Summary
该协议描述了在冷麻痹和表面漂白以去除外部细菌后，对单个细菌定植 的秀丽隐杆线虫炎的 96孔破坏。将得到的悬浮液接种在琼脂平板上，以便对大量单个蠕虫中的细菌负荷进行准确的中等通量定量。
Abstract
线虫 秀丽隐杆线虫 是宿主-微生物和宿主-微生物组相互作用的模型系统。迄今为止，许多研究使用间歇消化物而不是单个蠕虫样本来量化该生物体中的细菌负荷。这里认为，在 秀丽隐杆线虫 肠道的细菌定植中看到的较大的个体间变异性是信息性的，并且批量消化方法丢弃了对跨条件准确比较很重要的信息。由于描述这些样品固有的变异需要大量的个体，因此建立了一种方便的96孔板方案，用于单个蠕虫的破坏和菌落电镀。
Introduction
宿主 - 微生物关联的异质性无处不在，个体之间的变异越来越被认为是从竞争和共存1到疾病传播2，3，4的人群水平过程的一个促成因素。在秀丽隐杆线虫中，反复观察到等基因群体内的“隐藏的异质性”，个体亚群在热休克反应5，6，衰老和寿命7，8，9，10，11以及生理学和发育的许多其他方面显示出不同的表型12.大多数试图确定亚种群结构的分析为等基因同步蠕虫实验种群中的两个亚种群提供了证据5，7，8，尽管其他数据表明性状的种群内分布的可能性，而不是不同的群体7，12，13.与此相关的是，即使在从共享的微生物来源定植的蠕虫的等基因群体中，也观察到肠道群体中的大量异质性13，14，15，16，并且这种异质性可以通过批量消化测量来掩盖，该测量广泛用于蠕虫中的细菌定量17，18，19，20。
这项工作提供的数据表明，在宿主 - 微生物关联中需要更多地依赖单蠕虫测量，以及提高单蠕虫破坏准确性和通量的方案。这些方案旨在促进对大量单个 秀丽隐杆线虫 的机械破坏，以定量活的细菌负荷，同时提供比基于杵的单个蠕虫更好的可重复性和更低的每个样品的努力。包括推荐的肠道清除步骤，其中允许蠕虫在准备破坏之前以热杀死 的大肠杆菌 为食，以尽量减少最近摄入的细菌和其他瞬时（非粘附）细菌的贡献。这些方案包括用低浓度表面漂白处理清洁角质层的冷麻痹方法;表面漂白可用作单一蠕虫破坏的准备步骤，或作为制备活的、外部无菌蠕虫的方法。这种表面漂白方法足以去除广泛的外部微生物，冷处理提供了常规左旋咪唑类麻痹的替代方案;虽然左旋咪唑将首选用于冷敏感实验，但冷麻痹可最大限度地减少对危险废物流的贡献，并允许迅速恢复正常活动。虽然完整的方案描述了一个实验室实验，其中蠕虫被已知细菌定植，但清洁蠕虫和单蠕虫破坏的程序可以很容易地应用于从野生样本中分离出或在微观实验中定植的蠕虫。这里描述的方案产生从蠕虫肠中提取的活细菌，适用于单个蠕虫中菌落形成单元（CFU）的电镀和定量;对于基于测序的肠道群落分析，应在这些方案中添加随后的细胞裂解和核酸提取步骤。
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Protocol
这些实验中使用的蠕虫是从 Caenorhabditis 遗传中心获得的，该中心由NIH研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助。布里斯托尔N2是野生型。DAF-2/IGF 突变体 daf-16（mu86） I （CGC CF1038） 和 DAF-2（e1370） III （CGC CB1370） 用于说明肠道细菌负荷的差异。
携带 pos-1 RNAi 载体的大 肠杆菌 HT115 （DE3） 来自阿林格文库21。 秀丽隐杆线虫 本地肠道细菌22 的MYb集合是从舒伦堡实验室获得的。 肠道沙门氏菌 LT2 （ATCC 700720） attB：GFP-公里递归于本实验室 23. 莫塞利假单胞菌 是在这个实验室中分离出来的。金黄色葡萄球菌 纽曼大学从埃默里大学的拉洛克实验室获得。
所有蠕虫缓冲液和培养基都是根据先前发表的文献24 制备的，稍作修改（见 补充文件1）。
1. 同步无菌秀丽隐杆线虫的制备
注意：在本节中，描述了生成生殖不育成虫同步种群的分步程序。这里使用 pos-1 RNAi板来防止后代的产生，因为这种干扰是胚胎致命的;在 pos-1 RNAi上长大到成年期的L1幼虫发育成产卵的雌雄同体，但这些卵是不可存活的25。RNAi喂养方案与蠕虫手册26的“反向遗传学”一章相同。
- 在同步蠕虫之前，请确保可以使用新鲜的10厘米NGM + pos-1 RNAi板。板可以从浓缩的诱导液体培养物（+ Amp + IPTG）中新鲜制备，或作为NGM + 100μg/ mL氨苄西林+ 1mM IPTG上的草坪接种，并在25°C的黑暗中生长1天27。
注意：在RNAi板上，通常使用羧苄西林（25μg/ mL）代替氨苄西林。氨苄西林较便宜，但稳定性较差;如果使用氨苄西林，一旦干燥，应立即接种板并尽快使用（可在4°C下储存<1周）27。这里推荐的高抗生素浓度将有助于确保充分的选择。 - 从几个（通常两到四个）NGM板开始，这些板具有大量的妊娠雌雄同体。使用漂白剂-NaOH同步分离鸡蛋24。
- 使用2 mL无菌ddH2O每板洗掉琼脂平板上的蠕虫。将液体均匀地分配到1.5 mL微量离心管中（每板或雌雄同体一个管）。
- 在台式小型离心机（2，000 x g）中旋转约5秒，将成虫拉到管的底部。移取上清液并丢弃。
- 用1毫升无菌ddH2O洗涤;像以前一样旋转并丢弃上清液。
- 重复上一步以减少残留的细菌碎片。
- 将每个管的内容物重悬于1mL无菌ddH2O中，向每个管中加入130μL商业漂白剂（8.25%次氯酸钠）和130μL 5 N氢氧化钠（NaOH，终浓度0.5 N）。
- 涡旋管每2分钟剧烈旋转至少10-15秒，直到成年身体破裂。不要让漂白剂NaOH处理超过5分钟，以避免杀死卵子。
- 在小型离心机中以2，000 x g 的速度旋转30-60秒以沉淀卵子。移取上清液并丢弃。可能有也可能没有可见的颗粒，这是正常的。
- 加入1 mL M9蠕虫缓冲液，以2000 x g旋转30-60 秒。弃去上清液。
- 重复冲洗步骤（1.2.8）5x以彻底除去漂白剂- NaOH混合物，尽可能多地去除上清液而不会干扰鸡蛋沉淀。
- 将卵转移到 10 mL ML M9 蠕虫缓冲液中，置于 50 mL 锥形管或 30 mL 带盖的培养管中。如果使用锥形管，请稍微拧开盖子，并使用一点胶带将其固定。在25°C和200 RPM下振荡过夜（16小时），以使幼虫孵化。
- 将同步的L1幼虫转移到RNAi板以生长到成年期。
- 向每个 L1 管中加入 2 mL 无菌 M9 缓冲液 + 0.01% Triton X-100（以下简称 M9TX-01），并将整个体积 （12 mL） 转移到 15 mL 螺旋顶锥形管中。
- 将15mL管与L1蠕虫在4°C下放置10分钟以减缓幼虫运动。
- 在大型台式离心机中旋转15 mL锥形管（4°C下1，500× g ，持续3分钟;加速度和减速不应高于最大值的80%）。
- 小心地移走上清液，而不会干扰L1沉淀。弃去上清液。
- 向每管中加入 12 mL 冷 M9TX-01。重复离心。小心地移液并丢弃上清液。每个管子应剩余约200μL。
- 在M9TX-01中冲洗200μL移液器吸头以防止蠕虫粘附在塑料上，然后使用此吸头重悬蠕虫沉淀。通过将液体滴剂移液到细菌草坪上，将重悬的蠕虫转移到制备的 pos-1 板中。
- 将板在25°C孵育至成年期的第一天。
注意：如果在 pos-1 RNAi平板上生长蠕虫，蠕虫必须 随意 喂养RNAi细菌，直到它们完全过渡到成年期，以确保胚胎致死表型的高外显率。在24和48小时检查板。如果盘子看起来饥饿或几乎挨饿，蠕虫将需要移动到新鲜的盘子里，以完成成长为全尺寸的成虫。为避免在蠕虫生长之前耗尽板，目标是在每个10 cm RNAi板中添加250-500 L1幼虫。
- 收获成虫和清除肠道 大肠杆菌 ，以产生无菌蠕虫。
- 每板使用 5 mL M9TX-01 从平板上冲洗成虫。将缓冲液+蠕虫转移到15mL锥形管中，并允许成虫沉降到管的底部。
- 用10 mL新鲜M9TX-01缓冲液的变化冲洗成人，直到没有可见的细菌浊度残留（通常为1-2x）。管子可以在700 x g 下离心30秒以沉淀蠕虫，或者可以通过重力允许成虫沉降。
- 用10 mL M9TX-01进行一次额外的洗涤，以减少外部细菌。
- 将蠕虫转移到50 mL锥形管或30 mL培养管中，其中包含5 mL S培养基+ 2x热杀灭 的大肠杆菌 OP50（〜5 x 109 个杀死的细胞/ mL）+ 200μg/ mL庆大霉素+ 50μg/ mL氯霉素。如果使用锥形管，请稍微拧开盖子，并使用一点胶带将其固定。在M9TX-01中使用玻璃移液器或冲洗塑料移液器，以防止蠕虫粘附。
- 将成虫在25°C下孵育，以200RPM振荡24-48小时，以产生无菌成虫。
注意：如果蠕虫要在抗生素中停留>24小时，则可能需要添加更多热杀灭的OP50，以确保蠕虫有足够的食物来源。在24小时检查试管，如果浊度明显降低，则补充热杀灭的OP50。
- 蔗糖根据Wormbook协议24 洗涤成虫，以获得清洁，生殖无菌，同步的成人专用库存以进行细菌定植。
- 确保冷体积的 60% 蔗糖、M9 蠕虫缓冲液和 M9TX-01 可供使用。为简单起见，这些可以在前一天晚上保持在4°C。
- 对于每个要洗涤的样品，创建一个标记的15 mL锥形管，其中包含8 mL M9TX-01并放在冰上。这些将在步骤1.5.10中需要。
- 向每50 mL含有L1幼虫的管中加入5 mL M9TX-01。将整个体积（现在为10 mL）转移到空的15 mL螺旋顶锥形管中，并让成人沉降到管的底部。
- 小心地移取上清液并丢弃。
- 向每个试管中加入10 mL M9TX-01，并将试管移至冰桶中5-10分钟。
注意：从此时开始，蠕虫和所有缓冲液应保持在冰上。 - 使用“快速温度”设置将大型台式离心机冷却至4°C。
- 向每个试管中加入 10 mL 冷 M9TX-01 以冲洗掉任何残留的碎屑。让蠕虫在冰上定居;取出上清液并丢弃。
- 蔗糖浮子：向每根管中加入5 mL冷M9缓冲液和5 mL冷60%蔗糖溶液，充分混合。然后，小心地将1mL冷M9缓冲液漂浮在每个管中的蔗糖缓冲液混合物的顶部。加入浮子后不要混合。
注意：在接下来的几个步骤中快速移动 - 如果暴露于高浓度蔗糖中太长时间，蠕虫会干燥！ - 在4°C下以1500× g 离心3分钟。 活的成虫将位于M9和蔗糖的界面处，距离管顶部约1 mL。
- 使用玻璃5 mL血清学移液管将蠕虫层转移到具有冷M9TX-01的制备的15mL锥形管中（从步骤1.5.2开始）。要非常小心地获取活虫层，不要移取过多的蔗糖。
- 如有必要，加入M9TX-01以获得10-12 mL /管的等体积。在4°C下以1500× g 离心1分钟，然后移取上清液。此时，蠕虫可以恢复到室温。
- 重复洗涤步骤1.5.11两次，在4°C下将速度降低到700× g ，时间减少到30秒。
2.在液体培养物中以活细菌为食
注意：该方案用于在液体培养物中以混合良好的条件下用实验室培养的细菌定植蠕虫（补充图1）。蠕虫可以用纯培养物中的单个分离株（例如，病原体，例如 屎肠球菌28，29）或分离株的混合物（例如，最小微生物组群落14）定植。
- 从15 mL锥形管中方案步骤1.5中的蔗糖洗涤同步成虫开始。在12mL S缓冲液中洗涤蠕虫一次，并丢弃上清液。
- 将洗涤过的蠕虫重悬于实验所需的S培养基体积中。考虑实验条件的体积，蠕虫分裂的条件数量以及蠕虫和细菌的最终浓度。
注意：蠕虫的摄食因细菌可用性而异 30，蠕虫可能因拥挤31 而产生压力。对于液体培养物中的定植，建议<1000蠕虫/ mL和>10 7 CFU / mL;1011 CFU/mL 被认为是大肠杆菌32 的“随意”进食密度。 - 离心降序培养物。倒掉上清液;抽吸或移液可用于去除形成松散颗粒的细菌的上清液。
注意：对于>5 mL的培养物，转移到15 mL管中，并在大型台式离心机中以~2800 x g 旋转8-10分钟。<5 mL的培养物可以转移到1.5 mL管中，并在小型台式离心机中以9000× g 离心1-2分钟。高度运动细菌（例如，许多种类的 假单胞菌）可能需要在4°C下冷却10-15分钟以促进形成稳定的沉淀，并且在4°C下离心可能更好。 - 将细菌培养物重悬于一体积的S缓冲液中，然后再次离心以沉淀。像以前一样取出并丢弃上清液。
- 在S培养基中以实验所需的密度重悬细菌培养物，并添加任何抗生素进行选择。要使用的抗生素（如果有的话）将取决于用于定植的细菌的耐药性特征。
- 使用涂有M9TX-01的移液器吸头，轻轻地上下移液蠕虫，直到蠕虫完全重悬于S培养基中，然后转移到管或板孔中进行细菌定植。
- 向每个蠕虫培养物中加入细菌悬浮液以达到所需的细菌浓度和最终体积。
- 如果使用多孔板进行定植，请用无菌的96孔透气密封膜覆盖板。
- 以200 RPM的振荡孵育，以防止细菌在孵育过程中沉降。
3. 以96孔形式对单个蠕虫进行机械破坏
注意：本节描述了用于机械破坏单个细菌定植 秀丽隐杆线虫的96孔板格式方案。方案（3.1-3.8）中的第一步描述了一种从蠕虫肠道中清除未粘附的细菌并使用冷麻痹和表面漂白清洁蠕虫外部的方法。这些步骤将产生干净的活的成虫，可以机械地破坏细菌内容物（3.8端）或用于进一步的实验（补充图1）。该方案可以适应量化在液体培养物中定植的蠕虫中的细菌（第2部分），琼脂平板上或来自天然或微观土壤的细菌。
- 将等分试样的M9TX-01放在冰上冷却（以mL为单位的样品数量的4-5倍）。
- 准备一等分试样的M9TX-01 + 漂白剂（6%次氯酸钠，1：1000或1：2000 v / v，每个样品1 mL + 1 mL额外），并放在冰上冷却。该等分试样将在步骤3.8中使用。
- 制备96孔板，用于连续稀释破坏的蠕虫样品。
- 获得无菌300μL容量带盖的96孔板;该方案每消化12个蠕虫使用一个稀释板。
- 使用96孔多通道移液器用180μL 1x PBS缓冲液填充每个96孔板（300μL容量）的B-D行。将顶行留空。行 B-D 将成为蠕虫消化物的 10 倍连续稀释液 [0.1x， 0.01x， 0.01x]。
- 将盘子放在一边。稀释板将在步骤3.13中使用。
- 将每个蠕虫样品重悬于1.5 mL微量离心管中的1 mL M9TX-01中。
- 在25°C的低速小型离心机（2，000 x g）中短暂旋转管（2-3秒）以沉淀成虫。移取上清液并丢弃，确保不会干扰蠕虫沉淀。
- 使用步骤3.5中的离心设置，用1 mL M9TX-01冲洗蠕虫两次，然后用1 mL M9蠕虫缓冲液冲洗一次，以减少外部细菌。
- 清除蠕虫肠道中未粘附的细菌。
- 将每个蠕虫样品重悬于培养管中的1 mL S培养基+ 2x热杀灭OP50中。
- 在25°C下孵育20-30分钟，以允许任何未粘附的细菌从肠道中通过。
注意：这还将清除腔内的任何细胞外荧光蛋白，并允许更清晰地显示粘附在肠上皮上的标记细菌，特别是当使用抗酸荧光团（例如，mCherry，dsRed）时。
- 表面漂白蠕虫以清除外部细菌。
- 用1 mL冷M9TX-01冲洗清除的蠕虫两次，并弃去上清液。
- 让试管在冰上（首选）或在4°C下冷却10分钟。 这将使蠕虫瘫痪并防止摄入漂白剂。
注：其他方案使用化学麻痹剂，如左旋咪唑;这是一个既定的方法33 ，需要增加一个危险废物流。 - 向每管中加入 1 mL 冰冷的 M9 蠕虫缓冲液 + 无味漂白剂（8.25% 氢氧化钠，1：1000 或 1：2000 v/v）。让试管坐在冰上（优选）或在4°C下放置至少10分钟以杀死外部细菌。
注意：漂白剂的浓度不要超过1：1000。即使在瘫痪的蠕虫中，也可能导致死亡。 - 移液漂白缓冲液并丢弃;将管子放回冰中，以确保蠕虫在漂白剂清除之前不会恢复泵送。
- 向每个管中加入 1 mL 冷 M9TX-01。在小型离心机中旋转约5秒（25°C时为2，000× g ）;将管子放回冰上。取出上清液并丢弃。
- 用另一个1毫升冷的M9TX-01重复此冲洗步骤，尽可能多地丢弃上清液。
注意：如果使用蠕虫进行进一步的实验，请跳过渗透化步骤（协议3.9），而是将新鲜表面漂白的成虫转移到6厘米培养皿中的冰冷缓冲液中，并将蠕虫分离到实验条件下，如协议3.10所示。保持蠕虫的低温以防止蠕动恢复，但要快速工作 - 将蠕虫在冰上保持>30分钟可能会导致<100%恢复正常活动34。
- 用十二烷基硫酸钠和二硫基里醇（0.25% SDS + 300 mM DTT）对蠕虫角质层的化学渗透（基于35）
注意：DTT是一种还原剂和刺激性。在处理干燥的原料或溶液时，请穿戴PPE并在通风橱中工作。需要危险废物流。- 在通风橱中，准备足够的SDS / DTT溶液，以便每个样品100μL。对于 1 mL，在 1.5 mL 微量离心管中加入 965 μL M9 蠕虫缓冲液或 M9TX-01，加入 5 μL 5% （w/v） SDS 和 30 μL 1M DTT。
注意：1 M DTT溶液（水溶液）应新鲜制备或在-20°C下以等分试样储存，以确保效力。等分试样的大小应为在两到三个实验中使用，以避免过度冻融循环。 - 将含有表面漂白蠕虫的微量离心管移动到室温管架上。每个管子应含有~20μL缓冲液中的蠕虫。
- 向每个蠕虫样品中加入100μLS / DTT溶液。将任何剩余的SDS/DTT溶液处置在适当的危险废物流中。
- 让治疗在工作台上进行长达8分钟，以部分分解成虫的抗性角质层。在此期间，蠕虫会死亡并沉降到管子的底部。
- 通透时间结束后，小心地移取SDS/DTT上清液，并将其丢弃在适当的SDS/DTT危险废物流中。
- 向每个管中加入1 mL M9TX-01。在台式离心机中短暂旋转以沉淀蠕虫或让蠕虫通过重力沉降到管的底部，然后抽出上清液并处理在SDS / DTT危险废物流中。
- 将蠕虫重悬于 1 mL M9 蠕虫缓冲液 + 0.1% Triton X-100 中，直至可供使用。
- 在通风橱中，准备足够的SDS / DTT溶液，以便每个样品100μL。对于 1 mL，在 1.5 mL 微量离心管中加入 965 μL M9 蠕虫缓冲液或 M9TX-01，加入 5 μL 5% （w/v） SDS 和 30 μL 1M DTT。
- 将蠕虫分离到带有碳化硅砂砾的深96孔板中以进行机械破坏。准备96孔破坏板如下。
- 获得无菌的2 mL深孔96孔板和匹配的硅96孔板盖。
注意：对于组织干扰剂，使用与96孔适配器兼容的板非常重要。外部尺寸的微小差异使得可以从适配器上取下的板和不能从适配器上取下的板之间存在差异。 - 使用无菌勺刮刀，将少量无菌的36粒度碳化硅加入到将接收蠕虫的板的每个孔中。使用足够的砂砾勉强覆盖孔的底部（每孔约0.2g）。在取回内容物时，过多的材料会使移液器尖端难以到达孔的底部。
- 向每个孔中加入180μLM9蠕虫缓冲液。
- 标记列或行以指示每个样品将去哪里，然后用硅96孔板盖松散地覆盖板。
- 获得无菌的2 mL深孔96孔板和匹配的硅96孔板盖。
- 将单个蠕虫转移到96孔板以进行破坏。
- 小心地将透化蠕虫移动到含有足够M9TX-01的小型（35或60毫米）培养皿中，以填充培养皿至约1厘米的深度。
注意：如果存在大量蠕虫，则可能无法转移整个样品，因为液体会变得拥挤，并且难以移取单个蠕虫。 - 使用解剖显微镜或其他低放大倍率装置，移取20μL体积的单个蠕虫，并将这些蠕虫转移到96孔板的各个孔中。
注意：最好只收获刚杀死的蠕虫。避免使用刚性线性形状的蠕虫，因为这些蠕虫可能已经死了一段时间。尝试服用弯曲或S形的蠕虫，具有正常的粗略生理和完整的肠道。 - 转移每个体积后，确保所选蠕虫实际上已弹出到孔中。为此，从培养皿的透明区域移取20μLM9TX-01，并将全部体积释放回培养皿中;如果蠕虫粘在移液器上，这通常会弹出蠕虫。如果蠕虫卡住，请从孔中取出20μL并再次尝试转移。
- 转移所有蠕虫后，用一张市售的柔性背纸密封膜（2 x 2平方）覆盖96孔板，确保密封膜的纸背侧朝下朝向样品孔。注意不要将密封膜拉伸得太薄，否则以后很难去除。
- 将硅密封垫轻轻放在柔性密封膜的顶部;此时不要将盖子压入孔中。
- 将板移至4°C冷却30-60分钟。这将防止在破坏期间过热，从而损坏样品。
注意：这是协议中的断点。在大多数情况下，板可以在4°C下放置长达4小时，然后再研磨。不要让蠕虫过夜，因为这会改变细菌数量。
- 小心地将透化蠕虫移动到含有足够M9TX-01的小型（35或60毫米）培养皿中，以填充培养皿至约1厘米的深度。
- 将96孔板加载到组织破坏剂上以分解蠕虫组织并释放肠道细菌。
注意：（可选）如果使用奇数个96孔板进行消化，则必须在继续之前准备配重。使用一个空的深96孔板，用水填充孔，直到它的重量与第一个板相同。- 将硅密封垫牢固地压入孔中以形成密封，确保盖子平放在板的整个表面上。
注意：如果柔性密封膜在拉伸后太厚，将很难固定硅胶盖，使其在所有孔中都是平躺的。这将导致密封不足和振荡过程中的井间污染。 - 使用96孔板适配器将板固定在组织干扰物中。在30 Hz下摇动板1分钟，然后将板旋转180°并再次摇动1分钟。这将有助于确保板块所有孔的均匀破坏。
- 将板牢固地敲击在工作台上两到三次，以从柔性密封膜上除去任何砂砾。
- 使用带有两个96孔板适配器的大型离心机，将板以2400× g 旋转2分钟，将所有材料收集到孔的底部。
- 取下硅胶盖，小心地拉出柔性密封膜。
注意：如果柔性密封膜粘在任何孔中，请使用200μL移液器吸头将其取出。当柔性密封膜拉伸得太薄时，这种情况很常见。
- 将硅密封垫牢固地压入孔中以形成密封，确保盖子平放在板的整个表面上。
- 在96孔板中连续稀释300μL蠕虫消化物样品。
- 使用设置为200μL的多孔移液器，缓慢而小心地上下移液几次，以重新混合孔的内容物，然后抽出尽可能多的液体。将此液体转移到步骤3.3中制备的96孔板的顶部行。
- 使用设置为20μL的96孔移液器，从顶排取出该体积的液体并分配到B排中。丢弃吸头。
- 重复步骤3.13.2，从B行中的0.1x样品开始，在C行中创建0.01x稀释样品。
- 再次重复步骤 3.13.2，从 C 行转到行 D。
- 将板铺在固体琼脂上以进行细菌定量。对于单定植蠕虫，通常将每次稀释液[1x-0.001x]的10-20μL滴剂铺在琼脂平板上就足够了。对于多物种定植，通过将100μL移液到10厘米琼脂平板上分别接种每个稀释液;立即使用玻璃镀珠涂抹。
4. 清洗碳化硅砂砾以便重复使用
注意：此过程用于清洁和灭菌研磨材料碳化硅砂砾，以便在实验后重复使用。在首次使用之前，应完全遵循该协议，因为碳化硅砂砾是一种工业产品，不会预先灭菌。碳化硅砂砾（3.2 g/cc）是一种致密的粗边材料，可有效地破坏坚硬的样品。但是，反复使用时颗粒可能会磨损，当磨损变得明显时应进行更换。幸运的是，这种材料价格便宜，通常出售的尺寸（~1磅）足以用于许多实验。
- 取出样品进行电镀后，向96孔板的所有孔中加入10%漂白剂溶液，静置至少10分钟。
- 通过将96孔板快速倒置在一个小的高边托盘或空的P1000移液器吸头容器上来去除大部分砂砾，该容器大到足以捕获所有内容物。砂砾将立即沉入托盘底部。将漂白剂溶液倒入水槽中。
- 用自来水重新填充96孔板，并倒置到同一托盘中以冲洗掉剩余的砂砾。将水倒入水槽中。
- 用自来水重复一到三次，直到盘子完全没有砂砾。
- 用自来水冲洗2x砂砾，每次填充托盘。
注意：96孔深孔板可以在实验室洗碗机中清洗，用箔纸牢固地覆盖，并用其他可重复使用的塑料高压灭菌。砂砾不需要立即清洗，此时可以放在一边。用过的砂砾通常在洗涤和高压灭菌之前从多个实验中积累。 - 在实验室洗涤剂溶液中洗涤砂砾30分钟，偶尔通过旋转或与金属刮刀混合来搅拌。
- 用几（8-10）次自来水冲洗掉所有洗涤剂的痕迹，然后用蒸馏水冲洗2次。
- 将砂砾铺在打开的托盘中，例如浅聚丙烯高压灭菌器托盘中，并在40-70°C下干燥数小时。
注意：如果砂砾干燥时结块，则说明未充分清洁或冲洗。从步骤4.6开始重复清洁方案，在步骤4.7中添加额外的冲洗液。 - 将干净、干燥的砂砾分配到螺旋顶可高温高压灭菌的玻璃瓶中，最大深度为5-6厘米。在预真空循环中高压灭菌30分钟以灭菌。
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Representative Results
活虫的漂白灭菌
表面漂白的蠕虫实际上没有外部细菌，直到运动恢复并恢复排泄。在这里使用的条件下，观察到缓冲液中细菌的快速灭绝（图1A-C，补充图2，视频1），而不会干扰冷麻痹蠕虫中的肠道相关细菌（图1D-F，视频2）。这些数据表明，表面漂白可以有效地用于外部消毒蠕虫，而不会影响肠道内容物（表面漂白与无漂白蠕虫相关CFU计数的比较并不重要，Wilcoxon秩和测试p>0.05）。
多样品机械破碎的变化
用于蜗杆机械破碎的96孔技术对所使用的特定材料具有鲁棒性，并且实际考虑因素决定了研磨材料的选择。与之前的报告33类似，在所有缓冲条件下，手动破坏（图2A）导致比标准96孔方案（碳化硅砂砾， 图2B）（var（log10CFU） = 0.499）更多的异质性，相比之下，碳化硅为0.229，大型玻璃珠为0.243（图2C），小玻璃珠为0.227（图2D）).尽管如此，CFU/蠕虫分布的大多数差异并不显著（Kruskal-Wallace，p = 0.017，df = 3，大珠子与小珠子的显着后Wilcoxon测试，p = 0.021，大珠子与碳化硅砂砾，p = 0.02）。当作为单个因素（Kruskal-Wallace，p = 0.94，df = 3）时，使用Triton X-100作为表面活性剂与含Triton的样品的产量没有任何显着差异，尽管当使用大珠子（2.7 mm）时，无Triton与含Triton的样品的产量明显增加（图2C），这可能是由于当Triton存在时在这些孔中观察到的过度“泡沫”。这些结果表明，大型玻璃珠虽然非常适合用于均质管33，但不适合96孔技术。虽然小玻璃珠产生了合理的结果（图2D），但它们在混合和电镀过程中始终堵塞200μL移液器吸头。该测定中的标准材料碳化硅砂砾价格低廉，太大而无法堵塞标准尖端，并且像玻璃珠一样可以在高压灭菌后清洗和重复使用。砂砾确实会将少量“灰尘”释放到缓冲液中，这不会干扰电镀，但如果将破坏产物用于流式细胞术，则需要过滤掉。
成虫细菌定植的异质性
成功破坏单个蠕虫揭示了细菌定植的异质性。来自同源同步蠕虫种群的个体，同时在同一细菌池中定植，在肠道细菌负荷中始终显示出100倍或更大的范围。对于不同的细菌殖民者（图3A）和在多物种细菌群落上的定植期间（图3B），观察到这一点。当蠕虫被表达荧光蛋白（GFP）的细菌定植时，这种异质性在荧光的个体蠕虫测量中也很明显（图3C-D）。宿主的特性在塑造这种异质性方面起着重要作用，通过比较野生型布里斯托尔N2蠕虫的定植与DAF-2 / IGF突变体中相同细菌的定植可以看出;与N2相比，这种daf-16突变体支持更多的许多细菌种群，而daf-2对一系列细菌36的定植具有抗性（图3B，D）。这种异质性是特征性的，显示了宿主和殖民者的不同组合之间的差异，同时在同一实验的不同运行中保持了一致的结构（图3E-F）。
个体异质性对群体准确比较的重要性
通过考虑批量摘要如何改变数据的分布，可以很容易地看出个体异质性的重要性。由本地微生物组细菌MYb53（红球藻）和MYb120（菊螅属）定植（图3A，4A）以N2成虫为例。单个蠕虫数据的分布明显相似（双尾 t 检验，p = 0.9，威尔科克森秩和，p = 0.59）。当重新采样这些数据以模拟批量摘要的影响时，由于这些分布中的正偏斜（均值>中位数），批量外推的CFU /蠕虫会拉向数据的上分位数。由于批处理有效地对批次中的个体进行平均，因此批量外推的CFU /蠕虫将以单个数据的算术平均值为中心，并且随着批次根据中心极限定理变大，到该平均值的距离减小（图4B-D）。因此，来自生物变异的信号很快就会丢失;批量推断的 CFU/蠕虫测量值收敛于平均值，这不是这些对数规模分布式数据的代表性指标。MYb53与MYb120推断定植的差异在模拟批次消化中迅速变得显着（t检验批次5，p = 0.049，批次10，p = 2.27e-4，批次20，p = 1.19e-15;威尔科克森秩数和测试批次5，p = 2.27e-4;批次 10， p = 2.70e-06;批次20，p = 1.80e-09）作为原始信号被遮挡。
个体异质性对微生物传播的影响
由于单个蠕虫在细菌定植中表现出实质性的异质性，因此有理由询问这种异质性是否具有下游效应。例如，可以合理地预期传播可能是肠道细菌负荷的函数。通过将单个表面漂白的蠕虫转移到清洁的环境中，可以观察到环境中排泄的活细菌的接种情况。在这些实验中，表面漂白的预定植成虫携带一般大量的共生Ochrob14-GFP或致病性金黄色葡萄球菌-GFP的群体（10 3-10 5 CFU / 蠕虫，图5），被允许在NGM琼脂上的热杀性OP50草坪上漫游1.5小时。当这些蠕虫从排泄板中重新收获并破坏以进行细菌定量时，细菌负荷与活细菌排泄速率之间没有显着关系（对数转化菌落/小时与CFU /蠕虫之间的Pearson相关性：MYb14 rho = 0.19，p = 0.45;金黄色葡萄球菌rho = 0.02，p = 0.9）（图5）。平板上是否存在菌落与肠道细菌负荷之间也没有显着关系（以对数转化的CFU / 蠕虫为因子的二项式逻辑回归：p = 0.15，df = 53）。很大一部分板仍然没有新的生长（MYb14为9/18板，金黄色葡萄球菌为10/36板），表明总体排泄率低。
当允许蠕虫排泄到琼脂平板上时，每条蠕虫排出的活细菌的实际数量被“养殖”混淆，其中蠕虫穿过菌落并产生新生长的痕迹（图6）37。具有n个菌落的板代表至少一个，最多n个，活菌落形成细菌排泄的事件。从这个观察中，不可能知道（1，n）中实际发生了多少个排泄事件，也不可能知道每个事件中有多少细菌被排泄。因此，使用这些数据无法精确估计肠道中活细菌的排泄率。但是，可以推断出一些界限。虽然每个板的菌落数量信息量不是很丰富，但存在/不存在数据可用于粗略推断排泄率。为简单起见，如果假设活细菌的排泄速率不是细菌负荷的函数，并且排泄是泊松过程，则在18次试验中，当λ在MYb14中≈0.33蠕虫-1 hr-1时，至少有50%的机会观察到至少9个事件。对于金黄色葡萄球菌，获得与0.2蠕虫-1 hr-1≈λ的相似合理率。虽然这些粗略的计算表明活细菌的排泄率很低，但为了获得可靠的估计，有必要对大量单个蠕虫的这一过程进行更精确的量化。
数据可用性：
此处显示的数据可在 Dryad （https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2） 上找到。
图 1.低浓度表面漂白处理可快速杀死缓冲液中的细菌，但不会干扰冷瘫蠕虫的肠道群落。（自动对照）在三种不同浓度（1：1000、1：2000、1：5000 v/v;未漂白对照进行比较）的表面漂白过程中，M9 蠕虫缓冲液中的细菌 CFU/mL），靶向 （A） 金黄色葡萄球菌纽曼、（B） 肠道链球菌 LT2 或 （C） 大肠杆菌 OP50。在暴露后长达20分钟的指定时间点采集样品，并用无菌缓冲液洗涤两次，以防止漂白剂杀死板上的菌落。1：1000 条件的数据将略微偏移，以便这些数据在图中可见。（D-F）单个N2蠕虫中的肠道细菌（每个实验n = 24个蠕虫，在单独的几天内独立运行两到三次）。表面漂白和无漂白蠕虫相关CFU计数的所有比较都是不显着的（Wilcoxon秩和试验p>0.05）。灰色水平线表示检测阈值，定义为从200μL体积中接种10μL等分试样时观察到至少一个菌落的概率约为60%的密度（40 CFU / worm）。请点击此处查看此图的大图。
图 2.96 孔中断方案可产生一致的结果，并且对材料的选择具有鲁棒性。根据标准方案对用单一细菌物种定植48小时的N2成虫（P. mosselii）进行表面漂白和透化，然后使用（A）在单个0.5 mL管中手动破坏单个蠕虫（每种条件n = 24）以进行CFU电镀，使用电动杵或（B-D）议定书中详细描述的96孔中断协议的变化。在含有不同浓度的Triton X-100（x轴，0-0.1%，v / v）和（B）36粒度碳化硅之一，（C）小（425-600μm）玻璃珠或（D）大（2.7mm）玻璃珠的M9蠕虫缓冲液中进行破坏。对于所有图，显示的数据都是对数10（CFU /蠕虫），每个点都是一个单独的蠕虫。请点击此处查看此图的大图。
图 3.秀丽隐杆线虫肠道的异质性细菌定植。（A）N2成雌雄同体的单种定植制备方法。细菌是来自MYb本地蠕虫微生物组集合的四个物种（Dirksen等人，2016年）（n = 24条蠕虫，每个蠕虫一个实验）和两种病原体，金黄色葡萄球菌MSSA纽曼（SA）和肠沙门氏菌LT2（SE）（在两/三个独立实验中n = 96-144条蠕虫）。在液体S培养基+ 108 CFU / mL细菌中于25°C培养基中孵育48小时后，评估天然微生物组物种的定植;在NGM蠕虫琼脂的草坪上孵育24（SA）或48（SE）小时后，在25°C下评估病原体的定植。 （在48小时时，金黄色葡萄球菌上的蠕虫大多死亡。（B）N2，daf-16（mu86）和daf-2（e1370）成虫的总CFU /蠕虫在液体培养基中在八种最小天然微生物组上定植4天（数据来自Taylor和Vega，2021）14。（C-D）用表达GFP的细菌定植的单个蠕虫中的绿色荧光，通过大型物体流式细胞术观察。在（C）中，N2成虫的同步种群被OP50（非荧光，n = 1908个成虫），金黄色葡萄球菌（GFP，n = 968）或肠道链球菌（GFP，n = 1153）定植，如（A）;OP50对照显示第3天成虫N2蠕虫的绿道自发荧光的典型水平。在（D）中，N2（n = 1165），daf-16（mu86）（n = 1180）和daf-2（e1370）（n = 2267）的同步种群在（A）中描述的板上用共生奥氏体MYb14-GFP定植2天。（中-女）金黄色葡萄球菌（E）和肠道链球菌（F）定植的日常变化（与图A和图1中的数据相同，每个实验n = 48条蠕虫）。x 轴表示采样日期。灰色水平线代表检测阈值，定义为观察到至少一个菌落的概率约为60%的密度（单物种定植为40 CFU / worm，多物种定植为4个CFU / 蠕虫，由于200μL中的10μL和100μL的电镀体积不同）。请点击此处查看此图的大图。
图 4.批处理可擦除扭曲的对数刻度数据中的生物变异。图 3 中的 CFU/蠕虫数据通过替换重新采样，为每个批次大小创建 n = 25 个模拟数据集，其中大小是每个批次的单个蠕虫的数量。CFU/蠕虫是每个模拟批次中的总 CFU 除以每个批次的蠕虫数量。在原始数据（图A）中，MYb53的平均CFU /蠕虫为4450.8（103.6），MYb120的平均CFU /蠕虫为1398.3（103.1）;随着批次大小的增加，批次推断的数字收敛到这些值（B，每批五个蠕虫;C，10条蠕虫/批;D，20个蠕虫/批次），与中心极限定理的期望一致。请点击此处查看此图的大图。
图 5.活细菌的排泄与单个蠕虫肠道中的CFU负荷关系不高。 在这里，N2成虫分别在 金黄色葡萄球菌-GFP或MYb14-GFP的草坪上喂食1或2天， 从而定植。将具有可检测GFP荧光的蠕虫（总GFP>大型流式细胞仪上的1.8个对数）从大量种群中分选，按照方法所述进行表面漂白，并单独转移到NGM +热杀灭OP50板中。对数转化菌落/小时与CFU/蠕虫之间的皮尔逊相关性不显著（MYb14 rho = 0.19，p = 0.45; 金黄色葡萄球菌 = 0.02， p = 0.9）。 请点击此处查看此图的大图。
图 6.细菌“养殖”掩盖了琼脂平板上排泄事件的数量。 这是两个板，其中有来自蠕虫排泄物的MYb14-GFP菌落。第一个板（A）有明确的证据表明沿着蠕虫路径“养殖”，并且似乎代表了基于菌落之间GFP表达差异（可见为淡黄色色素沉着）的至少两个单独的排泄事件。虽然第二个板块（B）更加模糊，但不能根据殖民地的位置排除农业。在这些实验中，N2成虫通过喂食含有MYb14-GFP草坪的琼脂平板预先定植48小时。定植后，制备蠕虫并按照方法进行表面漂白，然后在5μL等分试样M9蠕虫缓冲液+ 0.1%Triton X-100至6cm NGM +热杀灭OP50板中转移（通过允许50μL5x浓缩热杀灭OP50斑点在表面上干燥而制备）。允许蠕虫在25°C下漫游1.5小时，然后从板中取出并破坏CFU / 蠕虫电镀（使用电动杵在单个0.5 mL管中的20μL缓冲液中手动破碎）。将板在25°C下孵育2天，然后计数。 请点击此处查看此图的大图。
视频 1.用GFP荧光 金黄色葡萄球菌 定植的N2蠕虫的可视化，没有表面漂白。 当图像穿过蠕虫的身体时，角质层上的少量荧光细胞会进入和离开焦点，并且当视野从体表面移动到肠道时，肠道的空间异质定植变得可见。在倒置荧光显微镜上以20倍放大倍率拍摄Z-stack图像。使用供应商软件将明场和GFP滤波荧光图像叠加在一起，并将Z堆栈中的图像拼接在一起。图像来自与 补充图2A中的同一张幻灯片。 请按此下载此影片。
视频 2.用GFP荧光 金黄色葡萄球菌 定植的N2蠕虫的可视化，表面漂白（1：1000 v / v，持续20分钟）。 在个体的肠道中可见荧光细菌的空间异质定植，并且细菌已渗透到身体组织中，表明晚期感染。角质层上看不到细菌。在倒置荧光显微镜上以20倍放大倍率拍摄Z-stack图像。使用供应商软件将明场和GFP滤波荧光图像叠加在一起，并将Z堆栈中的图像拼接在一起。图像来自与 补充图 2B 中的同一张幻灯片。 请按此下载此影片。
补充图1。议定书概述。 在这里，同步成虫与红色细菌单定植，表面漂白，并在96孔格式的单个蠕虫机械破坏之前透化。从肠道释放的细菌被稀释成10x系列进行CFU / 蠕虫定量;所示的板是观察到的异质性的典型特征。 请按此下载此档案。
补充图2。用GFP荧光 金黄色葡萄球菌 定植的N2蠕虫的可视化，伴有和不伴有表面漂白（1：1000 v / v，持续20分钟）。 （A）在未漂白的样品中，外部细菌在低放大倍率下可见，作为与蠕虫或蠕虫体碎片无关的绿色荧光区域。（B）在表面漂白的样品中，GFP荧光仅限于蠕虫体的内部（一个蠕虫体碎片在图像中间可见）。所有图像均在倒置荧光显微镜上以4倍放大倍率拍摄。使用供应商软件将明场和GFP滤波荧光图像叠加在一起，并将相邻视场的图像拼接在一起。 请按此下载此档案。
补充文件1：缓冲液和溶液配方。请按此下载此档案。
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Discussion
这里提供了关于 秀丽隐杆线虫中细菌负荷的单蠕虫定量的优势的数据，以及96孔破坏方案，以允许快速和一致地获取这种类型的大型数据集。与现有方法33相比，这些方案允许对蠕虫中的肠道微生物群落进行更高通量的测量。
这种方法将电镀作为速率限制步骤，并不是真正的“高吞吐量”。大物体流式细胞术（图3C，D）是一种有用的高通量方法，用于量化单个蠕虫16中的荧光标记细菌，尽管同时荧光团的数量在多物种群落中是一个限制。将多孔板破坏与社区测序联系起来是提高通量的另一种方法;然而，这里描述的96孔破坏程序经过专门优化，以保持细菌细胞完整。基于测序的分析，其中需要彻底裂解细胞，将需要添加核酸提取步骤或修改跳动方案（方案3.10-3.11）以提取细胞内容物而不是活细菌。关于单蠕虫破坏和提取核酸的方案已在其他地方发表，38，39。
蠕虫肠道中的细菌总丰度是异质的，这里显示的数据表明，基于批次的测量可能会在组间比较中产生错误的结果。然而，蠕虫中细菌群落的其他测量可能对配料的影响不太敏感。值得注意的是，蠕虫相关群落的相对丰度似乎与肠道总种群规模相差甚远，无论微生物之间的相互作用是否为中性40 或14。与计数数据相比，相对丰度测量值可能不太容易受到所描述的假阳性率问题的影响。因此，基于测序的群落分析可以生成群落组成的相对丰度数据，因此可能不需要测量单个蠕虫。在这一点上需要进一步调查。
在这里，我们使用冷处理来麻痹蠕虫以进行表面漂白。其他工作发现，如果冰上的时间保持在30分钟以下，蠕虫会迅速恢复正常活动（<15分钟），允许立即用于进一步的测定，与化学麻痹剂相比，化学麻痹剂可能需要更长的时间才能完全恢复34。如果要立即破坏蠕虫以进行细菌定量，则该功能是可有可无的，与化学麻痹相比，冷却的主要优点是避免了对受控废物流的需要。在研究应力反应时，应谨慎使用延长的冷处理，特别是如果与温度有已知的联系。这里描述的冷麻痹方案需要比冷应激实验中使用的更短的急性冷暴露（20-30分钟vs 2+小时在2-4°C下）41，42，43，并且1小时的冷休克在野生型蠕虫中没有产生明显的表型43。在4°C下短期（90分钟）孵育诱导冷应激基因表达的变化（通过TMEM-135：：GFP报告的表达测量），但一旦蠕虫恢复到室温34，表达在几分钟内恢复到无应激水平。然而，对应激敏感蠕虫基因型的影响可能比野生型更严重。该程序应在要使用的实验条件下进行验证。
这里描述的表面漂白方案可以用作限制或消除实验中外部微生物传代的方法。这种方法还用于通过表面漂白和仅将L1 / L2幼虫转移到新鲜板中来清除真菌污染物（表面漂白的成虫的转移导致无法清除污染物，可能是由于较大动物的肠道携带）。确保漂白剂浓度不超过1：1000 v / v至关重要，因为会导致蠕虫的损害和死亡。该过程可能在实验性宿主 - 微生物进化和宿主 - 病原体相互作用中有用。例如，这里观察到的活细菌的低排泄率可以帮助解释观察到的细菌从雌雄同体到后代15的高度可变的传播率。这里观察到的肠道细菌负荷与排泄率之间缺乏相关性是有趣的，但需要进一步研究;需要跨一系列条件的大量数据点来确定此观测值的位置（或是否）。
可能并不总是需要将蠕虫清洁到表面漂白提供的程度。当蠕虫用单个微生物内部定植时，如果最小预期的CFU / worm远高于缓冲液上清液中细菌的浓度（10-100倍），则在无菌缓冲液中多次洗涤可能就足够了，因为这种残留物对计数的影响最小（见 图1）。此外，如果感兴趣的微生物主要定植于角质层，则应明确避免表面漂白。在处理混合微生物群落时（确保样品中的所有菌落/读数都来自蠕虫相关细菌而不是来自环境），当粘附在角质层上的细菌干扰读取内化群体时，当预期的最小CFU / 蠕虫低时，彻底清洁更为重要，以确保准确性。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢H.舒伦伯格和C.拉洛克在这些实验中使用的细菌菌株的慷慨分享。这项工作得到了埃默里大学和NSF（PHY2014173）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
| 96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
| 96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
| 96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
| Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
| Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
| Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
| BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
| Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
| Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
| Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
| Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
| DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
| Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
| Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
| Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
| Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
| Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
| Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
| Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
| Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
| PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
| Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
| Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
| Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
| Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
| Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
| Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |
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