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Biology

Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64027
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

Summary

Questo protocollo descrive un'interruzione di 96 pozzi di singole Caenorhabditis elegans colonizzate battericamente a seguito di paralisi fredda e sbiancamento superficiale per rimuovere i batteri esterni. La sospensione risultante è placcata su piastre di agar per consentire una quantificazione accurata e di media produttività della carica batterica in un gran numero di singoli vermi.

Abstract

Il nematode Caenorhabditis elegans è un sistema modello per le interazioni ospite-microbo e ospite-microbioma. Molti studi fino ad oggi utilizzano digest batch piuttosto che singoli campioni di vermi per quantificare la carica batterica in questo organismo. Qui si sostiene che la grande variabilità inter-individuale osservata nella colonizzazione batterica dell'intestino di C. elegans è informativa e che i metodi di digestione batch scartano le informazioni che sono importanti per un confronto accurato tra le condizioni. Poiché la descrizione della variazione inerente a questi campioni richiede un gran numero di individui, viene stabilito un comodo protocollo a piastre a 96 pozzetti per l'interruzione e la placcatura della colonia di singoli vermi.

Introduction

L'eterogeneità nelle associazioni ospite-microbo è osservata ovunque e la variazione tra gli individui è sempre più riconosciuta come un fattore che contribuisce ai processi a livello di popolazione dalla competizione e coesistenza1 alla trasmissione della malattia 2,3,4. In C. elegans, "eterogeneità nascosta" all'interno di popolazioni isogeniche è stata osservata ripetutamente, con sottopopolazioni di individui che mostrano fenotipi distinti nella risposta allo shock termico 5,6, invecchiamento e durata della vita 7,8,9,10,11 e molti altri aspetti della fisiologia e dello sviluppo12 . La maggior parte delle analisi che tentano di identificare la struttura della sottopopolazione forniscono prove di due sottopopolazioni in popolazioni sperimentali di vermi isogenici e sincronizzati 5,7,8, sebbene altri dati suggeriscano la possibilità di distribuzioni all'interno della popolazione di tratti piuttosto che gruppi distinti 7,12,13 . Di rilevanza qui, l'eterogeneità sostanziale nelle popolazioni intestinali è osservata anche all'interno di popolazioni isogeniche di vermi colonizzati da una fonte condivisa di microbi 13,14,15,16, e questa eterogeneità può essere nascosta dalle misurazioni del digest batch che sono ampiamente utilizzate 17,18,19,20 per la quantificazione batterica nel verme.

Questo lavoro presenta dati che suggeriscono la necessità di una maggiore dipendenza dalle misurazioni a singolo worm nell'associazione ospite-microbo, nonché dai protocolli per aumentare l'accuratezza e il throughput nell'interruzione del singolo worm. Questi protocolli sono progettati per facilitare l'interruzione meccanica di un gran numero di singoli C. elegans per la quantificazione della carica batterica vitale, fornendo al contempo una migliore ripetibilità e uno sforzo inferiore per campione rispetto all'interruzione basata sui parassiti dei singoli vermi. Una fase raccomandata di spurgo intestinale, in cui i vermi sono autorizzati a nutrirsi di E. coli ucciso dal calore prima della preparazione per l'interruzione, è inclusa per ridurre al minimo i contributi di batteri recentemente ingeriti e altri batteri transitori (non aderenti). Questi protocolli includono un metodo di paralisi a freddo per la pulizia della cuticola con un trattamento di candeggina superficiale a bassa concentrazione; lo sbiancamento superficiale può essere utilizzato come fase preparatoria nella distruzione di un singolo verme o come metodo per preparare vermi vivi e privi di germi esternamente. Questo metodo di sbiancamento superficiale è sufficiente per rimuovere una vasta gamma di microbi esterni e il trattamento a freddo fornisce un'alternativa alla paralisi convenzionale basata sul levamisolo; mentre il levamisolo sarà preferito per gli esperimenti sensibili al freddo, la paralisi a freddo riduce al minimo i contributi ai flussi di rifiuti pericolosi e consente una rapida ripresa della normale attività. Mentre il protocollo completo descrive un esperimento di laboratorio in cui i vermi sono colonizzati con batteri noti, le procedure per la pulizia dei vermi e l'interruzione del verme singolo possono essere prontamente applicate a vermi isolati da campioni selvatici o colonizzati in esperimenti di microcosmo. I protocolli qui descritti producono batteri vivi estratti dall'intestino del verme, adatti per la placcatura e la quantificazione di unità formanti colonie (CFU) in singoli vermi; per l'analisi della comunità intestinale basata sul sequenziamento, a questi protocolli devono essere aggiunte successive fasi di lisi cellulare e di estrazione dell'acido nucleico.

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Protocol

I vermi utilizzati in questi esperimenti sono stati ottenuti dal Caenorhabditis Genetic Center, che è finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 è il wild-type. I mutanti DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) e daf-2(e1370) III (CGC CB1370) sono usati per illustrare le differenze nella carica batterica intestinale.

HT115(DE3) E. coli che trasporta il vettore pos-1 RNAi proviene dalla libreria Ahringer21. La collezione MYb di batteri intestinali nativi C. elegans 22 è stata ottenuta dal laboratorio Schulenburg. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR proviene da questo laboratorio23. Pseudomonas mosselii è stato isolato in questo laboratorio. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP è stato ottenuto dal laboratorio LaRock della Emory University.

Tutti i worm buffer e i supporti sono preparati secondo la letteraturaprecedentemente pubblicata 24 con piccole modifiche (vedere il file supplementare 1).

1. Preparazione di C. elegans sterili sincronizzati

NOTA: in questa sezione vengono descritte procedure dettagliate per la generazione di una popolazione sincronizzata di vermi adulti sterili per la riproduzione. Nutrirsi di piastre RNAi pos-1 viene utilizzato qui per prevenire la produzione di progenie perché questa interferenza è letale embrionale; Le larve L1 allevate fino all'età adulta su pos-1 RNAi si sviluppano in ermafroditi che depongono le uova, ma queste uova sono invivibili25. Il protocollo di alimentazione RNAi è come nel capitolo "Reverse genetics" di Wormbook26.

  1. Prima di sincronizzare i vermi, assicurarsi che siano disponibili piastre fresche NGM + pos-1 RNAi da 10 cm. Le piastre possono essere preparate fresche da colture liquide indotte concentrate (+Amp +IPTG) o inoculate come prati su NGM + 100 μg/mL di ampicillina + 1 mM IPTG e lasciate crescere a 25 °C al buio per 1 giorno27.
    NOTA: La carbenicillina (25 μg/ mL) viene spesso utilizzata al posto dell'ampicillina sulle piastre RNAi. L'ampicillina è meno costosa ma meno stabile; se si utilizza ampicillina, i piatti devono essere seminati immediatamente una volta asciutti e utilizzati il prima possibile (possono essere conservati per <1 settimana a 4 °C)27. L'alta concentrazione di antibiotici qui raccomandata contribuirà a garantire una selezione adeguata.
  2. Inizia con diverse (in genere da due a quattro) placche NGM con grandi popolazioni di ermafroditi gravidi. Isolare le uova utilizzando la sincronizzazione candeggina-NaOH24.
    1. Lavare i vermi dalle piastre di agar usando 2 ml di ddHsterile 2O per piastra. Distribuire uniformemente il liquido in tubi microcentrifuga da 1,5 ml (un tubo per piastra o ermafroditi).
    2. Spin down per ~ 5 s in una minicentrifuga da banco (2.000 x g) per tirare gli adulti sul fondo dei tubi. Pipettare il surnatante e scartare.
    3. Lavare con 1 mL di ddH2O sterile; girare verso il basso come prima e scartare il surnatante.
    4. Ripetere il passaggio precedente per ridurre i detriti batterici rimanenti.
    5. Sospendere il contenuto di ciascun tubo in 1 mL di ddH2O sterile. Aggiungere a ciascun tubo 130 μL di candeggina commerciale (8,25% ipoclorito di sodio) e 130 μL di idrossido di sodio 5 N (NaOH, concentrazione finale 0,5 N).
    6. Tubi a vortice vigorosamente per almeno 10-15 s ogni 2 minuti fino a quando i corpi adulti si sono rotti. Non permettere che il trattamento con candeggina-NaOH duri più di 5 minuti per evitare di uccidere le uova.
    7. Girare in un minicentrifuga per 30-60 s a 2.000 x g per pellettizzare le uova. Pipettare il surnatante e scartare. Ci può essere o non può essere un pellet visibile, questo è normale.
    8. Aggiungere 1 mL di worm buffer M9 e ruotare per 30-60 s a 2000 x g. Scartare il surnatante.
    9. Ripetere la fase di risciacquo (1.2.8) 5x per rimuovere accuratamente la miscela di candeggina-NaOH, rimuovendo il più possibile il surnatante senza disturbare il pellet d'uovo.
    10. Trasferire le uova in 10 mL di tampone a vite senza fine M9 in un tubo conico da 50 mL o in un tubo di coltura da 30 mL con cappuccio. Se si utilizzano tubi conici, lasciare il coperchio leggermente svitato e utilizzare un po 'di nastro adesivo per tenerlo al sicuro. Incubare con agitazione notturna (16 h) a 25 °C e 200 RPM per consentire alle larve di schiudersi.
  3. Trasferisci le larve L1 sincronizzate alle placche RNAi per crescere fino all'età adulta.
    1. Aggiungere 2 mL di tampone M9 sterile + 0,01% Triton X-100 (d'ora in poi M9TX-01) a ciascun tubo L1 e trasferire l'intero volume (12 mL) in un tubo conico a vite da 15 mL.
    2. Posizionare tubi da 15 ml con vermi L1 a 4 °C per 10 minuti per rallentare il movimento larvale.
    3. Spin down di tubi conici da 15 mL in una grande centrifuga da tavolo (1.500 x g a 4 °C per 3 min; accelerazione e decelerazione non devono essere superiori all'80% del massimo).
    4. Pipettare con cura il surnatante senza disturbare il pellet L1. Scartare il surnatante.
    5. Aggiungere 12 ml di M9TX-01 freddo a ciascun tubo. Ripetere la centrifugazione. Pipettare con cura e scartare il surnatante. Ogni tubo dovrebbe avere ~ 200 μL rimanenti.
    6. Risciacquare una punta della pipetta da 200 μL in M9TX-01 per evitare che i vermi si attacchino alla plastica, quindi utilizzare questa punta per risospese il pellet di verme. Trasferire i vermi risospesi su piastre pos-1 preparate pipettando gocce di liquido sul prato batterico.
    7. Incubare le piastre a 25 °C fino al primo giorno di età adulta.
      NOTA: Se i vermi crescono su piastre RNAi pos-1 , i vermi DEVONO nutrirsi ad libitum sui batteri RNAi fino a quando non sono completamente passati all'età adulta per garantire un'elevata penetranza del fenotipo embrionale-letale. Controllare le piastre a 24 e 48 h. Se i piatti appaiono affamati o quasi affamati, i vermi dovranno essere spostati in piatti freschi per finire di crescere in adulti a grandezza naturale. Per evitare di esaurire le piastre prima che i vermi vengano coltivati, mirare ad aggiungere 250-500 larve L1 a ciascuna piastra RNAi di 10 cm.
  4. Raccogli gli adulti e cancella l'E. coli intestinale per creare vermi privi di germi.
    1. Risciacquare i vermi adulti dalle piastre usando 5 ml di M9TX-01 per piastra. Trasferire tampone + vermi in un tubo conico da 15 ml e consentire agli adulti di depositarsi sul fondo del tubo.
    2. Risciacquare gli adulti con cambi di 10 ml di tampone fresco M9TX-01 fino a quando non rimane torbidità batterica visibile (in genere 1-2x). I tubi possono essere centrifugati a 700 x g per 30 s a vermi pellet, oppure gli adulti possono essere autorizzati a depositarsi per gravità.
    3. Eseguire un lavaggio aggiuntivo con 10 ml di M9TX-01 per ridurre i batteri esterni.
    4. Trasferire i vermi in tubi conici da 50 mL o tubi di coltura da 30 mL contenenti 5 mL S Medium + 2x E. coli OP50 termoidenti (~5 x 109 cellule uccise/mL) + 200 μg/mL di gentamicina + 50 μg/mL di cloramfenicolo. Se si utilizzano tubi conici, lasciare il coperchio leggermente svitato e utilizzare un po 'di nastro adesivo per tenerlo al sicuro. Utilizzare pipette di vetro o risciacquare pipette di plastica in M9TX-01 per evitare che i vermi si attacchino.
    5. Incubare adulti a 25 °C con agitazione a 200 RPM per 24-48 ore per produrre adulti privi di germi.
      NOTA: Se i vermi devono rimanere negli antibiotici per >24 ore, potrebbe essere necessario aggiungere più OP50 ucciso dal calore per garantire che i vermi abbiano una fonte di cibo adeguata. Controllare i tubi a 24 ore e integrare con OP50 ucciso termicamente se la torbidità è visibilmente ridotta.
  5. Il saccarosio lava gli adulti secondo i protocolli Wormbook24 per ottenere scorte pulite, riproduttivamente sterili e sincronizzate per soli adulti per la colonizzazione batterica.
    1. Assicurarsi che i volumi freddi di saccarosio al 60%, worm buffer M9 e M9TX-01 siano pronti per l'uso. Per semplicità, questi possono essere lasciati a 4 °C la sera prima.
    2. Per ogni campione da lavare, creare un tubo conico da 15 mL etichettato contenente 8 mL di M9TX-01 e mettere da parte sul ghiaccio. Questi saranno necessari nel passaggio 1.5.10.
    3. Aggiungere 5 mL di M9TX-01 a ciascun tubo da 50 mL contenente larve L1. Trasferire l'intero volume (ora 10 mL) in un tubo conico a vite vuoto da 15 mL e consentire agli adulti di depositarsi sul fondo del tubo.
    4. Pipettare con cura il surnatante e scartare.
    5. Aggiungere 10 mL M9TX-01 a ciascun tubo e spostare i tubi in un secchiello del ghiaccio per 5-10 minuti.
      NOTA: a partire da questo punto, i vermi e tutti i buffer devono essere mantenuti sul ghiaccio.
    6. Utilizzare l'impostazione "temperatura rapida" per raffreddare una grande centrifuga da tavolo a 4 °C.
    7. Aggiungere 10 ml di M9TX-01 freddo a ciascun tubo per risciacquare eventuali detriti rimanenti. Lascia che i vermi si depositino sul ghiaccio; rimuovere il surnatante e scartare.
    8. Galleggiante di saccarosio: aggiungere 5 mL di tampone M9 freddo e 5 mL di soluzione fredda al 60% di saccarosio in ciascun tubo, mescolando accuratamente. Quindi, far galleggiare con attenzione 1 mL di tampone M9 freddo sopra la miscela tampone di saccarosio in ciascun tubo. Non mescolare dopo che il galleggiante è stato aggiunto.
      ATTENZIONE: Muoviti rapidamente per i prossimi passi: i vermi possono essiccare se esposti ad alte concentrazioni di saccarosio per troppo tempo!
    9. Centrifugare a 1500 x g per 3 min a 4 °C. I vermi adulti vivi saranno all'interfaccia tra m9 e saccarosio, a circa 1 mL dalla parte superiore del tubo.
    10. Utilizzare una pipetta sierologica di vetro da 5 mL per trasferire lo strato di vite senza fine in tubi conici da 15 mL preparati con M9TX-01 freddo (dal passaggio 1.5.2). Fai molta attenzione a ottenere lo strato di vermi vivi senza pipettare troppo del saccarosio.
    11. Se necessario, aggiungere M9TX-01 per ottenere volumi uguali di 10-12 ml / tubo. Centrifugare a 1500 x g a 4 °C per 1 min, quindi pipettare il surnatante. I vermi possono essere riportati a temperatura ambiente a questo punto.
    12. Ripetere due volte la fase di lavaggio 1.5.11, riducendo la velocità a 700 x g a 4 °C e il tempo a 30 s.

2. Nutrire i vermi con batteri vivi in coltura liquida

NOTA: Questo protocollo viene utilizzato per colonizzare vermi con batteri cresciuti in laboratorio in condizioni ben miscelate in coltura liquida (Figura supplementare 1). I vermi possono essere colonizzati con singoli isolati di coltura pura (ad esempio, agenti patogeni come Enterococcus faecium 28,29) o miscele di isolati (ad esempio, comunità minime di microbioma14).

  1. Inizia con vermi adulti sincronizzati lavati con saccarosio dal passaggio 1.5 del protocollo in un tubo conico da 15 ml. Lavare i vermi una volta in 12 ml di tampone S e scartare il surnatante.
  2. Risospesciare i vermi lavati nel volume di S medium necessario per l'esperimento. Considera il volume delle condizioni sperimentali, il numero di condizioni su cui i vermi saranno divisi e le concentrazioni finali di vermi e batteri.
    NOTA: l'alimentazione nei vermi varia con la disponibilità batterica30 e i vermi possono essere stressati affollando31. Per la colonizzazione in coltura liquida, si raccomandano <1000 vermi/mL e >107 CFU/mL; 1011 CFU/mL è considerata densità di alimentazione "ad libitum" su E. coli32.
  3. Spin down colture batteriche. Versare il surnatante; l'aspirazione o il pipettaggio possono essere utilizzati per rimuovere il surnatante per i batteri che formano pellet sciolti.
    NOTA: per colture >5 mL, trasferire su tubi da 15 mL e ruotare a ~ 2800 x g in una grande centrifuga da tavolo per 8-10 min. Le colture <5 mL possono essere trasferite in tubi da 1,5 mL e centrifugate a 9000 x g per 1-2 minuti in una piccola centrifuga da tavolo. I batteri altamente mobili (ad esempio, molte specie di Pseudomonas) potrebbero dover essere refrigerati a 4 °C per 10-15 minuti per facilitare la formazione di un pellet stabile, e potrebbe essere meglio centrifugare a 4 °C.
  4. Risospendare le colture batteriche in un volume di tampone S e centrifugare di nuovo a pellet. Rimuovere e scartare il surnatante come prima.
  5. Risospese le colture batteriche in mezzo S alla densità desiderata per l'esperimento, più eventuali antibiotici per la selezione. Gli antibiotici da utilizzare, se presenti, dipenderanno dal profilo di resistenza dei batteri utilizzati per la colonizzazione.
  6. Utilizzando una punta di pipetta rivestita in M9TX-01, i vermi delle pipette si insinuano delicatamente su e giù fino a quando i vermi non vengono completamente risospesi nel mezzo S, quindi trasferiscono su tubi o pozzetti di piastre per la colonizzazione batterica.
  7. Aggiungere la sospensione batterica a ciascuna coltura di vermi per raggiungere la concentrazione batterica desiderata e il volume finale.
  8. Se si utilizza una piastra multi-pozzo per la colonizzazione, coprire la piastra con una membrana sigillante sterile permeabile al gas a 96 pozzetti.
  9. Incubare con agitazione a 200 RPM per evitare che i batteri si depositino durante l'incubazione.

3. Interruzione meccanica dei singoli vermi in un formato a 96 pozzetti

NOTA: Questa sezione descrive un protocollo di formato piastra a 96 pozzetti per l'interruzione meccanica di singoli C. elegans colonizzati battericamente. I primi passi del protocollo (3.1-3.8) descrivono un metodo per eliminare i batteri non aderenti dall'intestino del verme e pulire l'esterno dei vermi usando la paralisi a freddo e lo sbiancamento superficiale. Questi passaggi produrranno vermi adulti puliti e vivi che possono essere interrotti meccanicamente per la quantificazione del contenuto batterico (3.8-end) o utilizzati per ulteriori esperimenti (Figura supplementare 1). Questo protocollo può essere adattato per quantificare i batteri nei vermi colonizzati in coltura liquida (Sezione 2), su piastre di agar o da terreno naturale o microcosmo.

  1. Posizionare un'aliquota di M9TX-01 sul ghiaccio per raffreddare (4-5 volte il numero di campioni in ml).
  2. Preparare un'aliquota di M9TX-01 + candeggina (6% di ipoclorito di sodio, 1:1000 o 1:2000 v/v, 1 mL per campione + 1 mL extra) e mettere sul ghiaccio per raffreddare. Questa aliquota sarà utilizzata nella fase 3.8.
  3. Preparare piastre a 96 pozzetti per la diluizione seriale di campioni di worm interrotti.
    1. Ottenere piastre sterili da 300 μL capacità 96 pozzetti con coperchi; questo protocollo utilizza una piastra di diluizione per 12 vermi digeriti.
    2. Utilizzare un pipettor multicanale a 96 pozzetti per riempire le file B-D di ogni piastra a 96 pozzetti (capacità di 300 μL) con 180 μL di 1 buffer PBS. Lasciare vuota la riga superiore. Le righe B-D diventeranno diluizioni seriali 10x dei digest worm [0,1x, 0,01x, 0,01x].
    3. Mettere da parte i piatti. Le piastre di diluizione saranno utilizzate nel passaggio 3.13.
  4. Sospendere ogni campione di verme in 1 mL di M9TX-01 in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
  5. Ruotare brevemente i tubi (2-3 s) in una minicentrifuga a bassa velocità (2.000 x g) a 25 °C per pellet adulti. Pipettare il surnatante e scartare, assicurandosi di non disturbare il pellet di verme.
  6. Utilizzando le impostazioni di centrifugazione nel passaggio 3.5, sciacquare i vermi due volte con 1 mL di M9TX-01, quindi una volta con 1 mL di tampone worm M9, per ridurre i batteri esterni.
  7. Eliminare i batteri non aderenti dall'intestino del verme.
    1. Risospesare ogni campione di vermi in 1 mL di S medio + 2x OP50 ucciso termicamente in un tubo di coltura.
    2. Incubare a 25 °C per 20-30 minuti per consentire il passaggio di eventuali batteri non aderenti dall'intestino.
      NOTA: Questo eliminerà anche qualsiasi proteina fluorescente extracellulare dal lume e consentirà una visualizzazione più chiara dei batteri etichettati aderenti all'epitelio intestinale, in particolare quando vengono utilizzati fluorofori acido-veloci (ad esempio, mCherry, dsRed).
  8. Vermi di candeggina superficiale per eliminare i batteri esterni.
    1. Risciacquare i vermi eliminati due volte con 1 mL di M9TX-01 freddo ed eliminare il surnatante.
    2. Lasciare raffreddare i tubi per 10 minuti su ghiaccio (preferibilmente) o a 4 °C. Ciò paralizzerà i vermi e impedirà l'ingestione di candeggina.
      NOTA: Altri protocolli utilizzano un agente di paralisi chimica come il levamisolo; si tratta di un approccio consolidato33 che richiede l'aggiunta di un flusso di rifiuti pericolosi.
    3. Aggiungere 1 mL di tampone a vite senza fine M9 ghiacciato + candeggina non profumata (8,25% idrossido di sodio, 1:1000 o 1:2000 v/v) a ciascun tubo. Lasciare che i tubi si siedano sul ghiaccio (preferibilmente) o a 4 °C per almeno 10 minuti per uccidere i batteri esterni.
      NOTA: Non superare la concentrazione di candeggina 1:1000. Anche nei vermi paralizzati, la mortalità può risultare.
    4. Pipettare fuori dal tampone di candeggina e scartare; riportare i tubi sul ghiaccio per garantire che i vermi non riprendano a pompare fino a quando la candeggina non viene eliminata.
    5. Aggiungere 1 mL di M9TX-01 freddo a ciascun tubo. Spin per ~5 s in una minicentrifuga (2.000 x g a 25 °C); riportare i tubi al ghiaccio. Rimuovere il surnatante e scartare.
    6. Ripetere questa fase di risciacquo con un altro 1 mL di M9TX-01 freddo, scartando il più possibile il surnatante.
      NOTA: Se si utilizzano vermi per ulteriori esperimenti, saltare la fase di permeabilizzazione (Protocollo 3.9) e trasferire invece gli adulti appena sbiancati in superficie in un tampone ghiacciato in una capsula di Petri di 6 cm e separare i vermi in condizioni sperimentali come nel Protocollo 3.10. Mantenere i vermi freddi per evitare che la motilità riprenda, ma lavorare rapidamente - mantenere i vermi per >30 minuti sul ghiaccio può potenzialmente comportare < ripresa al 100% della normale attività34.
  9. Permeabilizzazione chimica della cuticola vermiforme con sodio dodecil solfato e ditiotrikgil (0,25% SDS + 300 mM DTT) (basato su35)
    ATTENZIONE: DTT è un agente riducente e irritante. Indossare DPI e lavorare in una cappa aspirante quando si maneggiano scorte o soluzioni asciutte. È necessario un flusso di rifiuti pericolosi.
    1. Nella cappa aspirante, preparare una soluzione SDS/DTT sufficiente per consentire 100 μL per ogni campione. Per 1 mL, fino a 965 μL di tampone worm M9 o M9TX-01 in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL, aggiungere 5 μL di SDS al 5% (p/v) e 30 μL di 1M DTT.
      NOTA: la soluzione di DTT da 1 M (acquosa) deve essere preparata fresca o conservata in aliquote a -20 °C per garantire la potenza. Le aliquote dovrebbero essere dimensionate per essere utilizzate in due o tre esperimenti per evitare un eccessivo ciclo di congelamento-scongelamento.
    2. Spostare i tubi microcentrifuga contenenti vermi sbiancati in superficie in un rack per tubi a temperatura ambiente. Ogni tubo deve contenere vermi in ~ 20 μL di tampone.
    3. Aggiungere 100 μL di soluzione SDS/DTT a ciascun campione di worm. Smaltire qualsiasi soluzione SDS/DTT rimanente nel flusso di rifiuti pericolosi appropriato.
    4. Lasciare che il trattamento proceda fino a 8 minuti sul banco per abbattere parzialmente la cuticola resistente dei vermi adulti. I vermi moriranno e si depositeranno sul fondo del tubo durante questo periodo.
    5. Dopo che il tempo di permeabilizzazione è scaduto, pipettare con cura il surnatante SDS / DTT e smaltirlo in un flusso di rifiuti pericolosi SDS / DTT appropriato.
    6. Aggiungere 1 mL di M9TX-01 a ciascun tubo. Ruotare brevemente in una centrifuga da tavolo per pellettificare i vermi o consentire ai vermi di depositarsi per gravità sul fondo dei tubi, quindi estrarre il surnatante e smaltire in un flusso di rifiuti pericolosi SDS / DTT.
    7. Sospendere i worm in 1 mL M9 worm buffer + 0,1% Triton X-100 fino a quando non è pronto per l'uso.
  10. Separare i vermi in una profonda piastra a 96 pozzetti con graniglia di carburo di silicio per interruzioni meccaniche. Preparare la piastra di interruzione a 96 pozzetti come sotto.
    1. Ottenere una piastra sterile da 2 ml a 96 pozzetti profondi e un coperchio in silicone a 96 pozzetti corrispondente.
      NOTA: è importante utilizzare piastre compatibili con gli adattatori a 96 pozzetti per il disgregatore tissutale. Piccole differenze nelle dimensioni esterne fanno la differenza tra una piastra che può essere rimossa dagli adattatori e una che non può.
    2. Usando una spatola sterile, aggiungi una piccola quantità di carburo di silicio sterile a grana 36 a ciascun pozzetto della piastra che riceverà un verme. Utilizzare abbastanza grana per coprire a malapena il fondo del pozzo (circa 0,2 g per pozzetto). Il materiale eccessivo renderà difficile ottenere una punta di pipetta sul fondo del pozzo quando si recupera il contenuto.
    3. Aggiungere 180 μL di worm buffer M9 a ciascun pozzetto.
    4. Etichettare le colonne o le righe per indicare dove andrà ogni campione, quindi coprire liberamente la piastra con il coperchio della piastra in silicio a 96 pozzetti.
  11. Trasferire i singoli vermi alla piastra a 96 pozzetti per l'interruzione.
    1. Spostare attentamente i vermi permeabilizzati su una piccola capsula di Petri (35 o 60 mm) contenente un M9TX-01 sufficiente per riempire il piatto a una profondità di ~ 1 cm.
      NOTA: se è presente un gran numero di vermi, potrebbe non essere possibile trasferire l'intero campione poiché il liquido diventerà affollato e sarà difficile pipettare singoli vermi.
    2. Utilizzando un microscopio di dissezione o un altro dispositivo a basso ingrandimento, pipettare i singoli vermi in volumi di 20 μL e trasferire questi vermi ai singoli pozzetti della piastra a 96 pozzetti.
      NOTA: è meglio raccogliere solo vermi appena uccisi. Evitare vermi con una forma lineare rigida, in quanto questi vermi potrebbero essere morti da qualche tempo. Prova a prendere vermi curvi o a forma di S, con normale fisiologia grossolana e un intestino intatto.
    3. Dopo aver trasferito ogni volume, assicurarsi che il worm selezionato sia stato effettivamente espulso nel pozzo. Per fare questo, pipettare fino a 20 μL di M9TX-01 da un'area chiara della piastra di Petri e rilasciare l'intero volume nella piastra; questo normalmente espellerà il worm se è attaccato alla pipetta. Se il worm è rimasto bloccato, rimuovere 20 μL dal pozzo e riprovare il trasferimento.
    4. Una volta trasferiti tutti i vermi, coprire la piastra a 96 pozzetti con un foglio di pellicola sigillante flessibile con supporto cartaceo disponibile in commercio (2 x 2 quadrati), assicurandosi che il lato cartaceo del film sigillante sia rivolto verso il basso sui pozzetti del campione. Fare attenzione a non allungare il film sigillante troppo sottile, o sarà molto difficile da rimuovere in seguito.
    5. Posizionare leggermente il tappetino sigillante in silicone sopra il film sigillante flessibile; non premere il coperchio nei pozzetti in questo momento.
    6. Spostare la piastra a 4 °C per raffreddare per 30-60 minuti. Ciò impedirà il surriscaldamento durante l'interruzione, che può danneggiare i campioni.
      NOTA: questo è un punto di interruzione nel protocollo. Nella maggior parte dei casi, la piastra può essere lasciata a 4°C per un massimo di 4 ore prima della macinazione. Non lasciare i vermi durante la notte, poiché ciò cambierà la conta batterica.
  12. Carica piastre a 96 pozzetti su un distruttore di tessuto per rompere i tessuti dei vermi e rilasciare batteri intestinali.
    NOTA: (Opzionale) Se si utilizza un numero dispari di piastre da 96 pozzetti per i digest, è necessario preparare un contrappeso prima di procedere. Utilizzare una piastra vuota profonda da 96 pozzetti e riempire i pozzetti con acqua fino a quando non pesa lo stesso della prima piastra.
    1. Premere saldamente il tappetino sigillante in silicone nei pozzetti per creare una guarnizione, assicurandosi che il coperchio sia piatto su tutta la superficie della piastra.
      NOTA: se il film sigillante flessibile è troppo spesso dopo lo stiramento, sarà difficile fissare il coperchio in silicone in modo che sia piatto in tutti i pozzetti. Ciò si tradurrà in una tenuta insufficiente e in una contaminazione da pozzo a pozzo durante l'agitazione.
    2. Fissare le piastre nel disgregatore tissutale utilizzando gli adattatori per piastre a 96 pozzetti. Agitare le piastre per 1 minuto a 30 Hz, quindi ruotare le piastre di 180 ° e agitare di nuovo per 1 minuto. Ciò contribuirà a garantire un'interruzione uniforme in tutti i pozzetti della piastra.
    3. Tocca saldamente le piastre sul banco due o tre volte per rimuovere qualsiasi grana dal film sigillante flessibile.
    4. Utilizzando una grande centrifuga con due adattatori a piastre da 96 pozzetti, ruotare le piastre a 2400 x g per 2 minuti per raccogliere tutto il materiale sul fondo dei pozzetti.
    5. Rimuovere il coperchio in silicone e staccare con cura il film sigillante flessibile.
      NOTA: se il film sigillante flessibile si attacca in uno qualsiasi dei pozzetti, utilizzare una punta della pipetta da 200 μL per rimuoverlo. Questo è comune quando il film sigillante flessibile è stato allungato troppo sottile.
  13. Campioni di digest di worm diluiti in serie in 300 μL in piastre a 96 pozzetti.
    1. Utilizzando un pipetttor multi-pozzo impostato su 200 μL, pipettare su e giù più volte lentamente e con attenzione per rimescolare il contenuto dei pozzetti, quindi estrarre il più possibile il liquido. Trasferire questo liquido nelle file superiori delle piastre a 96 pozzetti preparate al punto 3.3.
    2. Utilizzando un pipettor a 96 pozzetti impostato su 20 μL, rimuovere questo volume di liquido dalla fila superiore ed erogare nella riga B. Pipetta su e giù 8-10x per mescolare. Scartare le punte.
    3. Ripetere il passaggio 3.13.2, partendo dai campioni 0,1x nella riga B per creare campioni di diluizione 0,01x nella riga C.
    4. Ripetere nuovamente il passaggio 3.13.2, passando dalla riga C alla riga D.
    5. Piastra su agar solido per la quantificazione batterica. Per i vermi monocolodicizzati, è generalmente sufficiente placcare 10-20 μL gocce di ogni diluizione [1x-0,001x] su piastre di agar. Per la colonizzazione multispecie, placcare ogni diluizione separatamente pipettando 100 μL su una piastra di agar di 10 cm; diffondere immediatamente utilizzando perline di vetro.

4. Pulizia della graniglia di carburo di silicio per il riutilizzo

NOTA: Questa procedura viene utilizzata per pulire e sterilizzare il materiale di macinazione, graniglia di carburo di silicio, per il riutilizzo dopo gli esperimenti. Questo protocollo deve essere seguito nella sua interezza prima del primo utilizzo, poiché la graniglia di carburo di silicio è un prodotto industriale e non viene pre-sterilizzata. La graniglia in carburo di Si (3,2 g/cc) è un materiale denso e ruvido che funziona in modo efficiente per interrompere i campioni difficili. Tuttavia, le particelle possono consumarsi a causa di un uso ripetuto e devono essere sostituite quando l'usura diventa evidente. Fortunatamente, il materiale è economico e le dimensioni tipicamente vendute (~ 1 lb) sono sufficienti per molti esperimenti.

  1. Dopo aver rimosso i campioni per la placcatura, aggiungere la soluzione di candeggina al 10% a tutti i pozzetti della piastra a 96 pozzetti e lasciare riposare per almeno 10 minuti.
  2. Rimuovere la maggior parte della grana invertendo rapidamente la piastra a 96 pozzetti su un piccolo vassoio a lato alto o un contenitore vuoto P1000 pipetta abbastanza grande da catturare tutto il contenuto. La graniglia affonderà immediatamente sul fondo del vassoio. Versare la soluzione di candeggina in un lavandino.
  3. Riempire nuovamente la piastra da 96 pozzetti con acqua di rubinetto e capovolgere nello stesso vassoio per risciacquare la graniglia rimanente. Versare l'acqua nel lavandino.
  4. Ripeti da una a tre volte con l'acqua del rubinetto fino a quando il piatto è completamente privo di graniglia.
  5. Risciacquare la grana 2x in acqua di rubinetto, riempiendo ogni volta il vassoio.
    NOTA: La piastra a pozzetto profondo da 96 pozzetti può essere lavata in lavastoviglie da laboratorio, coperta saldamente con un foglio e autoclavata con altre materie plastiche riutilizzabili. La graniglia non ha bisogno di essere lavata immediatamente e può essere messa da parte a questo punto. La graniglia usata viene solitamente accumulata da più esperimenti prima del lavaggio e dell'autoclave.
  6. Lavare la graniglia in una soluzione di detergente da laboratorio per 30 minuti, agitando occasionalmente ruotando o mescolando con una spatola metallica.
  7. Risciacquare tutte le tracce di detergente in diversi (8-10) cambi di acqua di rubinetto, quindi risciacquare 2 volte con acqua distillata.
  8. Stendere la graniglia in un vassoio aperto, come un vassoio per autoclave in polipropilene poco profondo, e asciugare a 40-70 °C per diverse ore.
    NOTA: Se la grana è grumosa quando è asciutta, non è stata pulita o risciacquata a sufficienza. Ripetere il protocollo di pulizia a partire dal passaggio 4.6, aggiungendo ulteriori risciacqui nel passaggio 4.7.
  9. Distribuire graniglia pulita e asciutta in bottiglie di vetro autoclavabile a vite fino a una profondità massima di 5-6 cm. Autoclave su ciclo pre-vuoto per 30 minuti per sterilizzare.

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Representative Results

Sterilizzazione con candeggina di vermi vivi
I vermi sbiancati in superficie sono effettivamente privi di batteri esterni fino a quando la motilità ritorna e l'escrezione riprende. Nelle condizioni qui utilizzate, si osserva una rapida estinzione dei batteri nel tampone (Figura 1A-C, Figura supplementare 2, Video 1) senza disturbare i batteri associati all'intestino nei vermi paralizzati dal freddo (Figura 1D-F, Video 2). Questi dati indicano che lo sbiancamento superficiale può essere utilizzato efficacemente per disinfettare i vermi esternamente senza compromettere il contenuto intestinale (i confronti tra i conteggi di CFU sbiancati in superficie e quelli associati a vermi senza candeggina non sono significativi, wilcoxon rank-sum test p > 0,05).

Variazioni sulle interruzioni meccaniche multi-campione
La tecnica a 96 pozzetti per la rottura meccanica dei vermi è robusta per i materiali specifici utilizzati e considerazioni pratiche dettano la scelta del materiale di macinazione. Analogamente a un precedente rapporto33, l'interruzione manuale (Figura 2A) ha comportato una maggiore eterogeneità rispetto al protocollo standard a 96 pozzetti (graniglia di carburo di silicio, Figura 2B) (var(log10CFU) = 0,499) in tutte le condizioni tampone, rispetto a 0,229 per il carburo di Si, 0,243 per le grandi perle di vetro (Figura 2C) e 0,227 per le piccole perle di vetro (Figura 2D). ). Tuttavia, la maggior parte delle differenze nelle distribuzioni CFU / worm non erano significative (Kruskal-Wallace, p = 0,017 con df = 3; significativi test Wilcoxon post-hoc per perline grandi vs piccole perline, p = 0,021 e grandi perline vs graniglia di carburo di silicio, p = 0,02). L'uso di Triton X-100 come tensioattivo non è stato associato ad alcuna differenza significativa nella resa se considerato come un fattore individuale (Kruskal-Wallace, p = 0,94, df = 3), sebbene vi sia un apparente aumento della resa in campioni senza Tritone rispetto a campioni contenenti Tritone quando sono state utilizzate grandi perle (2,7 mm) (Figura 2C), probabilmente attribuibile all'eccessiva "schiuma" osservata in questi pozzi quando Triton era presente. Questi risultati indicano che le grandi perle di vetro, sebbene ideali per l'uso in tubi di omogeneizzazione33, non sono adatte per la tecnica a 96 pozzetti. Mentre le piccole perle di vetro hanno prodotto risultati ragionevoli (Figura 2D), hanno costantemente intasato le punte delle pipette da 200 μL durante la miscelazione e la placcatura. Il materiale standard in questo test, la graniglia di carburo di silicio, è economico, troppo grande per intasare le punte standard e, come le perle di vetro, può essere lavato e riutilizzato dopo l'autoclave. La graniglia rilascia una piccola quantità di "polvere" nel tampone, che non interferisce con la placcatura, ma deve essere filtrata se i prodotti di interruzione devono essere utilizzati per la citometria a flusso.

Eterogeneità nella colonizzazione batterica nei vermi adulti
L'interruzione riuscita dei singoli vermi rivela eterogeneità nella colonizzazione batterica. Gli individui provenienti da popolazioni isogeniche sincronizzate di vermi, colonizzati contemporaneamente sullo stesso pool di batteri, mostrano costantemente una gamma 100 volte o superiore nella carica batterica intestinale. Questo è osservato per diversi coloni batterici (Figura 3A) e durante la colonizzazione su comunità batteriche multi-specie (Figura 3B). Questa eterogeneità è evidente anche nelle misurazioni individuali della fluorescenza quando i vermi sono colonizzati con batteri che esprimono una proteina fluorescente (GFP) (Figura 3C-D). Le proprietà dell'ospite giocano un ruolo nel plasmare questa eterogeneità, come si può vedere confrontando la colonizzazione dei vermi Bristol N2 wild-type con la colonizzazione da parte degli stessi batteri nei mutanti DAF-2 / IGF; questo mutante daf-16 supporta popolazioni più grandi di molti batteri rispetto a N2, mentre daf-2 è resistente alla colonizzazione da parte di una serie di batteri36 (Figura 3B,D). Questa eterogeneità è caratteristica, mostrando variazioni tra diverse combinazioni di ospite e colono (s), pur mantenendo una struttura coerente su diverse esecuzioni dello stesso esperimento (Figura 3E-F).

Importanza dell'eterogeneità individuale per un confronto accurato dei gruppi
L'importanza dell'eterogeneità individuale può essere facilmente vista considerando come i digest batch potrebbero alterare le distribuzioni dei dati. Colonizzazione da parte dei batteri nativi del microbioma MYb53 (Rhodococcus erythropolis) e MYb120 (Chryseobacteria spp.) (Figura 3A, 4A) negli adulti N2 sono usati come esempi. I dati dei singoli worm sono chiaramente simili nella distribuzione (t-test a due code, p = 0,9, somma del rango di Wilcoxon, p = 0,59). Quando si ricampionano questi dati per simulare gli effetti dei digest batch, il batch estrapolato CFU / worm tira verso i quantili superiori dei dati a causa dell'inclinazione positiva in queste distribuzioni (media > mediana). Poiché il batching fa effettivamente la media degli individui all'interno di un batch, i CFU / worm estrapolati in batch si concentreranno sulla media aritmetica dei singoli dati, con una distanza decrescente a questa media man mano che i lotti diventano grandi secondo il teorema del limite centrale (Figura 4B-D). Di conseguenza, il segnale dalla variazione biologica viene rapidamente perso; le misurazioni CFU/worm dedotte in batch convergono verso la media, che non è una metrica rappresentativa di questi dati distribuiti su scala logaritmica. Le differenze nella colonizzazione dedotta da MYb53 rispetto a MYb120 diventano rapidamente significative nei digest batch simulati (lotto t-test 5, p = 0,049; lotto 10, p = 2,27e-4; lotto 20, p = 1,19e-15; Wilcoxon rank sum test batch 5, p = 2.27e-4; lotto 10, p = 2,70e-06; batch 20, p = 1.80e-09) poiché il segnale originale è oscurato.

Effetti dell'eterogeneità individuale sulla trasmissione microbica
Poiché i singoli vermi mostrano una sostanziale eterogeneità nella colonizzazione batterica, è ragionevole chiedersi se questa eterogeneità abbia effetti a valle. Ad esempio, è ragionevole aspettarsi che la trasmissione possa essere una funzione della carica batterica intestinale. Trasferendo i singoli vermi sbiancati in superficie in un ambiente pulito, è possibile osservare l'inoculazione dell'ambiente con batteri vivi escreti. In questi esperimenti, adulti pre-colonizzati sbiancati in superficie, portatori di popolazioni generalmente consistenti (103-10 5 CFU / verme, Figura 5) di Ochrobactrum MYb14-GFP commensale o S. aureus-GFP patogeno, sono stati autorizzati a vagare su prati OP50 uccisi dal calore su Agar NGM per 1,5 ore. Quando questi vermi vengono raccolti nuovamente dalle piastre di escrezione e interrotti per la quantificazione batterica, non esiste una relazione significativa tra carica batterica e tasso di escrezione di batteri vivi (correlazioni di Pearson tra colonie trasformate in log/hr e CFU/worm: MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9) (Figura 5). Né esiste una relazione significativa tra la presenza/assenza di colonie su una piastra e la carica batterica intestinale (regressione logistica binomiale con CFU/verme log-trasformato come fattore: p = 0,15 con df = 53). Una frazione sostanziale di piastre è rimasta priva di nuova crescita (9/18 piastre per MYb14, 10/36 piastre per S. aureus), indicando bassi tassi di escrezione complessiva.

Quando i vermi sono autorizzati a espellere su piastre di agar, il numero effettivo di batteri escreti vivi per verme è confuso da "agricoltura", in cui i vermi passano attraverso le colonie e creano scie di nuova crescita (Figura 6)37. Una placca con n colonie rappresenta almeno uno, e al massimo n, eventi in cui sono stati escreti batteri vivi che formano colonie. Da questa osservazione, non è possibile sapere quanti eventi di escrezione in (1,n) si sono effettivamente verificati, né è possibile sapere quanti batteri sono stati escreti in ciascun evento. Non è quindi possibile stimare con precisione i tassi di escrezione di batteri vivi dall'intestino utilizzando questi dati. Tuttavia, è possibile dedurre alcuni limiti. Sebbene il numero di colonie per piastra non sia molto informativo, i dati di presenza / assenza possono essere utilizzati per l'inferenza approssimativa dei tassi di escrezione. Per semplicità, se si presume che il tasso di escrezione dei batteri vivi non sia una funzione della carica batterica e che l'escrezione sia un processo di Poisson, c'è una probabilità di circa il 50% di osservare almeno nove eventi in 18 studi quando λ ≈ 0,33 worm-1 hr-1 in MYb14. Per S. aureus si ottengono tassi plausibili simili di λ ≈ 0,2 worm-1 hr-1 . Mentre questi calcoli approssimativi suggeriscono bassi tassi di escrezione di batteri vivi, sarà necessaria una quantificazione più precisa di questo processo su un numero maggiore di singoli vermi per ottenere stime affidabili.

Disponibilità dei dati:
I dati mostrati qui sono disponibili su Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2).

Figure 1
Figura 1. Il trattamento di sbiancamento superficiale a bassa concentrazione uccide rapidamente i batteri nel tampone, ma non disturba le comunità intestinali nei vermi paralizzati dal freddo. (A-C) CFU/mL batterico nel tampone worm M9 durante lo sbiancamento superficiale a tre diverse concentrazioni (1:1000, 1:2000, 1:5000 v/v; controllo non sbiancato per confronto), targeting (A) S. aureus Newman, (B) S. enterica LT2 o (C) E. coli OP50. I campioni sono stati prelevati in punti temporali indicati fino a 20 minuti dopo l'esposizione e lavati due volte con tampone sterile per evitare che la candeggina uccidesse le colonie sulle piastre. I dati per la condizione 1:1000 sono leggermente sfalsati in modo che questi dati siano visibili sul plottaggio. (D-F) Batteri intestinali nei singoli vermi N2 (n = 24 vermi per esperimento, due o tre corse indipendenti in giorni separati). Tutti i confronti tra i conteggi di CFU sbiancati in superficie e senza candeggina associati al worm non sono significativi (Wilcoxon rank-sum test p > 0,05). Le linee orizzontali grigie rappresentano la soglia di rilevazione, definita come la densità (40 CFU/worm) alla quale la probabilità di osservare almeno una colonia è ~60% quando si placcano aliquote da 10 μL da volumi di 200 μL. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Il protocollo di interruzione a 96 pozzi produce risultati coerenti ed è robusto per la scelta dei materiali. N2 vermi adulti colonizzati con una singola specie batterica per 48 ore (P. mosselii) sono stati sbiancati in superficie e permeabilizzati secondo protocolli standard, quindi i singoli vermi (n = 24 per condizione) sono stati interrotti meccanicamente per la placcatura CFU utilizzando (A) interruzione manuale in singoli tubi da 0,5 ml, utilizzando un pestello motorizzato o (B-D ) variazioni sul protocollo di perturbazione a 96 pozzi descritto in dettaglio nel protocollo. L'interruzione è stata effettuata in un tampone worm M9 contenente concentrazioni variabili di Triton X-100 (asse x, 0-0,1%, v/v) e uno di (B) carburo di silicio a grana 36, (C) piccole (425-600 μm) perle di vetro o (D) grandi (2,7 mm) perle di vetro. Per tutti i grafici, i dati mostrati sono log10 (CFU / worm) e ogni punto è un singolo worm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Colonizzazione batterica eterogenea dell'intestino di C. elegans. (A) Colonizzazione di singole specie di ermafroditi adulti N2 preparati come in Metodi. I batteri sono quattro specie della collezione di microbiomi dei vermi nativi MYb (Dirksen et al. 2016) (n = 24 vermi, un esperimento ciascuno) e due agenti patogeni, Staphylococcus aureus MSSA Newman (SA) e Salmonella enterica LT2 (SE) (n = 96-144 vermi su due/tre esperimenti indipendenti). La colonizzazione da parte di specie autoctone di microbioma è stata valutata dopo un'incubazione di 48 ore a 25°C in liquido S medio + 108 CFU/mL di batteri; la colonizzazione da parte di agenti patogeni è stata valutata dopo l'incubazione su prati su Agar verme NGM per 24 (SA) o 48 (SE) h a 25 ° C. (A 48 ore, i vermi su S. aureus sono per lo più morti.) (B) CFU/verme totale in adulti N2, daf-16(mu86) e daf-2(e1370) colonizzati per 4 giorni in mezzi liquidi su un microbioma nativo minimo di otto specie (dati di Taylor e Vega, 2021)14. (C-D) Fluorescenza verde in singoli vermi colonizzati con batteri che esprimono GFP, osservati mediante citometria a flusso di oggetti di grandi dimensioni. In (C), popolazioni sincronizzate di adulti N2 sono state colonizzate con OP50 (non fluorescente, n = 1908 singoli vermi adulti), S. aureus (GFP, n = 968) o S. enterica (GFP, n = 1153) come descritto in (A); il controllo OP50 indica livelli tipici di autofluorescenza a canale verde nei vermi N2 adulti del giorno 3. In (D), le popolazioni sincronizzate di N2 (n = 1165), daf-16 (mu86) (n = 1180) e daf-2 (e1370) (n = 2267) gli adulti sono stati colonizzati con Ochrobactrum MYb14-GFP commensale per 2 giorni su piastre come descritto in (A). (E-F) Variazione quotidiana della colonizzazione da parte di S. aureus (E) e S. enterica (F) (stessi dati del pannello A e della Figura 1, n = 48 vermi per esperimento). L'asse x indica il giorno del campionamento. Le linee orizzontali grigie rappresentano la soglia di rilevazione, definita come la densità alla quale la probabilità di osservare almeno una colonia è ~ 60% (40 CFU / verme per la colonizzazione di singole specie e quattro CFU / verme per la colonizzazione multi-specie, a causa di diversi volumi di placcatura di 10 μL e 100 μL rispettivamente su 200 μL). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Il batch cancella la variazione biologica nei dati distorti su scala di log. I dati CFU/worm della Figura 3 sono stati ricampionati con la sostituzione per creare n = 25 set di replica di dati simulati per ogni dimensione del batch, dove la dimensione è il numero di singoli worm per batch. CFU/worm è il CFU totale in ogni lotto simulato diviso sul numero di worm per lotto. Nei dati grezzi (pannello A), il CFU/worm medio per MYb53 è 4450.8 (103.6) e per MYb120, 1398.3 (103.1); i numeri dedotti dal batch convergono a questi valori all'aumentare delle dimensioni del batch (B, cinque worm/batch; C, 10 vermi/lotto; D, 20 worms/batch), coerente con le aspettative del teorema del limite centrale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5. L'escrezione di batteri vivi è scarsamente correlata con il carico di CFU nell'intestino dei singoli vermi. Qui, gli adulti N2 sono stati colonizzati nutrendosi per 1 o 2 giorni rispettivamente su prati di S. aureus-GFP o MYb14-GFP. I vermi con fluorescenza GFP rilevabile (GFP totale > 1,8 log su citometro a flusso di oggetti di grandi dimensioni) sono stati ordinati dalla popolazione di massa, sbiancati in superficie come descritto in Metodi e trasferiti individualmente a piastre OP50 NGM + uccise termicamente. Le correlazioni di Pearson tra colonie log-trasformate/h e CFU/worm non sono significative (MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6. L'"agricoltura" batterica oscura il numero di eventi di escrezione sulle piastre di agar. Ecco due piastre con colonie MYb14-GFP da escrementi di vermi. La prima piastra (A) ha una chiara evidenza di "agricoltura" lungo i percorsi dei vermi e sembra rappresentare almeno due eventi di escrezione separati basati sulle differenze nell'espressione della GFP (visibile come pigmentazione giallastra) tra le colonie. Mentre la seconda piastra (B) è più ambigua, l'agricoltura non può essere esclusa in base alle posizioni delle colonie. In questi esperimenti, i vermi adulti N2 sono stati pre-colonizzati per 48 ore nutrendosi di piastre di agar contenenti prati di MYb14-GFP. Dopo la colonizzazione, i vermi sono stati preparati e sbiancati in superficie secondo i metodi, quindi trasferiti in aliquote da 5 μL di tampone worm M9 + 0,1% Triton X-100 a 6 cm NGM + piastre OP50 uccise termicamente (preparate consentendo a 50 μL macchie di OP50 concentrate uccise dal calore di asciugarsi sulla superficie). Ai vermi è stato permesso di vagare per 1,5 ore a 25 ° C, quindi prelevati dalle piastre e interrotti per la placcatura CFU / worm (interruzione manuale nel tampone da 20 μL in singoli tubi da 0,5 ml, utilizzando un pestello motorizzato). Le piastre sono state incubate a 25°C per 2 giorni prima del conteggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1. Visualizzazione di vermi N2 colonizzati con S. aureus fluorescente GFP senza sbiancamento superficiale. Un piccolo numero di cellule fluorescenti sulla cuticola si muovono dentro e fuori fuoco mentre l'immagine passa attraverso il corpo del verme e la colonizzazione spazialmente eterogenea dell'intestino diventa visibile mentre il campo visivo si sposta dalla superficie corporea all'intestino. L'immagine Z-stack è stata scattata con un ingrandimento di 20x su un microscopio fluorescente invertito. Le immagini fluorescenti filtrate a campo luminoso e GFP sono state sovrapposte e le immagini attraverso lo Z-stack cucite insieme, utilizzando il software del fornitore. L'immagine proviene dalla stessa diapositiva della Figura 2A supplementare. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2. Visualizzazione di un worm N2 colonizzato con S. aureus fluorescente GFP con sbiancamento superficiale (1:1000 v/v per 20 min). La colonizzazione spazialmente eterogenea da parte di batteri fluorescenti è visibile nell'intestino di questo individuo e i batteri si sono infiltrati nei tessuti del corpo, indicando un'infezione avanzata. Nessun batterio è visibile sulla cuticola. L'immagine Z-stack è stata scattata con un ingrandimento di 20x su un microscopio fluorescente invertito. Le immagini fluorescenti filtrate a campo luminoso e GFP sono state sovrapposte e le immagini attraverso lo Z-stack cucite insieme, utilizzando il software del fornitore. L'immagine proviene dalla stessa diapositiva della Figura supplementare 2B. Clicca qui per scaricare questo video.

Figura supplementare 1. Panoramica del protocollo. Qui, i vermi adulti sincronizzati sono mono-colonizzati con batteri rossi, sbiancati in superficie e permeabilizzati prima della rottura meccanica dei singoli vermi in un formato a 96 pozzetti. I batteri rilasciati dall'intestino sono placcati in diluizione in serie 10x per la quantificazione CFU/worm; le piastre mostrate sono tipiche dell'eterogeneità osservata. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2. Visualizzazione di vermi N2 colonizzati con S. aureus fluorescente GFP con e senza sbiancamento superficiale (1:1000 v/v per 20 min). (A) Nel campione non sbiancato, i batteri esterni sono visibili a basso ingrandimento come aree di fluorescenza verde non associate a vermi o frammenti del corpo del verme. (B) Nel campione sbiancato in superficie, la fluorescenza GFP è limitata all'interno dei corpi dei vermi (un frammento del corpo del verme è visibile a metà immagine). Tutte le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 4x su un microscopio fluorescente invertito. Le immagini fluorescenti filtrate a campo luminoso e GFP sono state sovrapposte e le immagini provenienti da campi visivi adiacenti cucite insieme, utilizzando il software del fornitore. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Ricette tampone e soluzione. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Qui vengono presentati i dati sui vantaggi della quantificazione a verme singolo della carica batterica in C. elegans, insieme a un protocollo di interruzione a 96 pozzi per consentire l'acquisizione rapida e coerente di grandi set di dati di questo tipo. Rispetto ai metodi esistenti33, questi protocolli consentono una misurazione a più alto rendimento delle comunità microbiche intestinali nel verme.

Questo approccio ha la placcatura come un passaggio limitante la velocità e non è veramente "ad alto rendimento". La citometria a flusso di oggetti di grandi dimensioni (Figura 3C, D) è un utile metodo ad alto rendimento per quantificare i batteri marcati fluorescentemente in singoli vermi16, sebbene il numero di fluorofori simultanei sia una limitazione nelle comunità multi-specie. Collegare l'interruzione della piastra multi-pozzo con il sequenziamento della comunità è un altro modo per aumentare la produttività; tuttavia, la procedura di interruzione a 96 pozzi qui descritta è stata ottimizzata specificamente per lasciare intatte le cellule batteriche. L'analisi basata sul sequenziamento, in cui è auspicabile una lisi approfondita delle cellule, richiederà l'aggiunta di una fase di estrazione dell'acido nucleico o la modifica del protocollo di battitura (Protocollo 3.10-3.11) per estrarre il contenuto cellulare invece dei batteri vivi. I protocolli per la distruzione di singoli worm e l'estrazione di acidi nucleici sono stati pubblicati altrove38,39.

L'abbondanza totale batterica nell'intestino del verme è eterogenea e i dati mostrati qui suggeriscono che la misurazione basata su lotti può produrre risultati errati nei confronti tra i gruppi. Tuttavia, altre misure delle comunità batteriche nel verme possono essere meno sensibili agli effetti del dosaggio. Da notare, l'abbondanza relativa nelle comunità associate ai vermi sembra variare molto poco se non del tutto con le dimensioni totali della popolazione intestinale, indipendentemente dal fatto che le interazioni tra microbi siano neutre40 o non14. È plausibile che, rispetto ai dati di conteggio, le misure di abbondanza relativa saranno meno suscettibili al problema del tasso di falsi positivi descritto. L'analisi della comunità basata sul sequenziamento, che genera dati di abbondanza relativa per la composizione della comunità, potrebbe quindi non richiedere la misurazione di singoli worm. Sono necessarie ulteriori indagini su questo punto.

Qui, usiamo il trattamento a freddo per paralizzare i vermi per lo sbiancamento superficiale. Altri lavori hanno scoperto che i vermi riprendono rapidamente la normale attività (<15 min) se il tempo sul ghiaccio è mantenuto al di sotto dei 30 min, consentendo l'uso immediato in ulteriori saggi, in contrasto con gli agenti di paralisi chimica che possono richiedere periodi prolungati prima del pieno recupero34. Se i vermi devono essere interrotti immediatamente per la quantificazione batterica, questa caratteristica è superflua e il principale vantaggio del raffreddamento rispetto alla paralisi chimica è evitare la necessità di un flusso di rifiuti controllato. Il trattamento prolungato a freddo deve essere usato con cautela quando si indaga sulle risposte allo stress, in particolare se esiste una connessione nota con la temperatura. I protocolli di paralisi a freddo qui descritti comportano un'esposizione al freddo acuta più breve rispetto a quella utilizzata negli esperimenti per lo stress da freddo (20-30 min vs 2+ h a 2-4 °C)41,42,43, e uno shock da freddo di 1 ora non produce fenotipo apparente nei vermi wild-type 43. L'incubazione a breve termine (90 min) a 4 °C induce cambiamenti nell'espressione genica da stress da freddo (misurata dall'espressione di un reporter TMEM-135::GFP), ma l'espressione ritorna a livelli non stressati entro pochi minuti una volta che i vermi sono tornati a temperatura ambiente34. Tuttavia, gli effetti sui genotipi di vermi sensibili allo stress possono essere più gravi che nel wild-type. Questa procedura deve essere convalidata nelle condizioni sperimentali da utilizzare.

Il protocollo di sbiancamento superficiale qui descritto può essere utilizzato come un modo per limitare o eliminare il passaggio di microbi esterni negli esperimenti. Questo metodo è stato inoltre utilizzato per eliminare i contaminanti fungini mediante sbiancamento superficiale e trasferimento solo di larve L1 / L2 a piastre fresche (il trasferimento di adulti sbiancati in superficie ha comportato la mancata eliminazione del contaminante, presumibilmente a causa del trasporto nell'intestino degli animali più grandi). È di fondamentale importanza assicurarsi che la concentrazione di candeggina non superi 1:1000 v/v, poiché ne deriveranno danni ai vermi e mortalità. Questa procedura può essere utile nell'evoluzione sperimentale ospite-microbo e nelle interazioni ospite-patogeno. Ad esempio, il basso tasso di escrezione di batteri vivi osservato qui può aiutare a spiegare i tassi altamente variabili osservati per la trasmissione batterica dagli ermafroditi alla prole15. La mancanza di correlazione tra carica batterica intestinale e tasso di escrezione osservata qui è interessante ma richiede ulteriori indagini; sarà necessario un numero maggiore di punti dati in una serie di condizioni per determinare dove (o se) questa osservazione si manterrà.

Potrebbe non essere sempre necessario pulire i vermi nella misura fornita dallo sbiancamento superficiale. I lavaggi multipli in tampone sterile sono probabilmente sufficienti quando i vermi sono colonizzati internamente con un singolo microbo se il CFU/verme minimo atteso è molto più alto (10-100 volte) rispetto alla concentrazione di batteri nel surnatante tampone, poiché questo riporto influenzerà minimamente i conteggi (vedere Figura 1). Inoltre, se il microbo o i microbi di interesse colonizzano principalmente la cuticola, lo sbiancamento superficiale dovrebbe essere chiaramente evitato. Una pulizia accurata è più importante per garantire l'accuratezza quando si tratta di comunità microbiche miste (per garantire che tutte le colonie / letture in un campione provengano da batteri associati a vermi e non dall'ambiente), quando i batteri aderenti alla cuticola interferiscono con la lettura della popolazione internalizzata, quando il CFU / verme minimo previsto è basso, ecc.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero ringraziare H. Schulenberg e C. LaRock per la loro generosa condivisione di ceppi batterici utilizzati in questi esperimenti. Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti della Emory University e NSF (PHY2014173).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500

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Biologia Numero 185 Caenorhabditis elegans microbioma eterogeneità microbo ospite batteri trasmissione
Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni <em>caenorhabditis elegans-batteriche</em>
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Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).

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