteína de interés (por ejemplo, Aβ para la EA).
NOTA: Para abordar la exclusión de péptidos altamente abundantes, utilice un enfoque específico proporcionando una lista de valores m/z seleccionados correspondientes a péptidos trípticos Aβ. Este enfoque aborda el problema de la exclusión dependiente de datos de los péptidos Aβ y puede cuantificar las cantidades absolutas de diferentes monómeros (Aβ38, 40 y 42 péptidos) con alta resolución. - El espectrómetro de masas genera espectros MS de las muestras de péptidos y guarda archivos de datos sin procesar en el directorio de destino. Utilice este archivo para realizar la coincidencia espectral utilizando herramientas estadísticas y bioinformáticas bien establecidas. Múltiples herramientas de búsqueda y análisis de bases de datos en línea y fuera de línea están disponibles.
8. Análisis de datos de EM
- Extraiga los archivos MS1 y MS2 utilizando la herramienta Rawconverter sin conexión (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
- Realizar identificación, cuantificación y análisis detallados de los datos en un motor de búsqueda de datos de EM basado en la web. En este estudio, se utilizó Integrated Proteomics Pipeline - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/).
NOTA: Varias otras herramientas de análisis de datos de EM en línea y fuera de línea están disponibles y también se pueden usar, como MaxQuant (https://www.maxquant.org/). - Después de cargar los archivos MS1 y MS2, seleccione una base de datos de proteoma de mouse actualizada. Aquí, se selecciona una base de datos de ratones actualizada que contiene mutaciones específicas adicionales de App knock-in para la identificación de péptidos utilizando los algoritmos ProLuCId y SEQUEST11.
- En el sistema de análisis IP2, seleccione los parámetros predeterminados y modifíquelos de acuerdo con los requisitos experimentales. En este estudio, se utiliza una tolerancia de masa peptídica de 50 ppm para el precursor y 600 ppm para los fragmentos (consulte el Archivo Suplementario 1 para otros parámetros utilizados en IP2).
NOTA: Los investigadores pueden modificar los parámetros de búsqueda de acuerdo con los objetivos experimentales. Por ejemplo, para identificar modificaciones post-traduccionales, agregue valores de modificación diferencial para varios PTM (por ejemplo, ubiquitinación, SUMOilación, fosforilación).
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Representative Results
Aquí, se resume un método detallado para el aislamiento y purificación de fibrillas amiloides utilizando un método de purificación de ultracentrifugación de gradiente de densidad de sacarosa modificado (ver Figura 1). La innovación en este método es la inclusión de pasos de lavado basado en ultrasonidos utilizando un sistema de sonicación en baño de agua seguido de solubilización SDS, que elimina muchas proteínas vagamente asociadas de las fibrillas amiloides que se co-purifican con las fibrillas altamente densas y limpias. El paso de ultrasonido genera una alta fuerza de cizallamiento y agita las fibrillas, aflojando las fuerzas hidrofóbicas y liberando las proteínas solubles SDS asociadas libremente en el tampón de lavado SDS. A su vez, se recuperan pequeñas cantidades de núcleos de fibrilla amiloide altamente puros. Como se muestra en la Figura 2A, un pellet visible, que inicialmente parece opaco (posiblemente debido a impurezas), se puede ver después del enriquecimiento; sin embargo, después de la ultrasonicación y múltiples lavados SDS, el pellet se vuelve semitransparente y apenas es visible. La tinción roja representativa del Congo de amiloides purificados en comparación con la fracción soluble de SDS documenta el enriquecimiento de las fibrillas amiloides (Figura 2B). La tinción roja del Congo se puede utilizar para confirmar el material amiloide en diferentes fracciones y se puede visualizar utilizando un microscopio de campo brillante. Como se muestra en la Figura 2C, la fracción soluble de SDS no se tiñe con el tinte rojo Congo.
La estructura de las fibrillas purificadas con análisis de microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa confirmó la presencia de fibrillas amiloides casi puras (Figura 2D). Además, el marcado de inmunogold utilizando una combinación de anticuerpos Aβ42 (6E10 y 4G8) confirmó la presencia de péptidos Aβ42 (Figura 2E). Para investigar la composición y las características estructurales del material purificado, utilizamos técnicas de inmunoblot para péptidos Aβ y firmas estructurales distintivas (por ejemplo, fibrillas). El análisis representativo de puntos blot de las fracciones recogidas durante el aislamiento amiloide mostró una abundancia relativa de péptidos y fibrillas Aβ42 utilizando anticuerpos anti-Aβ42 y antifibrillas (LOC) (Figura 3A). Del mismo modo, el western blot de las fracciones representativas también mostró enriquecimiento de fibrillas que contienen Aβ42 en proteínas de alto peso molecular atrapadas en los pocillos del gel SDS PAGE (Figura 3B). Para comprender la composición de estas fibrillas de alto peso molecular, las fracciones amiloides purificadas se sometieron a un análisis proteómico basado en la EM. Estos resultados semicuantitativos revelaron la presencia de aproximadamente 250 proteínas, mientras que la fracción recolectada antes de la ultrasonicación y los lavados SDS contenía más de 2500 proteínas (Figura 3C). Esto indica la efectividad de estos dos pasos cruciales que se incluyen en este protocolo de purificación. Tomados en conjunto, múltiples resultados independientes indican la alta abundancia de clases de proteínas similares en los núcleos de fibrillas.
El análisis de componentes celulares de Gene Ontology (GO) para un conjunto de datos representativo de EM en la Figura 4 reveló que un gran número de proteínas presentes en los núcleos de fibrillas están asociadas con orgánulos no unidos a la membrana y complejos supramoleculares. Esta observación probablemente se deba a la tendencia inherente de muchas proteínas a agregarse o coagregarse con otras proteínas en inclusiones proteínicas que están muy cerca. Las fuerzas físicas juegan un papel crucial en estas interacciones. Los otros orgánulos celulares y componentes representados principalmente por estas proteínas son las mitocondrias, el citoesqueleto, la membrana celular y la vaina de mielina. Muchas de estas proteínas interactúan con péptidos Aβ, oligómeros o protofibrillas en diferentes etapas de la formación de amiloide. Pueden interactuar cerca de la membrana plasmática, donde se liberan los péptidos Aβ. La interacción también puede ocurrir mientras algunas de estas proteínas se liberan directamente o a través del transporte vesicular en el espacio extracelular. La secreción o exocitosis de agregados proteicos es una de las muchas estrategias que las células utilizan para hacer frente y reducir la carga asociada con los agregados proteicos15. Esto deja otra oportunidad donde algunas de las proteínas intracelulares pueden unirse a los péptidos Aβ. El protocolo proporciona un marco para una mayor optimización en función de los objetivos experimentales. Por ejemplo, la pureza y el rendimiento, al alterar el número de ultrasonidos y lavados SDS, se pueden ajustar en consecuencia.
Figura 1: Descripción general esquemática del flujo de trabajo para el aislamiento del núcleo de fibrillas amiloides de tejidos cerebrales humanos o animales modelo post mortem con EA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Confirmación de la extracción de amiloide mediante tinción bioquímica e imágenes de fibrillas amiloides. (A) El pellet insoluble enriquecido que contiene Amiloide SDS aparece opaco de color blanquecino. B) Tinción roja del Congo del sobrenadante soluble en SDS y del pellet insoluble de SDS que contiene amiloide purificado borrado en la membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm; Se utilizaron lecturas de BCA para la normalización de la cantidad de carga de las proteínas. El ensayo de BCA se realizó según las instrucciones del fabricante. (C) Imágenes de campo brillante de material soluble en SDS y amiloide después de la tinción roja del Congo (barra de escala: 100 μm). (D) Visualización de la fracción soluble de SDS y fibrillas amiloides purificadas mediante tinción negativa bajo el microscopio electrónico (barra de escala: 100 nm). (E) Confirmación de la abundancia de péptidos Aβ42 en fibrillas amiloides purificadas mediante microscopía electrónica de inmunooro utilizando anticuerpos Aβ42 (6E10 y 4G8) (barra de escala: 50 nm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Validación de la purificación amiloide mediante análisis de inmunoblot y EM. (A) Análisis de Puntos y (B) Análisis de Western blot de varias fracciones representativas recogidas durante el proceso de purificación de amiloide utilizando ANTICUERPOS ANTIFIBRILLA LOC y anti-Aβ42; Se utilizaron lecturas de ensayo de BCA para la normalización de la cantidad de carga de las proteínas. (C) Número de proteínas recuperadas en el análisis de espectrometría de masas sin etiqueta de fracciones amiloides enriquecidas y purificadas; Se utilizó el ensayo micro BCA para cargar 3 μg de péptidos digeridos para cada análisis de EM. Los ensayos de BCA y micro BCA se realizaron según las instrucciones del fabricante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de ontología génica de proteínas abundantes en fracciones amiloides purificadas. (A) Componentes celulares y (B) vías KEGG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Expediente complementario 1: Tampones y soluciones, parámetros de espectrometría de masas y parámetros de búsqueda ProLuCID para la identificación de péptidos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria 1- Una lista representativa de las relaciones m/z identificadas en la EM para los péptidos beta amiloides de APP knock en modelos de ratón. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Desarrollar una comprensión clara de la estructura y composición amiloide es un desafío para los biólogos estructurales y bioquímicos debido a las complejidades biológicas y las limitaciones experimentales en la extracción de fibrillas purificadas de los tejidos cerebrales de la EA16,17. Las fibrillas amiloides son polimórficas a nivel molecular, mostrando una población heterogénea de longitudes y complejidades variables18,19. Para comprender mejor sus características biológicas y su relevancia patológica, se requiere una caracterización exhaustiva de la composición de las fibrillas amiloides polimórficas obtenidas a partir de tejidos cerebrales post mortem humanos y ratonescon EA 20,21. Un gran subconjunto de proteínas interactúa directamente con Aβ42, mientras que otras pueden tener una tendencia a formar grandes estructuras fibrilares o complejos de proteínas 22,23,24. Es más difícil determinar los roles desempeñados por las proteínas que interactúan con Aβ42 en la formación, estabilización y alargamiento de amiloide en relación con la patología de la EA. En los últimos años, varios estudios proteómicos han dilucidado las diferencias y similitudes en la composición proteica de diversos arreglos supramoleculares, orgánulos sin membrana, cuerpos de inclusión y agregados proteicos 25,26,27. En las primeras etapas de la EA, múltiples proteínas celulares (por ejemplo, Aβ42 y la proteína tau asociada a microtúbulos y la apolipoproteína E) se pliegan y se agregan erróneamente en múltiples regiones cerebrales28,29. Las formaciones proteínicas amiloidógenas son un sello patológico importante de la EA y probablemente contribuyen a la patogénesis3.
La purificación de las fibrillas amiloides de cerebros humanos enfermos es una tarea tediosa y desafiante y tiene múltiples limitaciones. Un inconveniente importante de los métodos existentes es la baja pureza del material extraído, que a menudo restringe su análisis estructural detallado utilizando métodos de imagen, como el crioEM. Del mismo modo, los estudios de RMN requieren unos pocos miligramos de material purificado, que también debe etiquetarse con isótopos pesados (es decir, 15N)30. Los cerebros humanos post mortem pueden cumplir con el primer requisito, ya que el material de partida se puede aumentar hasta unos pocos gramos de tejidos humanos; sin embargo, no es posible etiquetar los tejidos cerebrales humanos con isótopos pesados. Por otro lado, etiquetar los modelos de ratón AD con 15isótopos N es posible (aunque costoso) y ahora es cada vez más común31,32. Nuestro laboratorio ha utilizado el etiquetado de persecución de pulsos para estudiar la dinámica de renovación de proteínas sinápticas durante la enfermedad y el envejecimiento cerebral14. También hemos utilizado el etiquetado de isótopos pesados de animales enteros para identificar proteínas de larga vida y comprender su relevancia fisiológica en estructuras biológicas elaboradas33,34. Sin embargo, para el cerebro del ratón, se requieren grandes cantidades de material de partida para obtener una cantidad viable de los núcleos de fibrilla. Este método aborda con éxito estos problemas al mejorar el rendimiento y la pureza de las fibrillas amiloides extraídas mediante la modificación de los principios de aislamiento bioquímico existentes. Por lo tanto, este protocolo robusto para la extracción de fibrillas amiloides de los tejidos cerebrales se puede utilizar fácilmente para estudios estructurales basados en crioEM y RMN.
Este método utiliza el paradigma de fraccionamiento subcelular basado en el gradiente de densidad de sacarosa existente y elimina las proteínas copurificantes inespecíficas en pasos sucesivos. Después de la eliminación de los restos celulares, la mielina, el ADN y los lípidos celulares, se aíslan los gránulos insolubles SDS ricos en amiloide. La incorporación de pasos adicionales de múltiples lavados SDS acoplados a ultrasonidos ayuda a reducir el número de componentes celulares co-purificantes, proteínas unidas libremente y polimorfos solubles SDS más pequeños de amiloides. El pellet final se solubiliza en agua ultrapura y se puede utilizar para muchas aplicaciones, incluidos experimentos de siembra, estudios bioquímicos o farmacológicos y análisis estructurales. Las fibrillas amiloides purificadas de los tejidos cerebrales de la EA también se utilizan para comprender la composición proteómica y las características estructurales de los núcleos de fibrilla utilizando proteómica basada en la EM. Este análisis confirmó la presencia de un subconjunto de proteínas celulares (representadas en la Figura 4) en el núcleo de las fibrillas, lo que puede indicar las posibles funciones de más de una proteína en la formación, elongación y estabilización de las fibrillas amiloides durante un largo período de tiempo. Algunas de las proteínas identificadas en este análisis son conocidas por su asociación con más de un trastorno neurodegenerativo, por ejemplo, Adam22, APP, ApoE, proteínas de neurofilamento de β-catenina, proteínas 14-3-3 y otras.
Existe la posibilidad de que algunas proteínas contaminantes puedan aparecer en el análisis proteómico debido al hecho de que, después de la homogeneización, pueden ocurrir algunas interacciones injustificadas entre las proteínas debido a la alta hidrofobicidad de las fibrillas amiloides. Algunas de estas proteínas se adhieren a los núcleos y no se eliminan incluso después de múltiples rondas de sonicación y pasos de lavado SDS. Esta es una limitación de esta estrategia de purificación de amiloide. Sin embargo, podría abordarse utilizando controles negativos adecuados y realizando puntos de corte estadísticos efectivos en estudios proteómicos a gran escala. Otra limitación que encontramos se relaciona con la subestimación de la abundancia del péptido Aβ después de la digestión de tripsina. Esto se ha abordado en este flujo de trabajo mediante una estrategia de análisis de EM/EM dirigida. El análisis GO para las vías KEGG indica la abundancia de proteínas pertenecientes a vías involucradas en muchas enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y las enfermedades priónicas. Estas proteínas son actores importantes en múltiples vías patológicas y, por lo tanto, tienen una participación conocida en el inicio y la progresión de la enfermedad. Curiosamente, algunas de estas proteínas requieren un análisis más detallado para determinar su posible participación en la patología de la EA y otras enfermedades neurodegenerativas.
Los estudios futuros sobre el material amiloide puro de otros modelos de enfermedad pueden proporcionar una comprensión profunda de los patrones estructurales y la composición de las fibrillas centrales y pueden ayudar a identificar objetivos terapéuticos clave.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención R01AG061865 de los NIH a R.J.V. y J.N.S. Los autores agradecen a los miembros del grupo de investigación Vassar y Savas de la Universidad Northwestern por sus discusiones reflexivas. También agradecemos sinceramente a los Dres. Ansgar Seimer y Ralf Langen de la Universidad del Sur de California por su aporte crucial. Agradecemos a la Dra. Farida Korabova por la preparación de muestras y las imágenes de microscopía electrónica de tinción negativa en el Centro de Microscopía Avanzada de la Universidad Northwestern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline - IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
References
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