Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Single-Molecule Analyse van Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motoren

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/63837
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1
1Discipline of Biological Engineering, Indian Institute of Technology Gandhinagar, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Sambalpur University

Summary

Deze studie beschrijft de zuivering van KIF1A (1-393LZ), een lid van de kinesine-3-familie, met behulp van het Sf9-baculovirusexpressiesysteem. In vitro single-molecule en multi-motor zweefanalyse van deze gezuiverde motoren vertoonde robuuste motiliteitseigenschappen vergelijkbaar met motoren van zoogdiercellysaat. Sf9-baculovirussysteem is dus vatbaar voor expressie en zuivering van motoreiwit van belang.

Abstract

Een complexe cellulaire omgeving vormt een uitdaging voor de analyse van de beweeglijkheid van één molecuul. De vooruitgang in beeldvormingstechnieken heeft echter studies met één molecuul verbeterd en is enorm populair geworden bij het detecteren en begrijpen van het dynamische gedrag van fluorescerende moleculen. Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor in vitro single-molecule studies van kinesine-3 familie motoren met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie. Kinesine-3 is een grote familie die een cruciale rol speelt in cellulaire en fysiologische functies, variërend van intracellulair vrachttransport tot celdeling tot ontwikkeling. We hebben eerder aangetoond dat constitutief actieve dimerische kinesine-3-motoren een snelle en superprocessieve motiliteit vertonen met een hoge microtubule-affiniteit op het niveau van één molecuul met behulp van cellysaten die worden bereid door motor in zoogdiercellen tot expressie te brengen. Ons laboratorium bestudeert kinesine-3-motoren en hun regulerende mechanismen met behulp van cellulaire, biochemische en biofysische benaderingen, en dergelijke studies vereisen gezuiverde eiwitten op grote schaal. Expressie en zuivering van deze motoren met behulp van zoogdiercellen zou duur en tijdrovend zijn, terwijl expressie in een prokaryote expressiesysteem resulteerde in significant geaggregeerd en inactief eiwit. Om de beperkingen van bacteriële zuiveringssystemen en zoogdiercellysaat te overwinnen, hebben we een robuust Sf9-baculovirusexpressiesysteem opgezet om deze motoren tot expressie te brengen en te zuiveren. De kinesine-3 motoren zijn C-terminal gelabeld met 3-tandem fluorescerende eiwitten (3xmCitirine of 3xmCit) die zorgen voor verbeterde signalen en verminderde fotobleaching. In vitro single-molecule en multi-motor gliding analyse van Sf9 gezuiverde eiwitten tonen aan dat kinesine-3 motoren snel en superprocessief zijn, vergelijkbaar met onze eerdere studies met behulp van zoogdiercellysaten. Andere toepassingen die deze assays gebruiken, omvatten gedetailleerde kennis van oligomeercondities van motoren, specifieke bindingspartners die parallel lopen met biochemische studies en hun kinetische toestand.

Introduction

Een immens drukke celomgeving brengt veel uitdagingen met zich mee bij het sorteren van voorbestemde eiwitten en moleculen. Deze intense werklast van organisatie en spatiotemporale verdeling van moleculen in het cytoplasma wordt vergemakkelijkt door moleculaire motoren en cytoskeletale sporen. Moleculaire motoren zijn de enzymen die de energievaluta's zoals ATP hydrolyseren en die energie gebruiken tijdens beweging en krachtgeneratie1. Op basis van de aminozuursequentieovereenkomst worden kinesines gegroepeerd in 14 families en ondanks deze gelijkenis draagt elke motor uniek bij aan het functioneren van een cel. Kinesine-3-familiemotoren vormen een van de grootste, bestaande uit vijf subfamilies (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 en KIF28)2, geassocieerd met diverse cellulaire en fysiologische functies, waaronder blaasjestransport, signalering, mitose, nucleaire migratie en ontwikkeling 3,4,5. Stoornissen in kinesine-3 transportfunctie impliceren in veel neurodegeneratieve aandoeningen, ontwikkelingsstoornissen en kankerziekten 6,7,8,9.

Recent werk heeft aangetoond dat kinesine-3-motoren monomeren zijn, maar door lading geïnduceerde dimerisatie ondergaan en resulteren in een snelle en superprocessieve beweeglijkheid in vergelijking met conventionele kinesine 10,11,12,13. Hun biochemische en biofysische karakterisering heeft een grote hoeveelheid gezuiverde, actieve eiwitten nodig. Hun productie in het prokaryote expressiesysteem resulteerde echter in inactieve of geaggregeerde motoren, vermoedelijk als gevolg van incompatibele eiwitsynthese-, vouw- en modificatiemachines 14,15,16,17,18. Om dergelijke beperkingen te omzeilen en de opbrengst te verhogen, hebben we hier een robuust Sf9-baculovirusexpressiesysteem opgezet om deze motoren tot expressie te brengen en te zuiveren.

Het baculovirusexpressiesysteem gebruikt Sf9-insectencellijnen als gastheersysteem voor high-throughput eukaryote recombinante eiwitexpressie19,20. Baculovirus bezit een sterke polyhedrinepromotor die helpt bij heterologe genexpressie en de productie van oplosbare recombinante eiwitten17. Vanwege de kosteneffectiviteit, veilig te hanteren en de hoge hoeveelheid actieve eiwitexpressie, is het een krachtig hulpmiddel geworden21. Om een eiwit van belang uit te drukken, is een belangrijke stap het genereren van een recombinant bacmide. Omdat de commercieel verkrijgbare bacmidegeneratoren duur zijn en we met meer monsters zullen werken, hebben we een intern protocol ontwikkeld voor zowel grote als kleine inserts van kinesine-3-motoren in bacmiden. Sf9-gezuiverde kinesine-3-motoren werden gebruikt om in vitro single-molecule en multi-motor microtubule gliding eigenschappen te karakteriseren met behulp van total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie. Motoren zijn C-terminaal gelabeld met 3-tandem fluorescerende moleculen (3xmCit) om verbeterd signaal en verminderde fotobleaching te bieden. Vanwege de verhoogde signaal-ruisverhouding, minder fototoxiciteit en selectieve beeldvorming van een zeer klein gebied dicht bij de coverslip, is TIRF-beeldvorming op grote schaal gebruikt om eiwitdynamica op het niveau van één molecuul in vivo en in vitro te visualiseren.

Deze studie bespreekt de zuivering van kinesine-3-motoren door gebruik te maken van sf9-baculovirusexpressiesysteem en in vitro single-molecule imaging en multi-motor zweefanalyse van motoren met behulp van TIRF-microscopie. Al met al toont deze studie aan dat de beweeglijkheidseigenschappen van Sf9-gezuiverde motoren identiek zijn aan die van motoren bereid uit zoogdiercellysaten. Daarom geloven we dat het Sf9-baculovirussysteem kan worden aangepast om elk motoreiwit van belang tot expressie te brengen en te zuiveren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sf9-cultuur, transfectie en virusgeneratie

OPMERKING: Onderhoud Sf9-cellen in 30 ml Sf-900 / SFM-medium in 100 ml steriele, wegwerpbare conische kolf zonder antibioticum / antimycotisch bij 28 ° C. Houd de ophangingscultuur in een orbitale shaker op 90 rpm. Toevoer van CO2 en vochtigheidsonderhoud is niet vereist. Cellen worden meestal elke vierde dag gesubcultureerd door 0,5 x 106 cellen / ml in te enten om op de vierde dag 2,0 x 106 cellen / ml dichtheid te bereiken.

  1. P0-virusvoorraadgeneratie
    1. Voor transfectie, zaadcellen in een schaal van 35 mm met 4,5 x 105 cellen / ml samenvloeiing en handhaven op 28 ° C zonder schudden.
    2. Na 24 uur, zodra cellen zijn bevestigd en er gezond uitzien, gaat u verder met transfectie zoals hieronder beschreven.
      1. Buis A: Meng 1 μg bacmide DNA dat codeert voor constitutief actieve KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG specifieke kinesine-3 motor met 100 μL niet-aangevulde Grace's media.
      2. Buis B: Meng 6 μL transfectiereagens met 100 μL niet-aangevulde Grace-media.
      3. Breng de inhoud van buis A voorzichtig over in buis B en meng grondig door op en neer te pipetteren (ongeveer 20 keer).
      4. Incubeer het mengsel gedurende ~ 45 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Voeg na het voltooien van de incubatie 0,8 ml niet-aangevulde Grace-media toe aan het bovenstaande mengsel en meng langzaam door te pipetteren.
    4. Adem de Sf-900/SFM-media voorzichtig uit cellen (om eventuele sporen van serum te verwijderen die de transfectie-efficiëntie kunnen beïnvloeden).
    5. Voeg het transfectiemengsel uit stap 1.1.3 druppelsgewijs toe aan de bovenkant van de cellen en incubeer de plaat gedurende 6 uur bij 28 °C.
    6. Verwijder na de incubatie voorzichtig het transfectiemengsel, voeg 2 ml Sf-900/SFM-media toe en incubeer verder gedurende 48 uur bij 28 °C.
    7. Controleer op de expressie van het motoreiwit onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Het motoreiwit is gelabeld met een fluorescerend eiwit, mCitrine, een variant van geel fluorescerend eiwit.
      OPMERKING: Getransfecteerde cellen werden gevisualiseerd onder een omgekeerde microscoop uitgerust met differentieel interferentiecontrast (DIC) en epifluorescentieverlichting met een 20x objectief (200 keer vergroting), kwiklamp en een EM-CCD-camera. Controleer de efficiëntie van virusgeneratie en infectie door de expressie van mCitrien-gelabelde motoren in cellen te controleren door middel van mCitrien-excitatie en emissiefilterkubus. Controleer daarnaast op morfologische veranderingen van geïnfecteerde cellen, zoals vergrote cellen/kernen (figuur 1A-C).
    8. Nogmaals, controleer de cellen 72 h na infectie. Meestal beginnen cellen los te komen van het oppervlak (figuur 2).
    9. Als >5% van de cellen loskomt van het oppervlak, oogst de media met geïnfecteerde cellen in 1,5 ml steriele microcentrifugebuizen en spin gedurende 5 minuten bij 500 x g.
    10. Verzamel het supernatant en snap vries aliquots van 1 ml in vloeibare stikstof en bewaar als P0-voorraad bij -80 °C of gebruik het om P1-virusvoorraad te genereren.
  2. Generatie van P1-virusvoorraden
    1. Om de P0 baculovirus-voorraad verder te versterken en de eiwitexpressie te bevestigen, kweekt u Sf9-cellen in vloeibare suspensiecultuur.
    2. Voeg in een steriele erlenmeyer van 100 ml 10 ml Sf-900 / SFM-media toe met een celdichtheid van 2 x 106 cellen / ml en 1 ml P0-virusvoorraad. Incubeer bij 28 °C met constant schudden bij 90 tpm.
    3. Controleer na 72 uur infectie op de eiwitexpressie zoals eerder beschreven (stap 1.1.7). Als de eiwitexpressie goed is (>90% van de cellen vertoont een helder mCitrien fluorescentiesignaal) en significante celdood vertoont (ongeveer 10% -15%), draai dan de cellen in een steriele conische buis van 15 ml bij 500 x g gedurende 5 minuten.
    4. Verzamel het supernatant, vries aliquots van 1 ml (P1-bouillon) in vloeibare stikstof en bewaar het bij -80 °C of ga over tot grootschalige infectie en eiwitzuivering.
  3. Grootschalige infectie
    1. Infecteer voor grootschalige eiwitexpressie 30 ml van de suspensiecultuur bij 2 x 106 cellen / ml dichtheid met 1 ml P1-virusvoorraad en incubeer bij 28 ° C met constant schudden bij 90 tpm.
    2. Controleer na ~ 72 uur na infectie op de eiwitexpressie (in het algemeen wordt maximale eiwitexpressie bereikt tussen 65-75 uur na infectie).
    3. Als >90% van de cellen een helder fluorescerend signaal vertonen met minimale celdood (<5%), verzamel de cellen dan in een steriele conische buis van 50 ml en draai gedurende 15 minuten bij 500 x g bij 4 °C.
      OPMERKING: Er moet minimale celdood (<5%) zijn, omdat dode cellen de cellulaire inhoud in de media vrijgeven, wat leidt tot verlies van uitgedrukt eiwit.
    4. Gooi het supernatant weg, verzamel de celpellet en ga verder met eiwitzuivering.

2. Sf9 zuivering van kinesine-3 motoren

  1. Voeg aan de bovenstaande celpellet 3 ml ijskoude lysisbuffer (aanvullende tabel 1) toe, vers aangevuld met 5 mM DTT, 5 μg / ml aprotinine, 5 μg / ml leupeptine en 5 μg / ml PMSF en lyseer de cellen door 20-25 keer te pipetteren zonder luchtbellen te genereren. Voor alle buffersamenstellingen en reagentia wordt verwezen naar aanvullende tabel 1.
  2. Laat de cel lyseren op 150.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  3. Verzamel het supernatant in een verse, steriele buis en meng met ~40 μL 50% anti-FLAG M2 affiniteitshars. Incubeer het mengsel gedurende 3 uur bij 4 °C met end-to-end tuimelen.
  4. Pelleteer na incubatie de FLAG-hars door gedurende 1 min bij 4 °C op 500 x g te draaien. Zuig het supernatant voorzichtig aan zonder de pellet te verstoren met een naald van 26 G en gooi het weg.
  5. Was de FLAG-harskorrel driemaal met ijskoude wasbuffer (aanvullende tabel 1) vers aangevuld met 2 mM DTT, 5 μg/ml aprotinine, 5 μg/ml leupeptine en 5 μg/ml PMSF. Pelleteer de kralen door in elke wasbeurt gedurende 1 min bij 4 °C op 500 x g te draaien.
  6. Giet na de derde wasbeurt de wasbuffer voorzichtig zoveel mogelijk af zonder de pellet te storen. Voeg voor eiwitelutie ~70 μL wasbuffer met 100 μg/ml FLAG-peptide toe aan de harspellet en incubeer 's nachts bij 4 °C met end-to-end tuimelen.
  7. Draai de hars de volgende dag op 500 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Verzamel het supernatant met gezuiverd eiwit in een verse buis en vul aan met 10% glycerol. Vries aliquots van 5 μL in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik.
  8. Voer de SDS-PAGE-gel uit om de eiwitconcentratie en -opbrengst te bepalen. Samen met gezuiverd eiwit van belang, een standaard eiwitcontrole, worden BSA van bekende concentraties variërend van 0,2 μg, 0,4 μg, 0,6 μg, 0,8 μg en 1 μg geladen om een standaardcurve te genereren. Kleur de gel met Coomassie Brilliant blue (Figuur 3).
  9. Analyseer de gel met behulp van een ingebouwde gelkwantificeringstool in ImageJ-software. Meet eerst de bandintensiteit van bekende BSA-concentraties en genereer de standaardcurve. Meet vervolgens de intensiteit van de gezuiverde eiwitband en bepaal de eiwitconcentratie. Om dit te doen, opent u de Image J-software, klikt u op de optie Analyseren in de menubalk en selecteert u Gels in het vervolgkeuzemenu.

3. In vitro single-molecule motiliteitstest met behulp van Sf9-gezuiverde kinesine-3 motoren

OPMERKING: De Sf9-gezuiverde kinesine-3-motoren kunnen worden gebruikt om biochemische en biofysische eigenschappen te bestuderen, zoals ATP-omloopsnelheid, microtubule-affiniteit, snelheid, looplengte, stapgrootte en krachtgeneratie. Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor in vitro single-molecule motiliteitsanalyse van KIF1A (1-393LZ) met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie. Voor alle samenstelling van buffers en reagentia wordt verwezen naar aanvullende tabel 1.

  1. Microtubule polymerisatie
    1. Bereid in een voorgekoelde microcentrifugebuis van 0,5 ml een polymerisatiemengsel door pipetteer in de volgende volgorde: 12,0 μL BRB80-buffer, pH 6,9; 0,45 μL van 100 mM MgCl2, 1 μL van 25 mM GTP.
    2. Neem een aliquot van 10 mg/ml tubuline van 10 mg/ml, opgeslagen in vloeibare stikstof, ontdooi onmiddellijk en voeg toe aan het bovenstaande polymerisatiemengsel. Meng voorzichtig door 2-3 keer te pipetteren zonder luchtbellen te creëren.
      OPMERKING: Voer de bovenstaande stappen snel en strikt op ijs uit.
    3. Laat het bovenstaande mengsel 5 minuten op ijs staan.
      OPMERKING: Dit is een cruciale stap om denaturering van tubuline te voorkomen of om de vorming van korte microtubulizaden te voorkomen.
    4. Breng de buis over in een voorverwarmd warmteblok/waterbad van 37 °C en incubeer gedurende 30 minuten voor polymerisatie van microtubuli.
    5. Terwijl microtubuli polymeriseren, ontdooit u een aliquot P12-buffer en brengt u deze op kamertemperatuur.
    6. Voordat u 30 minuten incubatie voltooit, begint u met het voorbereiden van de MT-stabilisatiebuffer door 100 μL P12-buffer in een verse microcentrifugebuis te pipetteren. Voeg hieraan 1 μL 1 mM taxol toe en vortex het mengsel onmiddellijk.
      OPMERKING: Begin ongeveer 5 minuten voordat u de incubatie voltooit met het voorbereiden van de MT-stabilisatiebuffer in stap 3.1.4. Taxol stabiliseert de gepolymeriseerde microtubuli door zich te binden aan β-tubuline.
    7. Verwarm de stabilisatiebuffer van de microtubuli gedurende 2-3 minuten bij 37 °C en voeg deze voorzichtig toe aan de gepolymeriseerde microtubuli zonder het polymerisatiemengsel aan de onderkant te verstoren.
      OPMERKING: Het opwarmen van de stabilisatiebuffer brengt deze op dezelfde temperatuur als het polymerisatiemengsel.
    8. Tik of pipetteer het mengsel niet en incubeer verder bij 37 °C gedurende 5 min.
    9. Tik voorzichtig op het mengsel en meng het met een afgeschuinde gesneden punt (200 μL capaciteit) langzaam met behulp van de pipet.
      OPMERKING: Hanteer vanaf dit punt microtubuli altijd met een afgeschuinde gesneden punt om microtubule-afschuiving te voorkomen.
    10. Neem 10-15 μL gepolymeriseerde microtubuli in een stroomcel om de juiste microtubulepolymerisatie te controleren.
      OPMERKING: Men kan de ongelabelde microtubuli visualiseren met behulp van een DIC-microscopie-opstelling.
    11. Als microtubuli geconcentreerd zijn, verdun ze dan in P12-buffer aangevuld met 10 μM taxol.
  2. Voorbereiding van de motiliteitsstroomcelkamer
    1. Bereid een motiliteitskamer voor met een glazen schuif, dubbelzijdige tape en glazen afdekplaat (22 mm x 30 mm).
    2. Neem een glazen dia, plaats een druppel (~ 70 μL) gedeïoniseerd gedestilleerd water in het midden en veeg het af met een pluisvrij tissuepapier.
    3. Snijd twee stroken dubbelzijdige tape (~ 35 x 3 mm) en plak ze stevig parallel aan de glasschuif, waardoor een opening van ~ 4-5 mm tussen twee stroken overblijft om een smalle doorgang te creëren.
    4. Neem vervolgens een coverslip en voeg een druppel (~ 20 μL) gedeïoniseerd gedestilleerd water toe in het midden. Leg een strook pluisvrij lensreinigingspapier op de waterdruppel totdat het het water absorbeert. Schuif het vervolgens langzaam naar het ene uiteinde van de coverslip.
      LET OP: De coverslip moet volledig droog zijn. Er mag geen water zichtbaar zijn op de coverlip.
    5. Plaats de coverslip op de dubbelzijdige strips die op de glijbaan zijn geplakt en druk de coverslip gelijkmatig langs de strips om stevig te plakken.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de gereinigde kant van de coverlip naar de glazen schuif is gericht.
    6. Zorg ervoor dat dit samen een smalle kamer van 10-15 μL capaciteit creëert voor het uitvoeren van motiliteitstest (figuur 4A).
  3. In vitro single-molecule motiliteitstest
    OPMERKING: Om de op microtubule gebaseerde motiliteitseigenschappen van motoren met één molecuul te bestuderen, moeten microtubuli worden geadsorbeerd op het coverslipoppervlak in de motiliteitskamer.
    1. Verdun de gepolymeriseerde taxol-gestabiliseerde microtubuli in P12-buffer aangevuld met 10 μM taxol in 1:5 verhoudingen en meng door langzaam te pipetteren met een afgeschuinde punt.
    2. Houd de stromingskamer schuin (~15-20°). Laat 30 μL verdunde microtubule-oplossing door de stroomkamer stromen vanaf het bovenste uiteinde, terwijl een pluisvrij tissuepapier aan het onderste uiteinde wordt gehouden om de vloeistof te absorberen. Dit creëert een schuifkracht om de microtubuli in de stroomrichting uit te lijnen en helpt de microtubuli recht en parallel uit te lijnen.
    3. Laat een kleine druppel vloeistof aan beide uiteinden van de kamer achter en houd de stroomcel in een omgekeerde positie (deklip naar de bodem) in een gesloten, vochtige kamer om uitdroging van de motiliteitskamer te voorkomen.
    4. Laat het ~ 30 minuten zitten, zodat microtubuli adsorberen aan het oppervlak van de coverslip in de motiliteitskamer.
    5. Bereid ondertussen de blokkerende buffer voor door de 500 μL P12-BSA-buffer te mengen met 5 μL 1 mM taxol.
    6. Laat 40-50 μL blokkerende buffer stromen en incubeer de glijbaan in omgekeerde positie gedurende 10 minuten in een vochtige kamer.
    7. Bereid het motiliteitsmengsel door de volgende componenten in een steriele microcentrifugebuis met een capaciteit van 500 μL te pipetteren in de volgende volgorde: 25 μL P12-buffer met taxol, 0,5 μL van 100 mM MgCl2, 0,5 μL van 100 mM DTT, 0,5 μL 20 mg/ml glucoseoxidase, 0,5 μL 8 mg/ml Catalase, 0,5 μL van 2,25 M Glucose en 1,0 μL van 100 mM ATP.
      OPMERKING: Fluorescentie beeldvorming is op grote schaal gebruikt voor biologische toepassingen 22,23,24,25,26. Foto-excitatie van fluorescerende eiwitten genereert reactieve zuurstofsoorten (ROS), die fotobleaching van de fluorescerende eiwitten en schade aan de biologische monsters kunnen veroorzaken27,28. Zuurstofvangers zoals glucose, glucoseoxidase en catalase worden routinematig gebruikt in motiliteitstests om fotoschade te beperken en de bleektijd van fluorescerende eiwitten te verlengen.
    8. Voeg ten slotte 1 μL van de gezuiverde motor toe aan het bovenstaande beweeglijkheidsmengsel en meng goed voordat het in de motiliteitskamer stroomt.
    9. Sluit beide uiteinden van de motiliteitskamer af met vloeibare paraffine en beeld onmiddellijk onder TIRF-verlichting met behulp van 100X TIRF-objectief van 1,49 NA met 1,5x vergroting.
    10. Om het oppervlak van de coverslip scherp te stellen, moet u eerst focussen op een van de binnenranden van dubbelzijdige tape in de motiliteitskamer onder differentiële interferentiecontrast (DIC) verlichting.
      OPMERKING: Het heldere en ongelijke oppervlak zal zichtbaar zijn.
    11. Verplaats vervolgens de focus naar de beweeglijkheidskamer. Met behulp van fijnafstelling, focus het coverslip-oppervlak en zoek naar de microtubuli die op het coverslipoppervlak zijn geadsorbeerd.
    12. Zodra de microtubuli zijn scherpgesteld, schakelt u over naar TIRF-verlichting met een excitatielaser van 488 nm en past u de verlichtingsdiepte aan door de excitatiestraalhoek te wijzigen om de beste en uniforme TIRF-verlichting te krijgen (figuur 4B).
    13. Focus de individuele mCitrine-gelabelde motoren die processief langs het microtubule-oppervlak bewegen met een belichting van 100 ms en neem de beweging op met behulp van een EM-CCD-camera.
      OPMERKING: Hoewel de motiliteitstests werden uitgevoerd op ongelabelde microtubuli, kan de maximale intensiteit z-projectiefunctie worden gebruikt om de omtrek van de microtubule-track te onthullen. Bij voorkeur werden gebeurtenissen op lange microtubulesporen overwogen voor trackinganalyse.
    14. Volg handmatig de positie van de fluorescerend gelabelde individuele motoren die frame voor frame op lange microtubule-tracks lopen met behulp van een op maat geschreven plug-in in ImageJ (nih.gov) -software zoals eerder beschreven29.
    15. Genereer de histogrammen van snelheid en looptijd voor de motorpopulatie door het aantal gebeurtenissen in elke bak uit te zetten. Pas deze histogrammen aan op een enkele Gaussische piekfunctie om de gemiddelde snelheid en looptijd12 te verkrijgen (figuur 4C-E).

4. In vitro microtubule gliding assay

OPMERKING: Om het collectieve gedrag van kinesine-3-motoren te begrijpen, werd in vitro microtubule gliding assay uitgevoerd 18,30,31. Waar motoren in omgekeerde positie op de coverslip worden geïmmobiliseerd en bij het toevoegen van microtubuli in de kamer, landen microtubuli op motoren en glijden ze mee terwijl de motoren erop proberen te lopen (figuur 5A, B).

  1. Fluorescerende microtubule polymerisatie: Polymeriseer de microtubuli volgens het eerder beschreven protocol, behalve voor het mengen van rhodamine gelabeld tubuline (3 mg / ml) met ongelabeld tubuline (10 mg / ml) in een verhouding van 1: 10.
  2. Voeg na 30 minuten polymerisatie voorzichtig 30 μL voorverwarmde microtubulistabilisatiebuffer toe en incubeer verder gedurende 5 minuten bij 37 °C.
  3. Schuif vervolgens de microtubuli door te pipetteren met de capillaire laadpunt (~ 25-30 keer).
  4. Bereid de motiliteitsstroomkamer voor zoals eerder beschreven, laat 50 μL Sf9-gezuiverde GFP-nanolichamen stromen (2,5 μL van 100 nM verdund in 50 μL P12-buffer) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met de deklip naar beneden gericht in een vochtige kamer.
    OPMERKING: De motoren zijn C-terminaal gelabeld met mCitrine. GFP nanobodies worden gebruikt om de motoren te immobiliseren vanwege hun lage dissociatieconstante32.
  5. Blokkeer het afdekvlak door 50 μL blokbuffer in de stroomkamer te laten stromen om niet-specifieke eiwitadsorptie te voorkomen en incubeer verder gedurende 5 minuten.
  6. Bereid het motormengsel voor door 50 μL blokbuffer, 1 μL 100mM ATP en 5 μL 100 nM Sf9-gezuiverde kinesine-3 motoren te pipetteren. Meng voorzichtig voordat je in de kamer stroomt en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige kamer.
  7. Was de kamer tweemaal met 50 μL P12 caseïne.
  8. Bereid in een steriele microcentrifugebuis het glijdende testmengsel in de volgende volgorde: 45 μL P12-caseïne met 10 μM taxol, 1 μL 100 mM ATP, 0,5 μL 8 mg/ml catalase, 0,5 μL 20 mg/ml glucoseoxidase, 0,5 μL 2,25 M glucose en 1 μL geschoren fluorescerende microtubuli. Meng de inhoud voorzichtig voordat u in de motiliteitskamer stroomt en sluit de uiteinden van de kamer af met vloeibare paraffinewas.
  9. Beeld microtubuli glijden onder TIRF-verlichting bij 100 ms belichting en leg de beelden vast met de aangesloten EM-CCD camera.
    OPMERKING: De gemiddelde microtubule glijsnelheid werd bepaald door handmatig ongeveer 100 individuele microtubuli frame voor frame te volgen met behulp van een op maat geschreven plug-in in ImageJ29. Bepaal de gemiddelde microtubule glijsnelheid door een histogram te genereren en aan te passen aan een Gaussische functie (figuur 5C,D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om actieve en functionele recombinante motoreiwitten op grote schaal tot expressie te brengen en te zuiveren met behulp van de Sf9-baculovirusexpressie, heeft het systeem de generatie van virale deeltjes nodig die stabiel een coderende sequentie dragen om Sf9-cellen te infecteren. Om dit te bereiken, werden Sf9-cellen getransfecteerd met recombinant bacmide dat codeert voor KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG. Na 72 uur vertoonde een significante populatie cellen expressie van groen fluorescerend eiwit (mCitrine) met vergrote cellen en kernen (figuur 1 en figuur 2), wat wijst op een succesvolle generatie van virale deeltjes (P0). Deze virale deeltjes werden verder uitgebreid door verse Sf9-populatie op een hoger volume te infecteren om P1-virale voorraden te genereren voor opslag en grootschalige infectie. Voor de zuivering van de kinesine-3-motor werd een 30 ml-cultuur van Sf9-cellen geïnfecteerd met 1 ml P1-virale deeltjes. Na 72 uur infectie werden cellen die helder groen fluorescerend eiwit tot expressie brachten geoogst, gelyseerd en gezuiverd met behulp van C-terminal FLAG tag affiniteitszuivering met anti-FLAG antilichaam-gecoate hars. Interessant is dat de toevoeging van FLAG-peptide aan de kralen bevestigd met kinesine-3-motoren het grootste deel van het eiwit in een enkele fractie elueerde en het gezuiverde eiwit was van hoge zuiverheid, weergegeven als een band van ~ 120 kDa in Lane 7 van figuur 3.

De succesvolle polymerisatie van lange en gezonde microtubuli om de beweeglijkheidseigenschappen van S9-gezuiverde kinesine-3-motoren op een enkel molecuulniveau te bestuderen, vereist pure tubuline. In de huidige studie werden de microtubuli gepolymeriseerd met behulp van 2X-gefietste tubuline gezuiverd uit de geitenhersenen in een kritische concentratie tussen ~ 2,5-3,0 mg / ml gedurende 30 minuten in afwezigheid van taxol, omdat taxol de kritische concentratie van microtubule-nucleatie vermindert en een groot aantal korte microtubuligenereert 33,34,35 . Taxol werd na polymerisatie toegevoegd om de microtubuli te stabiliseren en depolymerisatie te voorkomen. Microtubuli die met deze methode werden gepolymeriseerd, resulteerden in lange en uniforme structuren (video 1) met een gemiddelde lengte van 60-70 μm.

In vitro single-molecule motiliteitsanalyse van Sf9-gezuiverde kinesine-3-motor, KIF1A (1-393LZ) onder TIRF-verlichting (figuur 4B) vertoonde unidirectionele, snelle en superprocessieve beweging langs de microtubuli (video 2), zoals weergegeven in de kymograaf als lange diagonale witte lijnen (figuur 4C). Trackinganalyse van deze lange superprocessieve motiliteitsgebeurtenissen toonde een gemiddelde snelheid en looptijd van respectievelijk 2,44 ± 0,02 μms-1 en 10,79 ± 0,28 μm (figuur 4D-E). Deze resultaten komen overeen met onze eerder gepubliceerde gegevens12,13 met behulp van motoren bereid uit zoogdiercellysaat door overexpressie. Bovendien vertoonde de multi-motor microtubule-gliding assay met behulp van Sf9-gezuiverde motoren bevestigd op de coverslip onder TIRF-verlichting lange, uniforme en unidirectionele beweging (figuur 5C en video 3). Trackinganalyse van deze lange microtubule gliding events toonde een gemiddelde snelheid van 1,37 ± 0,01 μms-1 (figuur 5D).

Samen suggereren deze resultaten dat het Sf9-baculovirussysteem een uitstekend systeem biedt voor de expressie en zuivering van actieve motoreiwitten die over het algemeen moeilijk zijn met behulp van het prokaryote systeem. FLAG tag biedt een voordeel van de eenstapszuivering van eiwit in zijn pure vorm. Bovendien levert microtubule polymerisatie met behulp van verse en zuivere tubuline en hun stabilisatie na de polymerisatie lange en uniforme microtubuli op. Bovendien suggereert in vitro single-molecule motiliteitsanalyse dat Sf9-gezuiverde motoren robuust waren en motiliteitseigenschappen vertoonden die vergelijkbaar waren met motoren uitgedrukt in zoogdiersystemen.

Figure 1
Figuur 1: 48 uur posttransfectie van Sf9-cellen met fluorescerend getagde kinesine-3-motor: Sf9-cellen werden op een schaal van 35 mm geplaatst met een dichtheid van 4,5 x 105 cellen / ml. Na 24 uur werden cellen getransfecteerd met recombinant bacmide DNA dat codeert voor de specifieke kinesine-3-motor, KIF1A (1-393LZ) - 3xmCit-FLAG met behulp van transfectiereagens. Na 48 uur transfectie werden beelden vastgelegd onder differentiële interferentie en contrast (DIC) en epifluorescentieverlichting. (A) Niet-getransfecteerde cellen, klein, rond en stevig bevestigd. (B) Getransfecteerde cellen die KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG-gelabeld eiwit tot expressie brengen met een vergrote celdiameter en losjes aan het oppervlak zijn bevestigd. Schaalbalk, 100 μm. (C) Staafdiagram dat de gemiddelde celdiameter van niet-getransfecteerde en getransfecteerde cellen aangeeft. Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD. N = 50 cellen. De t-toets van de student wordt gebruikt om de significantiewaarde te vinden (****p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: 72 uur na transfectie van Sf9-cellen met fluorescerend gelabelde kinesine-3-motor: afbeeldingen met meer dan 90% van de Sf9-cellen die fluorescerend gelabelde kinesine-3-motor tot expressie brengen, KIF1A (1-393LZ). Cellen zijn losjes gebonden aan het oppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Sf9-gezuiverde kinesine-3 motor: Coomassie-gekleurde SDS-PAGE-gel die Sf9-gezuiverde kinesine-3-motor vertegenwoordigt, KIF1A (1-393LZ) C-terminaal gelabeld met 3xmCit-FLAG. Van links naar rechts, Eiwitladder (M), BSA standaard eiwitcontrole, 0,2 μg (baan 2), 0,4 μg (baan 3), 0,6 μg (baan 4), 0,8 μg (baan 5) en 1,0 μg (baan 6), gezuiverde kinesine-3 motor (S) (baan 7). BSA werd gebruikt als standaard om de gezuiverde eiwitconcentratie te schatten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: In vitro single-molecule motiliteitstest met behulp van Sf9 gezuiverde kinesine-3 motoren:(A) Schematische flowcelmotiliteitskamer bereid met behulp van een glazen dia, dubbelzijdige tape en glazen coverslip. (B) Cartoondiagram ter illustratie van in vitro single-molecule beeldvorming van fluorescerend gelabelde motoren die langs het microtubulioppervlak bewegen, geadsorbeerd aan de coverslip met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie. Alleen de moleculen die zich zeer dicht bij de coverslip bevinden, worden opgewonden door het evanescente veld (~ 150-200 nm) gevormd door de volledige reflectie van invallend licht wanneer het wordt verlicht onder een hoek buiten de kritische hoek. (C) Kymograaf toont kinesine-3 motor die processief (diagonale witte lijnen) langs het oppervlak van de microtubuli loopt. Tijd op de y-as (verticale pijl) en afstand op de x-as (horizontale pijl). (D-E) De histogrammen van snelheid (D) en looplengte (E) werden bepaald door individuele motoren te volgen die frame voor frame op het microtubulioppervlak liepen en histogrammen werden uitgezet voor elke populatie motoren en pasten bij een enkele Gauss. De piek vertegenwoordigt de gemiddelde snelheid en looptijd en waarden worden in de grafiek weergegeven als gemiddelde ± SEM. N = Aantal getelde gebeurtenissen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: In vitro microtubule gliding assay met behulp van Sf9 gezuiverde kinesine-3 motoren: (A) Schematische van flow cel kamer bereid met behulp van een glazen schuif, dubbelzijdige tape en glazen coverslip. (B) Cartoondiagram ter illustratie van microtubuli met rhodamine-label die op het oppervlak van constitutief actieve kinesine-3-motoren glijden. Omdat kinesine-3-motoren C-terminaal zijn gelabeld met mCitrine, werden GFP-nanobodies gebruikt om ze aan het glasoppervlak te bevestigen. Vervolgens werden geschoren rhodamine-gelabelde microtubuli in de stroomkamer geïntroduceerd en werden beelden van microtubuli glijdende bewegingen vastgelegd onder TIRF-verlichting. (C) De kymograaf vertegenwoordigt glad microtubule glijden (diagonale witte streep) door de kinesine-3 motoren. Tijd op de y-as (verticale pijl) en afstand op de x-as (horizontale pijl). D. Histogram van de snelheid werd uitgezet voor een populatie van microtubuli en paste bij een enkele Gaussische piek. De gemiddelde glijsnelheid wordt in de linkerbovenhoek aangegeven als gemiddelde ± SEM. N = Aantal getelde moleculen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Gepolymeriseerde microtubuli. TIRF-beeldvorming van gepolymeriseerde microtubuli vóór verdunning voor motiliteitstest. De film is verkregen met een belichting van 100 ms en de video wordt afgespeeld met 60 frames / s. Schaalbalk, 10 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: In vitro single-molecule assay van de constitutief actieve kinesine-3 motor. Fluorescerend getagde KIF1A (1-393LZ) motoren gezuiverd uit Sf9-cellen die progressief bewegen langs het microtubule-oppervlak (ongelabeld) geadsorbeerd op de coverslip in een motiliteitstestkamer. Beeldvorming werd uitgevoerd in TIRF-verlichting en beelden werden verkregen bij een blootstelling van 100 ms. Video wordt afgespeeld met 30 frames/s. Schaalbalk, 10 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 3: Microtubule gliding assay van de constitutief actieve kinesine-3 motor. Rhodamine-gelabelde microtubuli glijden soepel over het oppervlak van de glazen afdeklip bedekt met Sf9 gezuiverde KIF1A (1-393LZ) motor. Beeldvorming werd uitgevoerd in TIRF-verlichting en beelden werden verkregen bij een blootstelling van 100 ms. Video wordt afgespeeld met 60 frames/s. Schaalbalk, 10 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Samenstelling van buffers en reagentia. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het Sf9-baculovirus expressiesysteem is een van de meest veelzijdige en succesvolle methoden voor high-throughput eiwitproductie 19,36,37. Het posttranslationele modificatievermogen van Sf9-cellen is sterk vergelijkbaar met het zoogdiersysteem15. Een aanzienlijk nadeel van het gebruik van dit systeem is dat het traag en gevoelig is voor verontreiniging. Een van de meest kritieke stappen is efficiënte infectie en succesvolle expressie in Sf9-cellen, wat een goede behandeling en onderhoud van Sf9-cellen vereist zonder enige besmetting. Het systeem vereist speciale stofvrije ruimte en instrumenten zoals een temperatuurgecontroleerde incubator en shaker. Onregelmatige celkweekpraktijk en het gebruik van overwoekerde cultuur zal resulteren in een slechte infectie, langzame groei en aanzienlijke celdood.

De FLAG tag zuivering van eiwit uitgedrukt in Sf9 cellen heeft verschillende voordelen. Ten eerste kunnen Sf9-cellen efficiënt worden gelyseerd om het grootste deel van het eiwit in zijn actieve en oplosbare vorm te krijgen. Ten tweede heeft FLAG-hars minder niet-specifieke eiwitadsorptie dan HIS- en GST-hars38. Als gevolg hiervan wordt een aanzienlijke hoeveelheid van het eiwit vrijgegeven in een eenstapselution in zijn pure vorm. De Sf9-gezuiverde kinesine-3-motoren vertoonden robuuste microtubule-gestimuleerde ATP-omloopsnelheden in de biochemische ATPase-testen14. Evenzo vertoonden deze motoren in vitro single-molecule motiliteitstests een snelle en superprocessieve motiliteit op het oppervlak van de microtubuli. Interessant is dat deze motiliteitseigenschappen opmerkelijke gelijkenis vertoonden met de motiliteitseigenschappen gemeten met behulp van motoren bereid uit zoogdiercellysaten 11,12,13. Bovendien komt de gemeten stapsnelheid van kinesine-3-motoren in de in vitro motiliteitstest met één molecuul nauw overeen met de snelheid van ATP-hydrolyse gemeten in biochemische ATPase-assay, wat suggereert dat motoren één ATP-molecuul per stap14 hydrolyseren. Samen suggereren deze resultaten dat kinesine3-motoren gezuiverd uit het Sf9-baculovirusexpressiesysteem een aanzienlijk grote populatie actieve en oplosbare eiwitten opleverden. Daarom geloven we dat het Sf9-baculovirussysteem kan worden gebruikt om motoreiwitten van belang te zuiveren met de nodige aanpassingen.

In vitro single-molecule motiliteitstest van kinesine-3 motoren die superprocessieve motiliteit vertonen, heeft polymerisatie van lange gepolymeriseerde microtubuli nodig. Een cruciale stap in de in vitro polymerisatie van lange microtubuli is het bereiden van een polymerisatiemengsel met kritische tubulineconcentratie, incubatietijd en geschikte buffer-pH. De tubuline die wordt gebruikt voor microtubulepolymerisatie moet zeer competent, zuiver en opgeslagen zijn in vloeibare stikstof in kleine aliquots om bevriezing en ontdooien te voorkomen. Tubuline, eenmaal ontdooid, mag niet worden teruggevroren voor toekomstige polymerisatie omdat tubuline zijn competentie aanzienlijk verliest in elke vries-dooicyclus. Incompetente tubuline zal niet bijdragen aan de polymerisatie van microtubuli, maar zal het polymerisatieproces belemmeren en resulteren in korte microtubuli met onbekende defecten. De optimale tubulineconcentratie in het polymerisatiemengsel moet tussen 2,5-3 mg / ml liggen en het mengsel moet gedurende 5 minuten op ijs worden bewaard voordat het bij 37 ° C wordt geïncubeerd voor polymerisatie. De duur van microtubuli polymerisatie moet tussen 20-30 minuten en mag niet langer zijn dan 30 minuten, omdat langdurige polymerisatie vaak resulteert in de vorming van korte en gefragmenteerde microtubuli.

Vervolgens is stabilisatie van gepolymeriseerde microtubuli een tweede kritieke stap. Taxol is slecht oplosbaar in water en slaat neer in een waterige oplossing39. Bereid daarom de stabilisatiebuffer vers met 10 μM taxol, voeg voorzichtig toe over het gepolymeriseerde microtubulimengsel en incubeer verder zonder te storen. Gebruik altijd bevroren taxol aliquot uit de -20 °C vriezer om de stabilisatiebuffer te bereiden, omdat ontdooide aliquot resulteert in de precipitatie / aggregatie van gepolymeriseerde microtubuli. Behandel de gepolymeriseerde microtubuli altijd met afgeschuinde uiteinden om breuk te voorkomen. Microtubuli die met deze methode worden gepolymeriseerd, leveren lange microtubuli op met een lengte van 60-70 μm die geschikt zijn voor superprocessieve motiliteitsanalyse. De volgende kritieke stap is de stabiele adsorptie van microtubuli aan het afdekvlakoppervlak in de motiliteitskamer. Om dit te bereiken, moeten coverslips op een droge plaats worden bewaard, omdat blootstelling van coverslips aan de vochtige omgeving de efficiëntie van de adsorptie van microtubuli en hun stabiliteit aanzienlijk vermindert.

Het bereiden van een motiliteitstestmengsel met de juiste ingrediënten in bepaalde concentraties en optimale motoreiwitconcentratie is belangrijk om robuuste motiliteitsgebeurtenissen langs het microtubulioppervlak te bereiken. De meest cruciale component bij het genereren van gladde en processieve beweeglijkheid is het gebruik van een stabiele ATP-oplossing in het testmengsel. (Voorzichtigheid is dus geboden bij het voorbereiden van de ATP-voorraad. Het oplossen van het natriumzout van ATP in 10 mM PIPES buffer pH 6,9, levert een heldere oplossing op met een zeer lage pH. ATP is extreem onstabiel bij een lage pH en hydrolyseert snel tot ADP en fosfaat, waardoor de oplossing koud blijft en de pH onmiddellijk wordt aangepast naar 7,0 met behulp van geconcentreerd KOH voorkomt hydrolyse.) Laat het motiliteitsmengsel in de stroomcel stromen en sluit beide randen af met vloeibare paraffine om vloeistofstroom en droging van de kamer te voorkomen tijdens beeldvorming onder TIRF-verlichting.

Omdat kinesine-3-motoren snel en superprocessief zijn langs de microtubulesporen, vormen hun beeldvorming, data-acquisitie en analyse verschillende uitdagingen. Beeldvorming met één molecuul en gegevensverzameling moeten worden uitgevoerd onder een lage laserintensiteit om fotobleaching van fluorescerende eiwitten te voorkomen voordat de motor zijn processieve run voltooit. De verkregen gegevens zouden van lage intensiteit zijn met een slechte signaal-ruisverhouding. Bijgevolg zou het volgen van deze individuele motiliteitsgebeurtenissen met behulp van bestaande geautomatiseerde trackingsoftware om hun beweeglijkheidsgebeurtenissen te karakteriseren moeilijk zijn. Daarom moet data-analyse handmatig worden uitgevoerd door nauwkeurig fluorescerend gelabelde motorspots te volgen die frame voor frame langs de microtubulesporen bewegen met minimale fouten. Kies voor data-analyse bij voorkeur de motiliteitsgebeurtenissen op de lange microtubulesporen om te voorkomen dat motoren het microtubule-uiteinde bereiken voordat ze hun run voltooien. Voor consistente en reproduceerbare resultaten houdt u alleen rekening met die beweeglijkheidsgebeurtenissen voor het bijhouden van ten minste de laatste 10 frames (500 ms) met een duidelijk begin en einde van de processieve run.

Over het algemeen biedt de methode verschillende voordelen ten opzichte van de bestaande methode, zoals eenvoudige en eenstapszuivering van actieve motoreiwitten, bereiding van lange microtubuli en een gedetailleerd stapsgewijs protocol met instructies om een goede beweeglijkheid te bereiken. In principe kan de methode worden toegepast om elke klasse en type eiwitten tot expressie te brengen en te zuiveren, inclusief maar niet beperkt tot myosine, kinesine en dyneïne. Inderdaad, het baculovirusexpressiesysteem is met succes opgezet om verschillende virale vaccins, gentherapievectoren en andere farmaceutische eiwitten te zuiveren20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen aan te geven.

Acknowledgments

V.S. en P.S. bedanken Prof. Kristen J. Verhey (University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA) en Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, India) voor hun onvoorwaardelijke steun gedurende het onderzoek. P.S. bedankt Dr. Sivapriya Kirubakaran voor haar steun gedurende het hele project. V.S. erkent financiering via DBT (Grant No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 en BT/RLF/Re-entry/45/2015) en DST-SERB (Grant No.: ECR/2016/000913). P.K.N erkent ICMR voor financiering (Subsidie nr. 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. erkent financiering uit DST (Grant No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S erkent fellowship van IIT Gandhinagar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinity Biolegend 651502 For protein purification
Aprotinin Sigma A6279 For protein purification
Cellfectin Invitrogen 10362100 For Sf9 transfection
DTT Sigma D5545 For motility assays and protein purification
FLAG peptide Sigma F3290 For protein purification
Glycerol Sigma G5516 To freeze the protein
HEPES Sigma H3375 For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630 Sigma I8896 For Sf9 lysis buffer
KCl Sigma P9541 For buffers preparation
Leupeptin Sigma L2884 For protein purification
MgCl2 Sigma M2670 For buffers preparation
NaCl Sigma S7653 For preparing lysis buffer
PMSF Sigma P7626 For protein purification
Sf9 cells Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottles Thermo Scientific 4115-0125 For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X) Thermo Scientific 10902-096 -500ml For culturing Sf9 cells
Sucrose Sigma S1888 Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s media Thermo Scientific 11595030 -500ml For Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATP Sigma A2647 For motility and gliding assay
BSA Sigma A2153 For blocking motility chamber
Catalase Sigma C9322 For motility and gliding assay
DMSO Sigma D5879 For dissolving Rhodamine
EGTA Sigma 3777 For preparing buffers
Glucose Sigma G7021 For motility and gliding assay
Glucose oxidase Sigma G2133 For motility and gliding assay
GTP Sigma G8877 For microtubule polymerization
KOH Sigma P1767 Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPES Sigma P6757 For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needle Dispovan For shearing microtubules
Casein Sigma C3400 For microtubule glidning assay
GFP nanobodies Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) For attaching motors to the coverslip
Rhodamine Thermo Scientific 46406 For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tips Eppendorf For Sf9 culture and purification
15ml concal tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
35mm cell culture dish Cole Palmer 15179-39 For Sf9 culture
Balance Sartorious 0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubator REMI For Sf9 suspenculture at 28oC
Camera EMCCD Andor iXon Ultra 897 For TIRF imaging and acquesition
Double sided tape Scotch For making motility chamber
Glass coverslip Fisherfinest 12-548-5A size; 22X30
Glass slide Blue Star For making motility chamber
Heating block Neuation Dissolving paraffin wax
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti- U To check protein expression
Lasers 488nm (100mW) For TIRF imaging
Liquid nitrogen For sample freezing and storage
Microcapillary loading tip Eppendorf EP022491920 For shearing microtubules
Microscope Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up For TIRF imaging
Mini spin Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd For quick spin
Objective 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion For TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XE Beckman Coulter For protein purification
Parafilm Eppendorf
pH-meter Corning Coring 430 To adjust pH
Pipette-boy VWR For Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21 Thermo Scientific For protein purification
Sorvall ST8R centrifuge Thermo Scientific Protein purification
ThermoMixer Eppendorf For microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotor Beckman coulter SW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubes Beckman 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixer Neuation Sample mixing
Wax Sigma V001228 To seal motility chamber

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A. Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. Kumar, D., Gong, C. , Springer International Publishing. 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Tags

Biochemie nummer 185
Single-Molecule Analyse van Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soppina, P., Shewale, D. J., Naik,… More

Soppina, P., Shewale, D. J., Naik, P. K., Soppina, V. Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors. J. Vis. Exp. (185), e63837, doi:10.3791/63837 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter