Септины являются цитоскелетными белками. Они взаимодействуют с липидными мембранами и могут ощущать, но также генерировать кривизну мембраны в микронном масштабе. В этом протоколе мы описываем методологии снизу вверх in vitro для анализа деформаций мембран, чувствительного к кривизне связывания септина и ультраструктуры септиновой нити.
Ремоделирование мембраны происходит постоянно на плазматической мембране и внутри клеточных органелл. Чтобы полностью проанализировать роль окружающей среды (ионные условия, белковые и липидные композиции, кривизна мембраны) и различных партнеров, связанных со специфическими процессами изменения формы мембраны, мы предпринимаем подходы in vitro снизу вверх. В последние годы наблюдается большой интерес к выявлению роли белков септина, связанных с основными заболеваниями. Септины являются незаменимыми и вездесущими цитоскелетными белками, которые взаимодействуют с плазматической мембраной. Они участвуют в делении клеток, подвижности клеток, нейроморфогенезе и спермиогенезе, среди других функций. Поэтому важно понять, как септины взаимодействуют и организуются на мембранах, чтобы впоследствии индуцировать деформации мембран и как они могут быть чувствительны к определенным кривизнам мембраны. Целью данной статьи является расшифровка взаимодействия между ультраструктурой септинов на молекулярном уровне и ремоделированием мембран, происходящим в микронном масштабе. С этой целью почковые дрожжи и комплексы септина млекопитающих были рекомбинантно экспрессированы и очищены. Комбинация анализов in vitro затем использовалась для анализа самосборки септинов на мембране. Поддерживаемые липидные бислои (SLB), гигантские одноламеллярные везикулы (GUV), большие одноцветные везикулы (LUV) и волнистые субстраты использовались для изучения взаимодействия между самосборкой септина, изменением формы мембраны и кривизной мембраны.
Септины представляют собой цитоскелетные нитеобразующие белки, которые взаимодействуют с липидными мембранами. Септины повсеместно распространены у эукариот и необходимы для многочисленных клеточных функций. Они были идентифицированы как основные регуляторы деления клеток у почковых дрожжей и млекопитающих 1,2. Они участвуют в событиях изменения формы мембраны, цилиогенезе3 и спермиогенезе4. В клетках млекопитающих септины могут также взаимодействовать с актинами и микротрубочками 5,6,7 в связующем звене Rho GTPases (BORG)-зависимым способом 8. В различных тканях (нейроны9, реснички3, сперматозоиды10) септины были идентифицированы как регуляторы диффузионных барьеров для мембранно-связанных компонентов11. Было также показано, что септины регулируют образование мембран и протрузии12. Септины, являясь многозадачными белками, причастны к возникновению различных распространенных заболеваний13. Их неправильная регуляция связана с возникновением раковых заболеваний14 и нейродегенеративных заболеваний15.
В зависимости от организма несколько субъединиц септина (две у Caenorhabditis elegans до 13 у людей) собираются в комплексы, организация которых изменяется тканезависимым образом16. Основной строительный блок септина собирает от двух до четырех субъединиц, присутствующих в двух копиях и самостоятельно собранных палиндромным способом. В почковых дрожжах септины октамерны17,18. In situ септины часто локализуются на участках с кривизной микрометра; они обнаруживаются в местах сужения деления, у основания ресничек и дендритов, а также в кольце сперматозоидов19,20. На мембране роль септинов, по-видимому, двойственна: они участвуют в изменении формы липидного бислоя и в поддержании целостности мембраны21. Следовательно, исследование биофизических свойств септиновых нитеобразующих белков и/или субъединиц на мембране имеет решающее значение для понимания их роли. Для анализа специфических свойств септинов в хорошо контролируемой среде уместны подходы in vitro снизу вверх. До сих пор только несколько групп описали биофизические свойства септинов in vitro 20,22,23. Следовательно, по сравнению с другими цитоскелетными нитями, текущие знания о поведении септинов in vitro остаются ограниченными.
Этот протокол описывает, как можно проанализировать организацию нитей септина, изменение формы мембраны и чувствительность к кривизне19. С этой целью была использована комбинация методов оптической и электронной микроскопии (флуоресцентная микроскопия, криоэлектронная микроскопия [крио-ЭМ] и сканирующая электронная микроскопия [SEM]). Изменение формы мембраны гигантских одноламельных везикул (ГУВ) размером с микрометр визуализируется с помощью флуоресцентной оптической микроскопии. Анализ расположения и ультраструктуры септиновых нитей, связанных с липидными везикулами, проводится с использованием крио-ЭМ. Анализ чувствительности к кривизне септина проводится с использованием SEM, путем изучения поведения нитей септина, связанных с твердо поддерживаемыми липидными бислоями, нанесенными на волнистые субстраты переменных кривизн, что позволяет анализировать чувствительность кривизны как для положительных, так и для отрицательных кривизн. По сравнению с предыдущим анализом 20,24, здесь мы предлагаем использовать комбинацию методов для тщательного анализа того, как септины могут самособираться, синергетически деформировать мембрану и быть чувствительными к кривизне. Считается, что этот протокол полезен и адаптируется к любому нитевидному белку, который проявляет сродство к мембранам.
Как указано выше, была использована липидная смесь, которая усиливает включение PI(4,5)P2 в липидный бислой и, таким образом, облегчает септин-мембранные взаимодействия. Действительно, мы показали в другом месте25 , что почковые дрожжевые септины взаимодействуют с везику?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Патрисию Бассеро и Даниэля Леви за их полезные советы и обсуждения. Эта работа была поддержана ANR (Agence Nationale de la Recherche) для финансирования проекта “SEPTIME”, ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 и проекта “SEPTSCORT”, ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin финансируется Ecole Doctorale “ED564: Physique en Ile de France” и Fondation pour lea Recherche Médicale. К. Накадзава был поддержан Университетом Сорбонны (AAP Emergence). Г.Х. Кёндеринк был поддержан Нидерландской организацией вур Ветеншаппелийк Ондерзоек (NWO/OCW) через «BaSyC-Building a Synthetic Cell». Гравитационный грант (024.003.019). Мы благодарим Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) и Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Мы благодарим Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Институт Кюри, члена Французской национальной исследовательской инфраструктуры France-BioImaging (ANR10-INBS-04).
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
Osmometer | Löser | 15 M | |
Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
Wax plates, Vitrex | VWR |