Summary
运动细胞的 体外 再激活是了解细胞运动机制的关键实验。该协议描述了重新激活 衣原体莱因哈蒂衣原体的去膜化细胞模型，这是一种研究纤毛/鞭毛的模式生物。
Abstract
自从Szent-Györgyi在20世纪中叶证明的通过添加ATP来收缩甘油化肌肉的历史实验以来，去膜化细胞的体外再激活一直是检查细胞运动的传统而有效的方法。这种实验方法的根本优点是再活化溶液的组成可以很容易地改变。例如，由于体内膜激发而仅暂时发生的高Ca2 +浓度环境可以在实验室中复制。真核纤毛（又名鞭毛）是精心设计的运动机制，其调节机制仍有待澄清。单细胞绿藻衣原体是纤毛研究领域的优秀模式生物。使用C. reinhardtii的去膜化细胞模型及其衍生物（例如分离的纤毛的去膜化轴突）的再激活实验对理解纤毛运动的分子机制有显着贡献。这些实验澄清了ATP为纤毛运动提供能量，并且各种细胞信号，包括Ca2 +，cAMP和活性氧，调节纤毛运动。这里描述了C. reinhardtii细胞的去膜和细胞模型的再激活的精确方法。
Introduction
去膜运动细胞的体外再活化是研究细胞运动调节机制的分子基础的宝贵工具。Szent-Györgyi首先通过添加三磷酸腺苷（ATP）1，首次证明了用50%甘油提取的兔骨骼肌纤维的体外收缩。这个实验是第一个证明ATP为肌肉收缩提供能量的实验。该方法很快被应用于ATP激励的睫状/鞭毛运动的研究，例如精子鞭毛2，纤毛副膜3和克莱因哈蒂环状衣原体（也称为鞭毛）4，使用非离子洗涤剂进行去膜化。
单细胞绿藻 C. reinhardtii 是研究纤毛的模式生物：它通过像人类的蛙泳一样击败它们来与两个纤毛一起游泳5。纤毛运动由动力蛋白驱动，动力蛋白是一种基于负端定向微管的运动蛋白6，7。睫状动力素可分为外臂动力蛋白和内臂动力蛋白。缺乏每种动力蛋白的突变体已被分离为具有不同运动异常的慢游突变体。对这些突变体的详细 体外 运动性分析显著推动了动力蛋白研究8.
自去膜化C. reinhardtii细胞（细胞模型）的体外再活化实验以来，利用该方法及其衍生物已经取得了许多重要发现。例如，在一系列Ca2 +缓冲液中重新激活细胞模型，表明9表明两个纤毛受亚微摩尔Ca2 +的不同调控，并且这种不对称的纤毛控制使C. reinhardtii10的光定向成为可能。此外，纤毛都显示从前向游动模式（称为非对称波形）到向后游动模式（称为对称波形，在细胞被光或机械电击时短时间内出现）的波形转换11，12。这种波形转换由亚毫摩尔Ca2+调节，其通过所谓的细胞核细胞核装置（包含两个纤毛，基底体，连接基体的结构以及细胞核的残余物）11或分离纤毛13的去膜化轴突的重新激活来显示。除Ca2 +外，氧化还原（还原氧化）是一种调节纤毛跳动频率的信号，这通过在含有不同比例的还原谷胱甘肽与氧化谷胱甘肽14的氧化还原缓冲液中重新激活细胞模型来显示。此外，环磷酸腺苷（cAMP）不对称地调节两个纤毛，这表现为用光裂笼笼cAMP15重新激活轴突。这些体外发现，结合遗传学发现，使人们更深入地了解了C. reinhardtii纤毛调节的分子机制。
此处描述了用于重新激活单元模型的协议。该方法很简单，允许各种修饰，并且可以应用于与纤毛一起移动的多个生物体。然而，由于去膜化细胞是脆弱的，因此需要一些技巧才能以良好的效率重新激活细胞模型的运动性，同时防止分升。
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Protocol
本研究使用野生型 的莱因哈蒂衣原体菌株CC-125。CC-125从衣原体资源中心获得（见 材料表），并在20-25°C下维持在三乙酸酯磷酸盐（TAP）16，1.5%琼脂糖培养基上。
1. 细胞培养
- 在20-25°C下，在12小时/ 12小时明暗期（光照期的光照条件：~50μmol光子m−2 s−1白光）在TAP培养基16中培养莱因哈蒂衣原体（CC-125），持续2天（图1）。
注意：细胞必须处于对数生长中期（电影1）。长时间培养（>4天，在后期对数生长或固定期）会降低去膜化细胞模型的再活化效率。
图1：培养2天后的液体培养。 从TAP-1.5%琼脂平板中，将一大块填充铂环的野生型细胞接种到烧瓶中〜150 mL TAP液体培养基中。培养2天后的细胞密度为2.3×106 个细胞/ mL。 请点击此处查看此图的大图。
电影1：活细胞的游泳。 在显微镜下用10倍物镜和油浸暗场聚光镜观察细胞。比例尺 = 100 μm。 请点击此处下载此影片。
2. 去膜化细胞模型的制备
注意：在开始实验之前，将洗涤缓冲液保持在室温下，并将去膜，稀释，再活化缓冲液和ATP溶液保存在冰上。这些缓冲液的组成在 补充表1中提供。
- 在20°C下以1000× g 离心〜10mL液体培养物3分钟。
注意：从此步骤开始的整个实验方案中，请勿使用高压灭菌的塑料器皿（管，移液器吸头等），这会降低再活化效率。对于锥形管，重复使用的管是优选的。培养2天后的细胞密度通常为1.0-5.0×106 个细胞/ mL。当细胞密度低于此值时，取足够的培养体积以包含〜5×107个 细胞。 - 丢弃上清液，首先通过倾选，然后通过巴斯德移液器，并将沉淀物重悬于约5mL洗涤缓冲液中。
- 在20°C下以1000× g 在洗涤缓冲液中离心细胞3分钟。
- 用移液管小心地丢弃上清液（图2）。
注意：巴斯德移液器是优选的。使用微量移液器时，避免使用已高压灭菌的移液器吸头。 - 将〜0.5mL去膜缓冲液覆盖在细胞沉淀上，用手轻轻摇动试管以将细胞大致悬浮在缓冲液中，然后将试管放在冰上（图3A）。
注意：目前没有必要完全暂停颗粒。当细胞模型重新激活时，将去膜和再活化缓冲液中MgSO4 的浓度提高到15 mM，最终ATP浓度>1mM以实现稳定的再活化17。 - 用移液管轻轻悬浮剩余的细胞沉淀，然后再次将管放在冰上（图3B）。
- 取5-10μL细胞模型，用稀释缓冲液稀释10倍，并在显微镜下观察（电影2）以确认所有细胞模型都去膜化并且不会游泳（图4）。
注意：如果一些细胞仍在游泳（活着），则将去膜缓冲液中使用的非离子洗涤剂直接加入细胞模型溶液中，最终浓度为〜0.15%。或者，用含有0.15%洗涤剂的去膜溶液重复步骤2.1-2.5。
图2：丢弃上清液。 通过倾析管除去上清液后，用巴斯德移液管小心地除去其余的上清液。 请点击此处查看此图的大图。
（A）将0.5mL去膜溶液覆盖到细胞沉淀上后，用手混合溶液以粗略地悬浮细胞。（B）混合后，通过巴斯德移液器将其余的细胞沉淀完全悬浮在溶液中。请点击此处查看此图的大图。
图4：去膜的影响。 （A）卡在载玻片上的活细胞。（B）卡在载玻片上的细胞模型。请注意，在细胞模型中，纤毛变得略微变薄。这些图像是在带有20倍物镜和油浸暗场聚光镜的显微镜下观察的。比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
电影2：解膜的确认。 在具有10倍物镜和油浸暗场聚光镜的显微镜下观察细胞模型悬浮液。没有牢房在游泳。比例尺 = 100 μm。 请点击此处下载此影片。
3. 去膜化细胞模型的再激活
- 通过敲击试管在0.5mL试管中混合80μL再活化溶液，10μLATP溶液和10μL细胞模型（图5）。
注意：最终ATP浓度必须为<3 mM，因为纤毛搏动频率（纤毛运动的参数）随着ATP浓度的增加而增加，并在ATP17的2-3 mM处饱和。
注意：通过移液或涡旋混合会导致分化并降低再活化效率。- 要用<0.2 mM的ATP重新激活，请添加ATP再生系统，例如70 U / mL肌酸激酶和5 mM磷酸肌酸（参见 材料表）。
注意：再活化溶液以比稀释溶液更高的浓度（1.125x， 补充表1）制备，以便在混合溶解在水中的ATP后，内容物达到以下最终浓度：30mM的Hepes（pH 7.4），5mM的MgSO4，1mM的二硫舒醇（DTT），1mM的EGTA和50mM的乙酸钾（见 材料表）。
- 要用<0.2 mM的ATP重新激活，请添加ATP再生系统，例如70 U / mL肌酸激酶和5 mM磷酸肌酸（参见 材料表）。
- 将约30μL混合溶液放到载玻片上，并用垫片轻轻地在其上放置盖玻片，以避免对细胞模型进行机械冲击（图6）。
注：白色石油或双面胶带可用于制造垫片。 - 在显微镜下观察重新激活的细胞模型（电影3）。
图5：通过轻敲管混合溶液。 （A）按顺序加入80μL再活化溶液，10μLATP溶液和10μL细胞模型。（B）通过用手指敲击管子混合溶液。 请点击此处查看此图的大图。
图6：在盖玻片边缘上制作垫片。 （A）在手背上涂上一层薄薄的白色石油。（B）用盖玻片的边缘刮掉少量的白色石油。（C） 在盖玻片的边缘上做了一个垫片。（D） 在相对的边缘上制造了另一个垫片。 请点击此处查看此图的大图。
电影3：重新激活的细胞模型的游泳。 通过以1mM的最终浓度添加ATP来重新激活细胞模型的运动性，并在显微镜下用10倍物镜和油浸暗场聚光镜观察。比例尺 = 100 μm。 请点击此处下载此影片。
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Representative Results
这里显示了 C. reinhardtii 野生型菌株（CC-125）的脱膜和再活化过程。接种后2天的培养物变成浅绿色（步骤1.1）（图1）。收集细胞（步骤2.1），洗涤（步骤2.2）和去膜（步骤2.5）。去膜后，所有细胞模型都变得不对称（步骤2.7）。去膜化的纤毛（称为轴突）仍然附着在细胞体上，这表明细胞模型的不动性不是由分化引起的（图4）。与再活化缓冲液和ATP混合后（步骤3.1），>50%的细胞模型变得可运动（步骤3.2）。在步骤3.1中，通过温和和彻底的混合来提高再活化速率。（%运动细胞）。即使没有ATP再生系统（步骤3.1.1），重新激活的细胞继续移动约90分钟，最终ATP浓度为1mM，然后逐渐停止运动。
补充表1：研究中使用的溶液和缓冲液的组成。 请按此下载此表格。
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Discussion
该协议中有两个关键步骤。第一种是称为去膜的过程，需要温和但彻底地进行。通过剧烈移液或涡旋诱导分化（即纤毛从细胞体中分离），即使在添加ATP后，细胞模型也无法移动。通常，将5×10个7 个细胞悬浮在〜0.5mL的去膜缓冲液中（最终细胞密度：1×108 个细胞/ mL）。如果细胞模型密度远低于此值（例如，1个×10个6 个细胞/mL），则细胞模型的再激活率将降低。这些细胞模型密度对再激活的影响尚不清楚，但细胞提取物可能含有有助于再激活的因素。当然，细胞密度越高，彻底去膜就越困难。去膜不足可能导致细胞模型污染活细胞。在这种情况下，可以在步骤2.7中看到移动的单元格。活细胞的污染将导致对添加到再活化缓冲液中的ATP或其他组分（如Ca2 +）的作用的误解。此步骤需要熟练程度。
第二个关键步骤是重新激活。与去膜步骤类似，用于混合溶液的剧烈移液也诱导分化。因此，优选使用攻丝管混合溶液。此步骤还需要熟练程度。此外，当溶液的体积为100μL（如本方案中所述）时，建议在此步骤中使用0.5 mL管。
如引言所述，该协议的一个优点是它允许在体外检查各种生物信号的影响，其浓度仅在体内短暂升高。例如，可以将Ca2+添加到再活化溶液中。由于EGTA在这种情况下的螯合作用，需要仔细计算混合所有溶液（步骤3.1）后的最终钙浓度。为了在螯合剂存在下计算缓冲液中游离Ca2 +的最终浓度，程序CALCON18是有效的。含钙再活化缓冲液的一个例子显示在先前的研究19中。需要注意的是，高浓度的Ca2 +（>10-5 M）诱导分化20，因此Ca2 +对睫状体运动的影响必须在较低浓度下进行测试，如前所述21。
该方法具有某些限制。再活化缓冲液的组成不一定反映体内离子条件。因此，如果在细胞模型和活细胞之间观察到纤毛运动的一些差异，则需要小心确定这是否不是由于缓冲液组成的伪影。例如，如果我们试验这种经典的缓冲液组成，当ATP浓度为>1 mM17时，纤毛跳动频率低于预期。这个问题的解决方案是增加Mg2 +浓度，并将腺苷二磷酸（ADP）与ATP一起加入;然后，睫状体跳动频率按预期增加17。因此，有必要根据实验目的改变缓冲液组成。
本方案可应用于其他与纤毛一起游泳的藻类物种。例如，去膜化的Volvox rousseletii（含有5，000-10，000个衣原体样细胞的多细胞Volvocales绿藻）的运动可以通过添加ATP（如 C. reinhardtii 细胞模型22）来重新激活。在这种情况下需要进行一些修改：省略聚乙二醇（PEG）以保持脱膜 V. rousseletii的球形，并且由于从前极到后极的洗涤剂敏感性的梯度，Igepal CA-630（洗涤剂）的浓度被改变，前者最高，后者最低。经过修改，该方案还应用于最小的多细胞Volvocales物种，四细胞 Tetrabaena socialis23。如果要用一种新的生物体进行本实验，则需要通过修改去膜和再活化缓冲液中组分的类型和浓度，特别是洗涤剂和PEG来优化。根据生物体的大小和形态，需要调整离心设置。灌注也是除膜而不是离心的一种选择22。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究得到了日本科学促进会KAKENHI（https://www.jsps.go.jp/english/index.html）对N.U.（19K23758，21K06295）和K.W.（19H03242，20K21420，21H00420），Ohsumi Frontier Science Foundation（https://www.ofsf.or.jp/en/）到K.W.的资助，以及来自人类，环境和材料（http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/）与N.U.和K.W.的开放式创新动态联盟的支持。我们感谢筱原美雪女士（法政大学）在准备这些数字时给予的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
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