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Biology

Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade em Interações elegans-bacterianas de Caenorhabditis

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64027
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

Summary

Este protocolo descreve uma interrupção de 96 poços de caenorhabditis colonizada individualmente elegans após paralisia fria e branqueamento superficial para remover bactérias externas. A suspensão resultante é emplacada em placas de ágar para permitir quantificação precisa e média de carga bacteriana em um grande número de vermes individuais.

Abstract

O nematode Caenorhabditis elegans é um sistema modelo para interações hospedeiro-micróbio e hospedeiro-microbioma. Muitos estudos até o momento usam digerir em lote em vez de amostras individuais de vermes para quantificar a carga bacteriana neste organismo. Argumenta-se aqui que a grande variabilidade inter-individual observada na colonização bacteriana do intestino C. elegans é informativa, e que os métodos de digestão em lote descartam informações que são importantes para uma comparação precisa entre as condições. Como descrever a variação inerente a essas amostras requer um grande número de indivíduos, um conveniente protocolo de placa de 96 poços para interrupção e revestimento de colônia de vermes individuais é estabelecido.

Introduction

A heterogeneidade nas associações hospedeiras-micróbios é observada de forma onipresente, e a variação entre os indivíduos é cada vez mais reconhecida como fator contribuinte nos processos de nível populacional desde a concorrência e a convivência1 até a transmissão da doença 2,3,4. Em C. elegans, a "heterogeneidade oculta" dentro das populações isogênicas tem sido observada repetidamente, com sub-populações de indivíduos apresentando fenótipos distintos na resposta ao choque térmico 5,6, envelhecimento e vida útil 7,8,9,10,11, e muitos outros aspectos da fisiologia e desenvolvimento12 . A maioria das análises que tentam identificar a estrutura sub-populacional fornecem evidências para duas subsédias em populações experimentais de vermes isogênicos e sincronizados 5,7,8, embora outros dados sugiram a possibilidade de distribuições dentro da população de traços em vez de grupos distintos 7,12,13 . De relevância aqui, observa-se uma heterogeneidade substancial nas populações intestinais mesmo dentro de populações isogênicas de vermes colonizados a partir de uma fonte compartilhada de micróbios 13,14,15,16, e essa heterogeneidade pode ser ocultada pelas medições de digestão em lote que são amplamente utilizadas 17,18,19,20 para quantificação bacteriana no verme.

Este trabalho apresenta dados que sugerem uma necessidade de maior dependência de medições de um único verme na associação hospedeiro-micróbio, bem como protocolos para aumentar a precisão e o throughput na interrupção de um único worm. Estes protocolos são projetados para facilitar a interrupção mecânica de um grande número de C. elegans individuais para quantificação de carga bacteriana viável, ao mesmo tempo em que fornecem melhor repetibilidade e menor esforço por amostra do que a interrupção baseada em pilão de vermes individuais. Uma etapa recomendada de purificação intestinal, onde os vermes são autorizados a se alimentar de E. coli morto pelo calor antes da preparação para a interrupção, está incluído para minimizar contribuições de bactérias recém-ingeridas e outras bactérias transitórias (não aderidas). Estes protocolos incluem um método de paralisia fria para limpar a cutícula com um tratamento de alvejante superficial de baixa concentração; o branqueamento da superfície pode ser usado como um passo preparatório na interrupção de um único verme ou como um método para preparar vermes vivos e externamente livres de germes. Este método de branqueamento superficial é suficiente para remover uma ampla gama de micróbios externos, e o tratamento a frio fornece uma alternativa à paralisia convencional à base de levamisola; Enquanto o levamisole será preferido para experimentos sensíveis ao frio, a paralisia fria minimiza as contribuições para fluxos de resíduos perigosos e permite a rápida retomada da atividade normal. Enquanto o protocolo completo descreve um experimento de laboratório onde os vermes são colonizados com bactérias conhecidas, os procedimentos para limpar vermes e interrupção de um único verme podem ser facilmente aplicados a vermes isolados de amostras selvagens ou colonizados em experimentos de microcosmo. Os protocolos descritos aqui produzem bactérias vivas extraídas do intestino de verme, adequadas para chapeamento e quantificação de unidades formadoras de colônias (UFC) em vermes individuais; para análise da comunidade intestinal baseada em sequenciamento, devem ser adicionadas etapas subsequentes de lise celular e extração de ácido nucleico a esses protocolos.

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Protocol

Os vermes utilizados nesses experimentos foram obtidos do Centro Genético de Caenorhabditis , que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 é do tipo selvagem. Os mutantes DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) e daf-2(e1370) III (CGC CB1370) são usados para ilustrar diferenças na carga bacteriana intestinal.

HT115(DE3) E. coli carregando o vetor pos-1 RNAi é da biblioteca Ahringer21. A coleção MYb de C. elegans native gut bacteria22 foi obtida do laboratório de Schulenburg. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR é deste laboratório23. Pseudomonas mosselii foi isolado neste laboratório. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP foi obtido do laboratório LaRock na Universidade em Emory.

Todos os buffers e mídia de worm são preparados de acordo com a literatura publicada anteriormente24 com pequenas modificações (ver Arquivo Suplementar 1).

1. Preparação de C. elegans estéreis sincronizados

NOTA: Nesta seção, procedimentos passo a passo são descritos para gerar uma população sincronizada de vermes adultos reprodutivamente estéreis. Alimentando-se de placas pos-1 RNAi é usado aqui para evitar a produção de descendentes porque essa interferência é letal embrionária; Larvas L1 levantadas até a idade adulta em pos-1 RNAi desenvolvem-se em hermafroditas que colocam ovos, mas esses ovos são inviáveis25. O protocolo de alimentação RNAi é como no capítulo "Genética reversa" do Wormbook26.

  1. Antes de sincronizar os worms, certifique-se de que novas placas NGM + pos-1 RNAi estejam disponíveis. As placas podem ser preparadas frescas da cultura líquida induzida concentrada (+Amp +IPTG) ou inoculadas como gramados em NGM + 100 μg/mL ampicillin + 1 mM IPTG e permitidas a crescer a 25 °C no escuro durante 1 dia27.
    NOTA: A carbenicilina (25 μg/mL) é frequentemente usada em vez de ampicillina em placas RNAi. A ampicillina é menos cara, mas menos estável; se utilizar ampicilina, as placas devem ser semeadas imediatamente uma vez secas e usadas o mais rápido possível (pode ser armazenada por <1 semana a 4 °C)27. A alta concentração de antibióticos recomendada aqui ajudará a garantir a seleção adequada.
  2. Comece com várias (tipicamente duas a quatro) placas de NGM com grandes populações de hermafroditas gravid. Isolar ovos usando síncronia alvejante-NaOH24.
    1. Lave os vermes das placas de ágar usando 2 mL de ddH2O estéril por placa. Distribua o líquido uniformemente em tubos de microcentrifuus de 1,5 mL (um tubo por placa ou hermafroditas).
    2. Gire para baixo por ~5 s em uma minicentrifuge benchtop (2.000 x g) para puxar os adultos para o fundo dos tubos. Pipeta fora do supernante e descartar.
    3. Lave com 1 mL de ddH2O estéril; girar para baixo como antes e descartar o supernatante.
    4. Repita a etapa anterior para reduzir os detritos bacterianos restantes.
    5. Resuspenque o conteúdo de cada tubo em 1 mL de ddH2O. Adicione a cada tubo 130 μL de alvejante comercial (8,25% hipoclorito de sódio) e 130 μL de hidróxido de sódio de 5 N (NaOH, concentração final 0,5 N).
    6. Tubos de vórtice vigorosamente por pelo menos 10-15 s a cada 2 minutos até que corpos adultos tenham se rompido. Não permita que o tratamento alvejante-NaOH deseca mais de 5 minutos para evitar matar ovos.
    7. Gire em uma minicentrifuge para 30-60 s a 2.000 x g para pelotar os ovos. Pipeta fora do supernante e descartar. Pode ou não haver uma pelota visível, isso é normal.
    8. Adicione 1 mL de tampão de m9 e gire para 30-60 s a 2000 x g. Descarte o supernatante.
    9. Repita o passo de lavagem (1,2,8) 5x para remover completamente a mistura alvejante-NaOH, removendo o máximo possível do sobrenante sem perturbar a pelota de ovo.
    10. Transfira ovos para 10 mL de tampão de maminho M9 em um tubo cônico de 50 mL ou tubo de cultura de 30 mL com tampa. Se usar tubos cônicos, deixe a tampa ligeiramente desparafusada e use um pouco de fita para mantê-la segura. Incubar com agitação durante a noite (16 h) a 25 °C e 200 RPM para permitir que as larvas eclodam.
  3. Transfira larvas L1 sincronizadas para placas RNAi para crescer até a idade adulta.
    1. Adicione 2 mL de tampão M9 estéril + 0,01% Triton X-100 (a partir de agora M9TX-01) a cada tubo L1 e transfira todo o volume (12 mL) para um tubo cônico de 15 mL.
    2. Coloque tubos de 15 mL com vermes L1 a 4 °C por 10 minutos para retardar o movimento larval.
    3. Gire para baixo tubos cônicos de 15 mL em uma grande centrífuga de mesa (1.500 x g a 4 °C por 3 min; aceleração e desaceleração não devem ser superiores a 80% do máximo).
    4. Cuidadosamente pipeta fora do supernante sem perturbar a pelota L1. Descarte o supernatante.
    5. Adicione 12 mL de M9TX frio-01 a cada tubo. Repita a centrifugação. Pipeta cuidadosamente fora e descartar o supernatante. Cada tubo deve ter ~200 μL restantes.
    6. Enxágüe uma ponta de pipeta de 200 μL no M9TX-01 para evitar que os vermes grudem no plástico, em seguida, use esta ponta para resuspencar a pelota de verme. Transfira vermes resuspendados para placas pos-1 preparadas por gotas de líquido no gramado bacteriano.
    7. Incubar as placas a 25 °C até o primeiro dia de vida adulta.
      NOTA: Se cultivar vermes em placas pos-1 RNAi, os vermes devem alimentar ad libitum nas bactérias RNAi até que tenham totalmente transicionada para a idade adulta para garantir alta penetração do fenótipo embrionário-letal. Verifique as placas às 24 e 48 horas. Se as placas parecerem famintas ou quase famintas, os vermes precisarão ser movidos para placas novas para terminar de crescer em adultos de tamanho real. Para evitar o esgotamento das placas antes que os vermes sejam cultivados, procure adicionar 250-500 larvas L1 a cada placa RNAi de 10 cm.
  4. Colher adultos e limpar o E. coli intestinal para criar vermes livres de germes.
    1. Enxágüe vermes adultos de placas usando 5 mL de M9TX-01 por placa. Transfira o buffer + worms para um tubo cônico de 15 mL e permita que os adultos se acomodem na parte inferior do tubo.
    2. Enxágüe adultos em alterações de 10 mL de tampão M9TX-01 fresco até que nenhuma turbidez bacteriana visível permaneça (tipicamente 1-2x). Os tubos podem ser centrifugados a 700 x g por 30 s para pelotas de vermes, ou adultos podem ser autorizados a se estabelecer pela gravidade.
    3. Realize uma lavagem adicional com 10 mL de M9TX-01 para reduzir as bactérias externas.
    4. Transfira vermes para tubos cônicos de 50 mL ou tubos de cultura de 30 mL contendo 5 mL S Médio + 2x E. coli OP50 (~5 x 109 células mortas/mL) + 200 μg/mL de gentamicina + 50 μg/mL de clororamfenicol. Se usar tubos cônicos, deixe a tampa ligeiramente desparafusada e use um pouco de fita para mantê-la segura. Use pipetas de vidro ou enxágue pipetas plásticas em M9TX-01 para evitar que os vermes grudem.
    5. Incubar adultos a 25 °C com agitação a 200 RPM por 24-48 h para produzir adultos livres de germes.
      NOTA: Se os vermes permanecerem em antibióticos por >24 h, mais OP50 morto pelo calor pode ter que ser adicionado para garantir que os vermes tenham uma fonte de alimento adequada. Verifique os tubos às 24h e complemente com OP50 morto pelo calor se a turbidez for visivelmente reduzida.
  5. Adultos de lavagem de sacarose de acordo com os protocolos wormbook24 para obter estoques limpos, reprodutivamente estéreis e sincronizados somente para adultos para colonização bacteriana.
    1. Certifique-se de que os volumes frios de 60% de sacarose, tampão de minhoca M9 e M9TX-01 estejam prontos para o uso. Para simplificar, estes podem ser deixados a 4 °C na noite anterior.
    2. Para que cada amostra seja lavada, crie um tubo cônico de 15 mL rotulado contendo 8 mL de M9TX-01 e reserve no gelo. Estes serão necessários na etapa 1.5.10.
    3. Adicione 5 mL de M9TX-01 a cada tubo de 50 mL contendo larvas L1. Transfira todo o volume (agora 10 mL) para um tubo cônico vazio de 15 mL e permita que os adultos se acomodem na parte inferior do tubo.
    4. Pipeta cuidadosamente fora do supernaspe e descarte.
    5. Adicione 10 mL M9TX-01 a cada tubo e mova tubos para um balde de gelo por 5-10 min.
      NOTA: A partir deste ponto, vermes e todos os buffers devem ser mantidos no gelo.
    6. Use a configuração "temperatura rápida" para esfriar uma centrífuga de mesa grande a 4 °C.
    7. Adicione 10 mL de M9TX frio-01 a cada tubo para enxaguar os detritos restantes. Deixe os vermes se estabelecerem no gelo; remover o supernante e descartar.
    8. Flutuação de sacarose: Adicione 5 mL de tampão M9 frio e 5 mL de solução de sacarose fria de 60% para cada tubo, misturando bem. Em seguida, flutue cuidadosamente 1 mL de tampão M9 frio em cima da mistura de tampão de sacarose em cada tubo. Não misture depois que o carro alegórico tiver sido adicionado.
      ATENÇÃO: Mova-se rapidamente para os próximos passos-vermes podem dessecar se expostos a altas concentrações de sacarose por muito tempo!
    9. Centrifugar a 1500 x g para 3 min a 4 °C. Vermes adultos vivos estarão na interface do M9 e da sacarose, aproximadamente 1 mL do topo do tubo.
    10. Use uma pipeta sorológica de vidro de 5 mL para transferir a camada de verme para tubos cônicos preparados de 15 mL com M9TX-01 frio (a partir do passo 1.5.2). Tenha muito cuidado para obter a camada de vermes vivos sem pipetting muito da sacarose.
    11. Se necessário, adicione M9TX-01 para obter volumes iguais de 10-12 mL/tubo. Centrifugar a 1500 x g a 4 °C por 1 min, depois pipeta fora do supernante. Vermes podem ser devolvidos à temperatura ambiente neste momento.
    12. Repita a etapa de lavagem 1.5.11 duas vezes, reduzindo a velocidade para 700 x g a 4 °C e o tempo para 30 s.

2. Alimentar vermes em bactérias vivas na cultura líquida

NOTA: Este protocolo é usado para colonizar vermes com bactérias cultivadas em laboratório em condições bem misturadas na cultura líquida (Figura Suplementar 1). Os vermes podem ser colonizados com isolados individuais da cultura pura (por exemplo, patógenos como enterococcus faecium28,29) ou misturas de isolados (por exemplo, comunidades mínimas de microbioma14).

  1. Comece com vermes adultos sincronizados com sacarose do protocolo passo 1.5 em um tubo cônico de 15 mL. Lave os vermes uma vez em 12 mL de tampão S e descarte o supernatante.
  2. Resuspenda os vermes lavados no volume do meio S necessário para o experimento. Considere o volume de condições experimentais, o número de condições sobre as quais os vermes serão divididos, e as concentrações finais de vermes e bactérias.
    NOTA: A alimentação em vermes varia de acordo com a disponibilidade bacteriana30 e os vermes podem ser estressados pelo lotação31. Para colonização na cultura líquida, recomenda-se <1000 worms/mL e >107 CFU/mL; 1011 UFC/mL é considerada densidade alimentar "ad libitum" em E. coli32.
  3. Desça culturas bacterianas. Despeje o supernante; aspiração ou pipetação pode ser usado para remover o supernatante para bactérias que formam pelotas soltas.
    NOTA: Para culturas >5 mL, transfira para tubos de 15 mL e gire a ~2800 x g em uma grande centrífuga de mesa por 8-10 min. Culturas <5 mL podem ser transferidas para tubos de 1,5 mL e centrifugadas a 9000 x g por 1-2 min em uma pequena centrífuga de mesa. Bactérias altamente motile (por exemplo, muitas espécies de Pseudomonas) podem precisar ser refrigeradas a 4 °C por 10-15 min para facilitar a formação de uma pelota estável, e pode ser melhor centrifugar a 4 °C.
  4. Resuspend culturas bacterianas em um volume de tampão S e centrífuga novamente para pelota. Remova e descarte o supernatante como antes.
  5. Resuspend culturas bacterianas em S médio na densidade desejada para o experimento, além de quaisquer antibióticos para seleção. Os antibióticos a serem utilizados, se houver, dependerão do perfil de resistência das bactérias utilizadas para colonização.
  6. Usando uma ponta de pipeta revestida em M9TX-01, os vermes pipetas suavemente para cima e para baixo até que os vermes sejam completamente resuspengidos em meio S, em seguida, transfira para tubos ou poços de placa para colonização bacteriana.
  7. Adicione suspensão bacteriana a cada cultura de vermes para atingir a concentração bacteriana desejada e o volume final.
  8. Se usar uma placa multi-poço para colonização, cubra a placa com uma membrana de vedação estéril permeável a gás de 96 poços.
  9. Incubar com agitação a 200 RPM para evitar que as bactérias se instalem durante a incubação.

3. Interrupção mecânica de vermes individuais em um formato de 96 poços

NOTA: Esta seção descreve um protocolo de formato de placa de 96 poços para interrupção mecânica de C. elegans colonizados bacterialmente individuais. Os primeiros passos do protocolo (3.1-3.8) descrevem um método para purgar bactérias não aderidas do intestino do verme e limpar o exterior dos vermes usando paralisia fria e branqueamento da superfície. Essas etapas produzirão vermes adultos limpos e vivos que podem ser mecanicamente interrompidos para quantificação de conteúdos bacterianos (3,8 extremidade) ou usados para experimentos adicionais (Figura Suplementar 1). Este protocolo pode ser adaptado para quantificar bactérias em vermes colonizados na cultura líquida (Seção 2), em placas de ágar, ou a partir de solo natural ou microcosmo.

  1. Coloque uma alíquota de M9TX-01 no gelo para esfriar (4-5x o número de amostras em mL).
  2. Prepare uma alíquota de M9TX-01 + alvejante (6% hipoclorito de sódio, 1:1000 ou 1:2000 v/v, 1 mL por amostra + 1 mL extra) e coloque no gelo para esfriar. Esta alíquota será usada na etapa 3.8.
  3. Prepare placas de 96 poços para diluição serial de amostras de vermes rompidas.
    1. Obter placas estéreis de 300 μL com tampas; este protocolo usa uma placa de diluição por 12 vermes digeridos.
    2. Use um pipettor multicanal de 96 poços para encher as linhas B-D de cada placa de 96 poços (capacidade de 300 μL) com 180 μL de 1x pbs tampão. Deixe a primeira fila vazia. As linhas B-D se tornarão diluições seriais de 10x dos digestores de vermes [0,1x, 0,01x, 0,01x].
    3. Reserve as placas. As placas de diluição serão utilizadas na etapa 3.13.
  4. Resuspend cada amostra de verme em 1 mL de M9TX-01 em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.
  5. Tubos de giro brevemente (2-3 s) em uma minicentrifuagem de baixa velocidade (2.000 x g) a 25 °C para os adultos de pelotas. Pipeta fora do supernante e descartar, tendo certeza de não perturbar a pelota de verme.
  6. Usando as configurações de centrifugação na etapa 3.5, enxágue vermes duas vezes com 1 mL de M9TX-01, depois uma vez com 1 mL de tampão de m9, para reduzir as bactérias externas.
  7. Purigue bactérias não aderidas do intestino do verme.
    1. Resuspend cada amostra de vermes em 1 mL de S médio + 2x op50 morto pelo calor em um tubo de cultura.
    2. Incubar a 25 °C por 20-30 min para permitir a passagem de qualquer bactéria não aderida do intestino.
      NOTA: Isso também limpará qualquer proteína fluorescente extracelular do lúmen e permitirá uma visualização mais clara das bactérias rotuladas aderidas ao epitélio intestinal, particularmente quando fluoroforos ácido-rápidos (por exemplo, mCherry, dsRed) são usados.
  8. Vermes de alvejante de superfície para limpar bactérias externas.
    1. Enxágüe vermes expurgados duas vezes com 1 mL de M9TX-01 frio e descarte o supernasciente.
    2. Deixe os tubos esfriarem por 10 minutos no gelo (preferido) ou a 4 °C. Isso vai paralisar os vermes e evitar a ingestão de alvejante.
      NOTA: Outros protocolos utilizam um agente de paralisia química, como o levamisole; esta é uma abordagem estabelecida33 que requer a adição de um fluxo de resíduos perigosos.
    3. Adicione 1 mL de tampão de maminho M9 gelado + alvejante não perfumado (hidróxido de sódio de 8,25%, 1:1000 ou 1:2000 v/v) a cada tubo. Deixe os tubos sentarem no gelo (preferido) ou a 4 °C por pelo menos 10 minutos para matar bactérias externas.
      NOTA: Não exceda a concentração de alvejante de 1:1000. Mesmo em vermes paralisados, a mortalidade pode resultar.
    4. Pipeta fora tampão de alvejante e descarte; tubos de retorno ao gelo para garantir que os vermes não retomem o bombeamento até que o alvejante seja limpo.
    5. Adicione 1 mL de M9TX frio-01 a cada tubo. Gire por ~5 s em um minicentrifuge (2.000 x g a 25 °C); tubos de retorno para o gelo. Remova o supernatante e descarte.
    6. Repita este passo de lavagem com mais 1 mL de M9TX-01 frio, descartando o máximo possível do supernante.
      NOTA: Se usar worms para outros experimentos, pule a etapa de permeabilização (Protocolo 3.9) e, em vez disso, transfira adultos recém-branqueados para tampão gelado em uma placa de Petri de 6 cm e separe vermes em condições experimentais como no Protocolo 3.10. Manter os vermes frios para evitar que a motilidade seja retomada, mas trabalhe rapidamente - manter os vermes por >30 minutos no gelo pode potencialmente resultar em <100% de retomada da atividade normal34.
  9. Permeabilização química da cutícula de minhoca com sulfato de dodecyl de sódio e dithiothrietol (0,25% SDS + 300 mM DTT) (com base em35)
    ATENÇÃO: O DTT é um agente redutor e irritante. Use EPI e trabalhe em um capô de fumaça ao manusear estoques ou soluções secas. Um fluxo de resíduos perigosos é necessário.
    1. Na capa de fumaça, prepare a solução SDS/DTT suficiente para permitir 100 μL para cada amostra. Para 1 mL, a 965 μL de tampão de m9 ou M9TX-01 em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL, adicione 5 μL de 5% (w/v) SDS e 30 μL de 1M DTT.
      NOTA: A solução DTT de 1 M (aquos) deve ser preparada fresca ou armazenada em alíquotas a -20 °C para garantir a potência. As alíquotas devem ser utilizadas em dois ou três experimentos para evitar o excesso de congelamento.
    2. Mova tubos de microcentrifuuagem contendo vermes branqueados na superfície para um rack de tubo de temperatura ambiente. Cada tubo deve conter vermes em ~20 μL de buffer.
    3. Adicione 100 μL de solução SDS/DTT a cada amostra de worm. Descarte qualquer solução SDS/DTT restante no fluxo de resíduos perigosos apropriado.
    4. Permita que o tratamento prossiga por até 8 minutos no banco para quebrar parcialmente a cutícula resistente dos vermes adultos. Vermes morrerão e se estabelecerão no fundo do tubo durante este tempo.
    5. Após o tempo de permeabilização acabar, pipeta cuidadosamente fora do supernatante SDS/DTT e descarte-o em um fluxo de resíduos perigosos SDS/DTT apropriado.
    6. Adicione 1 mL de M9TX-01 a cada tubo. Gire brevemente em uma centrífuga de mesa para pelotar os vermes ou permitir que os vermes se instalem pela gravidade até o fundo dos tubos, em seguida, desenhe o supernatante e descarte em um fluxo de resíduos perigosos SDS/DTT.
    7. Resuspend worms em tampão de worm M9 de 1 mL + 0,1% Triton X-100 até estar pronto para usar.
  10. Separe vermes em uma placa profunda de 96 poços com grão de carboneto de silício para interrupção mecânica. Prepare a placa de interrupção de 96 poços como abaixo.
    1. Obtenha uma placa de 2 mL de profundidade de 96 poços e uma tampa de placa de silício de 96 poços correspondente.
      NOTA: É importante usar placas compatíveis com os adaptadores de 96 poços para o disruptor tecidual. Pequenas diferenças nas dimensões externas fazem a diferença entre uma placa que pode ser removida dos adaptadores e uma que não pode.
    2. Usando uma espátula de colher estéril, adicione uma pequena quantidade de carboneto de silício estéril de 36 grãos a cada poço da placa que receberá um verme. Use grão suficiente para cobrir mal a parte inferior do poço (cerca de 0,2 g por poço). O material excessivo dificultará a ponta da pipeta na parte inferior do poço ao recuperar o conteúdo.
    3. Adicione 180 μL de tampão de m9 a cada poço.
    4. Rotule as colunas ou linhas para indicar para onde cada amostra irá e cubra a placa livremente com a tampa da placa de silício de 96 poços.
  11. Transfira vermes individuais para a placa de 96 poços para interrupção.
    1. Mova vermes permeabilizados cuidadosamente para uma pequena (35 ou 60 mm) placa de Petri contendo M9TX-01 suficiente para encher o prato a uma profundidade de ~1 cm.
      NOTA: Se um grande número de vermes estiver presente, pode não ser viável transferir toda a amostra, pois o líquido ficará lotado e será difícil canalizar vermes individuais.
    2. Usando um microscópio dissecando ou outro dispositivo de baixa ampliação, pipeta fora worms individuais em volumes de 20 μL, e transferir esses worms para poços individuais da placa de 96 poços.
      NOTA: É melhor colher apenas vermes recém-mortos. Evite vermes com uma forma linear rígida, pois esses vermes podem estar mortos há algum tempo. Tente pegar vermes que são curvados ou em forma de S, com fisiologia bruta normal e um intestino intacto.
    3. Depois de transferir cada volume, certifique-se de que o worm selecionado foi realmente ejetado para o poço. Para isso, pipeta até 20 μL de M9TX-01 a partir de uma área clara da placa de Petri e liberar o volume total de volta para a placa; isso normalmente ejetará o verme se ele estiver preso à pipeta. Se o verme estiver preso, remova 20 μL do poço e tente a transferência novamente.
    4. Uma vez que todos os vermes tenham sido transferidos, cubra a placa de 96 poços com uma folha de filme de vedação flexível comercialmente disponível (2 x 2 quadrados), certificando-se de que o lado apoiado em papel do filme de vedação está voltado para os poços de amostra. Tenha cuidado para não esticar o filme de vedação muito fino, ou será muito difícil de remover mais tarde.
    5. Coloque levemente o tapete de vedação de silício em cima do filme de vedação flexível; não pressione a tampa para baixo nos poços neste momento.
    6. Mova a placa para 4 °C para esfriar por 30-60 min. Isso evitará o excesso de aquecimento durante a interrupção, o que pode danificar as amostras.
      NOTA: Este é um ponto de ruptura no protocolo. Na maioria dos casos, a placa pode ser deixada a 4°C por até 4 horas antes de moer. Não deixe os vermes da noite para o dia, pois isso mudará a contagem bacteriana.
  12. Carregue 96 placas de poço em um disruptor de tecido para quebrar tecidos de vermes e liberar bactérias intestinais.
    NOTA: (Opcional) Se usar um número ímpar de placas de 96 poços para digestão, é necessário preparar um contrapeso antes de prosseguir. Use uma placa vazia de 96 poços e encha os poços com água até que ele pese o mesmo que a primeira placa.
    1. Pressione o tapete de vedação de silício firmemente para baixo nos poços para criar uma vedação, certificando-se de que a tampa está plana por toda a superfície da placa.
      NOTA: Se o filme de vedação flexível for muito grosso após o alongamento, será difícil fixar a tampa de silicone de tal forma que ela esteja deitada plana em todos os poços. Isso resultará em um selo insuficiente e contaminação bem-a-poço durante o tremor.
    2. Placas seguras no disruptor tecidual usando os adaptadores de placa de 96 poços. Agite as placas por 1 min a 30 Hz, depois gire as placas 180° e agite novamente por 1 min. Isso ajudará a garantir até mesmo a interrupção em todos os poços da placa.
    3. Toque firmemente nas placas do banco duas ou três vezes para desalojar qualquer grão do filme de vedação flexível.
    4. Usando uma centrífuga grande com dois adaptadores de placa de 96 poços, gire as placas a 2400 x g por 2 minutos para recolher todo o material até o fundo dos poços.
    5. Remova a tampa de silicone e retire cuidadosamente o filme de vedação flexível.
      NOTA: Se a película de vedação flexível grudar em qualquer um dos poços, use uma ponta de pipeta de 200 μL para removê-la. Isso é comum quando o filme de vedação flexível foi esticado muito fino.
  13. Amostras de digestão de vermes diluídos em 300 μL em placas de 96 poços.
    1. Usando um pipettor multi-poço definido para 200 μL, pipeta para cima e para baixo várias vezes lentamente e cuidadosamente para re-misturar o conteúdo dos poços, em seguida, retirar o máximo do líquido possível. Transfira este líquido para as fileiras superiores das placas de 96 poços preparadas na etapa 3.3.
    2. Usando um pipettor de 96 poços definido para 20 μL, remova este volume de líquido da linha superior e dispense na linha B. Pipeta para cima e para baixo 8-10x para misturar. Descarte dicas.
    3. Repita o passo 3.13.2, partindo das amostras de 0,1x da linha B para criar amostras de diluição de 0,01x na linha C.
    4. Repita o passo 3.13.2 novamente, indo da linha C para a linha D.
    5. Placa em ágar sólido para quantificação bacteriana. Para vermes monocolonizados, geralmente é suficiente para emplacar gotas de 10-20 μL de cada diluição [1x-0,001x] em placas de ágar. Para colonização de várias espécies, emplaque cada diluição separadamente, canalização de 100 μL em uma placa de ágar de 10 cm; espalhar imediatamente usando contas de revestimento de vidro.

4. Limpeza do grão de carboneto de silício para reutilização

NOTA: Este procedimento é usado para limpar e esterilizar o material de moagem, grão de carboneto de silício, para reutilização após experimentos. Este protocolo deve ser seguido em sua totalidade antes do primeiro uso, uma vez que o grão de carboneto de silício é um produto industrial e não vem pré-esterilizado. O grão de si-carboneto (3,2 g/cc) é um material denso e áspero que funciona eficientemente para interromper amostras resistentes. No entanto, as partículas podem se desgastar sobre o uso repetido e devem ser substituídas quando o desgaste se torna aparente. Felizmente, o material é barato, e os tamanhos normalmente vendidos (~1 lb) são suficientes para muitos experimentos.

  1. Depois de remover amostras para chapeamento, adicione 10% de solução de alvejante a todos os poços da placa de 96 poços e deixe descansar por pelo menos 10 minutos.
  2. Remova a maior parte do grão invertendo rapidamente a placa de 96 poços sobre uma pequena bandeja de lado alto ou recipiente de ponta de pipeta P1000 vazio grande o suficiente para capturar todo o conteúdo. O grão afundará imediatamente no fundo da bandeja. Despeje a solução de alvejante em uma pia.
  3. Reencha a placa de 96 poços com água da torneira e inverta na mesma bandeja para enxaguar o grão restante. Despeje a água na pia.
  4. Repita mais uma a três vezes com água da torneira até que a placa esteja completamente limpa de grão.
  5. Enxágüe grão 2x na água da torneira, enchendo a bandeja cada vez.
    NOTA: A placa de 96 poços profundos pode ser lavada em uma máquina de lavar louça de laboratório, coberta com papel alumínio, e autoclavada com outros plásticos reutilizáveis. O grão não precisa ser lavado imediatamente e pode ser deixado de lado neste momento. O grão usado é geralmente acumulado a partir de vários experimentos antes de lavar e autoclavar.
  6. Lave o grão em uma solução de detergente de laboratório por 30 minutos, agitando ocasionalmente girando ou misturando com uma espátula de metal.
  7. Enxágüe todos os traços de detergente em várias (8-10) trocas de água da torneira e enxágue 2x com água destilada.
  8. Espalhe o grão em uma bandeja aberta, como uma bandeja de autocláve de polipropileno raso, e seque a 40-70 °C por várias horas.
    NOTA: Se o grão estiver desajeitado quando seco, não foi limpo ou enxaguado o suficiente. Repita o protocolo de limpeza a partir da etapa 4.6, adicionando enxágües adicionais na etapa 4.7.
  9. Distribua grãos limpos e secos em garrafas de vidro autoclaváveis de rosca a uma profundidade máxima de 5-6 cm. Autoclave no ciclo pré-vácuo por 30 minutos para esterilizar.

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Representative Results

Esterilização alvejante de vermes vivos
Vermes branqueados na superfície são efetivamente livres de bactérias externas até que a motilidade retorne e a excreção retome. Nas condições aqui utilizadas, observa-se a rápida extinção de bactérias no tampão (Figura 1A-C, Figura Suplementar 2, Vídeo 1) sem perturbar as bactérias associadas ao intestino em vermes paralisados a frio (Figura 1D-F, Vídeo 2). Esses dados indicam que o branqueamento da superfície pode ser usado efetivamente para higienizar vermes externamente sem comprometer o conteúdo intestinal (comparações de contagens de CFU associadas a vermes não associados à superfície não são significativas, o teste de soma de wilcoxon p > 0,05).

Variações na interrupção mecânica de várias amostras
A técnica de 96 poços para disrupção mecânica de vermes é robusta aos materiais específicos utilizados, e considerações práticas ditam a escolha do material de moagem. Semelhante a um relatório anterior33, a interrupção manual (Figura 2A) resultou em mais heterogeneidade do que o protocolo padrão de 96 poços (grão de carboneto de silício, Figura 2B) (var(log10CFU) = 0,499) em todas as condições tampão, em comparação com 0,229 para Si-carboneto, 0,243 para contas de vidro grande (Figura 2C) e 0,227 para pequenas contas de vidro (Figura 2D ). No entanto, a maioria das diferenças nas distribuições de CFU/worm não foram significativas (Kruskal-Wallace, p = 0,017 com df = 3; testes significativos pós-hoc Wilcoxon para contas grandes versus contas pequenas, p = 0,021, e contas grandes vs. grão de carboneto de silício, p = 0,02). O uso de Triton X-100 como surfactante não foi associado a nenhuma diferença significativa de rendimento quando considerado como um fator individual (Kruskal-Wallace, p = 0,94, df = 3), embora haja um aumento aparente no rendimento em amostras contendo triton vs. Triton quando grandes contas (2,7 mm) foram usadas (Figura 2C), possivelmente atribuíveis à excessiva "espuma" observada nesses poços quando Tritão estava presente. Esses resultados indicam que grandes contas de vidro, embora ideais para uso em tubos de homogeneização33, não são adequadas para a técnica de 96 poços. Enquanto pequenas contas de vidro produziam resultados razoáveis (Figura 2D), elas constantemente entupiavam 200 pontas de pipeta μL durante a mistura e o revestimento. O material padrão neste ensaio, grão de carboneto de silício, é barato, muito grande para entupir pontas padrão, e como contas de vidro podem ser lavadas e reutilizadas após autoclaving. A grão libera uma pequena quantidade de "pó" no tampão, que não interfere no revestimento, mas precisa ser filtrada se os produtos de interrupção forem usados para citometria de fluxo.

Heterogeneidade na colonização bacteriana em vermes adultos
A interrupção bem sucedida dos vermes individuais revela a heterogeneidade na colonização bacteriana. Indivíduos de populações isogênicas sincronizadas de vermes, colonizados ao mesmo tempo no mesmo pool de bactérias, mostram consistentemente 100 vezes ou maior alcance na carga bacteriana intestinal. Isso é observado para diferentes colonos bacterianos (Figura 3A) e durante a colonização em comunidades bacterianas multi-espécies (Figura 3B). Essa heterogeneidade também é evidente em medições individuais de vermes de fluorescência quando os vermes são colonizados com bactérias expressando uma proteína fluorescente (GFP) (Figura 3C-D). As propriedades do hospedeiro desempenham um papel na formação dessa heterogeneidade, como pode ser visto comparando a colonização de vermes de Bristol N2 do tipo selvagem à colonização pelas mesmas bactérias em mutantes DAF-2/IGF; este mutante daf-16 suporta populações maiores de muitas bactérias em comparação com n2, enquanto daf-2 é resistente à colonização por uma gama de bactérias36 (Figura 3B,D). Essa heterogeneidade é característica, mostrando variação entre diferentes combinações de hospedeiros e colonos, mantendo uma estrutura consistente ao longo de diferentes corridas do mesmo experimento (Figura 3E-F).

Importância da heterogeneidade individual para comparação precisa de grupos
A importância da heterogeneidade individual pode ser facilmente vista considerando como os digeridos em lote podem alterar as distribuições de dados. Colonização pelas bactérias nativas do microbioma MYb53 (Rhodococcus erythropolis) e MYb120 (Chryseobacteria spp.) (Figura 3A, 4A) em adultos N2 são usados como exemplos. Os dados individuais do worm são claramente semelhantes na distribuição (teste t de duas caudas, p = 0,9, soma de classificação Wilcoxon, p = 0,59). Ao resutar esses dados para simular os efeitos dos digestores em lote, o lote extrapolado CFU/worm puxa para os quantiles superiores dos dados devido à inclinação positiva nessas distribuições (média > mediana). À medida que o loteamento efetivamente faz uma média sobre os indivíduos dentro de um lote, a CFU/worm extrapolada em lote será centrada em torno da média aritmética dos dados individuais, com a diminuição da distância para este meio à medida que os lotes se tornam grandes de acordo com o teorema do limite central (Figura 4B-D). Assim, o sinal da variação biológica é rapidamente perdido; As medições de CFU/worm inferidas em lote convergem para a média, que não é uma métrica representativa desses dados distribuídos em escala de log. As diferenças na colonização inferida por MYb53 vs. MYb120 rapidamente se tornam significativas em digestões em lote simulados (t-test batch 5, p = 0,049; lote 10, p = 2,27e-4; lote 20, p = 1.19e-15; Wilcoxon classifica o lote de teste 5, p = 2,27e-4; lote 10, p = 2,70e-06; lote 20, p = 1,80e-09) como o sinal original é obscurecido.

Efeitos da heterogeneidade individual na transmissão microbiana
Como os vermes individuais mostram heterogeneidade substancial na colonização bacteriana, é razoável perguntar se essa heterogeneidade tem efeitos a jusante. Por exemplo, é razoável esperar que a transmissão possa ser uma função da carga bacteriana intestinal. Ao transferir vermes branqueados pela superfície individuais para um ambiente limpo, é possível observar a inoculação do ambiente com bactérias vivas excretadas. Nestes experimentos, adultos pré-colonizados comesados à superfície, carregando populações geralmente substanciais (103-10 5 CFU/worm, Figura 5) de Ochrobactrum Commensal MYb14-GFP ou patogênico S. aureus-GFP, foram autorizados a vagar em gramados OP50 mortos pelo calor em ngm ágar por 1,5 h. Quando esses vermes são recolhidos a partir de placas de excreção e interrompidos para quantificação bacteriana, não há relação significativa entre carga bacteriana e taxa de excreção de bactérias vivas (correlações de Pearson entre colônias transformadas em tronco/rh e CFU/worm: MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9) (Figura 5). Também não há uma relação significativa entre a presença/ausência de colônias em uma placa e a carga bacteriana intestinal (regressão logística binomial com CFU/worm transformado em tronco como fator: p = 0,15 com df = 53). Uma fração substancial de placas permaneceu livre de novo crescimento (placas de 18/9 para MYb14, 10/36 placas para S. aureus), indicando baixas taxas globais de excreção.

Quando os vermes são autorizados a excretar em placas de ágar, o número real de bactérias excretadas vivas por verme é confundido pela "agricultura", onde os vermes passam por colônias e criam trilhas de novo crescimento (Figura 6)37. Uma placa com n colônias representa pelo menos uma, e no máximo n, eventos onde bactérias formadoras de colônias vivas foram excretadas. A partir dessa observação, não é possível saber quantos eventos de excreção em (1,n) realmente ocorreram, nem é possível saber quantas bactérias foram excretadas em cada evento. Portanto, não é possível estimar com precisão as taxas de excreção de bactérias vivas do intestino usando esses dados. No entanto, é possível inferir alguns limites. Embora o número de colônias por placa não seja muito informativo, os dados de presença/ausência podem ser usados para inferência áspera das taxas de excreção. Para a simplicidade, se supõe-se que a taxa de excreção de bactérias vivas não é uma função da carga bacteriana e que a excreção é um processo de Poisson, há uma chance de ~50% de observar pelo menos nove eventos em 18 ensaios quando λ ≈ 0,33 worm-1 hr-1 em MYb14. Para S. aureus, são obtidas taxas plausíveis similares de λ ≈ 0,2 worm-1 hr-1. Embora esses cálculos aproximados sugiram baixas taxas de excreção de bactérias vivas, uma quantificação mais precisa desse processo sobre um número maior de vermes individuais será necessária para obter estimativas confiáveis.

Disponibilidade de dados:
Os dados aqui apresentados estão disponíveis na Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2).

Figure 1
Figura 1. O tratamento de branqueamento de superfície de baixa concentração mata rapidamente bactérias no tampão, mas não perturba comunidades intestinais em vermes paralisados a frio. (A-C) CFU/mL bacteriano em tampão de m9 durante o branqueamento da superfície em três concentrações diferentes (1:1000, 1:2000, 1:5000 v/v; controle não branqueado para comparação), direcionamento (A) S. aureus Newman, (B) S. enterica LT2, ou (C) E. coli OP50. As amostras foram colhidas em pontos de tempo indicados até 20 minutos após a exposição e lavadas duas vezes com tampão estéril para evitar que alvejante matasse colônias em placas. Os dados da condição de 1:1000 são ligeiramente compensados para que esses dados sejam visíveis na trama. (D-F) Bactérias intestinais em vermes N2 individuais (n = 24 vermes por experimento, duas ou três corridas independentes em dias separados). Todas as comparações de contagens de CFU associadas a vermes branqueados e sem alvejante não são significativas (wilcoxon rank-sum teste p > 0,05). As linhas horizontais cinzas representam um limiar de detecção, definido como a densidade (40 UFC/worm) na qual a probabilidade de observar pelo menos uma colônia é de ~60% ao emplacar 10 alíquotas de μL a partir de volumes de 200 μL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. O protocolo de interrupção de 96 poços produz resultados consistentes e é robusto para a escolha dos materiais. N2 vermes adultos colonizados com uma única espécie bacteriana por 48 h (P. mosselii) foram branqueados e permeabilizados de acordo com os protocolos padrão, então vermes individuais (n = 24 por condição) foram mecanicamente interrompidos para revestimento de CFU usando (A) interrupção manual em tubos individuais de 0,5 mL, usando um pilão motorizado ou (B-D ) variações no protocolo de interrupção de 96 poços descritos detalhadamente no Protocolo. A interrupção foi realizada no tampão de vermes M9 contendo concentrações variadas de Tritão X-100 (eixo x, 0-0,1%, v/v) e um de (B) carboneto de silício de 36 grãos, (C) pequenas (425-600 μm) contas de vidro, ou (D) grandes (2,7 mm) contas de vidro grandes (2,7 mm). Para todas as parcelas, os dados mostrados são log10 (CFU/worm), e cada ponto é um worm individual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Colonização bacteriana heterogênea do intestino C. elegans. (A) Colonização de espécies únicas de hermafroditas adultas N2 preparadas como em Métodos. As bactérias são quatro espécies da coleção de microbiomas de minhoca nativa MYb (Dirksen et al. 2016) (n = 24 vermes, um experimento cada) e dois patógenos, Staphylococcus aureus MSSA Newman (SA) e Salmonella enterica LT2 (SE) (n = 96-144 worms ao longo de dois/três experimentos independentes). A colonização por espécies de microbioma nativa foi avaliada após uma incubação de 48 h a 25°C em média S líquida + 108 bactérias UFC/mL; a colonização por patógenos foi avaliada após a incubação em gramados no ágar de verme NGM para 24 (SA) ou 48 (SE) h a 25°C. (Às 48 horas, vermes em S. aureus morreram principalmente.) (B) CfU/worm total em N2, daf-16(mu86)e adultos daf-2(e1370) colonizados por 4 dias em mídia líquida em um microbioma nativo mínimo de oito espécies (dados de Taylor e Vega, 2021)14. (C-D) Fluorescência verde em vermes individuais colonizados com bactérias que expressam GFP, observadas por grande citometria de fluxo de objetos. Em (C), populações sincronizadas de adultos N2 foram colonizadas com OP50 (não fluorescente, n = 1908 vermes adultos individuais), S. aureus (GFP, n = 968) ou S. enterica (GFP, n = 1153) conforme descrito em (A); o controle OP50 indica níveis típicos de autofluorescência de canais verdes em worms N2 adultos do dia 3. Em (D), populações sincronizadas de N2 (n = 1165), daf-16(mu86) (n = 1180) e daf-2(e1370) (n = 2267) adultos foram colonizados com Ochrobactrum commensal MYb14-GFP por 2 dias em placas conforme descrito em (A). (E-F) Variação cotidiana na colonização por S. aureus (E) e S. enterica (F) (mesmos dados dos painéis A e Figura 1, n = 48 vermes por experimento). O eixo x indica o dia da amostragem. As linhas horizontais cinzas representam um limiar de detecção, definido como a densidade em que a probabilidade de observar pelo menos uma colônia é de ~60% (40 UFC/verme para colonização de espécies únicas e quatro UFC/verme para colonização de várias espécies, devido a diferentes volumes de revestimento de 10 μL e 100 μL, respectivamente, de 200 μL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. O loteamento apaga a variação biológica em dados distorcidos em escala de log. Os dados de CFU/worm da Figura 3 foram reamostrados com substituição para criar n = 25 conjuntos de réplica de dados simulados para cada tamanho de lote, onde o tamanho é o número de worms individuais por lote. CFU/worm é a CFU total em cada lote simulado dividido sobre o número de worms por lote. Nos dados brutos (painel A), a MÉDIA DE CFU/worm para MYb53 é de 4450,8 (103,6) e para MYb120, 1398,3 (103.1); os números inferidos em lote convergem para esses valores à medida que o tamanho do lote aumenta (B, cinco worms/lote; C, 10 worms/lote; D, 20 worms/lote), consistente com as expectativas do teorema do limite central. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. A excreção de bactérias vivas está mal correlacionada com a carga de UFC no intestino de vermes individuais. Aqui, os adultos N2 foram colonizados por alimentação por 1 ou 2 dias, respectivamente, em gramados de S. aureus-GFP ou MYb14-GFP. Vermes com fluorescência GFP detectável (GFP total > 1,8 troncos em grande citômetro de fluxo de objeto) foram classificados a partir da população em massa, branqueados na superfície como descrito em Métodos, e transferidos individualmente para placas OP50 mortas pelo calor . As correlações de Pearson entre colônias transformadas em tronco/h e CFU/worm não são significativas (MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6. A "agricultura" bacteriana obscurece o número de eventos de excreção em placas de ágar. Aqui estão duas placas com colônias MYb14-GFP da excreta de vermes. A primeira placa (A) tem evidências claras de "agricultura" ao longo de caminhos de vermes e parece representar pelo menos dois eventos separados de excreção baseados em diferenças na expressão GFP (visível como pigmentação amarelada) entre colônias. Embora a segunda placa (B) seja mais ambígua, a agricultura não pode ser descartada com base nas posições das colônias. Nestes experimentos, os vermes adultos N2 foram pré-colonizados por 48 h, alimentando-se de placas de ágar contendo gramados de MYb14-GFP. Após a colonização, os vermes foram preparados e branqueados na superfície de acordo com os Métodos, depois transferidos em 5 μL de tampão de minhoca M9 + 0,1% Triton X-100 a 6 cm NGM + placas OP50 mortas pelo calor (preparadas permitindo 50 μL pontos de 5x concentrados de OP50 mortos pelo calor para secar na superfície). Os vermes foram autorizados a vagar por 1,5 h a 25°C, depois colhidos em placas e interrompidos para revestimento de CFU/worm (interrupção manual em 20 μL tampão em tubos individuais de 0,5 mL, usando um pilão motorizado). As placas foram incubadas a 25°C durante 2 dias antes da contagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1. Visualização de vermes N2 colonizados com S. aureus fluorescente GFP sem branqueamento superficial. Um pequeno número de células fluorescentes na cutícula se movem para dentro e para fora do foco à medida que a imagem passa pelo corpo do verme, e a colonização espacialmente heterogênea do intestino torna-se visível à medida que o campo de visão se move da superfície do corpo para o intestino. A imagem da pilha Z foi tirada com ampliação de 20x em um microscópio fluorescente invertido. Imagens fluorescentes filtradas por campo brilhante e GFP foram sobrepostas, e imagens em toda a pilha Z costuradas juntas, usando o software do fornecedor. A imagem é do mesmo slide da Figura Suplementar 2A. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2. Visualização de um worm N2 colonizado com S. aureus fluorescente GFP com branqueamento superficial (1:1000 v/v por 20 min). A colonização espacialmente heterogênea por bactérias fluorescentes é visível no intestino deste indivíduo, e as bactérias infiltraram-se nos tecidos do corpo, indicando infecção avançada. Nenhuma bactéria é visível na cutícula. A imagem da pilha Z foi tirada com ampliação de 20x em um microscópio fluorescente invertido. Imagens fluorescentes filtradas por campo brilhante e GFP foram sobrepostas, e imagens em toda a pilha Z costuradas juntas, usando o software do fornecedor. A imagem é do mesmo slide da Figura Suplementar 2B. Clique aqui para baixar este vídeo.

Figura suplementar 1. Visão geral do Protocolo. Aqui, vermes adultos sincronizados são mono-colonizados com bactérias vermelhas, branqueados na superfície e permeabilizados antes da interrupção mecânica de vermes individuais em um formato de 96 poços. Bactérias liberadas do intestino são diluição banhadas em séries 10x para quantificação de UFC/verme; placas mostradas são típicas para heterogeneidade observada. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2. Visualização de vermes N2 colonizados com S. aureus fluorescente GFP com e sem branqueamento superficial (1:1000 v/v por 20 min). (A) Na amostra não boquiacada, as bactérias externas são visíveis na baixa ampliação como áreas de fluorescência verde não associadas a vermes ou fragmentos do corpo de vermes. (B) Na amostra branqueada da superfície, a fluorescência GFP é restrita ao interior dos corpos de vermes (um fragmento do corpo de verme é visível no meio da imagem). Todas as imagens foram tiradas em 4x de ampliação em um microscópio fluorescente invertido. Imagens fluorescentes filtradas por campo brilhante e GFP foram sobrepostas, e imagens de campos de visão adjacentes costuradas juntas, usando o software do fornecedor. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo suplementar 1: Receitas de tampão e solução. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

Aqui os dados são apresentados sobre as vantagens da quantificação de um único verme da carga bacteriana em C. elegans, juntamente com um protocolo de interrupção de 96 poços para permitir a rápida e consistente aquisição de grandes conjuntos de dados deste tipo. Em comparação com os métodos existentes33, esses protocolos permitem uma medição de maior rendimento das comunidades microbianas intestinais no verme.

Essa abordagem tem o revestimento como um passo limitante de taxas e não é verdadeiramente "high-throughput". A citometria de fluxo de objetos grandes (Figura 3C,D) é um método útil de alta taxa para quantificar bactérias fluorescentes rotuladas em vermes individuais16, embora o número de fluoroforos simultâneos seja uma limitação em comunidades de várias espécies. Vincular a interrupção da placa multi-poço com o sequenciamento da comunidade é outra maneira de aumentar o rendimento; no entanto, o procedimento de interrupção de 96 poços descrito aqui foi otimizado especificamente para deixar as células bacterianas intactas. A análise baseada em sequenciamento, onde a lise minuciosa das células é desejável, exigirá a adição de uma etapa de extração de ácido nucleico ou modificação do protocolo de espancamento (Protocolo 3.10-3.11) para extrair conteúdo celular em vez de bactérias vivas. Protocolos para interrupção de um único verme e extração de ácidos nucleicos foram publicados em outros lugares38,39.

A abundância total bacteriana no intestino do verme é heterogênea, e os dados aqui mostrados sugerem que a medição em lote pode produzir resultados errôneos em comparações entre grupos. No entanto, outras medidas de comunidades bacterianas no verme podem ser menos sensíveis aos efeitos do loteamento. Note-se que as abundâncias relativas em comunidades associadas a vermes parecem variar muito pouco se em tudo com o tamanho total da população intestinal, independentemente de as interações entre micróbios serem neutras40 ou não14. É plausível que, em comparação com os dados de contagem, medidas relativas de abundância sejam menos suscetíveis à questão da taxa falsa-positiva descrita. A análise comunitária baseada em sequenciamento, que gera dados relativos de abundância para a composição da comunidade, pode, portanto, não exigir a medição de vermes únicos. Mais investigações são necessárias neste ponto.

Aqui, usamos tratamento frio para paralisar vermes para branqueamento superficial. Outros trabalhos descobriram que os vermes retomam a atividade normal rapidamente (<15 min) se o tempo no gelo for mantido abaixo de 30 minutos, permitindo o uso imediato em outros ensaios, em contraste com agentes de paralisia química que podem exigir longos períodos antes da recuperação completa34. Se os vermes forem interrompidos imediatamente para quantificação bacteriana, este recurso é dispensável, e a principal vantagem do resfriamento versus paralisia química é evitar a necessidade de um fluxo de resíduos controlado. O tratamento frio prolongado deve ser usado com cautela ao investigar as respostas ao estresse, especialmente se houver uma conexão conhecida com a temperatura. Os protocolos de paralisia fria descritos aqui implicam uma exposição aguda mais curta ao frio do que o usado em experimentos de estresse frio (20-30 min vs 2+ h a 2-4°C)41,42,43, e um choque frio de 1 h não produz fenótipo aparente em vermes do tipo selvagem 43. A incubação de curto prazo (90 min) a 4 °C induz alterações na expressão genética de estresse frio (medida pela expressão de um repórter TMEM-135::GFP), mas a expressão retorna a níveis não estressados em poucos minutos, uma vez que os vermes são devolvidos à temperatura ambiente34. No entanto, os efeitos sobre genótipos de vermes sensíveis ao estresse podem ser mais graves do que no tipo selvagem. Este procedimento deve ser validado nas condições experimentais a serem utilizadas.

O protocolo de branqueamento de superfície descrito aqui pode ser usado como uma maneira de limitar ou eliminar a passagem de micróbios externos em experimentos. Este método também tem sido usado para limpar contaminantes fúngicos por branqueamento superficial e transferir apenas larvas L1/L2 para placas frescas (a transferência de adultos branqueados na superfície resultou em falha na liberação do contaminante, presumivelmente devido ao transporte nos intestinos dos animais maiores). É extremamente importante garantir que a concentração de alvejante não exceda 1:1000 v/v, pois o dano aos vermes e a mortalidade resultarão. Este procedimento pode ser útil na evolução experimental do micróbio hospedeiro e interações hospedeiro-patógeno. Por exemplo, a baixa taxa de excreção de bactérias vivas observadas aqui pode ajudar a explicar as taxas altamente variáveis observadas para a transmissão bacteriana de hermafroditas paradescendentes 15. A falta de correlação entre a carga bacteriana intestinal e a taxa de excreção aqui observada é interessante, mas requer uma investigação mais aprofundada; um número maior de pontos de dados em uma série de condições será necessário para determinar onde (ou se) essa observação irá conter.

Nem sempre pode ser necessário limpar vermes na medida em que o branqueamento da superfície. Várias lavagens em tampão estéril são provavelmente suficientes quando os vermes são colonizados internamente com um único micróbio se o mínimo esperado de CFU/worm for muito maior (10-100 vezes) do que a concentração de bactérias em supernatante tampão, pois esta transferência afetará minimamente a contagem (ver Figura 1). Além disso, se os micróbios de interesse colonizarem principalmente a cutícula, o branqueamento superficial deve ser claramente evitado. A limpeza completa é mais importante para garantir a precisão ao lidar com comunidades microbianas mistas (para garantir que todas as colônias/leituras em uma amostra sejam de bactérias associadas a vermes e não do ambiente), quando as bactérias aderidas à cutícula interferem na leitura da população internalizada, quando o mínimo esperado de CFU/worm é baixo, etc.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores gostariam de reconhecer H. Schulenberg e C. LaRock por seu generoso compartilhamento de cepas bacterianas usadas nesses experimentos. Este trabalho foi apoiado por financiamento da Universidade Emory e da NSF (PHY2014173).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500

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Biologia Edição 185 Caenorhabditis elegans microbioma heterogeneidade micróbio hospedeiro bactérias transmissão
Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade em <em>Interações elegans-bacterianas de Caenorhabditis</em>
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Taylor, M. N., Spandana Boddu, S.,… More

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).

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