Summary
Die In-vitro-Reaktivierung beweglicher Zellen ist ein entscheidendes Experiment zum Verständnis der Mechanismen der Zellmotilität. Das Protokoll beschreibt die Reaktivierung der demembranierten Zellmodelle von Chlamydomonas reinhardtii, einem Modellorganismus zur Untersuchung von Zilien / Flagellen.
Abstract
Seit dem historischen Experiment zur Kontraktion glykerinierter Muskeln durch Zugabe von ATP, das Szent-Györgyi Mitte des 20. Jahrhunderts demonstrierte, ist die In-vitro-Reaktivierung demembranierter Zellen ein traditioneller und wirksamer Weg, um die Zellmotilität zu untersuchen. Der grundlegende Vorteil dieser experimentellen Methode besteht darin, dass die Zusammensetzung der Reaktivierungslösung leicht verändert werden kann. Zum Beispiel kann eine Umgebung mit hoher Ca2 + - Konzentration, die aufgrund der Membrananregung in vivo nur vorübergehend auftritt, im Labor repliziert werden. Eukaryotische Zilien (auch bekannt als Flagellen) sind ausgeklügelte Motilitätsmechanismen, deren Regulationsmechanismen noch geklärt werden müssen. Die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ist ein hervorragender Modellorganismus im Forschungsgebiet der Zilien. Die Reaktivierungsexperimente mit demembranierten Zellmodellen von C. reinhardtii und ihren Derivaten, wie demembranierten Axonemen isolierter Zilien, haben wesentlich zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Ziliarmotilität beigetragen. Diese Experimente stellten klar, dass ATP die Ziliarmotilität anregt und dass verschiedene zelluläre Signale, einschließlich Ca2 +, cAMP und reaktive Sauerstoffspezies, Ziliarbewegungen modulieren. Die genaue Methode zur Demembranation von C. reinhardtii-Zellen und zur Reaktivierung der Zellmodelle wird hier beschrieben.
Introduction
Die In-vitro-Reaktivierung demembranierter beweglicher Zellen ist ein wertvolles Werkzeug, um die molekularen Grundlagen für den Regulationsmechanismus der Zellmotilität zu untersuchen. Szent-Györgyi zeigte erstmals eine In-vitro-Kontraktion von Kaninchenskelettmuskelfasern, die mit 50% Glycerin extrahiert wurden, durch Zugabe von Adenosintriphosphat (ATP)1. Dieses Experiment war das erste, das bewies, dass ATP die Muskelkontraktion mit Energie versorgt. Die Methodik wurde bald auf die Untersuchung von ATP-energetisierter Ziliar- / Flagellenmotilität angewendet, wie Spermienflagellen2, Paramecium cilia 3 und Chlamydomonas reinhardtii cilia (auch Flagellen genannt)4 unter Verwendung von nichtionischen Reinigungsmitteln zur Demembranation.
Die einzellige Grünalge C. reinhardtii ist ein Modellorganismus für die Erforschung von Zilien: Sie schwimmt mit zwei Zilien, indem sie sie wie die Brust eines Menschen schlägt5. Die Ziliarbewegung wird durch Dynein angetrieben, ein minus-end-gerichtetes Mikrotubuli-basiertes Motorprotein 6,7. Ziliare Dyneine können in Außenarm-Dynes und Innenarm-Dynein eingeteilt werden. Mutanten, denen jede Art von Dynein fehlt, wurden als langsam schwimmende Mutanten mit unterschiedlichen Motilitätsanomalien isoliert. Die detaillierte In-vitro-Motilitätsanalyse dieser Mutanten hat die Dynein-Forschung erheblich vorangebracht8.
Seit der Etablierung des In-vitro-Reaktivierungsexperiments von demembranierten C. reinhardtii-Zellen (Zellmodelle) wurden mit dieser Methode und ihren Derivaten viele wichtige Erkenntnisse erzielt. Die Reaktivierung von Zellmodellen in einer Reihe von Ca2+-Puffern zeigtebeispielsweise 9, dass zwei Zilien durch submikromolare Ca2+ unterschiedlich reguliert werden, und diese asymmetrische Zilienkontrolle ermöglicht die phototaktische Orientierung von C. reinhardtii10. Darüber hinaus zeigen beide Zilien eine Wellenformkonvertierung vom Vorwärtsschwimmmodus (asymmetrische Wellenform genannt) in den Rückwärtsschwimmmodus (symmetrische Wellenform genannt, die für einen kurzen Zeitraum auftritt, wenn Zellen photo- oder mechanoschockiert sind)11,12. Diese Wellenformumwandlung wird durch submillimolare Ca2+ reguliert, was durch die Reaktivierung des sogenannten Nukleoflagellarapparates (ein Komplex mit zwei Zilien, den Basalkörpern, den Strukturen, die die Basalkörper mit dem Kern verbinden, und dem Rest des Kerns)11 oder demembranierten Axonemen isolierter Zilien13 gezeigt wurde. Abgesehen von Ca2 + ist die Redox-Haltung (Reduktions-Oxidation) ein Signal, das die Ziliarschlagfrequenz reguliert, was durch die Reaktivierung von Zellmodellen in Redoxpuffern gezeigt wurde, die unterschiedliche Verhältnisse von reduziertem Glutathion zu oxidiertem Glutathion 14 enthalten. Darüber hinaus reguliert cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) asymmetrisch zwei Zilien, was durch die Reaktivierung von Axonemen mit photoklavierbarem cAMP15 gezeigt wurde. Diese In-vitro-Befunde, kombiniert mit genetischen Befunden, haben zu einem tieferen Verständnis der molekularen Mechanismen der Zilienregulation bei C. reinhardtii geführt.
Ein Protokoll zur Reaktivierung der Zellmodelle wird hier beschrieben. Die Methode ist einfach, ermöglicht verschiedene Modifikationen und kann auf mehrere Organismen angewendet werden, die sich mit Zilien bewegen. Da demembranierte Zellen jedoch zerbrechlich sind, sind einige Tipps erforderlich, um die Motilität von Zellmodellen mit guter Effizienz zu reaktivieren und gleichzeitig eine Dezitilisierung zu verhindern.
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Protocol
Ein Wildtypstamm von Chlamydomonas reinhardtii, CC-125, wurde für die vorliegende Studie verwendet. CC-125 wurde vom Chlamydomonas Resource Center (siehe Tabelle der Materialien) gewonnen und auf einem Tris-Acetat-Phosphat (TAP)16, 1,5% Agarosemedium bei 20-25 °C gehalten.
1. Zellkultur
- Kultur Chlamydomonas reinhardtii (CC-125) in TAP medium 16 in einer 12 h/12 h Hell-Dunkel-Periode (Lichtverhältnisse für die Lichtperiode: ~50 μmol Photonen m−2 s−1 Weißlicht) bei 20-25 °C für 2 Tage (Abbildung 1).
HINWEIS: Die Zellen müssen sich in einer mittleren logarithmischen Wachstumsphase befinden (Film 1). Lange Kultur (>4 Tage, in der spätlogarithmischen Wachstums- oder stationären Phase) verringert die Reaktivierungseffizienz demembranierter Zellmodelle.
Abbildung 1: Flüssigkultur nach 2-tägiger Kultivierung. Von einer TAP-1,5% Agarplatte wurde ein Stück Wildtypzellen zum Füllen der Platinschleife in einem Kolben auf ~ 150 ml TAP-Flüssigmedium geimpft. Die Zelldichte nach 2-Tages-Kultur betrug 2,3 × 106 Zellen/ml. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Film 1: Schwimmen lebender Zellen. Die Zellen wurden unter einem Mikroskop mit einer 10-fachen Objektivlinse und einem Öl-Tauch-Dunkelfeldkondensator beobachtet. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
2. Erstellung demembranierter Zellmodelle
HINWEIS: Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, bewahren Sie den Waschpuffer bei Raumtemperatur und die Demembranierungs-, Verdünnungs-, Reaktivierungspuffer und die ATP-Lösung auf Eis auf. Die Zusammensetzung dieser Puffer ist in der Ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt.
- Zentrifuge ~10 mL Flüssigkultur bei 1000 × g bei 20 °C für 3 min.
HINWEIS: Verwenden Sie im gesamten Protokoll dieses Schritts keine autoklavierten Kunststoffwaren (Röhrchen, Pipettenspitzen usw.), wodurch die Reaktivierungseffizienz verringert wird. Für konische Rohre sind wiederverwendete bevorzugt. Die Zelldichte nach 2-Tage-Kultur kann typischerweise 1,0-5,0 × 106 Zellen / ml betragen. Wenn die Zelldichte niedriger ist, nehmen Sie genug Kulturvolumen, um ~ 5 × 107 Zellen zu enthalten. - Entsorgen Sie den Überstand, zuerst durch Dekantieren und dann durch eine Pasteur-Pipette, und suspendieren Sie die Ausscheidungen in ~ 5 ml Waschpuffer.
- Zentrifugenzellen im Waschpuffer bei 1000 × g für 3 min bei 20 °C.
- Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette (Abbildung 2).
HINWEIS: Pasteur-Pipetten sind vorzuziehen. Vermeiden Sie bei der Verwendung von Mikropipetten die Verwendung von Pipettenspitzen, die autoklaviert wurden. - Überlagern Sie ~ 0,5 ml Demembranationspuffer auf ein Zellpellet, schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig von Hand, um die Zellen im Puffer grob zu suspendieren, und legen Sie das Rohr auf Eis (Abbildung 3A).
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, das Pellet in diesem Moment vollständig auszusetzen. Erhöhen Sie die Konzentration von MgSO4 auf 15 mM in den Demembranations- und Reaktivierungspuffern, wenn Zellmodelle reaktiviert werden, mit einer endgültigen ATP-Konzentration >1 mM für eine stabile Reaktivierung17. - Suspendieren Sie das verbleibende Zellpellet vorsichtig mit einer Pipette und legen Sie das Rohr erneut auf Eis (Abbildung 3B).
- Nehmen Sie 5-10 μL der Zellmodelle, verdünnen Sie 10-fach mit dem Verdünnungspuffer und beobachten Sie unter dem Mikroskop (Film 2), um zu bestätigen, dass alle Zellmodelle demembraniert sind und nicht schwimmen (Abbildung 4).
HINWEIS: Wenn einige Zellen noch schwimmen (lebendig), fügen Sie das im Demembranationspuffer verwendete nichtionische Reinigungsmittel direkt in die Zellmodelllösung bis zur Endkonzentration von ~ 0,15% hinzu. Alternativ können Sie die Schritte 2.1-2.5 mit der Demembranierungslösung wiederholen, die 0,15% Reinigungsmittel enthält.
Abbildung 2: Verwerfen des Überstandes. Der Rest des Überstands wurde vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette entfernt, nachdem der Überstand durch Dekantieren des Röhrchens entfernt worden war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Demembranation . (A) Nach dem Überlagern von 0,5 ml Demembranierungslösung auf das Zellpellet wurde die Lösung von einer Hand gemischt, um die Zellen grob zu suspendieren. (B) Nach dem Mischen wurde der Rest des Zellpellets durch eine Pasteurpipette vollständig in der Lösung suspendiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Auswirkungen der Demembranation . (A) Eine lebende Zelle, die auf einem Glasobjektträger steckt. (B) Ein Zellmodell, das auf einem Glasobjektträger klebt. Beachten Sie, dass im Zellmodell die Zilien etwas dünner wurden. Die Bilder wurden unter einem Mikroskop mit einer 20-fachen Objektivlinse und einem Öl-Tauch-Dunkelfeldkondensator beobachtet. Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Film 2: Bestätigung der Demembranation. Die Zellmodellsuspension wurde unter einem Mikroskop mit einer 10-fachen Objektivlinse und einem Öl-Tauch-Dunkelfeldkondensator beobachtet. Keine Zelle schwamm. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
3. Reaktivierung demembranierter Zellmodelle
- Mischen Sie 80 μL Reaktivierungslösung, 10 μL ATP-Lösung und 10 μL Zellmodelle in einer 0,5 ml Röhre durch Klopfen des Röhrchens (Abbildung 5).
HINWEIS: Die endgültige ATP-Konzentration muss <3 mM betragen, da die Ziliarschlagfrequenz, ein Parameter für die Ziliarbewegung, mit der ATP-Konzentration zunimmt und bei 2-3 mM von ATP17 gesättigt ist.
ACHTUNG: Das Mischen durch Pipettieren oder Vortexen verursacht eine Deziliation und verringert die Reaktivierungseffizienz.- Zur Reaktivierung mit <0,2 mM ATP fügen Sie ein ATP-Regenerationssystem hinzu, z. B. 70 E/ml Kreatinkinase und 5 mM Kreatinphosphat (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die Reaktivierungslösung wird in einer höheren Konzentration (1.125x, Ergänzende Tabelle 1) als die Verdünnungslösung hergestellt, so dass nach dem Mischen des in Wasser gelösten ATP der Inhalt die folgenden Endkonzentrationen erreicht: 30 mM Hepes (pH 7,4), 5 mM MgSO4, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM EGTA und 50 mM Kaliumacetat (siehe Materialtabelle).
- Zur Reaktivierung mit <0,2 mM ATP fügen Sie ein ATP-Regenerationssystem hinzu, z. B. 70 E/ml Kreatinkinase und 5 mM Kreatinphosphat (siehe Materialtabelle).
- Geben Sie ~ 30 μL der gemischten Lösung auf einen Glasobjektträger und legen Sie vorsichtig ein Deckglas mit Abstandshaltern darauf, um mechanische Stöße auf die Zellmodelle zu vermeiden (Abbildung 6).
HINWEIS: Weißes Erdöl oder doppelseitige Klebebänder können verwendet werden, um die Abstandshalter herzustellen. - Beobachten Sie die reaktivierten Zellmodelle unter dem Mikroskop (Film 3).
Abbildung 5: Mischlösung durch Klopfen des Rohres . (A) Zu 80 μL der Reaktivierungslösung wurden 10 μL ATP-Lösung und 10 μL Zellmodelle in sequenzieller Reihenfolge zugegeben. (B) Die Lösung wurde durch Klopfen des Röhrchens mit einem Finger gemischt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Herstellen von Abstandshaltern an Deckglaskanten . (A) Eine dünne Schicht aus weißem Erdöl wurde auf den Handrücken aufgetragen. (B) Eine kleine Menge Weißöl wurde mit einem Rand eines Deckglases abgekratzt. (C) Am Rand eines Deckglases wurde ein Abstandshalter hergestellt. (D) Ein weiterer Abstandshalter wurde an der gegenüberliegenden Kante hergestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Film 3: Schwimmen reaktivierter Zellmodelle. Die Motilität der Zellmodelle wurde durch Zugabe von ATP in einer Endkonzentration von 1 mM reaktiviert und unter einem Mikroskop mit einer 10-fachen Objektivlinse und einem Öl-Tauch-Dunkelfeldkondensator beobachtet. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
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Representative Results
Der Demembranations- und Reaktivierungsprozess in C. reinhardtii Wildtypstamm (CC-125) ist hier dargestellt. Die Kultur wurde 2 Tage nach der Impfung hellgrün (Schritt 1.1) (Abbildung 1). Die Zellen wurden gesammelt (Schritt 2.1), gewaschen (Schritt 2.2) und demembraniert (Schritt 2.5). Nach der Demembranation wurden alle Zellmodelle unbeweglich (Schritt 2.7). Die demembranierten Zilien (Axoneme genannt) bleiben am Zellkörper haften, was zeigt, dass die Unbeweglichkeit der Zellmodelle nicht durch Deziliation verursacht wird (Abbildung 4). Nach dem Mischen mit dem Reaktivierungspuffer und ATP (Schritt 3.1) wurden >50% der Zellmodelle beweglich (Schritt 3.2). Die Reaktivierungsrate wird durch schonendes und gründliches Mischen in Schritt 3.1 erhöht. (% bewegliche Zellen). Auch ohne das ATP-Regenerationssystem (Schritt 3.1.1) bewegten sich die reaktivierten Zellen mit der endgültigen ATP-Konzentration von 1 mM für ~ 90 Minuten weiter, bevor sie die Bewegung allmählich stoppten.
Ergänzende Tabelle 1: Zusammensetzung der in der Studie verwendeten Lösungen und Puffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Protokoll. Der erste ist ein Prozess, der als Demembranation bekannt ist und sanft, aber gründlich durchgeführt werden muss. Die Deziliation (d.h. das Ablösen von Zilien vom Zellkörper) wird durch kräftiges Pipettieren oder Wirbeln induziert, wodurch die Zellmodelle auch nach der Zugabe von ATP unbeweglich werden. Typischerweise sind 5 × 107 Zellen in ~0,5 ml Demembranationspuffer suspendiert (Endzelldichte: 1 × 108 Zellen/ml). Die Reaktivierungsrate der Zellmodelle würde abnehmen, wenn die Zellmodelldichte viel niedriger ist (z. B. 1 ×10 6 Zellen / ml). Diese Zellmodelldichteeffekte auf die Reaktivierung sind unklar, aber die Zellextrakte enthalten wahrscheinlich die Faktoren, die zur Reaktivierung beitragen. Je höher die Zelldichte, desto schwieriger wird es natürlich für eine gründliche Demembranation. Eine unzureichende Demembranation kann dazu führen, dass lebende Zellen mit Zellmodellen kontaminiert werden. Bewegliche Zellen sind in diesem Fall in Schritt 2.7 zu sehen. Eine Kontamination lebender Zellen führt zu einer Fehlinterpretation der Auswirkungen von ATP oder anderen Komponenten (wie Ca2+), die dem Reaktivierungspuffer zugesetzt werden. Dieser Schritt erfordert Kenntnisse.
Der zweite kritische Schritt ist die Reaktivierung. Ähnlich wie beim Demembranierungsschritt induziert auch ein kräftiges Pipettieren zum Mischen der Lösung. Daher ist das Mischen von Lösungen mit Gewinderohren vorzuziehen. Dieser Schritt erfordert auch Kenntnisse. Darüber hinaus wird in diesem Schritt die Verwendung von 0,5-ml-Röhrchen empfohlen, wenn das Volumen der Lösung 100 μL beträgt (wie in diesem Protokoll beschrieben).
Wie in der Einleitung erwähnt, besteht ein Vorteil dieses Protokolls darin, dass es die Untersuchung der Auswirkungen verschiedener biologischer Signale in vitro ermöglicht, deren Konzentrationen in vivo nur vorübergehend erhöht sind. Beispielsweise kann der Reaktivierungslösung Ca2+ hinzugefügt werden. Aufgrund der Chelateffekte von EGTA muss in diesem Fall die endgültige Calciumkonzentration nach dem Mischen aller Lösungen (Schritt 3.1) sorgfältig berechnet werden. Für die Berechnung der Endkonzentration von freiem Ca2+ in einem Puffer in Gegenwart von Chelatoren ist das Programm CALCON18 gültig. Ein Beispiel für den calciumhaltigen Reaktivierungspuffer zeigt eine frühere Studie19. Es ist zu beachten, dass eine hohe Konzentration von Ca2+ (>10−5 M) eine Deziliation 20 induziert und somit die Wirkung von Ca2+ auf die Ziliarmotilität bei niedrigeren Konzentrationen getestet werden muss, wie zuvor beschrieben 21.
Die Methode leidet unter gewissen Einschränkungen. Die Zusammensetzung des Reaktivierungspuffers spiegelt nicht unbedingt die in vivo ionischen Bedingungen wider. Wenn also ein Unterschied in der Ziliarbewegung zwischen den Zellmodellen und den lebenden Zellen beobachtet würde, müsste man vorsichtig sein, um festzustellen, ob dies aufgrund der Pufferzusammensetzung kein Artefakt ist. Wenn wir beispielsweise mit dieser klassischen Pufferzusammensetzung experimentieren, ist die Ziliarschlagfrequenz niedriger als erwartet, wenn die ATP-Konzentration >1 mM17 beträgt. Eine Lösung für dieses Problem besteht darin, die Konzentration von Mg2+ zu erhöhen und Adenosindiphosphat (ADP) zusammen mit ATP hinzuzufügen; Dann erhöht sich die Ziliarschlagfrequenz wie erwartet17. Daher ist es notwendig, die Pufferzusammensetzung entsprechend dem Zweck des Experiments zu ändern.
Das vorliegende Protokoll kann auf andere Algenarten angewendet werden, die mit Zilien schwimmen. Zum Beispiel könnte die Motilität von demembranierten Volvox rousseletii, der mehrzelligen Volvocales-Grünalge, die 5.000-10.000 Chlamydomonas-ähnliche Zellen enthält, durch Zugabe von ATP wie C. reinhardtii Zellmodellen22 reaktiviert werden. In diesem Fall waren mehrere Modifikationen erforderlich: Polyethylenglykol (PEG) wurde weggelassen, um die kugelförmige Form des demembranierten V. rousseletii zu erhalten, und die Konzentrationen von Igepal CA-630 (Waschmittel) wurden aufgrund eines Gradienten der Waschmittelempfindlichkeit vom vorderen Pol zum hinteren Pol modifiziert, der bei ersterem am höchsten und am letzteren am niedrigsten war. Mit Modifikationen wurde dieses Protokoll auch auf die kleinste mehrzellige Volvocales-Spezies, die vierzellige Tetrabaena socialis23, angewendet. Wenn das vorliegende Experiment mit einem neuen Organismus versucht werden soll, ist eine Optimierung erforderlich, indem die Arten und Konzentrationen der Komponenten in den Demembranations- und Reaktivierungspuffern, insbesondere Detergenzien und PEG, modifiziert werden. Abhängig von der Größe und Morphologie des Organismus müssen die Zentrifugationseinstellungen abgestimmt werden. Perfusion ist auch eine Option für Demembranation anstelle von Zentrifugation22.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) an N.U. (19K23758, 21K06295) und K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), von der Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) an K.W. und von der Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) an N.U. und K.W. unterstützt. Wir danken Frau Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) für ihre Hilfe bei der Vorbereitung der Figuren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
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