Summary
運動性細胞の インビトロ 再活性化は、細胞運動性のメカニズムを理解する上で重要な実験である。このプロトコルは、繊毛/鞭毛を研究するためのモデル生物である クラミドモナス・ラインハルティイの膜除去細胞モデルの再活性化を記述している。
Abstract
Szent-Györgyiが20世紀半ばに実証したATP添加によるグリセリン化筋肉の収縮に関する歴史的な実験以来、脱膜細胞のインビトロ再活性化は、細胞運動性を調べるための伝統的かつ強力な方法であった。この実験方法の基本的な利点は、再活性化溶液の組成を容易に変更できることである。例えば、生体内の膜励起のために一時的にしか起こらない高Ca2+濃度環境を実験室で再現することができる。真核生物の繊毛(別名鞭毛)は精巧な運動機構であり、その調節機構はまだ明らかにされていない。単細胞緑藻クラミドモナス・ラインハルティイは、繊毛の研究分野における優れたモデル生物である。単離繊毛の脱膜軸索などのC. reinhardtiiおよびその誘導体の膜除去細胞モデルを用いた再活性化実験は、毛様体運動の分子機構の理解に大きく貢献している。これらの実験により、ATPが毛様体運動を活性化し、Ca2+、cAMP、活性酸素種を含む様々な細胞シグナルが毛様体運動を調節することが明らかになりました。C. reinhardtii細胞のデメンブラネーションおよび細胞モデルの再活性化のための正確な方法をここで説明する。
Introduction
脱膜された運動性細胞のインビトロ再活性化は、細胞運動性の調節機構の分子基盤を研究するための貴重なツールである。Szent-Györgyiは、アデノシン三リン酸(ATP)1を添加することにより、50%グリセロールで抽出したウサギ骨格筋線維のインビトロ収縮を初めて実証した。この実験は、ATPが筋肉の収縮にエネルギーを与えることを証明した最初の実験でした。この方法論は、精子鞭毛2、ゾウリムシ繊毛3、クラミドモナス・ラインハルティイ繊毛(鞭毛とも呼ばれる)4などのATP活性化毛様体/鞭毛運動性の研究にすぐに適用され、非イオン性洗剤を用いてデメンブラネーションに使用されました。
単細胞緑藻 C. reinhardtii は繊毛を研究するためのモデル生物です:それは人間の平泳ぎのようにそれらを打つことによって2つの繊毛で泳ぎます5.毛様体運動は、マイナス末端指向性微小管ベースの運動タンパク質であるダイニン6,7によって駆動される。毛様体ダイニンは、外腕ダイニンと内腕ダイニンに分類することができる。各種類のダイニンを欠く変異体は、運動異常の異なる遅泳変異体として単離されている。これらの変異体の詳細なインビトロ運動性解析は、ダイニン研究を著しく進歩させた8。
この方法およびその誘導体を利用して、脱膜化C.ラインハルティイ細胞のin vitro再活性化実験(細胞モデル)が確立されて以来、多くの重要な知見が達成されてきた。例えば、一連のCa2+緩衝液における細胞モデルの再活性化は、2つの繊毛がサブマイクロモルCa2+によって異なる調節されることを9示し、この非対称繊毛制御は、C. reinhardtii10の光戦術配向を可能にする。さらに、両方の繊毛は、順方向遊泳モード(非対称波形と呼ばれる)から後方遊泳モード(細胞が光またはメカノショックを受けたときに短時間現れる対称波形と呼ばれる)への波形変換を示す11,12。この波形変換は、サブミリモルCa2+によって調節され、これは、いわゆる核鞭毛装置(2つの繊毛、基底体、基底体と核をつなぐ構造、および核の残骸を含む複合体)11または単離繊毛13の膜除去された軸索の再活性化によって示された。Ca2+以外に、酸化還元(還元酸化)ポイズは毛様体拍動頻度を調節するシグナルであり、これは還元型グルタチオン対酸化型グルタチオンの異なる比率を含む酸化還元緩衝液中の細胞モデルの再活性化によって示された14。さらに、環状アデノシン一リン酸(cAMP)は2つの繊毛を非対称に調節し、これは光切断可能なケージcAMP15による軸索の再活性化によって示された。これらのインビトロでの知見は、遺伝的知見と相まって、C. reinhardtiiにおける繊毛調節の分子機構のより深い理解につながった。
ここでは、細胞モデルを再アクティブ化するためのプロトコルについて説明します。この方法は簡単で、様々な改変を可能にし、繊毛とともに移動する複数の生物に適用することができる。しかし、脱膜細胞は壊れやすいため、脱毛を防ぎながら細胞モデルの運動性を良好な効率で再活性化するには、いくつかのヒントが必要です。
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Protocol
クラミドモナス・ラインハルティイの野生型株CC-125を本研究に使用した。CC-125はクラミドモナス資源センター(材料表参照)から入手し、トリス酢酸リン酸(TAP)16、1.5%アガロース培地上で20-25°Cで維持した。
1. 細胞培養
- クラミドモナス・ラインハルティイ(CC-125)をTAP培地16中で、12時間/12時間の明暗期(明期の明条件:~50μmol光子m−2s−1白色光)で20-25°Cで2日間培養した(図1)。
注:細胞は中間対数成長期にある必要があります(ムービー1)。長時間の培養(>4日間、対数増殖後期または静止期)は、脱膜化細胞モデルの再活性化効率を低下させる。
図1:培養2日後の液体培養。 TAP−1.5%寒天プレートから、白金ループを埋めるように野生型細胞の塊を、フラスコ内の〜150mLのTAP液体培地に接種した。2日間培養後の細胞密度は2.3×106個 /mLであった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
映画1:生細胞の水泳。 細胞を10倍の対物レンズと油浸暗視野凝縮器で顕微鏡下で観察した。スケール バー = 100 μm。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
2. 変性細胞モデルの作製
注:実験を開始する前に、洗浄バッファーを室温に保ち、デメンブラネーション、希釈、再活性化バッファー、およびATP溶液を氷上に保管してください。これらの緩衝剤の組成は、 補足表1に提供される。
- 遠心分離機〜10mLの液体培養を1000× g で20°Cで3分間遠心分離する。
注:このステップからのプロトコル全体を通して、オートクレーブ処理されたプラスチック製品(チューブ、ピペットチップなど)を使用しないでください。円錐管の場合は、再利用したものが好ましい。2日間培養後の細胞密度は、典型的には1.0〜5.0×106 細胞/mLであり得る。細胞密度がこれより低い場合、〜5〜107 個の細胞を含むのに十分な培養体積×取る。 - 上清を捨て、まずデカンテーションによって、次いでパスツールピペットによって、沈殿物を〜5mLの洗浄緩衝液に再懸濁した。
- 洗浄バッファー中の細胞を1000× g で20°Cで3分間遠心分離する。
- 上清をピペットで丁寧に捨てます(図2)。
注:パスツールピペットが好ましい。マイクロピペットを使用する場合は、オートクレーブ処理されたピペットチップの使用を避けてください。 - 細胞ペレット上に約0.5 mLのデメンブラネーション緩衝液を重ね、手でチューブを軽く振って細胞を緩衝液に大まかに懸濁させ、チューブを氷上に置きます(図3A)。
注:現時点では、ペレットを完全に懸濁させる必要はありません。細胞モデルが再活性化されるとき、デメンブレーションおよび再活性化バッファー中の MgSO4 の濃度を 15 mM に上げ、安定した再活性化のために最終 ATP 濃度を >1 mM にしてください17. - 残りの細胞ペレットをピペットで穏やかに懸濁し、チューブを再び氷の上に置きます(図3B)。
- 5~10 μLの細胞モデルを採取し、希釈バッファーで10倍に希釈し、顕微鏡下で観察し(動画2)、すべての細胞モデルが膜外であり、遊泳していないことを確認します(図4)。
注:一部の細胞がまだ泳いでいる(生きている)場合は、デメンブラン化バッファーで使用されている非イオン性洗剤を細胞モデル溶液に直接添加して、終濃度が約0.15%になります。あるいは、0.15%の洗剤を含むデメンブラネーション溶液でステップ2.1〜2.5を繰り返します。
図2:上清を捨てる。 上清の残りの部分は、チューブのデカンテーションによって上清を除去した後、パスツールピペットで慎重に除去した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)0.5 mLのデメンブラネーション溶液を細胞ペレット上に重ね合わせた後、溶液を手で混合し、細胞を粗く懸濁する。(b)混合後、残りの細胞ペレットをパスツールピペットによって溶液中に完全に懸濁した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:デメンブラネーションの効果 (A)スライドガラスに貼り付けられた生細胞。(B)スライドガラスに貼り付けたセルモデル。細胞モデルでは、繊毛がわずかに細くなったことに注意してください。画像は、20倍の対物レンズと油浸暗視野コンデンサーを備えた顕微鏡下で観察された。スケール バー = 10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
映画2:デメンブラネーションの確認。 細胞モデル懸濁液を、10倍の対物レンズおよび油浸暗視野凝縮器を用いて顕微鏡下で観察した。泳いでいる独房はありませんでした。スケール バー = 100 μm。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
3. 膜除去細胞モデルの再活性化
- チューブをタップして、80 μL の再活性化溶液、10 μL の ATP 溶液、および 10 μL の細胞モデルを 0.5 mL チューブに混ぜます (図 5)。
注:毛様体運動のパラメータである毛様体拍動頻度はATP濃度とともに増加し、ATP17の2〜3mMで飽和するため、最終ATP濃度は<3mMでなければなりません。
警告: ピペッティングまたはボルテックスによる混合は、デシリレーションの原因となり、再活性化効率が低下します。- <0.2 mM の ATP で再活性化するには、70 U/mL のクレアチンキナーゼや 5 mM のクレアチンリン酸などの ATP 再生システムを追加します ( 材料表を参照)。
注:再活性化溶液は、希釈溶液よりも高い濃度(1.125x、補足表1)で調製され、水に溶解したATPを混合した後、内容物が以下の最終濃度に達する:30mMのHepes(pH7.4)、5mMのMgSO4、1mMのジチオスレイトール(DTT)、1mMのEGTAおよび50mMの酢酸カリウム(材料表参照)。
- <0.2 mM の ATP で再活性化するには、70 U/mL のクレアチンキナーゼや 5 mM のクレアチンリン酸などの ATP 再生システムを追加します ( 材料表を参照)。
- 約30 μLの混合溶液をスライドガラスの上に置き、細胞モデルへの機械的衝撃を避けるために、スペーサーでカバースリップをそっと置きます(図6)。
注:白い石油または両面粘着テープを使用してスペーサーを作ることができます。 - 再活性化された細胞モデルを顕微鏡下で観察する(動画3)。
図5:チューブをタッピングして混合溶液を混合する 。 (A)80 μLの再活性化溶液、10 μLのATP溶液、および10 μLの細胞モデルを順次添加した。(b)チューブを指で叩いて溶液を混合した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:カバースリップの端にスペーサーを作る (A)白い石油の薄い層を手の甲に塗布した。(B)少量の白色石油をカバースリップの端で削り取った。(C)カバースリップの端にスペーサーが作られました。(D) 反対側の端に別のスペーサーが作られた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
動画3:再活性化細胞モデルの遊泳 細胞モデルの運動性は、終濃度1mMでATPを添加することによって再活性化され、10倍の対物レンズおよび油浸暗視野凝縮器を用いて顕微鏡下で観察された。スケール バー = 100 μm。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
C. reinhardtii野生型株(CC-125)におけるデメンブラン化および再活性化プロセスをここに示す。接種後2日目の培養液は淡緑色となった(工程1.1)(図1)。細胞を回収し(ステップ2.1)、洗浄し(ステップ2.2)、および膜除去した(ステップ2.5)。デメンブラネーション後、すべての細胞モデルは不動になった(ステップ2.7)。脱膜繊毛(軸索と呼ばれる)は細胞体に付着したままであり、これは細胞モデルの不動性が脱毛によって引き起こされないことを示している(図4)。再活性化緩衝液およびATPと混合した後(ステップ3.1)、細胞モデルの>50%が運動性になった(ステップ3.2)。再活性化率は、ステップ3.1で穏やかで徹底的な混合によって増加する。(%運動性細胞)。ATP再生システムがなくても(ステップ3.1.1)、再活性化細胞は最終ATP濃度1mMで〜90分間移動し続け、その後徐々に移動を停止した。
補足表1:研究で使用した溶液および緩衝液の組成。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルには 2 つの重要な手順があります。1つ目は、デメンブラネーションとして知られるプロセスであり、穏やかに、しかし徹底的に実行する必要があります。脱鼠(すなわち、細胞体からの繊毛の剥離)は、激しいピペッティングまたはボルテックスによって誘導され、ATPの添加後でさえも細胞モデルを不動にする。典型的には、5×107 個の細胞を〜0.5mLのデメンブラン化緩衝液に懸濁する(最終細胞密度:1×108 細胞/mL)。細胞モデルの密度がこれよりはるかに低い場合(例えば、1×106 細胞/mL)に細胞モデルの再活性化率は低下するであろう。再活性化に対するこれらの細胞モデル密度の影響は不明であるが、細胞抽出物にはおそらく再活性化を助ける因子が含まれている。もちろん、細胞密度が高いほど、徹底的なデメンブラネーションが難しくなります。不十分なデメンブラネーションは、生細胞を細胞モデルで汚染する結果となり得る。この場合、移動する細胞はステップ2.7で見ることができます。生細胞の汚染は、再活性化バッファーに添加されたATPまたは他の成分(Ca2+など)の影響の誤った解釈につながります。このステップには熟練度が必要です。
2 番目の重要なステップは、再アクティブ化です。デメンブラネーション工程と同様に、溶液を混合するための激しいピペッティングもデシリレーションを誘発する。従って、溶液をタッピングチューブで混合することが好ましい。このステップには熟練度も必要です。さらに、溶液の容量が100μLの場合(このプロトコルに記載されているように)、このステップでは0.5mLチューブを使用することが推奨されます。
「はじめに」で述べたように、このプロトコルの利点の1つは、インビボで濃度が一過性にしか上昇しない様々な生物学的シグナルの影響をインビトロで調べることができることである。例えば、Ca2+を再活性化溶液に加えることができる。この場合のEGTAのキレート化効果のため、すべての溶液を混合した後の最終カルシウム濃度(ステップ3.1)を慎重に計算する必要があります。キレート剤の存在下で緩衝液中の遊離Ca2+の最終濃度を計算するために、プログラムCALCON18が有効である。カルシウム含有再活性化緩衝液の一例は、以前の研究19に示されている。高濃度のCa2+(>10−5M)は脱毛20を誘導するので、毛様体運動性に対するCa2+の効果は、前述のようにより低い濃度で試験されなければならないことに留意されたい21。
この方法には一定の制限があります。再活性化緩衝液の組成は、必ずしもインビボイオン条件を反映していない。したがって、細胞モデルと生細胞の間で毛様体運動に何らかの違いが観察された場合、これがバッファー組成によるアーチファクトではないかどうかを判断するために注意する必要があります。例えば、この古典的なバッファー組成物で実験すると、ATP濃度が>1mM17の場合、毛様体拍動頻度は予想よりも低くなります。この問題の解決策は、Mg2+濃度を増加させ、ATPと共にアデノシン二リン酸(ADP)を添加することである。その後、毛様体拍動頻度は予想通り増加する17。従って、実験の目的に応じて緩衝液組成を変更する必要がある。
本プロトコールは、繊毛と共に泳ぐ他の藻類種に適用することができる。例えば、脱膜化ボルボックス・ルセレティの運動性は、5,000〜10,000個のクラミドモナス様細胞を含む多細胞ボルボカレス緑藻に、 C.ラインハルティイ 細胞モデル22のようなATPを添加することによって再活性化することができた。ポリエチレングリコール(PEG)は、デメンブラン化された V. rousseletiiの球形を維持するために省略され、Igepal CA-630(洗剤)の濃度は、前極から後極への洗剤感受性の勾配のために修正され、前者で最高であり、後者で最も低い。修正を加えて、このプロトコルは最小の多細胞ボルボケール種、4細胞 テトラベナ・ソーシャリス23にも適用された。本実験を新しい生物で試みる場合、デメンブラン化および再活性化緩衝液、特に洗剤およびPEG中の成分の種類および濃度を変更することによって最適化が必要となる。生物の大きさと形態に応じて、遠心分離設定を調整する必要があります。灌流はまた、遠心分離22の代わりにデメンブラネーションのためのオプションである。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
本研究は、日本学術振興会(https://www.jsps.go.jp/english/index.html)からN.U.(19K23758, 21K06295)およびK.W.(19H03242, 20K21420, 21H00420)への助成金、財団法人大隅フロンティアサイエンス財団(https://www.ofsf.or.jp/en/)から株式会社への助成金、および http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/ からN.U.およびK.W.への人的・環境・材料架け橋活動連携(Dynamic Alliance for Open Innovation Bridge Human and Environment and Materials)からの助成金によって支援されました。篠原みゆきさん(法政大学)がフィギュア作成に協力してくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
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