Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkeltmolekyleanalyse af Sf9 rensede superprocessive Kinesin-3-familiemotorer

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/63837
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1
1Discipline of Biological Engineering, Indian Institute of Technology Gandhinagar, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Sambalpur University

Summary

Denne undersøgelse beskriver oprensning af KIF1A (1-393LZ), et medlem af kinesin-3-familien, ved hjælp af Sf9-baculovirusekspressionssystem. In vitro enkeltmolekyle og multimotorisk glideanalyse af disse oprensede motorer udviste robuste bevægelighedsegenskaber, der kan sammenlignes med motorer fra pattedyrcellelysat. Således er Sf9-baculovirus-systemet egnet til at udtrykke og rense motorprotein af interesse.

Abstract

Et komplekst cellulært miljø udgør udfordringer for enkeltmolekylemotilitetsanalyse. Imidlertid har fremskridt inden for billeddannelsesteknikker forbedret enkeltmolekylestudier og har vundet enorm popularitet i detektion og forståelse af den dynamiske opførsel af fluorescerende mærkede molekyler. Her beskriver vi en detaljeret metode til in vitro enkeltmolekylestudier af kinesin-3 familiemotorer ved hjælp af total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi. Kinesin-3 er en stor familie, der spiller kritiske roller i cellulære og fysiologiske funktioner lige fra intracellulær godstransport til celledeling til udvikling. Vi har tidligere vist, at konstitutivt aktive dimere kinesin-3-motorer udviser hurtig og superprocessiv bevægelighed med høj mikrotubuliaffinitet på enkeltmolekyleniveau ved anvendelse af cellelysater fremstillet ved at udtrykke motor i pattedyrceller. Vores laboratorium studerer kinesin-3-motorer og deres reguleringsmekanismer ved hjælp af cellulære, biokemiske og biofysiske tilgange, og sådanne undersøgelser kræver oprensede proteiner i stor skala. Ekspression og oprensning af disse motorer ved hjælp af pattedyrceller ville være dyrt og tidskrævende, mens ekspression i et prokaryot ekspressionssystem resulterede i signifikant aggregeret og inaktivt protein. For at overvinde begrænsningerne ved bakterielle rensningssystemer og pattedyrcellelysat har vi etableret et robust Sf9-baculovirusekspressionssystem til at udtrykke og rense disse motorer. Kinesin-3-motorerne er C-terminalt mærket med 3-tandem fluorescerende proteiner (3xmCitirine eller 3xmCit), der giver forbedrede signaler og nedsat fotobleaching. In vitro enkeltmolekyle og multimotorisk glideanalyse af Sf9 oprensede proteiner viser, at kinesin-3 motorer er hurtige og superprocessive i lighed med vores tidligere undersøgelser ved hjælp af pattedyrcellelysater. Andre applikationer, der bruger disse assays, omfatter detaljeret viden om oligomerforhold for motorer, specifikke bindingspartnere parallelt med biokemiske undersøgelser og deres kinetiske tilstand.

Introduction

Et uhyre overfyldt cellemiljø udgør mange udfordringer ved sortering af bestemte proteiner og molekyler. Denne intense arbejdsbyrde med organisation og spatiotemporal fordeling af molekyler inden for cytoplasmaet lettes af molekylære motorer og cytoskeletale spor. Molekylære motorer er de enzymer, der hydrolyserer energivalutaerne som ATP og udnytter denne energi under bevægelses- og kraftgenerering1. Baseret på aminosyresekvensens lighed grupperes kinesiner i 14 familier, og på trods af denne lighed bidrager hver motor unikt til en celles funktion. Kinesin-3-familiemotorer udgør en af de største, der består af fem underfamilier (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 og KIF28)2, der er forbundet med forskellige cellulære og fysiologiske funktioner, herunder vesikeltransport, signalering, mitose, nuklear migration og udvikling 3,4,5. Svækkelse i kinesin-3 transportfunktion implicerer i mange neurodegenerative lidelser, udviklingsfejl og kræftsygdomme 6,7,8,9.

Nyligt arbejde har vist, at kinesin-3-motorer er monomerer, men gennemgår lastinduceret dimerisering og resulterer i hurtig og superprocessiv bevægelighed sammenlignet med konventionel kinesin10,11,12,13. Deres biokemiske og biofysiske karakterisering har brug for en stor mængde oprensede, aktive proteiner. Imidlertid resulterede deres produktion i det prokaryote ekspressionssystem i inaktive eller aggregerede motorer, formodentlig på grund af inkompatible proteinsyntese-, folde- og modifikationsmaskiner 14,15,16,17,18. For at omgå sådanne begrænsninger og øge udbyttet har vi her etableret et robust Sf9-baculovirus-ekspressionssystem til at udtrykke og rense disse motorer.

Baculovirusekspressionssystemet bruger Sf9-insektcellelinjer som værtssystem til eukaryot rekombinant proteinekspression med høj kapacitet19,20. Baculovirus besidder en stærk polyhedrinpromotor, der hjælper med heterolog genekspression og produktion af opløselige rekombinante proteiner17. På grund af dets omkostningseffektivitet, sikker at håndtere og høje mængde aktivt proteinudtryk er det blevet et kraftfuldt værktøj21. For at udtrykke et protein af interesse er et vigtigt skridt at generere et rekombinant bacmid. Da de kommercielt tilgængelige bacmid-genereringssæt er dyre, og vi vil arbejde med flere prøver, udviklede vi en intern protokol til både store og små indsatser af kinesin-3-motorer i bacmider. Sf9-oprensede kinesin-3-motorer blev brugt til at karakterisere in vitro-enkeltmolekyle og multimotoriske mikrotubuli-glideegenskaber ved anvendelse af total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi. Motorer er C-terminalt mærket med 3-tandem fluorescerende molekyler (3xmCit) for at give forbedret signal og nedsat fotobleaching. På grund af dets øgede signal-støj-forhold, mindre fototoksicitet og selektiv billeddannelse af et meget lille område tæt på dækslippet er TIRF-billeddannelse blevet brugt i vid udstrækning til at visualisere proteindynamik på enkeltmolekyleniveau in vivo og in vitro.

Denne undersøgelse diskuterer oprensning af kinesin-3-motorer ved at anvende Sf9-baculovirusekspressionssystem og in vitro-enkeltmolekylebilleddannelse og multimotorisk glideanalyse af motorer ved hjælp af TIRF-mikroskopi. Alt i alt viser denne undersøgelse, at bevægelighedsegenskaberne ved Sf9-rensede motorer er identiske med motorer fremstillet af pattedyrcellelysater. Derfor mener vi, at Sf9-baculovirus-systemet kan tilpasses til at udtrykke og rense ethvert motorprotein af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sf9-kultur, transfektion og virusgenerering

BEMÆRK: Vedligehold Sf9-celler i 30 ml Sf-900 / SFM-medium i 100 ml steril, engangskonisk kolbe uden antibiotika / antimykotisk middel ved 28 ° C. Hold suspensionskulturen i en orbital shaker ved 90 o / min. Levering af CO2 og fugtighedsvedligeholdelse er ikke påkrævet. Celler subkultureres normalt hver fjerde dag ved at inokulere 0,5 x 10 6 celler / ml for at nå 2,0 x 106 celler / ml tæthed på den fjerde dag.

  1. Generering af P0-viruslager
    1. Til transfektion sættes frøceller i en 35 mm skål med 4,5 x 105 celler/ml sammenløb og holdes ved 28 °C uden omrystning.
    2. Efter 24 timer, når cellerne er fastgjort og ser sunde ud, fortsæt til transfektion som beskrevet nedenfor.
      1. Tube A: Bland 1 μg bacmid-DNA-kodning til konstitutivt aktiv KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG-specifik kinesin-3-motor med 100 μL ikke-suppleret Graces medier.
      2. Rør B: Bland 6 μL transfektionsreagens med 100 μL usuppleret Graces medier.
      3. Overfør forsigtigt indholdet af rør A til rør B og bland grundigt ved at pipettere op og ned (ca. 20 gange).
      4. Inkuber blandingen i ~ 45 minutter ved stuetemperatur.
    3. Efter endt inkubation tilsættes 0,8 ml ikke-suppleret Graces medie til ovenstående blanding og blandes langsomt ved pipettering.
    4. Opsug forsigtigt Sf-900/SFM-mediet fra celler (for at fjerne spor af serum, der kan påvirke transfektionseffektiviteten).
    5. Transfektionsblandingen tilsættes fra trin 1.1.3 dråbevis på toppen af cellerne, og pladen inkuberes i 6 timer ved 28 °C.
    6. Efter inkubationen fjernes forsigtigt transfektionsblandingen, der tilsættes 2 ml Sf-900/SFM-medier, og der inkuberes yderligere i 48 timer ved 28 °C.
    7. Kontroller for motorproteinekspressionen under et omvendt fluorescensmikroskop. Motorproteinet er mærket med et fluorescerende protein, mCitrine, en variant af gult fluorescerende protein.
      BEMÆRK: Transinficerede celler blev visualiseret under et omvendt mikroskop udstyret med differentiel interferenskontrast (DIC) og epifluorescensbelysning med et 20x mål (200 gange forstørrelse), kviksølvlampe og et EM-CCD-kamera. Kontroller effektiviteten af virusgenerering og infektion ved at overvåge ekspressionen af mCitrine-mærkede motorer i celler gennem mCitrine excitation og emissionsfilterterning. Derudover kontrolleres for morfologiske ændringer af inficerede celler, såsom forstørrede celler / kerner (figur 1A-C).
    8. Igen skal du kontrollere cellerne 72 timer efter infektion. Normalt begynder celler at løsne sig fra overfladen (figur 2).
    9. Hvis >5% af cellerne løsnes fra overfladen, høstes mediet med inficerede celler i 1,5 ml sterile mikrocentrifugerør og spindes i 5 minutter ved 500 x g.
    10. Saml supernatanten og snap frys aliquots på 1 ml i flydende nitrogen og opbevar som P0-lager ved -80 ° C, eller brug den til at generere P1-viruslager.
  2. P1 virus lager generation
    1. For yderligere at forstærke P0 baculovirusbestanden og bekræfte proteinekspression skal du dyrke Sf9-celler i flydende suspensionskultur.
    2. I en steril 100 ml konisk kolbe tilsættes 10 ml Sf-900 / SFM-medier med en celletæthed på 2 x 106 celler / ml og 1 ml P0-viruslager. Inkuberes ved 28 °C med konstant omrystning ved 90 o / min.
    3. Efter 72 timers infektion kontrolleres proteinekspressionen som beskrevet tidligere (trin 1.1.7). Hvis proteinekspressionen er god (>90% af cellerne viser et lyst mCitrinfluorescenssignal) og viser signifikant celledød (ca. 10% -15%), skal cellerne spindes ned i et 15 ml sterilt konisk rør ved 500 x g i 5 min.
    4. Opsamling supernatanten, snapfrys aliquots på 1 ml (P1-lager) i flydende nitrogen og opbevar ved -80 ° C eller fortsæt til storskala infektion og proteinrensning.
  3. Storstilet infektion
    1. Til proteinekspression i stor skala inficeres 30 ml suspensionskulturen ved 2 x 106 celler/ml densitet med 1 ml P1-virusbestand og inkuberes ved 28 °C med konstant omrystning ved 90 omdr./min.
    2. Efter ~ 72 timer efter infektion skal du kontrollere proteinekspressionen (generelt opnås maksimal proteinekspression mellem 65-75 timer efter infektion).
    3. Hvis >90% af cellerne viser et lyst fluorescerende signal med minimal celledød (<5%), samles cellerne i et sterilt 50 ml konisk rør og drejer ned ved 500 x g ved 4 ° C i 15 minutter.
      BEMÆRK: Der skal være minimal celledød (<5%), fordi døde celler frigiver det cellulære indhold i mediet, hvilket fører til tab af udtrykt protein.
    4. Kassér supernatanten, saml cellepelleten, og fortsæt med proteinrensning.

2. Sf9 rensning af kinesin-3 motorer

  1. Til ovenstående cellepellet tilsættes 3 ml iskold lysisbuffer (supplerende tabel 1) frisk suppleret med 5 mM DTT, 5 μg/ml aprotinin, 5 μg/ml leupeptin og 5 μg/ml PMSF og lyser cellerne ved pipettering 20-25 gange uden at generere luftbobler. For alle buffersammensætninger og reagenser henvises til supplerende tabel 1.
  2. Drej cellelysatet ved 150.000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
  3. Saml supernatanten i et frisk, sterilt rør og bland med ~ 40 μL 50% anti-FLAG M2 affinitetsharpiks. Blandingen inkuberes i 3 timer ved 4 °C med ende-til-ende tumbling.
  4. Efter inkubation pelleres FLAG-harpiksen ved at dreje ved 500 x g i 1 minut ved 4 °C. Opsug forsigtigt supernatanten uden at forstyrre pelleten med en 26 G nål og kassér.
  5. FLAG-harpikspilleren vaskes tre gange med iskold vaskebuffer (supplerende tabel 1) frisk suppleret med 2 mM DTT, 5 μg/ml aprotinin, 5 μg/ml leupeptin og 5 μg/ml PMSF. Pelleter perlerne ved at dreje ved 500 x g i 1 min ved 4 °C i hver vask.
  6. Efter den tredje vask drænes vaskebufferen forsigtigt så meget som muligt uden at forstyrre pelleten. Til proteineluering tilsættes ~70 μL vaskebuffer indeholdende 100 μg/ml FLAG-peptid til harpikspilleren, og der inkuberes natten over ved 4 °C med ende-til-ende-tumbling.
  7. På den efterfølgende dag drejes harpiksen ned ved 500 x g i 1 minut ved 4 °C. Saml supernatanten indeholdende renset protein i et frisk rør og suppler med 10% glycerol. Fastfrys alikvoter på 5 μL i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C indtil yderligere brug.
  8. Kør SDS-PAGE gelen for at bestemme proteinkoncentrationen og udbyttet. Sammen med oprenset protein af interesse indlæses en standardproteinkontrol, BSA af kendte koncentrationer fra 0,2 μg, 0,4 μg, 0,6 μg, 0,8 μg og 1 μg for at generere en standardkurve. Plet gelen med Coomassie Brilliant blå (figur 3).
  9. Analyser gelen ved hjælp af et indbygget gelkvantificeringsværktøj i ImageJ-software. Først måles båndintensiteten af kendte koncentrationer af BSA, og standardkurven genereres. Mål derefter intensiteten af det oprensede proteinbånd og bestem proteinkoncentrationen. For at gøre det skal du åbne Image J-softwaren ved at klikke på indstillingen Analyser i menulinjen og vælge Gels i rullemenuen.

3. In vitro enkeltmolekyle motilitetsassay ved hjælp af Sf9-rensede kinesin-3-motorer

BEMÆRK: De Sf9-rensede kinesin-3-motorer kan bruges til at studere biokemiske og biofysiske egenskaber såsom ATP-omsætningshastighed, mikrotubulusaffinitet, hastighed, løbelængde, trinstørrelse og kraftgenerering. Her beskrives en detaljeret protokol for in vitro enkeltmolekylemotilitetsanalyse af KIF1A (1-393LZ) ved hjælp af Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) mikroskopi. For alle buffersammensætninger og reagenser henvises til supplerende tabel 1.

  1. Mikrotubuluspolymerisation
    1. I et forkølet 0,5 ml mikrocentrifugerør fremstilles en polymerisationsblanding ved pipettering i følgende rækkefølge: 12,0 μL BRB80-buffer, pH 6,9; 0,45 μL af 100 mM MgCl2, 1 μL af 25 mM GTP.
    2. Tag en 10 μL aliquot af 10 mg / ml tubulin opbevaret i flydende nitrogen, optø straks og tilsæt i ovennævnte polymerisationsblanding. Bland forsigtigt ved at pipettere 2-3 gange uden at skabe luftbobler.
      BEMÆRK: Udfør ovenstående trin hurtigt og strengt på is.
    3. Lad ovenstående blanding sidde på is i 5 min.
      BEMÆRK: Dette er et kritisk skridt for at forhindre denaturering af tubulin eller for at undgå dannelse af korte mikrotubulusfrø.
    4. Overfør røret til en forvarmet 37 °C varmeblok/vandbad og inkuber i 30 minutter til polymerisation af mikrotubuli.
    5. Mens mikrotubuli polymeriserer, optøes en aliquot af P12-buffer og bringes til stuetemperatur.
    6. Inden du afslutter 30 minutters inkubation, skal du begynde at forberede MT-stabiliseringsbuffer ved at pipettere 100 μL P12-buffer i et frisk mikrocentrifugerør. Hertil tilsættes 1 μL 1 mM taxol og straks hvirvles blandingen.
      BEMÆRK: Start forberedelsen af MT-stabiliseringsbufferen ca. 5 minutter, før inkubationen afsluttes i trin 3.1.4. Taxol stabiliserer de polymeriserede mikrotubuli ved at binde til β-tubulin.
    7. Mikrotubulusstabiliseringsbufferen opvarmes i 2-3 minutter ved 37 °C, og tilsæt den forsigtigt til de polymeriserede mikrotubuli uden at forstyrre polymerisationsblandingen i bunden.
      BEMÆRK: Opvarmning af stabiliseringsbufferen bringer den til samme temperatur som polymerisationsblandingen.
    8. Blandingen må ikke tappes eller pipetteres, og der inkuberes yderligere ved 37 °C i 5 minutter.
    9. Bank forsigtigt på blandingen og bland den langsomt med en skrå skåret spids (200 μL kapacitet) ved hjælp af pipetten.
      BEMÆRK: Fra dette tidspunkt skal du altid håndtere mikrotubuli med en skrå snitspids for at undgå mikrotubulusklipning.
    10. Tag 10-15 μL polymeriserede mikrotubuli i en flowcelle for at kontrollere korrekt mikrotubuluspolymerisation.
      BEMÆRK: Man kan visualisere de umærkede mikrotubuli ved hjælp af en DIC-mikroskopiopsætning.
    11. Hvis mikrotubuli er koncentreret, fortyndes de i P12-buffer suppleret med 10 μM taxol.
  2. Fremstilling af motilitetsstrømcellekammer
    1. Forbered et bevægelighedskammer ved hjælp af et glasglas, dobbeltsidet tape og glasdæksel (22 mm x 30 mm).
    2. Tag et glasglas, læg en dråbe (~ 70 μL) deioniseret destilleret vand i midten og tør det af med et fnugfrit silkepapir.
    3. Skær to strimler dobbeltsidet tape (~ 35 x 3 mm) og fastgør dem fast til glasglideren parallelt, hvilket efterlader et ~ 4-5 mm mellemrum mellem to strimler for at skabe en smal passage.
    4. Tag derefter en dækslip og tilsæt en dråbe (~ 20 μL) deioniseret destilleret vand i midten. Læg en strimmel fnugfri linserensningsserviet på vanddråben, indtil det absorberer vandet. Skub den derefter langsomt mod den ene ende af dækslippet.
      BEMÆRK: Dækslet skal være helt tørt. Intet vand skal være synligt på dækslippen.
    5. Placer dækslippet på de dobbeltsidede strimler, der sidder fast på diaset, og tryk dækslippet jævnt langs strimlerne for at klæbe fast.
      BEMÆRK: Sørg for, at den rensede side af dækslikket vender mod glasrutsjebanen.
    6. Sørg for, at dette sammen skaber et smalt kammer med 10-15 μL kapacitet til udførelse af motilitetsassay (figur 4A).
  3. In vitro enkeltmolekyle motilitetsassay
    BEMÆRK: For at studere motorers mikrotubulibaserede enkeltmolekylemotilitetsegenskaber skal mikrotubuli adsorberes på dækslipoverfladen i bevægelighedskammeret.
    1. De polymeriserede taxolstabiliserede mikrotubuli fortyndes i P12-buffer suppleret med 10 μM taxol i forholdet 1:5, og blandes ved at pipettere langsomt med en skrå spids.
    2. Hold flowkammeret i skrå position (~ 15-20 °). Der ledes 30 μL fortyndet mikrotubulusopløsning gennem flowkammeret fra den øvre ende, mens der opbevares et fnugfrit silkepapir i den nedre ende for at absorbere væsken. Dette skaber en forskydningskraft til at justere mikrotubuli i strømningsretningen og hjælper med at adsorbere mikrotubuli lige og justere parallelt.
    3. Efterlad en lille dråbe væske i begge ender af kammeret, og hold strømningscellen i en omvendt position (dækslip mod bunden) i et lukket, fugtigt kammer for at forhindre tørring af bevægelighedskammeret.
    4. Lad det sidde i ~ 30 minutter, så mikrotubuli adsorberer til overfladen af dækslet inde i bevægelighedskammeret.
    5. I mellemtiden forberedes blokeringsbufferen ved at blande 500 μL P12-BSA-buffer med 5 μL 1 mM taxol.
    6. Flow 40-50 μL blokerende buffer og inkuber glideren i omvendt position i 10 minutter i et fugtigt kammer.
    7. Motilitetsblandingen fremstilles ved at pipettere følgende komponenter i et sterilt mikrocentrifugerør med en kapacitet på 500 μL i følgende rækkefølge: 25 μL P12-buffer med taxol, 0,5 μL 100 mM MgCl2, 0,5 μL 100 mM DTT, 0,5 μL 20 mg/ml glucoseoxidase, 0,5 μL 8 mg/ml katalase, 0,5 μL 2,25 m glucose og 1,0 μL 100 mM ATP.
      BEMÆRK: Fluorescensbilleddannelse er blevet anvendt i vid udstrækning til biologiske anvendelser 22,23,24,25,26. Fotoexcitation af fluorescerende proteiner genererer reaktive iltarter (ROS), som kan forårsage fotoblegning af de fluorescerende proteiner og skade på de biologiske prøver27,28. Oxygen-ådselædere såsom glucose, glucoseoxidase og katalase anvendes rutinemæssigt i motilitetsassays for at begrænse fotoskader og forlænge blegningstiden for fluorescerende proteiner.
    8. Til sidst tilsættes 1 μL af den rensede motor til ovenstående motilitetsblanding og blandes godt, inden den strømmer ind i bevægelighedskammeret.
    9. Forsegl begge ender af bevægelighedskammeret med flydende paraffinvoks og billede straks under TIRF-belysning ved hjælp af 100X TIRF-mål på 1,49 NA med 1,5x forstørrelse.
    10. For at fokusere dækslipoverfladen skal du først fokusere på en af de indvendige kanter af dobbeltsidet tape i bevægelighedskammeret under differentiel interferenskontrast (DIC) belysning.
      BEMÆRK: Den lyse og ujævne overflade vil være synlig.
    11. Flyt derefter fokus ind i bevægelighedskammeret. Brug finjustering til at fokusere dækslipoverfladen og se efter mikrotubuli, der adsorberes på dækslipoverfladen.
    12. Når mikrotubuli er fokuseret, skal du skifte til TIRF-belysning med en 488 nm excitationslaser og justere belysningsdybden ved at ændre excitationsstrålevinklen for at få den bedste og ensartede TIRF-belysning (figur 4B).
    13. Fokuser de enkelte mCitrine-mærkede motorer, der bevæger sig processuelt langs mikrotubulusoverfladen med 100 ms eksponering, og optag bevægelsen ved hjælp af et EM-CCD-kamera.
      BEMÆRK: Selvom motilitetsassays blev udført på umærkede mikrotubuli, kan z-projektionsfunktionen med maksimal intensitet bruges til at afsløre omridset af mikrotubulussporet. Fortrinsvis blev begivenheder på lange mikrotubulusspor overvejet til sporingsanalyse.
    14. Spor manuelt placeringen af de fluorescerende mærkede individuelle motorer, der går på lange mikrotubulispor ramme for ramme ved hjælp af et specialskrevet plugin i ImageJ (nih.gov) software som beskrevet tidligere29.
    15. Generer histogrammer af hastighed og kørelængde for motorpopulationen ved at plotte antallet af begivenheder i hver skraldespand. Tilpas disse histogrammer til en enkelt gaussisk topfunktion for at opnå gennemsnitshastighed og løbelængde12 (figur 4C-E).

4. In vitro mikrotubulus glidende assay

BEMÆRK: For at forstå den kollektive opførsel af kinesin-3-motorer blev in vitro mikrotubulusglidende assay udført 18,30,31. Hvor motorer er immobiliseret på dækslippet i omvendt position, og når der tilsættes mikrotubuli i kammeret, lander mikrotubuli på motorer og glider sammen, når motorerne forsøger at gå på dem (figur 5A, B).

  1. Fluorescerende mikrotubuluspolymerisation: Polymeriser mikrotubuli efter den tidligere beskrevne protokol bortset fra blanding af rhodaminmærket tubulin (3 mg / ml) med umærket tubulin (10 mg / ml) i forholdet 1: 10.
  2. Efter 30 minutters polymerisation tilsættes forsigtigt 30 μL forvarmet mikrotubulistabiliseringsbuffer og inkuberes yderligere i 5 minutter ved 37 °C.
  3. Forskydning derefter mikrotubuli ved at pipettere med kapillærbelastningsspidsen (~ 25-30 gange).
  4. Bevægelighedsflowkammeret som tidligere beskrevet forberedes, flow 50 μL Sf9-rensede GFP-nanolegemer (2,5 μL af 100 nM fortyndet i 50 μL P12-buffer) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur med dækslippet nedad i et fugtigt kammer.
    BEMÆRK: Motorerne er C-terminalt mærket med mCitrine. GFP nanobodies bruges til at immobilisere motorerne på grund af deres lave dissociationskonstant32.
  5. Dækslipoverfladen blokeres ved at strømme 50 μL blokbuffer ind i flowkammeret for at forhindre uspecifik proteinadsorption og inkuberes yderligere i 5 minutter.
  6. Forbered motorblandingen ved at pipettere 50 μL blokbuffer, 1 μL 100mM ATP og 5 μL 100 nM Sf9-rensede kinesin-3-motorer. Bland forsigtigt, inden du strømmer ind i kammeret, og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur i et fugtigt kammer.
  7. Kammeret vaskes to gange med 50 μL P12 kasein.
  8. I et sterilt mikrocentrifugerør fremstilles glideassayblandingen i følgende rækkefølge, 45 μL P12-kasein med 10 μM taxol, 1 μL 100 mM ATP, 0,5 μL 8 mg/ml katalase, 0,5 μL 20 mg/ml glucoseoxidase, 0,5 μL 2,25 M glucose og 1 μL forklippede fluorescerende mikrotubuli. Bland forsigtigt indholdet, før det strømmer ind i bevægelighedskammeret, og forsegl enderne af kammeret med flydende paraffinvoks.
  9. Billedmikrotubulus glider under TIRF-belysning ved 100 ms eksponering og tager billederne med vedhæftet EM-CCD-kamera.
    BEMÆRK: Den gennemsnitlige mikrotubulusglidehastighed blev bestemt ved manuelt at spore ca. 100 individuelle mikrotubuli ramme for ramme ved hjælp af et specialskrevet plugin i ImageJ29. Den gennemsnitlige mikrotubulusglidehastighed bestemmes ved at generere et histogram og passe til en gaussisk funktion (figur 5C,D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at udtrykke og rense aktive og funktionelle rekombinante motorproteiner i stor skala ved hjælp af Sf9-baculovirusekspressionen har systemet brug for generering af virale partikler, der stabilt bærer en kodende sekvens for at inficere Sf9-celler. For at opnå dette blev Sf9-celler transficeret med rekombinant bacmidkodning KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG. Efter 72 timer viste en signifikant population af celler ekspression af grønt fluorescerende protein (mCitrine) med forstørrede celler og kerner (figur 1 og figur 2), hvilket tyder på vellykket generering af virale partikler (P0). Disse virale partikler blev yderligere udvidet ved at inficere frisk Sf9-befolkning i et højere volumen for at generere P1-viruslagre til opbevaring og storstilet infektion. Til oprensning af kinesin-3-motor blev en 30 ml kultur af Sf9-celler inficeret med 1 ml P1 virale partikler. Efter 72 timers infektion blev celler, der stærkt udtrykte grønt fluorescerende protein, høstet, lyset og oprenset ved hjælp af C-terminal FLAG-mærkeaffinitetsrensning med anti-FLAG-antistofbelagt harpiks. Interessant nok eluerede tilsætningen af FLAG-peptid til perlerne fastgjort med kinesin-3-motorer det meste af proteinet i en enkelt fraktion, og det oprensede protein var af høj renhed, vist som et bånd på ~ 120 kDa i bane 7 i figur 3.

Den vellykkede polymerisation af lange og sunde mikrotubuli for at studere bevægelighedsegenskaberne af S9-rensede kinesin-3-motorer på et enkeltmolekyleniveau kræver rent tubulin. I denne undersøgelse blev mikrotubuli polymeriseret ved anvendelse af 2X cyclet tubulin renset fra gedehjernen i en kritisk koncentration mellem ~ 2,5-3,0 mg / ml i 30 minutter i fravær af taxol, da taxol reducerer den kritiske koncentration af mikrotubulikerne og genererer et stort antal korte mikrotubuli33,34,35 . Taxol blev tilsat efter polymerisation for at stabilisere mikrotubuli og forhindre depolymerisering. Mikrotubuli polymeriseret ved hjælp af denne metode resulterede i lange og ensartede strukturer (Video 1) med en gennemsnitlig længde på 60-70 μm.

In vitro enkeltmolekylemotilitetsanalyse af Sf9-renset kinesin-3-motor, KIF1A (1-393LZ) under TIRF-belysning (figur 4B) udviste ensrettet, hurtig og superprocessiv bevægelse langs mikrotubuli (Video 2), som vist i kymografen som lange diagonale hvide linjer (figur 4C). Sporingsanalyse af disse lange superprocessive motilitetshændelser viste en gennemsnitlig hastighed og løbelængde på henholdsvis 2,44 ± 0,02 μms-1 og 10,79 ± 0,28 μm (figur 4D-E). Disse resultater er i overensstemmelse med vores tidligere offentliggjorte data12,13 ved hjælp af motorer fremstillet af pattedyrcellelysat ved overekspression. Desuden udviste multimotorens mikrotubuli-glidende assay ved hjælp af Sf9-rensede motorer fastgjort på dækslippet under TIRF-belysning lang, ensartet og ensrettet bevægelse (figur 5C og video 3). Sporingsanalyse af disse lange mikrotubuli-svæveflyvningshændelser viste en gennemsnitlig hastighed på 1,37 ± 0,01 μms-1 (figur 5D).

Sammen tyder disse resultater på, at Sf9-baculovirus-systemet giver et fremragende system til ekspression og oprensning af aktive motorproteiner, der generelt er vanskelige ved hjælp af det prokaryote system. FLAG-tag giver en fordel ved enkelttrinsrensning af protein i sin rene form. Desuden giver mikrotubuluspolymerisation ved anvendelse af frisk og ren tubulin og deres stabilisering efter polymerisationen lange og ensartede mikrotubuli. Derudover antyder in vitro enkeltmolekylemotilitetsanalyse, at Sf9-rensede motorer var robuste og udviste bevægelighedsegenskaber svarende til motorer udtrykt i pattedyrsystemer.

Figure 1
Figur 1: 48 timer efter transfektion af Sf9-celler med fluorescerende mærket kinesin-3-motor: Sf9-celler blev belagt på en 35 mm skål med en densitet på 4,5 x 105 celler / ml. Efter 24 timer blev celler transficeret med rekombinant bacmid-DNA, der koder for specifik kinesin-3-motor, KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG ved hjælp af transfektionsreagens. Efter 48 timers transfektion blev billeder taget under differentiel interferens og kontrast (DIC) og epifluorescensbelysning. (A) Uoverførte celler, små, runde og fastgjorte. (B) Transinficerede celler, der udtrykker KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG-mærket protein, der viser forstørret cellediameter og er løst fastgjort til overfladen. Skalalinje, 100 μm. (C) Søjlediagram, der angiver gennemsnitlig cellediameter for uoverførte og transficerede celler. Fejllinjer repræsenterer middel ± SD. N = 50 celler. Elevens t-test bruges til at finde signifikansværdien (****p < 0,0001). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: 72 timer efter transfektion af Sf9-celler med fluorescerende mærket kinesin-3-motor: Billeder, der viser mere end 90% af Sf9-celler, der udtrykker fluorescerende mærket kinesin-3-motor, KIF1A (1-393LZ). Celler er løst bundet til overfladen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Sf9-renset kinesin-3-motor: Coomassie-farvet SDS-PAGE-gel, der repræsenterer Sf9-renset kinesin-3-motor, KIF1A (1-393LZ) C-terminalt mærket med 3xmCit-FLAG. Fra venstre mod højre, Proteinstige (M), BSA standard proteinkontrol, 0,2 μg (bane 2), 0,4 μg (bane 3), 0,6 μg (bane 4), 0,8 μg (bane 5) og 1,0 μg (bane 6), renset kinesin-3 motor (S) (bane 7). BSA blev brugt som standard til at estimere oprenset proteinkoncentration. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: In vitro enkeltmolekyle motilitetsassay ved hjælp af Sf9 rensede kinesin-3 motorer: (A) Skematisk flowcellemotilitetskammer fremstillet ved hjælp af et glasglas, dobbeltsidet tape og glasdæksel. (B) Tegneseriediagram, der illustrerer in vitro-enkeltmolekylebilleddannelse af fluorescerende mærkede motorer, der bevæger sig langs mikrotubulusoverfladen, adsorberet på dækslippet ved hjælp af Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) mikroskopi. Kun molekylerne meget tæt på dækslippet bliver ophidset på grund af det flygtige felt (~ 150-200 nm) dannet af fuldstændig refleksion af indfaldende lys, når de belyses i en vinkel ud over den kritiske vinkel. (C) Kymograph viser kinesin-3 motor, der går processivt (diagonale hvide linjer) langs mikrotubulusoverfladen. Tid på y-aksen (lodret pil) og afstand på x-aksen (vandret pil). (D-E) Histogrammerne af hastighed (D) og løbelængde (E) blev bestemt ved at spore individuelle motorer, der gik på mikrotubulusoverfladen ramme for ramme, og histogrammer blev plottet for hver population af motorer og passede til en enkelt gaussisk. Toppen repræsenterer gennemsnitshastigheden og løbelængden, og værdierne vises på grafen som gennemsnit ± SEM. N = Antal hændelser talt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: In vitro mikrotubulusglidningsassay ved hjælp af Sf9 rensede kinesin-3-motorer: (A) Skematisk af flowcellekammer fremstillet ved hjælp af et glasglas, dobbeltsidet tape og glasdæksel. (B) Tegneseriediagram, der illustrerer rhodaminmærkede mikrotubuli, der glider på overfladen af konstitutivt aktive kinesin-3-motorer. Da kinesin-3-motorer er C-terminalt mærket med mCitrine, blev GFP-nanobodies brugt til at fastgøre dem til glasoverfladen. Derefter blev klippede rhodaminmærkede mikrotubuli introduceret i strømningskammeret, og billeder af mikrotubulusglidende bevægelse blev fanget under TIRF-belysning. (C) Kymografen repræsenterer glat mikrotubuliglidning (diagonal hvid stribe) af kinesin-3-motorerne. Tid på y-aksen (lodret pil) og afstand på x-aksen (vandret pil). D. Histogram af hastigheden blev plottet for en population af mikrotubuli og egnet til en enkelt gaussisk top. Gennemsnitlig glidehastighed er angivet i øverste venstre hjørne som middel ± SEM. N = Antal molekyler talt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1: Polymeriserede mikrotubuli. TIRF-billeddannelse af polymeriserede mikrotubuli inden fortynding til motilitetsassay. Filmen blev erhvervet ved 100 ms eksponering, og videoen afspilles med 60 billeder / s. Vægtstang, 10 μm. Klik her for at downloade denne video.

Video 2: In vitro enkeltmolekyleassay af den konstitutivt aktive kinesin-3-motor. Fluorescerende mærkede KIF1A (1-393LZ) motorer renset fra Sf9-celler, der gradvist bevæger sig langs mikrotubulusoverfladen (umærket) adsorberet på dækslippen i et bevægelighedsanalysekammer. Billeddannelse blev udført i TIRF-belysning, og billeder blev erhvervet ved 100 ms eksponering. Video afspilles med 30 billeder/s. Vægtstang, 10 μm. Klik her for at downloade denne video.

Video 3: Microtubule glidende assay af den konstitutivt aktive kinesin-3 motor. Rhodaminmærkede mikrotubuli glider glat på overfladen af glasdækslet belagt med Sf9 renset KIF1A (1-393LZ) motor. Billeddannelse blev udført i TIRF-belysning, og billeder blev erhvervet ved 100 ms eksponering. Video afspilles med 60 billeder/s. Vægtstang, 10 μm. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende tabel 1: Buffere og reagenser sammensætning. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sf9-baculovirusekspressionssystemet er en af de mest alsidige og succesrige metoder til proteinproduktion med høj kapacitet 19,36,37. Sf9-cellernes posttranslationelle modifikationsevne er meget sammenlignelig med pattedyrsystemet15. En væsentlig ulempe ved at bruge dette system er, at det er langsomt og følsomt over for forurening. Et af de mest kritiske trin er effektiv infektion og vellykket ekspression i Sf9-celler, hvilket kræver korrekt håndtering og vedligeholdelse af Sf9-celler uden forurening. Systemet kræver dedikeret støvfri plads og instrumenter såsom en temperaturstyret inkubator og ryster. Uregelmæssig cellekulturpraksis og brug af overgroet kultur vil resultere i dårlig infektion, langsom vækst og betydelig celledød.

FLAG-tagrensningen af protein udtrykt i Sf9-celler har flere fordele. For det første kan Sf9-celler lyses effektivt for at få det meste af proteinet i sin aktive og opløselige form. For det andet har FLAG-harpiks mindre uspecifik proteinadsorption end HIS- og GST-harpiks38. Som et resultat frigives en betydelig mængde af proteinet i en enkelttrins elution i sin rene form. De Sf9-rensede kinesin-3-motorer viste robuste mikrotubuli-stimulerede ATP-omsætningshastigheder i de biokemiske ATPase-assays14. På samme måde viste disse motorer i in vitro enkeltmolekylemotilitetsassays hurtig og superprocessiv bevægelighed på overfladen af mikrotubuli. Interessant nok viste disse bevægelighedsegenskaber bemærkelsesværdig lighed med bevægelighedsegenskaberne målt ved hjælp af motorer fremstillet af pattedyrcellelysater11,12,13. Derudover svarer den målte trinhastighed for kinesin-3-motorer i in vitro-monokylemotilitetsanalysen tæt til hastigheden af ATP-hydrolyse målt i biokemisk ATPase-assay, hvilket tyder på, at motorer hydrolyserer et ATP-molekyle pr. Trin14. Tilsammen tyder disse resultater på, at kinesin3-motorer oprenset fra Sf9-baculovirusekspressionssystemet gav en signifikant stor population af aktive og opløselige proteiner. Derfor mener vi, at Sf9-baculovirus-systemet kan anvendes til at rense motorproteiner af interesse med nødvendige ændringer.

In vitro enkeltmolekyle motilitetsassay af kinesin-3-motorer, der udviser superprocessiv motilitet, har brug for polymerisation af lange polymeriserede mikrotubuli. Et kritisk trin i in vitro-polymerisation af lange mikrotubuli er at fremstille en polymerisationsblanding med kritisk tubulinkoncentration, inkubationstid og passende buffer-pH. Tubulinet, der anvendes til mikrotubulipolymerisation, skal være yderst kompetent, rent og opbevares i flydende nitrogen i små alikvoter for at undgå frysning og optøning. Tubulin, når det er optøet, bør ikke fryses tilbage til fremtidig polymerisation, fordi tubulin mister sin kompetence betydeligt i hver fryse-optøningscyklus. Inkompetent tubulin vil ikke bidrage til mikrotubuluspolymerisationen, men vil hindre polymerisationsprocessen og resultere i korte mikrotubuli med ukendte defekter. Den optimale tubulinkoncentration i polymerisationsblandingen skal være mellem 2,5-3 mg/ml, og blandingen skal opbevares på is i 5 minutter, før den inkuberes ved 37 °C til polymerisation. Varigheden af mikrotubuli polymerisation bør være mellem 20-30 min og bør ikke overstige 30 min, da langvarig polymerisation ofte resulterer i dannelse af korte og fragmenterede mikrotubuli.

Dernæst er stabilisering af polymeriserede mikrotubuli et andet kritisk trin. Taxol er dårligt opløseligt i vand og udfældes i en vandig opløsning39. Forbered derfor stabiliseringsbufferen frisk med 10 μM taxol, tilsæt forsigtigt over den polymeriserede mikrotubuliblanding og inkuber yderligere uden at forstyrre. Brug altid frosne taxol aliquot fra fryseren -20 °C til at forberede stabiliseringsbufferen, da optøet aliquot resulterer i udfældning/aggregering af polymeriserede mikrotubuli. Håndter altid de polymeriserede mikrotubuli ved hjælp af skrå spidser for at undgå brud. Mikrotubuli polymeriseret ved hjælp af denne metode giver lange mikrotubuli med 60-70 μm lang egnet til superprocessiv motilitetsanalyse. Det næste kritiske trin er den stabile adsorption af mikrotubuli til dækslipoverfladen i bevægelighedskammeret. For at opnå dette skal dækslips opbevares på et tørt sted, fordi eksponering af dækslips for det fugtige miljø reducerer mikrotubuliadsorptionseffektiviteten og deres stabilitet betydeligt.

Forberedelse af en motilitetsassayblanding med korrekte ingredienser i bestemte koncentrationer og optimal motorisk proteinkoncentration er vigtig for at opnå robuste motilitetshændelser langs mikrotubulusoverfladen. Den mest afgørende komponent til generering af glat og processiv bevægelighed er at bruge en stabil ATP-opløsning i analyseblandingen. (Der skal således udvises forsigtighed under forberedelsen af ATP-aktien. Opløsning af natriumsaltet af ATP i 10 mM PIPES buffer pH 6,9 giver en klar opløsning med en meget lav pH. ATP er ekstremt ustabil ved lav pH og hydrolyserer hurtigt til ADP og fosfat, hvilket holder opløsningen kold og straks justerer pH til 7,0 ved hjælp af koncentreret KOH forhindrer hydrolyse.) Flow motilitetsblandingen ind i flowcellen, og forsegl begge kanter med flydende paraffin for at forhindre væskestrøm og tørring af kammeret under billeddannelse under TIRF-belysning.

Da kinesin-3-motorer er hurtige og superprocessive langs mikrotubulussporene, udgør deres billeddannelse, dataindsamling og analyse flere udfordringer. Enkeltmolekylebilleddannelse og dataindsamling bør udføres under lav laserintensitet for at forhindre fotoblegning af fluorescerende proteiner, før motoren afslutter sin processive kørsel. De indsamlede data ville være af lav intensitet med dårligt signal/støj-forhold. Derfor ville det være vanskeligt at spore disse individuelle motilitetshændelser ved hjælp af eksisterende automatiseret sporingssoftware til at karakterisere deres motilitetshændelser. Derfor skal dataanalyse udføres manuelt ved nøjagtigt at spore fluorescerende mærkede motorpletter, der bevæger sig langs mikrotubulussporene ramme for ramme med minimale fejl. Til dataanalyse skal du fortrinsvis vælge bevægelighedshændelserne på de lange mikrotubulusspor for at undgå, at motorer når mikrotubulærenden, før de afslutter deres løb. For ensartede og reproducerbare resultater skal du kun overveje de bevægelighedshændelser til sporing af mindst de sidste 10 billeder (500 ms) med en klar start og slutning af den processive kørsel.

Samlet set giver metoden flere fordele i forhold til den eksisterende metode, såsom enkel og et-trins oprensning af aktive motorproteiner, fremstilling af lange mikrotubuli og detaljeret trin-for-trin protokol med instruktioner for at opnå god bevægelighed. I princippet kan metoden anvendes til at udtrykke og rense enhver klasse og type proteiner, herunder men ikke begrænset til myosin, kinesin og dynein. Faktisk er baculovirusekspressionssystemet blevet etableret med succes for at rense flere virale vacciner, genterapivektorer og andre farmaceutiske proteiner20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser at erklære.

Acknowledgments

VS og P.S. takker prof. Kristen J. Verhey (University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA) og prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, Indien) for deres ubetingede støtte gennem hele undersøgelsen. P.S. takker Dr. Sivapriya Kirubakaran for hendes støtte gennem hele projektet. VS anerkender finansiering gennem DBT (tilskudsnr.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 og BT/RLF/Re-entry/45/2015) og DST-SERB (tilskudsnr.: ECR/2016/000913). P.K.N anerkender ICMR til finansiering (tilskud nr. 5/13/13/2019 / NCD-III). P.S. anerkender finansiering fra DST (tilskudsnr.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S anerkender fællesskab fra IIT Gandhinagar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinity Biolegend 651502 For protein purification
Aprotinin Sigma A6279 For protein purification
Cellfectin Invitrogen 10362100 For Sf9 transfection
DTT Sigma D5545 For motility assays and protein purification
FLAG peptide Sigma F3290 For protein purification
Glycerol Sigma G5516 To freeze the protein
HEPES Sigma H3375 For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630 Sigma I8896 For Sf9 lysis buffer
KCl Sigma P9541 For buffers preparation
Leupeptin Sigma L2884 For protein purification
MgCl2 Sigma M2670 For buffers preparation
NaCl Sigma S7653 For preparing lysis buffer
PMSF Sigma P7626 For protein purification
Sf9 cells Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottles Thermo Scientific 4115-0125 For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X) Thermo Scientific 10902-096 -500ml For culturing Sf9 cells
Sucrose Sigma S1888 Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s media Thermo Scientific 11595030 -500ml For Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATP Sigma A2647 For motility and gliding assay
BSA Sigma A2153 For blocking motility chamber
Catalase Sigma C9322 For motility and gliding assay
DMSO Sigma D5879 For dissolving Rhodamine
EGTA Sigma 3777 For preparing buffers
Glucose Sigma G7021 For motility and gliding assay
Glucose oxidase Sigma G2133 For motility and gliding assay
GTP Sigma G8877 For microtubule polymerization
KOH Sigma P1767 Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPES Sigma P6757 For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needle Dispovan For shearing microtubules
Casein Sigma C3400 For microtubule glidning assay
GFP nanobodies Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) For attaching motors to the coverslip
Rhodamine Thermo Scientific 46406 For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tips Eppendorf For Sf9 culture and purification
15ml concal tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
35mm cell culture dish Cole Palmer 15179-39 For Sf9 culture
Balance Sartorious 0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubator REMI For Sf9 suspenculture at 28oC
Camera EMCCD Andor iXon Ultra 897 For TIRF imaging and acquesition
Double sided tape Scotch For making motility chamber
Glass coverslip Fisherfinest 12-548-5A size; 22X30
Glass slide Blue Star For making motility chamber
Heating block Neuation Dissolving paraffin wax
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti- U To check protein expression
Lasers 488nm (100mW) For TIRF imaging
Liquid nitrogen For sample freezing and storage
Microcapillary loading tip Eppendorf EP022491920 For shearing microtubules
Microscope Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up For TIRF imaging
Mini spin Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd For quick spin
Objective 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion For TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XE Beckman Coulter For protein purification
Parafilm Eppendorf
pH-meter Corning Coring 430 To adjust pH
Pipette-boy VWR For Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21 Thermo Scientific For protein purification
Sorvall ST8R centrifuge Thermo Scientific Protein purification
ThermoMixer Eppendorf For microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotor Beckman coulter SW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubes Beckman 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixer Neuation Sample mixing
Wax Sigma V001228 To seal motility chamber

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A. Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. Kumar, D., Gong, C. , Springer International Publishing. 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Tags

Biokemi udgave 185
Enkeltmolekyleanalyse af Sf9 rensede superprocessive Kinesin-3-familiemotorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soppina, P., Shewale, D. J., Naik,… More

Soppina, P., Shewale, D. J., Naik, P. K., Soppina, V. Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors. J. Vis. Exp. (185), e63837, doi:10.3791/63837 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter