Summary
गतिशील कोशिकाओं के इन विट्रो पुनर्सक्रियन में सेल गतिशीलता के तंत्र को समझने में एक महत्वपूर्ण प्रयोग है। प्रोटोकॉल क्लैमाइडोमोनास रेनहार्ड्टी के डिमेम्ब्रेनेटेड सेल मॉडल को फिर से सक्रिय करने का वर्णन करता है, जो सिलिया / फ्लैगेला का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव है।
Abstract
एटीपी जोड़कर ग्लिसरिनेटेड मांसपेशियों के संकुचन पर ऐतिहासिक प्रयोग के बाद से, जो 20 वीं शताब्दी के मध्य में स्ज़ेंट-ग्योर्गी ने प्रदर्शित किया था, डिमेम्ब्रेनेटेड कोशिकाओं के इन विट्रो पुनर्सक्रियन में सेल गतिशीलता की जांच करने का एक पारंपरिक और शक्तिशाली तरीका रहा है। इस प्रयोगात्मक विधि का मौलिक लाभ यह है कि पुनर्सक्रियन समाधान की संरचना को आसानी से बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक उच्च-सीए2 + एकाग्रता वातावरण जो केवल विवो में झिल्ली उत्तेजना के कारण अस्थायी रूप से होता है, प्रयोगशाला में दोहराया जा सकता है। यूकेरियोटिक सिलिया (उर्फ फ्लैगेला) विस्तृत गतिशीलता मशीनरी हैं जिनके नियामक तंत्र को अभी भी स्पष्ट किया जाना है। एककोशिकीय हरे रंग की अल्गा क्लैमीडोमोनास रेनहार्ड्टिई सिलिया के अनुसंधान क्षेत्र में एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है। रेनहार्ड्टी और उनके डेरिवेटिव के डिमेम्ब्रेनेटेड सेल मॉडल का उपयोग करके पुनर्सक्रियन प्रयोगों, जैसे कि पृथक सिलिया के डिमेम्ब्रेनेटेड एक्सोनेम्स ने सिलिअरी गतिशीलता के आणविक तंत्र को समझने में महत्वपूर्ण योगदान दिया है। उन प्रयोगों ने स्पष्ट किया कि एटीपी सिलिअरी गतिशीलता को सक्रिय करता है और सीए2 +, सीएएमपी और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों सहित विभिन्न सेलुलर सिग्नल, सिलिअरी आंदोलनों को संशोधित करते हैं। सी रेनहार्ड्टिई कोशिकाओं के विघटन और सेल मॉडल के पुनर्सक्रियन के लिए सटीक विधि यहां वर्णित है।
Introduction
डिमेम्ब्रेनेटेड गतिशील कोशिकाओं के इन विट्रो पुनर्सक्रियन सेल गतिशीलता के नियामक तंत्र के लिए आणविक आधार का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। स्ज़ेंट-ग्योर्गी ने पहली बार खरगोश कंकाल की मांसपेशी फाइबर के विट्रो संकुचन में एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) 1 जोड़कर 50% ग्लिसरॉल के साथ निकाला। यह प्रयोग यह साबित करने वाला पहला था कि एटीपी मांसपेशियों के संकुचन को सक्रिय करता है। फ्लैगेलर गतिशीलता के अध्ययन के लिए लागू किया गया था, जैसे कि शुक्राणु फ्लैगेला2, पैरामेशियम सिलिया3, और क्लैमिडोमोनास रेनहार्ड्टिई सिलिया (जिसे फ्लैगेला भी कहा जाता है) 4 डिमेम्ब्रेनेशन के लिए गैर-आयनिक डिटर्जेंट का उपयोग करके।
रेनहार्ड्टी सिलिया का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव है: यह मानव के ब्रेस्टस्ट्रोक5 की तरह उन्हें मारकर दो सिलिया के साथ तैरता है। सिलिअरी गति डाइनिन द्वारा संचालित होती है, एक माइनस-एंड निर्देशित सूक्ष्मनलिका-आधारित मोटर प्रोटीन 6,7। सिलिअरी डाइनिन को बाहरी-बांह डाइनिन और आंतरिक-बांह डाइनिन में वर्गीकृत किया जा सकता है। प्रत्येक प्रकार के डायनेन की कमी वाले म्यूटेंट को अलग-अलग गतिशीलता असामान्यताओं के साथ धीमी तैराकी म्यूटेंट के रूप में अलग किया गया है। इन म्यूटेंट के इन विट्रो गतिशीलता विश्लेषण में विस्तृत ने डायनेन अनुसंधान 8 को काफी उन्नतकिया है।
इस विधि और इसके डेरिवेटिव का उपयोग करके कई महत्वपूर्ण निष्कर्ष प्राप्त किए गए हैं क्योंकि डिमेम्ब्रेनेटेड सी रेनहार्ड्टिई कोशिकाओं (सेल मॉडल) के इन विट्रो पुनर्सक्रियन प्रयोग की स्थापना की गई थी। उदाहरण के लिए, सीए2 + बफर की एक श्रृंखला में सेल मॉडल के पुनर्सक्रियन ने9 दिखाया कि दो सिलिया को सबमाइक्रोमोलर सीए2 + द्वारा अलग-अलग विनियमित किया जाता है, और यह विषम सिलिया नियंत्रण सी। इसके अलावा, दोनों सिलिया आगे तैराकी मोड (असममित तरंग कहा जाता है) से पिछड़े तैराकी मोड (सममित तरंग कहा जाता है कि एक छोटी अवधि के लिए प्रकट होता है जब कोशिकाओं फोटो या मेचानो-चौंक जाते हैं) 11,12 करने के लिए तरंग रूपांतरण दिखाते हैं। इस तरंग रूपांतरण को सबमिलिमोलर सीए2 + द्वारा विनियमित किया जाता है, जिसे तथाकथित न्यूक्लियोफ्लैगेलर उपकरण (दो सिलिया, बेसल निकायों, नाभिक के साथ बेसल निकायों को जोड़ने वाली संरचनाओं, और नाभिक के अवशेष युक्त एक परिसर) के पुनर्सक्रियन द्वारा दिखाया गयाथा। सीए2 + के अलावा, रेडॉक्स (कमी-ऑक्सीकरण) शिष्टता एक संकेत है जो सिलिअरी बीटिंग आवृत्ति को नियंत्रित करता है, जिसे रेडॉक्स बफर में सेल मॉडल के पुनर्सक्रियन द्वारा दिखाया गया था जिसमें कम ग्लूटाथियोन बनाम ऑक्सीकरण ग्लूटाथियोन14 के विभिन्न अनुपात होते हैं। इसके अलावा, चक्रीय एडेनोसाइन मोनोफॉस्फेट (सीएएमपी) असममित रूप से दो सिलिया को नियंत्रित करता है, जिसे फोटोक्लेवेबल पिंजरे वाले सीएएमपी15 के साथ एक्सोनेम के पुनर्सक्रियन द्वारा दिखाया गया था। इन इन विट्रो निष्कर्षों में, आनुवांशिक निष्कर्षों के साथ संयुक्त, सी रेनहार्ड्टी में सिलिया विनियमन के आणविक तंत्र की गहरी समझ का नेतृत्व किया है।
सेल मॉडल को फिर से सक्रिय करने के लिए एक प्रोटोकॉल यहां वर्णित है। विधि सरल है, विभिन्न संशोधनों के लिए अनुमति देता है, और कई जीवों पर लागू किया जा सकता है जो सिलिया के साथ चलते हैं। हालांकि, क्योंकि डिमेम्ब्रेनेटेड कोशिकाएं नाजुक होती हैं, इसलिए इसे डिसिलिएशन को रोकने के दौरान अच्छी दक्षता के साथ सेल मॉडल की गतिशीलता को फिर से सक्रिय करने के लिए कुछ युक्तियों की आवश्यकता होती है।
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Protocol
वर्तमान अध्ययन के लिए क्लैमिडोमोनास रेनहार्ड्टिई, सीसी -125 के एक जंगली प्रकार के तनाव का उपयोग किया गया था। सीसी -125 को क्लैमिडोमोनास रिसोर्स सेंटर ( सामग्री की तालिका देखें) से प्राप्त किया गया था और 20-25 डिग्री सेल्सियस पर ट्रिस-एसीटेट-फॉस्फेट (टीएपी) 16, 1.5% एगारोज माध्यम पर बनाए रखा गया था।
1. सेल संस्कृति
- 12 घंटे की प्रकाश-अंधेरे अवधि (प्रकाश अवधि के लिए प्रकाश की स्थिति: ~ 50 μmol फोटॉन एम -2 एस -1 सफेद प्रकाश) में टीएपी माध्यम16 में 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए (चित्रा 1)।
नोट: कोशिकाओं को एक मध्य-लघुगणकीय विकास चरण (मूवी 1) में होना चाहिए। लंबी संस्कृति (>4 दिन, देर से लॉगरिदमिक वृद्धि या स्थिर चरण में) डिमेम्ब्रेनेटेड सेल मॉडल की पुनर्सक्रियन दक्षता को कम कर देती है।
चित्रा 1: 2-दिवसीय संवर्धन के बाद तरल संस्कृति। एक टीएपी -1.5% अगर प्लेट से, प्लैटिनम लूप को भरने के लिए जंगली प्रकार की कोशिकाओं का एक हिस्सा एक फ्लास्क में ~ 150 एमएल टीएपी तरल माध्यम में लगाया गया था। 2-दिवसीय संस्कृति के बाद सेल घनत्व 2.3 × 106 कोशिकाओं / कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 1: लाइव कोशिकाओं की तैराकी। कोशिकाओं को 10x उद्देश्य लेंस और एक तेल-विसर्जन अंधेरे क्षेत्र कंडेनसर के साथ एक माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
2. डिमेम्ब्रेनेटेड सेल मॉडल की तैयारी
नोट: प्रयोग शुरू करने से पहले, कमरे के तापमान पर धोने बफर और डिमेम्ब्रेनेशन, कमजोर पड़ने, पुनर्सक्रियन बफर और बर्फ पर एटीपी समाधान रखें। इन बफरों की संरचना अनुपूरक तालिका 1 में प्रदान की गई है।
- अपकेंद्रित्र ~ 10 एमएल तरल संस्कृति 1000 × जी पर 3 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर।
नोट: इस चरण से प्रोटोकॉल के दौरान, आटोक्लेव प्लास्टिक के बर्तन (ट्यूब, विंदुक युक्तियाँ, आदि) का उपयोग न करें, पुनर्सक्रियन दक्षता को कम करें। शंक्वाकार ट्यूबों के लिए, पुन: उपयोग किए गए बेहतर होते हैं। 2-दिवसीय संस्कृति के बाद सेल घनत्व आमतौर पर 1.0-5.0 × 106 कोशिकाओं / जब सेल घनत्व इससे कम होता है, तो ~ 5 × 107 कोशिकाओं को शामिल करने के लिए पर्याप्त संस्कृति मात्रा लें। - सतह पर तैरनेवाला त्यागें, पहले डिकैंटेशन द्वारा और फिर एक पाश्चर विंदुक द्वारा, और धोने के बफर के ~ 5 एमएल में अवक्षेप को फिर से निलंबित करें।
- 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 1000 × ग्राम पर धोने बफर में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
- एक विंदुक (चित्रा 2) के साथ ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
नोट: पाश्चर पिपेट बेहतर कर रहे हैं. माइक्रोपिपेट्स का उपयोग करते समय, विंदुक युक्तियों का उपयोग करने से बचें जिन्हें आटोक्लेव किया गया है। - एक सेल गोली पर डिमेम्ब्रेनेशन बफर के ओवरले ~ 0.5 एमएल, बफर में कोशिकाओं को मोटे तौर पर निलंबित करने के लिए धीरे-धीरे हाथ से ट्यूब को हिलाएं, और ट्यूब को बर्फ पर रखें (चित्रा 3 ए)।
नोट: इस समय गोली को पूरी तरह से निलंबित करना आवश्यक नहीं है। स्थिर पुनर्सक्रियन17 के लिए अंतिम एटीपी एकाग्रता >1 एमएम के साथ सेल मॉडल को फिर से सक्रिय करने पर डिमेम्ब्रेनेशन और पुनर्सक्रियन बफर में एमजीएसओ4 से 15 एमएम की एकाग्रता बढ़ाएं। - एक विंदुक के साथ धीरे से शेष सेल गोली निलंबित करें, और बर्फ पर ट्यूब को फिर से रखें (चित्रा 3 बी)।
- सेल मॉडल के 5-10 μL ले लो, कमजोर पड़ने बफर के साथ 10 गुना पतला, और सभी सेल मॉडल demembranated कर रहे हैं और तैराकी नहीं (चित्रा 4) की पुष्टि करने के लिए माइक्रोस्कोप (मूवी 2) के तहत निरीक्षण।
नोट: यदि कुछ कोशिकाएं अभी भी तैर रही हैं (जीवित), ~ 0.15% की अंतिम एकाग्रता के लिए सेल मॉडल समाधान के लिए सीधे डिमेम्ब्रेनेशन बफर में उपयोग किए जाने वाले गैर-आयनिक डिटर्जेंट जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, डिटर्जेंट के 0.15% युक्त डिमेम्ब्रेनेशन समाधान के साथ चरण 2.1-2.5 दोहराएं।
चित्रा 2: सतह पर तैरनेवाला त्यागना। सतह पर तैरनेवाला के बाकी ध्यान से एक पाश्चर विंदुक के साथ हटा दिया गया था के बाद सतह पर तैरनेवाला ट्यूब के decantation द्वारा हटा दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
(ए) सेल गोली पर डिमेम्ब्रेनेशन समाधान के 0.5 एमएल को ओवरले करने के बाद, समाधान को कोशिकाओं को मोटे तौर पर निलंबित करने के लिए एक हाथ से मिलाया गया था। (बी) मिश्रण के बाद, सेल गोली के बाकी पूरी तरह से एक पाश्चर विंदुक द्वारा समाधान में निलंबित कर दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: डिमेम्ब्रेनेशन के प्रभाव ( ए) एक ग्लास स्लाइड पर फंस गया एक लाइव सेल। (बी) एक सेल मॉडल एक ग्लास स्लाइड पर अटक गया। ध्यान दें कि सेल मॉडल में, सिलिया थोड़ा पतला हो गया। छवियों को 20x उद्देश्य लेंस और एक तेल-विसर्जन अंधेरे क्षेत्र कंडेनसर के साथ एक माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 2: डिमेम्ब्रेनेशन की पुष्टि। सेल मॉडल निलंबन एक 10x उद्देश्य लेंस और एक तेल विसर्जन अंधेरे क्षेत्र कंडेनसर के साथ एक माइक्रोस्कोप के तहत मनाया गया था। कोई भी सेल तैर नहीं रहा था। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
3. डिमेम्ब्रेनेटेड सेल मॉडल का पुनर्सक्रियन
- ट्यूब (चित्रा 5) को टैप करके 0.5 एमएल ट्यूब में पुनर्सक्रियन समाधान के 80 μL, एटीपी समाधान के 10 μL, और सेल मॉडल के 10 μL मिलाएं।
नोट: अंतिम एटीपी एकाग्रता <3 एमएम होना चाहिए क्योंकि सिलिअरी बीटिंग आवृत्ति, सिलिअरी गति के लिए एक पैरामीटर, एटीपी एकाग्रता के साथ बढ़ता है और एटीपी17 के 2-3 एमएम पर संतृप्त होता है।
चेतावनी: पाइपिंग या भंवर द्वारा मिश्रण करने से विघटन होता है और पुनर्सक्रियन दक्षता कम हो जाती है।- एटीपी के <0.2 एमएम के साथ फिर से सक्रिय करने के लिए, एक एटीपी-पुनर्जनन प्रणाली जोड़ें, जैसे क्रिएटिन किनेज के 70 यू / एमएल और क्रिएटिन फॉस्फेट के 5 एमएम ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: पुनर्सक्रियन समाधान कमजोर पड़ने समाधान की तुलना में एक उच्च एकाग्रता (1.125x, पूरक तालिका 1) पर तैयार किया जाता है ताकि पानी में भंग एटीपी मिश्रण के बाद, सामग्री निम्नलिखित अंतिम सांद्रता तक पहुंच जाए: हेप्स के 30 एमएम (पीएच 7.4), एमजीएसओ4 के 5 एमएम, डिथियोथ्रिटोल (डीटीटी) के 1 एमएम, ईजीटीए के 1 एमएम, और पोटेशियम एसीटेट के 50 एमएम ( सामग्री की तालिका देखें)।
- एटीपी के <0.2 एमएम के साथ फिर से सक्रिय करने के लिए, एक एटीपी-पुनर्जनन प्रणाली जोड़ें, जैसे क्रिएटिन किनेज के 70 यू / एमएल और क्रिएटिन फॉस्फेट के 5 एमएम ( सामग्री की तालिका देखें)।
- एक ग्लास स्लाइड पर मिश्रित समाधान के ~ 30 μL रखो और धीरे सेल मॉडल (चित्रा 6) के लिए यांत्रिक सदमे से बचने के लिए स्पेसर के साथ उस पर एक कवरस्लिप जगह।
नोट: व्हाइट पेट्रोलियम या डबल-पक्षीय चिपकने वाला टेप स्पेसर बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। - एक माइक्रोस्कोप (मूवी 3) के तहत पुन: सक्रिय सेल मॉडल का निरीक्षण करें।
चित्रा 5: ट्यूब दोहन द्वारा मिश्रण समाधान(ए) पुनर्सक्रियन समाधान के 80 μL, एटीपी समाधान के 10 μL, और सेल मॉडल के 10 μL अनुक्रमिक क्रम में जोड़ा गया था। (बी) समाधान एक उंगली के साथ ट्यूब दोहन द्वारा मिश्रित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: कवरस्लिप किनारों पर स्पेसर बनाना। (ए) एक हाथ के पीछे सफेद पेट्रोलियम की एक पतली परत लागू की गई थी। (बी) सफेद पेट्रोलियम की एक छोटी मात्रा को कवरस्लिप के किनारे के साथ स्क्रैप किया गया था। (सी) एक कवरस्लिप के किनारे पर एक स्पेसर बनाया गया था। (डी) विपरीत किनारे पर एक और स्पेसर बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 3: पुन: सक्रिय सेल मॉडल की तैराकी। सेल मॉडल की गतिशीलता को 1 एमएम की अंतिम एकाग्रता पर एटीपी जोड़कर फिर से सक्रिय किया गया था, और 10 एक्स उद्देश्य लेंस और एक तेल-विसर्जन अंधेरे-क्षेत्र कंडेनसर के साथ माइक्रोस्कोप के तहत मनाया गया था। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Representative Results
रेनहार्ड्टिई जंगली प्रकार के तनाव (सीसी -125) में डिमेम्ब्रेनेशन और पुनर्सक्रियन प्रक्रिया यहां दिखाई गई है। टीकाकरण के 2 दिन बाद संस्कृति एक हल्के हरे रंग का रंग (चरण 1.1) (चित्रा 1) बन गई। कोशिकाओं को एकत्र किया गया (चरण 2.1), धोया गया (चरण 2.2), और डिमेम्ब्रेनेटेड (चरण 2.5)। डिमेम्ब्रेनेशन के बाद, सभी सेल मॉडल इम्मोटाइल (चरण 2.7) बन गए। डिमेम्ब्रेनेटेड सिलिया (जिसे एक्सोनेम कहा जाता है) सेल बॉडी से जुड़ा रहता है, जो दिखाता है कि सेल मॉडल की अस्थिरता डेसिलिएशन (चित्रा 4) के कारण नहीं होती है। पुनर्सक्रियन बफर और एटीपी (चरण 3.1) के साथ मिश्रण करने के बाद, सेल मॉडल का >50% गतिशील (चरण 3.2) बन गया। पुनर्सक्रियन दर चरण 3.1 पर कोमल और पूरी तरह से मिश्रण द्वारा बढ़ जाती है। (% गतिशील कोशिकाएं)। यहां तक कि एटीपी पुनर्जनन प्रणाली (चरण 3.1.1) के बिना, पुन: सक्रिय कोशिकाओं ने धीरे-धीरे आंदोलन को रोकने से पहले, 1 एमएम की अंतिम एटीपी एकाग्रता के साथ ~ 90 मिनट के लिए आगे बढ़ना जारी रखा।
अनुपूरक तालिका 1: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले समाधानों और बफर की संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम हैं। पहला एक प्रक्रिया है जिसे डिमेम्ब्रेनेशन के रूप में जाना जाता है, जिसे धीरे-धीरे लेकिन अच्छी तरह से करने की आवश्यकता होती है। डेसिलिएशन (यानी, सेल बॉडी से सिलिया की अलग करना) जोरदार पाइपिंग या भंवर से प्रेरित होता है, जिससे एटीपी के अलावा के बाद भी सेल मॉडल स्थिर हो जाते हैं। आमतौर पर, 5 × 107 कोशिकाओं को ~ 0.5 एमएल डिमेम्ब्रेनेशन बफर (अंतिम सेल घनत्व: 1 × 108 कोशिकाओं / एमएल) में निलंबित कर दिया जाता है। सेल मॉडल की पुनर्सक्रियन दर कम हो जाएगी यदि सेल मॉडल घनत्व इससे बहुत कम है (उदाहरण के लिए, 1 × 106 कोशिकाएं / एमएल)। पुनर्सक्रियन पर ये सेल मॉडल-घनत्व प्रभाव अस्पष्ट हैं, लेकिन सेल अर्क में शायद ऐसे कारक होते हैं जो पुनर्सक्रियन में मदद करते हैं। बेशक, सेल घनत्व जितना अधिक होगा, उतना ही कठिन यह पूरी तरह से डिमेम्ब्रेनेशन के लिए होगा। अपर्याप्त डिमेम्ब्रेनेशन के परिणामस्वरूप सेल मॉडल के साथ जीवित कोशिकाओं को दूषित किया जा सकता है। चलती कोशिकाओं को इस मामले में चरण 2.7 में देखा जा सकता है। लाइव कोशिकाओं के संदूषण से एटीपी या अन्य घटकों (जैसे सीए2 +) के प्रभावों की गलत व्याख्या होगी जो पुनर्सक्रियन बफर में जोड़ा गया है। इस कदम को प्रवीणता की आवश्यकता है।
दूसरा महत्वपूर्ण कदम पुनर्सक्रियन है। डिमेम्ब्रेनेशन चरण के समान, समाधान को मिलाने के लिए जोरदार पाइपिंग भी डेसिलिएशन को प्रेरित करती है। इस प्रकार, दोहन ट्यूबों के साथ मिश्रण समाधान बेहतर है। इस कदम को प्रवीणता की भी आवश्यकता है। इसके अलावा, इस चरण में 0.5 एमएल ट्यूबों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जब समाधान की मात्रा 100 μL (जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है) है।
जैसा कि परिचय में कहा गया है, इस प्रोटोकॉल का एक लाभ यह है कि यह इन विट्रो में विभिन्न जैविक संकेतों के प्रभावों की जांच करने की अनुमति देता है जिनकी सांद्रता केवल विवो में क्षणिक रूप से ऊंचा है। उदाहरण के लिए, सीए2 + को पुनर्सक्रियन समाधान में जोड़ा जा सकता है। इस मामले में ईजीटीए के केलेशन प्रभावों के कारण, सभी समाधानों (चरण 3.1) को मिलाने के बाद अंतिम कैल्शियम एकाग्रता को सावधानीपूर्वक गणना करने की आवश्यकता है। चेलेटर्स की उपस्थिति में एक बफर में मुक्त सीए2 + की अंतिम एकाग्रता की गणना करने के लिए, कार्यक्रम कैलकॉन18 मान्य है। कैल्शियम युक्त पुनर्सक्रियन बफर का एक उदाहरण पिछले अध्ययन19 में दिखाया गया है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सीए2 + (>10−5 एम) की एक उच्च सांद्रता20 को प्रेरित करती है, और इस प्रकार सिलिअरी गतिशीलता पर सीए2 + के प्रभाव को कम सांद्रता पर परीक्षण किया जाना चाहिए जैसा कि पहले वर्णित21 था।
विधि कुछ सीमाओं से ग्रस्त है। पुनर्सक्रियन बफर की संरचना जरूरी विवो आयनिक स्थितियों में प्रतिबिंबित नहीं करती है। इसलिए, यदि सेल मॉडल और लाइव कोशिकाओं के बीच सिलिअरी गति में कुछ अंतर देखा गया था, तो किसी को यह निर्धारित करने के लिए सावधान रहने की आवश्यकता होगी कि क्या यह बफर संरचना के कारण एक विरूपण साक्ष्य नहीं है। उदाहरण के लिए, यदि हम इस क्लासिक बफर संरचना के साथ प्रयोग करते हैं, तो एटीपी एकाग्रता >1 एमएम17 होने पर सिलिअरी बीटिंग आवृत्ति अपेक्षा से कम होती है। इस समस्या का एक समाधान एमजी2 + एकाग्रता को बढ़ाना और एटीपी के साथ एडेनोसाइन डिफॉस्फेट (एडीपी) जोड़ना है; फिर, सिलिअरी बीटिंग आवृत्ति अपेक्षित17 के रूप में बढ़ जाती है। इस प्रकार, प्रयोग के उद्देश्य के अनुसार बफर संरचना को बदलना आवश्यक है।
वर्तमान प्रोटोकॉल सिलिया के साथ तैराकी अन्य शैवाल प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, डिमेम्ब्रेनेटेड वोल्वॉक्स रूसलेटी की गतिशीलता, बहुकोशिकीय वोल्वोकल्स ग्रीन अल्गा जिसमें 5,000-10,000 क्लैमिडोमोनास जैसी कोशिकाएं होती हैं, को सी की तरह एटीपी जोड़कर फिर से सक्रिय किया जा सकता है। इस मामले में कई संशोधनों की आवश्यकता थी: पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) को डिमेम्ब्रेनेटेड वी रूसलेटी के गोलाकार आकार को संरक्षित करने के लिए छोड़ दिया गया था, और इगेपल सीए -630 (डिटर्जेंट) की सांद्रता को डिटर्जेंट संवेदनशीलता में ढाल के कारण संशोधित किया गया था पूर्वकाल ध्रुव से पीछे के ध्रुव तक, पूर्व में उच्चतम और उत्तरार्द्ध में सबसे कम। संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल को सबसे छोटी बहुकोशिकीय वोल्वोकल्स प्रजातियों, चार-कोशिका वाले टेट्राबेना सोशलिस23 पर भी लागू किया गया था। यदि वर्तमान प्रयोग को एक नए जीव के साथ आजमाया जाना है, तो डिमेम्ब्रेनेशन और पुनर्सक्रियन बफर, विशेष रूप से डिटर्जेंट और पीईजी में घटकों के प्रकार और सांद्रता को संशोधित करके अनुकूलन आवश्यक होगा। जीव के आकार और आकृति विज्ञान के आधार पर, सेंट्रीफ्यूजेशन सेटिंग्स को ट्यून करने की आवश्यकता है। छिड़काव सेंट्रीफ्यूजेशन22 के बजाय डिमेम्ब्रेनेशन के लिए भी एक विकल्प है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस काकेन्ही (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) से एनयू (19के 23758, 21 के 06295) और केडब्ल्यू (1 9 एच 03242, 20 के 21420, 21 एच 00420), ओहसुमी फ्रंटियर साइंस फाउंडेशन (https://www.ofsf.or.jp/en/) से केडब्ल्यू तक, और डायनामिक एलायंस फॉर ओपन इनोवेशन ब्रिजिंग ह्यूमन, पर्यावरण और सामग्री (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) से लेकर केडब्ल्यू तक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम आंकड़ों को तैयार करने में उनकी मदद के लिए सुश्री मियुकी शिनोहारा (होसेई विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
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- Hoffman-Berling, H. Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen. Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).
- Naitoh, Y., Kaneko, H. Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions. Science. 176 (4034), 523-524 (1972).
- Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components. Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).
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