Summary
In vitro-reaktivering av rörliga celler är ett avgörande experiment för att förstå mekanismerna för cellmotilitet. Protokollet beskriver återaktivering av de demembranerade cellmodellerna av Chlamydomonas reinhardtii, en modellorganism för att studera cilia/flagella.
Abstract
Sedan det historiska experimentet på sammandragning av glycerinerad muskel genom tillsats av ATP, som Szent-Györgyi demonstrerade i mitten av 20-talet, har in vitro-reaktivering av demembranerade celler varit ett traditionellt och potent sätt att undersöka cellmotilitet. Den grundläggande fördelen med denna experimentella metod är att sammansättningen av reaktiveringslösningen lätt kan ändras. Till exempel kan en koncentrationsmiljö med hög Ca2+ som endast uppstår tillfälligt på grund av membranexcitation in vivo replikeras i labbet. Eukaryota cilia (aka flageller) är utarbetade rörlighetsmaskiner vars regleringsmekanismer ännu inte har klargjorts. Den encelliga gröna algen Chlamydomonas reinhardtii är en utmärkt modellorganism inom forskningsfältet flimmerhår. Reaktiveringsexperimenten med hjälp av demembranerade cellmodeller av C. reinhardtii och deras derivat, såsom demembranerade axonemer av isolerade cilia, har signifikant bidragit till att förstå de molekylära mekanismerna för ciliär motilitet. Dessa experiment klargjorde att ATP ger energi till ciliär rörlighet och att olika cellulära signaler, inklusive Ca2+, cAMP och reaktiva syrearter, modulerar ciliära rörelser. Den exakta metoden för demembranering av C. reinhardtii-celler och reaktivering av cellmodellerna beskrivs här.
Introduction
In vitro-reaktivering av demembranerade rörliga celler är ett värdefullt verktyg för att studera den molekylära grunden för regleringsmekanismen för cellmotilitet. Szent-Györgyi visade först in vitro-sammandragning av kaninskelettmuskelfibrer extraherade med 50% glycerol genom tillsats av adenosintrifosfat (ATP)1. Detta experiment var det första som bevisade att ATP ger energi till muskelkontraktion. Metoden tillämpades snart på studien av ATP-energisk ciliär/flagellärmotilitet, såsom sperm flagella2, Paramecium cilia3 och Chlamydomonas reinhardtii cilia (även kallad flagella)4 med hjälp av icke-joniska tvättmedel för hågkomst.
Den encelliga gröna algen C. reinhardtii är en modellorganism för att studera flimmerhår: den simmar med två flimmerhår genom att slå dem som en människas bröstsim5. Ciliary rörelse drivs av dynein, ett minus-end riktat mikrotubulibaserat motorprotein 6,7. Ciliary dyneiner kan klassificeras i yttre armen dyneiner och inre arm dyneiner. Mutanter som saknar varje typ av dynein har isolerats som långsamt simmande mutanter med olika rörlighetsavvikelser. Detaljerad in vitro-motilitetsanalys av dessa mutanter har signifikant avancerad dyneinforskning8.
Många viktiga fynd har uppnåtts med hjälp av denna metod och dess derivat sedan in vitro-reaktiveringsexperimentet av demembranerade C. reinhardtii-celler (cellmodeller) etablerades. Reaktivering av cellmodeller i en serie Ca2+ buffertar visade till exempel9 att två flimmerhår regleras olika av submikromolär Ca2+, och denna asymmetriska ciliakontroll möjliggör den fototaktiska orienteringen av C. reinhardtii10. Dessutom visar båda flimmerhåren vågformsomvandling från det framåtriktade simläget (kallat asymmetrisk vågform) till bakåtsimningsläget (kallat symmetrisk vågform som visas under en kort period när celler är foto- eller mekanochockade)11,12. Denna vågformsomvandling regleras av submillimolar Ca2+, vilket visades genom reaktivering av den så kallade nukleoflagellarapparaten (ett komplex innehållande två cilia, de basala kropparna, strukturerna som förbinder basalkropparna med kärnan och återstoden av kärnan)11 eller demembranerade axonemer av isolerade cilia13. Annat än Ca2+ är redox (reduktion-oxidation) poise en signal som reglerar ciliär slagfrekvensen, vilket visades genom reaktivering av cellmodeller i redoxbuffertar innehållande olika förhållanden av reducerad glutation kontra oxiderad glutation14. Dessutom reglerar cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) asymmetriskt två cilia, vilket visades genom reaktivering av axonemer med fotocleavable caged cAMP15. Dessa in vitro-fynd, i kombination med genetiska fynd, har lett till en djupare förståelse av de molekylära mekanismerna för ciliareglering i C. reinhardtii.
Ett protokoll för att återaktivera cellmodellerna beskrivs här. Metoden är enkel, möjliggör olika modifieringar och kan tillämpas på flera organismer som rör sig med cilia. Men eftersom demembranerade celler är ömtåliga kräver det några tips för att återaktivera cellmodellernas rörlighet med god effektivitet samtidigt som de förhindrar decilation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En vildtypsstam av Chlamydomonas reinhardtii, CC-125, användes för den aktuella studien. CC-125 erhölls från Chlamydomonas Resource Center (se materialtabell) och upprätthölls på ett Tris-acetatfosfat (TAP)16, 1,5% agarosmedium vid 20-25 °C.
1. Cellodling
- Kultur Chlamydomonas reinhardtii (CC-125) i TAP medium16 i en 12 h/12 h ljus-mörk period (ljusförhållanden för ljusperioden: ~50 μmol fotoner m−2 s−1 vitt ljus) vid 20-25 °C i 2 dagar (figur 1).
OBS: Cellerna måste vara i en mitten av logaritmisk tillväxtfas (film 1). Lång odling (>4 dagar, i sen logaritmisk tillväxt eller stationär fas) minskar reaktiveringseffektiviteten hos demembranerade cellmodeller.
Figur 1: Flytande kultur efter 2-dagars odling. Från en TAP-1.5% agarplatta inokulerades en bit vildtypsceller för att fylla platinaslingan till ~ 150 ml TAP flytande medium i en kolv. Celltätheten efter 2-dagars odling var 2,3 × 106 celler/ml. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: Simning av levande celler. Celler observerades under ett mikroskop med en 10x objektivlins och en oljedämpande mörkfältskondensor. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
2. Beredning av demembranerade cellmodeller
OBS: Innan du påbörjar experimentet, håll tvättbufferten vid rumstemperatur och demembranerings-, utspädnings-, reaktiveringsbuffertarna och ATP-lösningen på is. Sammansättningen av dessa buffertar anges i tilläggstabell 1.
- Centrifugera ~10 ml flytande odling vid 1000 × g vid 20 °C i 3 min.
OBS: Under hela protokollet från detta steg, använd inte autoklaverade plaströr (rör, pipettspetsar etc.), vilket minskar reaktiveringseffektiviteten. För koniska rör är återanvända att föredra. Celldensiteten efter 2-dagars odling kan vanligtvis vara 1,0-5,0 × 106 celler / ml. När celldensiteten är lägre än detta, ta tillräckligt med odlingsvolym för att innehålla ~ 5 × 107 celler. - Kassera supernatanten, först genom dekantering och sedan med en Pasteur-pipett, och återsuspendera fällningarna i ~ 5 ml tvättbuffert.
- Centrifugera cellerna i tvättbufferten vid 1000 × g i 3 min vid 20 °C.
- Kassera supernatanten försiktigt med en pipett (figur 2).
OBS: Pasteurpipetter är att föredra. När du använder mikropipetter, undvik att använda pipettspetsar som har autoklaverats. - Lägg över ~ 0,5 ml demembraneringsbuffert på en cellpellets, skaka röret försiktigt för hand för att grovt suspendera cellerna i bufferten och lägg röret på is (figur 3A).
OBS: Det är inte nödvändigt att helt avbryta pelleten just nu. Höj koncentrationen av MgSO4 till 15 mM i demembranerings- och reaktiveringsbuffertarna när cellmodeller återaktiveras, med en slutlig ATP-koncentration >1 mM för stabil reaktivering17. - Suspendera den återstående cellpelleten försiktigt med en pipett och lägg röret på is igen (figur 3B).
- Ta 5-10 μL av cellmodellerna, späd 10 gånger med utspädningsbufferten och observera under mikroskopet (film 2) för att bekräfta att alla cellmodeller är demembranerade och inte simmar (figur 4).
OBS: Om vissa celler fortfarande simmar (levande), tillsätt det icke-joniska tvättmedlet som används i hågkomstbufferten direkt till cellmodelllösningen till den slutliga koncentrationen på ~ 0,15%. Alternativt kan du upprepa steg 2.1-2.5 med hågkomstlösningen som innehåller 0,15% tvättmedel.
Bild 2: Kassera supernatanten. Resten av supernatanten avlägsnades försiktigt med en Pasteur-pipett efter att supernatanten avlägsnats genom dekantering av röret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(A) Efter att ha lagt över 0,5 ml demembraneringslösning på cellpelleten blandades lösningen med en hand för att suspendera cellerna grovt. (B) Efter blandning suspenderades resten av cellpelleten helt i lösningen med en Pasteur-pipett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Effekter av hågkomst. (A) En levande cell som sitter fast på en glasskiva. (B) En cellmodell som sitter fast på en glasskiva. Observera att i cellmodellen blev cilia något tunnare. Bilderna observerades under ett mikroskop med en 20x objektivlins och en oljedämpande mörkfältskondensor. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Film 2: Bekräftelse av hågkomst. Cellmodellupphängning observerades under ett mikroskop med en 10x objektivlins och en oljedämpande mörkfältskondensor. Ingen cell simmade. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
3. Reaktivering av demembranerade cellmodeller
- Blanda 80 μl reaktiveringslösning, 10 μl ATP-lösning och 10 μl cellmodeller i ett 0,5 ml rör genom att knacka på röret (figur 5).
OBS: Den slutliga ATP-koncentrationen måste vara <3 mM eftersom ciliär slagfrekvens, en parameter för ciliär rörelse, ökar med ATP-koncentration och mättas vid 2-3 mM ATP17.
VARNING: Blandning genom pipettering eller virvel orsakar decilation och minskar reaktiveringseffektiviteten.- För återaktivering med <0,2 mM ATP, lägg till ett ATP-regenereringssystem, såsom 70 U / ml kreatinkinas och 5 mM kreatinfosfat (se materialtabell).
ANMÄRKNING: Reaktiveringslösningen bereds med en högre koncentration (1,125x, tilläggstabell 1) än utspädningslösningen så att innehållet efter blandning av ATP upplöst i vatten når följande slutliga koncentrationer: 30 mM Hepes (pH 7,4), 5 mM MgSO4, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM EGTA och 50 mM kaliumacetat (se materialtabell).
- För återaktivering med <0,2 mM ATP, lägg till ett ATP-regenereringssystem, såsom 70 U / ml kreatinkinas och 5 mM kreatinfosfat (se materialtabell).
- Lägg ~ 30 μL av den blandade lösningen på en glasskiva och placera försiktigt ett täckglas på den med distanser för att undvika mekanisk chock på cellmodellerna (figur 6).
OBS: Vit petroleum eller dubbelhäftande tejp kan användas för att tillverka distanserna. - Observera de återaktiverade cellmodellerna under ett mikroskop (film 3).
Figur 5: Blandningslösning genom att knacka på röret(A) Till 80 μL av reaktiveringslösningen tillsattes 10 μL ATP-lösning och 10 μL cellmodeller i sekventiell ordning. (B) Lösningen blandades genom att knacka på röret med ett finger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Tillverkning av distanser på täckglaskanter. (B) En liten mängd vit petroleum skrapades bort med en kant på ett täckglas. (C) En distans gjordes på kanten av ett täckglas. (D) En annan distans gjordes på motsatt kant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 3: Simning av reaktiverade cellmodeller. Cellmodellernas rörlighet återaktiverades genom tillsats av ATP vid en slutlig koncentration av 1 mM och observerades under ett mikroskop med en 10x objektivlins och en oljedämpande mörkfältskondensor. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Demembranerings- och reaktiveringsprocessen i C. reinhardtii vildtypstam (CC-125) visas här. Kulturen 2 dagar efter inokulering blev en ljusgrön färg (steg 1.1) (Figur 1). Cellerna samlades in (steg 2.1), tvättades (steg 2.2) och demembranerades (steg 2.5). Efter hågkomst blev alla cellmodeller omogna (steg 2.7). De demembranerade cilia (kallade axonemer) förblir fästa vid cellkroppen, vilket visar att cellmodellernas omognad inte orsakas av decilation (Figur 4). Efter blandning med reaktiveringsbufferten och ATP (steg 3.1) blev >50% av cellmodellerna rörliga (steg 3.2). Reaktiveringshastigheten ökas genom skonsam och noggrann blandning i steg 3.1. (% rörliga celler). Även utan ATP-regenereringssystemet (steg 3.1.1) fortsatte de återaktiverade cellerna att röra sig i ~ 90 minuter med den slutliga ATP-koncentrationen på 1 mM innan de gradvis stoppade rörelsen.
Tilläggstabell 1: Sammansättning av lösningar och buffertar som använts i studien. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns två kritiska steg i detta protokoll. Den första är en process som kallas hågkomst, som måste utföras försiktigt men noggrant. Decilation (dvs. lossning av cilia från cellkroppen) induceras genom kraftig pipettering eller virvel, vilket gör cellmodellerna orörliga även efter tillsats av ATP. Vanligtvis suspenderas 5 × 107 celler i ~ 0,5 ml demembraneringsbuffert (slutlig celltäthet: 1 × 108 celler / ml). Cellmodellernas reaktiveringshastighet skulle minska om cellmodelldensiteten är mycket lägre än detta (t.ex. 1 × 106 celler / ml). Dessa cellmodelldensitetseffekter på reaktivering är oklara, men cellextrakten innehåller förmodligen de faktorer som hjälper till att återaktivera. Naturligtvis, ju högre celltäthet, desto svårare blir det för grundlig demembranering. Otillräcklig hågkomst kan leda till att levande celler förorenas med cellmodeller. Rörliga celler kan sesi detta fall i steg 2.7. Kontaminering av levande celler kommer att leda till misstolkning av effekterna av ATP eller andra komponenter (såsom Ca2+) som läggs till reaktiveringsbufferten. Det här steget behöver kunskaper.
Det andra kritiska steget är återaktivering. I likhet med hågkomststeget inducerar kraftig pipettering för blandning av lösningen också decilation. Således är blandningslösningar med tapprör att föredra. Detta steg behöver också färdigheter. Dessutom rekommenderas användning av 0,5 ml rör i detta steg när lösningens volym är 100 μL (som beskrivs i detta protokoll).
Som anges i inledningen är en fördel med detta protokoll att det gör det möjligt att undersöka effekterna av olika biologiska signaler in vitro vars koncentrationer endast är tillfälligt förhöjda in vivo. Till exempel kan Ca2+ läggas till i reaktiveringslösningen. På grund av keleringseffekterna av EGTA i detta fall måste den slutliga kalciumkoncentrationen efter blandning av alla lösningar (steg 3.1) beräknas noggrant. För beräkning av den slutliga koncentrationen av fri Ca2+ i en buffert i närvaro av kelatorer är programmet CALCON18 giltigt. Ett exempel på den kalciumhaltiga reaktiveringsbufferten visas i en tidigare studie19. Det bör noteras att en hög koncentration av Ca2+ (>10−5 M) inducerar decilation20, och därför måste effekten av Ca2+ på ciliär rörlighet testas vid lägre koncentrationer som tidigarebeskrivits 21.
Metoden har vissa begränsningar. Reaktiveringsbuffertens sammansättning återspeglar inte nödvändigtvis jonförhållandena in vivo . Så om någon skillnad i ciliärrörelsen observerades mellan cellmodellerna och de levande cellerna, skulle man behöva vara försiktig med att avgöra om detta inte är en artefakt på grund av buffertkompositionen. Om vi till exempel experimenterar med denna klassiska buffertkomposition är ciliärslagfrekvensen lägre än förväntat när ATP-koncentrationen är >1 mM17. En lösning på detta problem är att öka Mg2+ koncentrationen och att tillsätta adenosindifosfat (ADP) tillsammans med ATP; sedan ökar ciliärslagfrekvensen som förväntat17. Således är det nödvändigt att ändra buffertkompositionen enligt syftet med experimentet.
Det nuvarande protokollet kan tillämpas på andra algarter som simmar med flimmerhår. Till exempel kan rörligheten hos demembranerade Volvox rousseletii, den flercelliga Volvocales gröna algen som innehåller 5 000-10 000 Chlamydomonas-liknande celler, återaktiveras genom att lägga till ATP som C. reinhardtii-cellmodeller 22. Flera modifieringar krävdes i detta fall: polyetylenglykol (PEG) utelämnades för att bevara den sfäriska formen av demembranerad V. rousseletii, och koncentrationerna av Igepal CA-630 (tvättmedel) modifierades på grund av en gradient i tvättmedelskänsligheten från den främre polen till den bakre polen, som var högst vid den förra och lägsta vid den senare. Med modifieringar tillämpades detta protokoll också på den minsta flercelliga Volvocales-arten, fyrcellig Tetrabaena socialis23. Om det aktuella experimentet ska prövas med en ny organism kommer optimering att vara nödvändig genom att modifiera typerna och koncentrationerna av komponenterna i demembranations- och reaktiveringsbuffertarna, särskilt tvättmedel och PEG. Beroende på organismens storlek och morfologi måste centrifugeringsinställningarna ställas in. Perfusion är också ett alternativ för hågkomst istället för centrifugering22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) till N.U. (19K23758, 21K06295) och K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), från Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) till K.W., och från Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) till N.U. och K.W. Vi tackar Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) för hennes hjälp med att förbereda figurerna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Szent-Gyorgyi, A. Free-energy relations and contraction of actomyosin. Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).
- Hoffman-Berling, H. Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen. Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).
- Naitoh, Y., Kaneko, H. Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions. Science. 176 (4034), 523-524 (1972).
- Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components. Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes. Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).
- Sale, W. S., Satir, P. Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).
- Fox, L. A., Sale, W. S. Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules. Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).
- Kamiya, R., Yagi, T. Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants. Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, Pt 3 529-537 (2005).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Saegusa, Y., Yoshimura, K. cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas. Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).
- bio.chuo-u. , Available from: http://www.bio.chuo-u.ac.jp/nano/calcon.html (2022).
- Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).
- Yueh, Y. G., Crain, R. C. Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry. Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).
- Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation. Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).
- Ueki, N., Wakabayashi, K. Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
