Summary
In vitro reaktivering av motile celler er et avgjørende eksperiment for å forstå mekanismene for cellemotilitet. Protokollen beskriver reaktivering av de demembranerte cellemodellene til Chlamydomonas reinhardtii, en modellorganisme for å studere cilia/flagella.
Abstract
Siden det historiske eksperimentet på sammentrekningen av glyserinerte muskler ved å legge til ATP, som Szent-Györgyi demonstrerte på midten av 1900-tallet, har in vitro reaktivering av demembranerte celler vært en tradisjonell og potent måte å undersøke cellemotilitet på. Den grunnleggende fordelen med denne eksperimentelle metoden er at sammensetningen av reaktiveringsløsningen lett kan endres. For eksempel kan et høy-Ca2 + konsentrasjonsmiljø som bare oppstår midlertidig på grunn av membraneksitasjon in vivo , replikeres i laboratoriet. Eukaryotisk cilia (også kjent som flagella) er forseggjorte motilitetsmaskiner hvis regulatoriske mekanismer fortsatt skal avklares. Den unicellular grønne alge Chlamydomonas reinhardtii er en utmerket modellorganisme innen ciliaforskning. Reaktiveringseksperimentene ved hjelp av demembranerte cellemodeller av C. reinhardtii og deres derivater, som demembranerte axoner av isolert cilia, har bidratt betydelig til å forstå de molekylære mekanismene for ciliary motility. Disse eksperimentene presiserte at ATP energizes ciliary motility og at ulike cellulære signaler, inkludert Ca2 +, cAMP, og reaktive oksygenarter, modulerer ciliary bevegelser. Den nøyaktige metoden for demembranering av C. reinhardtii celler og reaktivering av cellemodellene er beskrevet her.
Introduction
In vitro reaktivering av demembranerte motile celler er et verdifullt verktøy for å studere molekylært grunnlag for reguleringsmekanismen for cellemotilitet. Szent-Györgyi viste først in vitro sammentrekning av kanin skjelettmuskulaturfibre ekstrahert med 50% glyserol ved å legge til adenosin triphosfat (ATP)1. Dette eksperimentet var det første som beviste at ATP energizes muskel sammentrekning. Metodikken ble snart brukt på studiet av ATP-energisk ciliary / flagellar motility, som sperm flagella2, Paramecium cilia3, og Chlamydomonas reinhardtii cilia (også kalt flagella)4 ved hjelp av ikke-ionic vaskemidler for demembranering.
Den unicellular grønne algen C. reinhardtii er en modellorganisme for å studere cilia: den svømmer med to cilia ved å slå dem som et menneskes brystslag5. Ciliary bevegelse er drevet av dynein, en minus-end rettet mikrotubule-basert motorprotein 6,7. Ciliary dyneins kan klassifiseres i ytre armdyneiner og indre armdyneliner. Mutanter som mangler hver type dynein har blitt isolert som sakte svømmende mutanter med forskjellige motilitetsavvik. Detaljert in vitro motility analyse av disse mutantene har betydelig avansert dynein forskning8.
Mange viktige funn har blitt oppnådd ved hjelp av denne metoden og dens derivater siden in vitro reaktiveringseksperimentet av demembranerte C. reinhardtiiceller (cellemodeller) ble etablert. Reaktivering av cellemodeller i en serie med Ca2+ buffere, for eksempel, viste9 at to cilia er forskjellig regulert av submicromolar Ca2+, og denne asymmetriske cilia-kontrollen muliggjør fototaktisk orientering av C. reinhardtii10. Videre viser begge cilia bølgeformkonvertering fra fremoversvømmingsmodus (kalt asymmetrisk bølgeform) til bakoversvømmingsmodus (kalt symmetrisk bølgeform som vises i en kort periode når cellene er foto- eller mekano-sjokkerte)11,12. Denne bølgeformkonverteringen er regulert av submillimolar Ca2+, som ble vist ved reaktivering av det såkalte nukleoflagellarapparatet (et kompleks som inneholder to cilia, basale legemer, strukturene som forbinder basale legemer med kjernen, og restene av kjernen)11 eller demembranerte axoner av isolert cilia13. Annet enn Ca2+, er redoks (reduksjonsoksidasjon) poise et signal som regulerer ciliary slåfrekvensen, som ble vist ved reaktivering av cellemodeller i redoksbuffere som inneholder forskjellige forhold mellom redusert glutathione vs. oksidert glutathione14. I tillegg regulerer syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) asymmetrisk to cilia, som ble vist ved reaktivering av axoner med fotokleavable bur cAMP15. Disse in vitro funnene, kombinert med genetiske funn, har ført til en dypere forståelse av molekylære mekanismer for cilia regulering i C. reinhardtii.
En protokoll for reaktivering av cellemodellene er beskrevet her. Metoden er enkel, tillater ulike modifikasjoner, og kan brukes på flere organismer som beveger seg med cilia. Men fordi demembranerte celler er skjøre, krever det noen tips for å reaktivere motiliteten til cellemodeller med god effektivitet samtidig som dedikasjon forhindres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En villstamme av Chlamydomonas reinhardtii, CC-125, ble brukt til den nåværende studien. CC-125 ble hentet fra Chlamydomonas Resource Center (se Materialfortegnelser) og vedlikeholdt på et Tris-acetatfosfat (TAP)16, 1,5% agarose medium ved 20-25 °C.
1. Cellekultur
- Kultur Chlamydomonas reinhardtii (CC-125) i TAP medium16 i en 12 t/12 t lys-mørk periode (lysforhold for lysperioden: ~50 μmol fotoner m−2 s−1 hvitt lys) ved 20-25 °C i 2 dager (figur 1).
MERK: Cellene må være i en midt logaritmisk vekstfase (film 1). Lang kultur (>4 dager, i sen-logaritmisk vekst eller stasjonær fase) reduserer reaktiveringseffektiviteten til demembranerte cellemodeller.
Figur 1: Flytende kultur etter 2-dagers dyrking. Fra en TAP-1,5% agarplate ble en del av ville celler for å fylle platinaløkken inokulert til ~ 150 ml TAP flytende medium i en kolbe. Celletettheten etter 2-dagers kultur var 2,3 × 106 celler/ml. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 1: Svømming av levende celler. Celler ble observert under et mikroskop med en 10x objektiv linse og en olje-nedsenknings mørkfeltkondensator. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
2. Fremstilling av demembranerte cellemodeller
MERK: Før du starter eksperimentet, må du holde vaskebufferen ved romtemperatur og demembranering, fortynning, reaktiveringsbuffere og ATP-løsningen på is. Sammensetningen av disse bufferne finnes i supplerende tabell 1.
- Sentrifuge ~ 10 ml flytende kultur ved 1000 × g ved 20 °C i 3 minutter.
MERK: Gjennom hele protokollen fra dette trinnet må du ikke bruke autoklavert plastvare (rør, pipettespisser osv.), noe som reduserer reaktiveringseffektiviteten. For koniske rør er gjenbrukte å foretrekke. Celletettheten etter 2-dagers kultur kan vanligvis være 1,0-5,0 × 106 celler/ml. Når celletettheten er lavere enn dette, ta nok kulturvolum til å inneholde ~ 5 × 107 celler. - Kast supernatanten, først ved dekantering og deretter av en Pasteur pipette, og resuspender utfellingene i ~ 5 ml vaskebuffer.
- Sentrifuger celler i vaskebufferen ved 1000 × g i 3 min ved 20 °C.
- Kast supernatanten forsiktig med en pipette (figur 2).
MERK: Pasteurpipetter er å foretrekke. Når du bruker mikropipetter, må du unngå å bruke pipettespisser som er autoklavert. - Overlegg ~0,5 ml demembraneringsbuffer på en cellepellet, rist røret forsiktig for hånd for å grovt suspendere cellene i bufferen, og legg røret på is (figur 3A).
MERK: Det er ikke nødvendig å fullstendig suspendere pelletsen for øyeblikket. Øk konsentrasjonen av MgSO4 til 15 mM i demembranerings- og reaktiveringsbufferne når cellemodeller reaktiveres, med en endelig ATP-konsentrasjon >1 mM for stabil reaktivering17. - Heng den gjenværende cellepelleten forsiktig med en pipette, og legg røret på is igjen (figur 3B).
- Ta 5-10 μL av cellemodellene, fortynn 10 ganger med fortynningsbufferen, og observer under mikroskopet (Film 2) for å bekrefte at alle cellemodellene er demembranert og ikke svømmer (figur 4).
MERK: Hvis noen celler fortsatt svømmer (levende), tilsett det ikke-ioniske vaskemiddelet som brukes i demembranasjonsbufferen direkte til cellemodellløsningen til den endelige konsentrasjonen på ~ 0,15%. Alternativt kan du gjenta trinn 2.1-2.5 med demembranasjonsløsningen som inneholder 0,15% vaskemiddel.
Figur 2: Kast supernatanten. Resten av supernatanten ble forsiktig fjernet med en Pasteur pipette etter at supernatanten ble fjernet ved dekantering av røret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Demembranasjon. (A) Etter å ha overleggt 0,5 ml demembraneringsløsning på cellepelleten, ble løsningen blandet med en hånd for å suspendere cellene grovt. (B) Etter blanding ble resten av cellepellet helt suspendert i løsningen av en Pasteur pipette. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Virkninger av demembranering. (A) En levende celle som sitter fast på et glasssklie. (B) En cellemodell som sitter fast på et glasssklie. Legg merke til at i cellemodellen ble cilia litt tynnere. Bildene ble observert under et mikroskop med en 20x objektiv linse og en olje-nedsenknings mørkfeltkondensator. Skalalinje = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 2: Bekreftelse på demembranering. Cellemodellfjæring ble observert under et mikroskop med en 10x objektiv linse og en olje-nedsenking mørkfeltkondensator. Ingen celle svømte. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
3. Reaktivering av demembranerte cellemodeller
- Bland 80 μL reaktiveringsløsning, 10 μL ATP-oppløsning og 10 μL cellemodeller i et 0,5 ml rør ved å trykke på røret (figur 5).
MERK: Den endelige ATP-konsentrasjonen må være <3 mM fordi ciliary slagfrekvens, en parameter for ciliary bevegelse, øker med ATP-konsentrasjon og metter ved 2-3 mM ATP17.
FORSIKTIG: Blanding ved pipettering eller virveling forårsaker deiliering og reduserer reaktiveringseffektiviteten.- For reaktivering med <0,2 mM ATP, tilsett et ATP-regenereringssystem, for eksempel 70 U/ml kreatinkinase og 5 mM kreatinfosfat (se Materialliste).
MERK: Reaktiveringsløsningen fremstilles med høyere konsentrasjon (1,125x, Supplerende tabell 1) enn fortynningsløsningen slik at etter blanding av ATP oppløst i vann, når innholdet følgende endelige konsentrasjoner: 30 mM Hepes (pH 7,4), 5 mM MgSO4, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM EGTA og 50 mM kaliumacetat (se materialfortegnelse).
- For reaktivering med <0,2 mM ATP, tilsett et ATP-regenereringssystem, for eksempel 70 U/ml kreatinkinase og 5 mM kreatinfosfat (se Materialliste).
- Sett ~30 μL av den blandede oppløsningen på en glasssklie og legg forsiktig en deksleslip på den med avstandsstykker for å unngå mekanisk støt på cellemodellene (figur 6).
MERK: Hvit petroleum eller dobbeltsidig tape kan brukes til å lage avstandsstykkene. - Vær oppmerksom på de reaktiverte cellemodellene under et mikroskop (film 3).
Figur 5: Blandeløsning ved å tappe røret. (A) Til 80 μL av reaktiveringsløsningen, 10 μL ATP-oppløsning og 10 μL cellemodeller ble tilsatt i sekvensiell rekkefølge. (B) Oppløsningen ble blandet ved å trykke på røret med en finger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Lage avstandsstykker på deksler. (A) Et tynt lag med hvit petroleum ble påført på baksiden av en hånd. (B) En liten mengde hvit petroleum ble skrapt av med en kant av en deksle. (C) Et avstandsstykke ble laget på kanten av en deksle. (D) En annen avstandsstykke ble laget på motsatt kant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 3: Svømming av reaktiverte cellemodeller. Motiliteten til cellemodellene ble reaktivert ved å legge til ATP ved en endelig konsentrasjon på 1 mM, og observert under et mikroskop med en 10x objektiv linse og en olje-nedsenknings mørkfeltkondensator. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Demembranerings- og reaktiveringsprosessen i C. reinhardtii wild type stamme (CC-125) er vist her. Kulturen 2 dager etter inokulering ble en lysegrønn farge (trinn 1.1) (figur 1). Celler ble samlet inn (trinn 2.1), vasket (trinn 2.2) og demembranert (trinn 2.5). Etter demembranering ble alle cellemodeller immotile (trinn 2.7). Den demembranerte ciliaen (kalt axonemes) forblir festet til cellekroppen, noe som viser at umotligheten til cellemodellene ikke er forårsaket av desilitering (figur 4). Etter blanding med reaktiveringsbufferen og ATP (trinn 3.1) ble >50% av cellemodellene motile (trinn 3.2). Reaktiveringshastigheten økes ved skånsom og grundig blanding i trinn 3.1. (% motile celler). Selv uten ATP-regenereringssystemet (trinn 3.1.1) fortsatte de reaktiverte cellene å bevege seg i ~ 90 min med den endelige ATP-konsentrasjonen på 1 mM, før de gradvis stoppet bevegelsen.
Supplerende tabell 1: Sammensetning av løsninger og buffere som brukes i studien. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er to kritiske trinn i denne protokollen. Den første er en prosess kjent som demembranering, som må utføres forsiktig, men grundig. Desilitering (dvs. løsrivelse av cilia fra cellekroppen) induseres ved kraftig pipettering eller virveling, noe som gjør cellemodellene immobile selv etter tilsetning av ATP. Vanligvis er 5 × 107 celler suspendert i ~ 0,5 ml demembraneringsbuffer (endelig celletetthet: 1 × 108 celler / ml). Reaktiveringshastigheten til cellemodellene vil reduseres hvis cellemodelltettheten er mye lavere enn dette (f.eks. 1 × 106 celler/ml). Disse cellemodelltetthetseffektene på reaktivering er uklare, men celleekstraktene inneholder sannsynligvis faktorene som bidrar til reaktivering. Selvfølgelig, jo høyere celletetthet, jo vanskeligere blir det for grundig demembranering. Utilstrekkelig demembranering kan føre til kontaminering av levende celler med cellemodeller. Flytteceller kan ses i dette tilfellet i trinn 2.7. Kontaminering av levende celler vil føre til feiltolkning av effektene av ATP eller andre komponenter (for eksempel Ca2+) som legges til reaktiveringsbufferen. Dette trinnet trenger ferdigheter.
Det andre kritiske trinnet er reaktivering. I likhet med demembranasjonstrinnet induserer kraftig pipettering for blanding av løsningen også desilitering. Dermed er blandingsløsninger med tapperør å foretrekke. Dette trinnet trenger også ferdigheter. I tillegg anbefales bruk av 0,5 ml rør i dette trinnet når volumet av løsningen er 100 μL (som beskrevet i denne protokollen).
Som nevnt i innledningen, er en fordel med denne protokollen at den gjør det mulig å undersøke effekten av ulike biologiske signaler in vitro hvis konsentrasjoner bare er forbigående forhøyet in vivo. Ca2+ kan for eksempel legges til i reaktiveringsløsningen. På grunn av chelateringseffektene av EGTA i dette tilfellet, må den endelige kalsiumkonsentrasjonen etter blanding av alle løsningene (trinn 3.1) beregnes nøye. For beregning av den endelige konsentrasjonen av gratis Ca2 + i en buffer i nærvær av chelators, er programmet CALCON18 gyldig. Et eksempel på kalsiumholdig reaktiveringsbuffer er vist i en tidligere studie19. Det skal bemerkes at en høy konsentrasjon på Ca2+ (>10-5 M) induserer desilitering20, og dermed må effekten av Ca2+ på ciliary motility testes ved lavere konsentrasjoner som tidligere beskrevet21.
Metoden lider av visse begrensninger. Sammensetningen av reaktiveringsbufferen gjenspeiler ikke nødvendigvis de in vivo ioniske forholdene. Så hvis det ble observert en viss forskjell i ciliary-bevegelsen mellom cellemodellene og levende celler, må man være forsiktig med å avgjøre om dette ikke er en artefakt på grunn av buffersammensetningen. For eksempel, hvis vi eksperimenterer med denne klassiske buffersammensetningen, er ciliary slåfrekvensen lavere enn forventet når ATP-konsentrasjonen er >1 mM17. En løsning på dette problemet er å øke Mg2 + konsentrasjonen og å legge til adenosin difosfat (ADP) sammen med ATP; Deretter øker ciliary slagfrekvensen som forventet17. Dermed er det nødvendig å endre buffersammensetningen i henhold til formålet med eksperimentet.
Den nåværende protokollen kan brukes på andre alger arter som svømmer med cilia. For eksempel kan motiliteten til demembranerte Volvox rousseletii, de multicellulære Volvocales grønne algen som inneholder 5000-10 000 Chlamydomonas-lignende celler, reaktiveres ved å legge til ATP som C. reinhardtii cellemodeller22. Flere modifikasjoner var nødvendig i dette tilfellet: polyetylenglykol (PEG) ble utelatt for å bevare den sfæriske formen av demembranert V. rousseletii, og konsentrasjonene av Igepal CA-630 (vaskemiddel) ble modifisert på grunn av en gradient i vaskemiddelfølsomheten fra fremre pol til bakre pol, som var høyest på den tidligere og laveste ved sistnevnte. Med modifikasjoner ble denne protokollen også brukt på de minste multicellulære Volvocales-artene, firecellede Tetrabaena socialis23. Hvis det nåværende eksperimentet skal prøves med en ny organisme, vil optimalisering være nødvendig ved å endre typene og konsentrasjonene av komponentene i demembranerings- og reaktiveringsbufferne, spesielt vaskemidler og PEG. Avhengig av organismens størrelse og morfologi, må sentrifugeringsinnstillingene justeres. Perfusjon er også et alternativ for demembranering i stedet for sentrifugering22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) til N.U. (19K23758, 21K06295) og K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), fra Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) til K.W., og fra Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) til N.U. og K.W. Vi takker Ms. Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) for hennes hjelp til å forberede tallene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Szent-Gyorgyi, A. Free-energy relations and contraction of actomyosin. Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).
- Hoffman-Berling, H. Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen. Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).
- Naitoh, Y., Kaneko, H. Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions. Science. 176 (4034), 523-524 (1972).
- Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components. Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes. Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).
- Sale, W. S., Satir, P. Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).
- Fox, L. A., Sale, W. S. Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules. Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).
- Kamiya, R., Yagi, T. Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants. Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, Pt 3 529-537 (2005).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Saegusa, Y., Yoshimura, K. cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas. Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).
- bio.chuo-u. , Available from: http://www.bio.chuo-u.ac.jp/nano/calcon.html (2022).
- Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).
- Yueh, Y. G., Crain, R. C. Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry. Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).
- Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation. Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).
- Ueki, N., Wakabayashi, K. Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
