Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones caenorhabditis elegans-bacterianas

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64027
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

Summary

Este protocolo describe una interrupción de 96 pocillos de Caenorhabditis elegans colonizada bacterianamente después de la parálisis por frío y el blanqueamiento de la superficie para eliminar las bacterias externas. La suspensión resultante está chapada en placas de agar para permitir una cuantificación precisa y de rendimiento medio de la carga bacteriana en un gran número de gusanos individuales.

Abstract

El nematodo Caenorhabditis elegans es un sistema modelo para las interacciones huésped-microbioma y huésped-microbioma. Muchos estudios hasta la fecha utilizan resúmenes por lotes en lugar de muestras individuales de gusanos para cuantificar la carga bacteriana en este organismo. Aquí se argumenta que la gran variabilidad interindividual observada en la colonización bacteriana del intestino de C. elegans es informativa, y que los métodos de digestión por lotes descartan información que es importante para una comparación precisa entre las condiciones. Como la descripción de la variación inherente a estas muestras requiere un gran número de individuos, se establece un conveniente protocolo de placa de 96 pocillos para la interrupción y el recubrimiento de colonias de gusanos individuales.

Introduction

La heterogeneidad en las asociaciones huésped-microbio se observa de manera ubicua, y la variación entre individuos se reconoce cada vez más como un factor contribuyente en los procesos a nivel poblacional desde la competencia y la coexistencia1 hasta la transmisión de enfermedades 2,3,4. En C. elegans, se ha observado repetidamente "heterogeneidad oculta" dentro de las poblaciones isogénicas, con subpoblaciones de individuos que muestran fenotipos distintos en la respuesta al choque térmico 5,6, el envejecimiento y la esperanza de vida 7,8,9,10,11, y muchos otros aspectos de la fisiología y el desarrollo 12 . La mayoría de los análisis que intentan identificar la estructura de la subpoblación proporcionan evidencia de dos subpoblaciones en poblaciones experimentales de gusanos isogénicos y sincronizados 5,7,8, aunque otros datos sugieren la posibilidad de distribuciones de rasgos dentro de la población en lugar de grupos distintos 7,12,13 . De relevancia aquí, se observa una heterogeneidad sustancial en las poblaciones intestinales incluso dentro de las poblaciones isogénicas de gusanos colonizados a partir de una fuente compartida de microbios 13,14,15,16, y esta heterogeneidad puede ocultarse mediante las mediciones de digestión por lotes que se utilizan ampliamente 17,18,19,20 para la cuantificación bacteriana en el gusano.

Este trabajo presenta datos que sugieren la necesidad de una mayor dependencia de las mediciones de un solo gusano en la asociación huésped-microbio, así como protocolos para aumentar la precisión y el rendimiento en la interrupción de un solo gusano. Estos protocolos están diseñados para facilitar la interrupción mecánica de un gran número de C. elegans individuales para la cuantificación de la carga bacteriana viable, al tiempo que proporcionan una mejor repetibilidad y un menor esfuerzo por muestra que la interrupción basada en morteros de gusanos individuales. Se incluye un paso recomendado de purga intestinal, donde se permite que los gusanos se alimenten de E. coli muerta por calor antes de la preparación para la interrupción, para minimizar las contribuciones de bacterias recientemente ingeridas y otras bacterias transitorias (no adheridas). Estos protocolos incluyen un método de parálisis en frío para limpiar la cutícula con un tratamiento de lejía superficial de baja concentración; El blanqueamiento de superficies se puede utilizar como un paso preparatorio en la interrupción de un solo gusano o como un método para preparar gusanos vivos, externamente libres de gérmenes. Este método de blanqueamiento de la superficie es suficiente para eliminar una amplia gama de microbios externos, y el tratamiento en frío proporciona una alternativa a la parálisis convencional a base de levamisol; mientras que el levamisol será preferido para experimentos sensibles al frío, la parálisis por frío minimiza las contribuciones a los flujos de desechos peligrosos y permite una rápida reanudación de la actividad normal. Si bien el protocolo completo describe un experimento de laboratorio en el que los gusanos se colonizan con bacterias conocidas, los procedimientos para limpiar los gusanos y la interrupción de un solo gusano se pueden aplicar fácilmente a gusanos aislados de muestras silvestres o colonizados en experimentos de microcosmos. Los protocolos descritos aquí producen bacterias vivas extraídas del intestino del gusano, adecuadas para el recubrimiento y la cuantificación de unidades formadoras de colonias (UFC) en gusanos individuales; para el análisis de la comunidad intestinal basado en la secuenciación, se deben agregar a estos protocolos pasos posteriores de lisis celular y extracción de ácido nucleico.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Los gusanos utilizados en estos experimentos se obtuvieron del Centro Genético Caenorhabditis , que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Bristol N2 es el tipo salvaje. Los mutantes DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) y daf-2(e1370) III (CGC CB1370) se utilizan para ilustrar las diferencias en la carga bacteriana intestinal.

HT115(DE3) E. coli que transporta el vector RNAi pos-1 es de la biblioteca de Ahringer21. La colección MYb de bacterias intestinales nativas de C. elegans 22 se obtuvo del laboratorio de Schulenburg. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR es de este laboratorio23. Pseudomonas mosselii fue aislado en este laboratorio. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP se obtuvo del laboratorio LaRock de la Universidad de Emory.

Todos los tampones y medios de gusanos se preparan de acuerdo con la literatura publicada previamente24 con modificaciones menores (ver Archivo Complementario 1).

1. Preparación de C. elegans estériles sincronizados

NOTA: En esta sección, se describen los procedimientos paso a paso para generar una población sincronizada de gusanos adultos reproductivamente estériles. La alimentación en placas de ARNi pos-1 se utiliza aquí para prevenir la producción de progenie porque esta interferencia es letal embrionaria; Las larvas L1 criadas hasta la edad adulta en el ARNi pos-1 se convierten en hermafroditas ponedoras de huevos, pero estos huevos son inviables25. El protocolo de alimentación de ARNi es como en el capítulo "Genética inversa" de Wormbook26.

  1. Antes de sincronizar gusanos, asegúrese de que haya placas frescas de 10 cm NGM + rNAi pos-1 disponibles. Las placas se pueden preparar frescas a partir de cultivo líquido inducido concentrado (+Amp +IPTG) o inocularse como césped en NGM + 100 μg/mL de ampicilina + 1 mM de IPTG y se dejan crecer a 25 °C en la oscuridad durante 1 día27.
    NOTA: La carbenicilina (25 μg/ml) se usa a menudo en lugar de la ampicilina en las placas de ARNi. La ampicilina es menos costosa pero menos estable; si se utiliza ampicilina, las placas deben sembrarse inmediatamente una vez secas y utilizarse lo antes posible (se pueden almacenar durante <1 semana a 4 °C)27. La alta concentración de antibióticos recomendada aquí ayudará a garantizar una selección adecuada.
  2. Comience con varias (típicamente de dos a cuatro) placas NGM con grandes poblaciones de hermafroditas grávidas. Aislar los huevos usando la sincronización bleach-NaOH24.
    1. Lave los gusanos de las placas de agar con 2 ml de ddH2O estéril por placa. Distribuya el líquido uniformemente en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (un tubo por placa o hermafroditas).
    2. Gire hacia abajo durante ~ 5 s en una minicentrífuga de sobremesa (2,000 x g) para tirar de los adultos hasta el fondo de los tubos. Pipetee el sobrenadante y deseche.
    3. Lavar con 1 ml de ddH2O estéril; girar hacia abajo como antes y desechar el sobrenadante.
    4. Repita el paso anterior para reducir los restos bacterianos restantes.
    5. Resuspender el contenido de cada tubo en 1 mL de ddH2O estéril. Añadir a cada tubo 130 μL de lejía comercial (hipoclorito de sodio al 8,25%) y 130 μL de hidróxido de sodio 5 N (NaOH, concentración final 0,5 N).
    6. Tubos de vórtice vigorosamente durante al menos 10-15 s cada 2 minutos hasta que los cuerpos adultos se hayan roto. No permita que el tratamiento con lejía-NaOH dure más de 5 minutos para evitar matar los huevos.
    7. Girar en una minicentrífuga durante 30-60 s a 2.000 x g para granular los huevos. Pipetee el sobrenadante y deseche. Puede haber o no un pellet visible, esto es normal.
    8. Agregue 1 ml de tampón de gusano M9 y gire durante 30-60 s a 2000 x g. Deseche el sobrenadante.
    9. Repita el paso de enjuague (1.2.8) 5 veces para eliminar completamente la mezcla de lejía-NaOH, eliminando la mayor cantidad posible del sobrenadante sin molestar la bolita de huevo.
    10. Transfiera los huevos a 10 ml de tampón de gusano M9 en un tubo cónico de 50 ml o un tubo de cultivo de 30 ml con tapa. Si usa tubos cónicos, deje la tapa desenroscada ligeramente y use un poco de cinta adhesiva para mantenerla segura. Incubar con agitación durante la noche (16 h) a 25 °C y 200 RPM para permitir que las larvas eclosionen.
  3. Transfiera las larvas L1 sincronizadas a las placas de ARNi para crecer hasta la edad adulta.
    1. Agregue 2 ml de tampón M9 estéril + 0.01% Triton X-100 (en adelante M9TX-01) a cada tubo L1 y transfiera todo el volumen (12 ml) a un tubo cónico de 15 ml con tapa de rosca.
    2. Coloque tubos de 15 ml con gusanos L1 a 4 °C durante 10 minutos para ralentizar el movimiento larvario.
    3. Gire hacia abajo 15 ml de tubos cónicos en una centrífuga de mesa grande (1.500 x g a 4 °C durante 3 min; la aceleración y desaceleración no deben ser superiores al 80% del máximo).
    4. Pipete con cuidado el sobrenadante sin molestar el pellet L1. Deseche el sobrenadante.
    5. Añadir 12 ml de M9TX-01 frío a cada tubo. Repita la centrifugación. Retire con cuidado la pipeta y deseche el sobrenadante. Cada tubo debe tener ~200 μL restantes.
    6. Enjuague una punta de pipeta de 200 μL en M9TX-01 para evitar que los gusanos se peguen al plástico, luego use esta punta para volver a suspender el pellet de gusano. Transfiera los gusanos resuspendidos a las placas pos-1 preparadas mediante el pipeteo de gotas de líquido en el césped bacteriano.
    7. Incubar las placas a 25 °C hasta el primer día de la edad adulta.
      NOTA: Si crecen gusanos en placas de ARNi pos-1 , los gusanos DEBEN alimentarse ad libitum de la bacteria ARNi hasta que hayan pasado completamente a la edad adulta para garantizar una alta penetrancia del fenotipo embrionario-letal. Revisa las placas a las 24 y 48 h. Si las placas parecen hambrientas o casi hambrientas, los gusanos deberán trasladarse a platos frescos para terminar de crecer en adultos de tamaño completo. Para evitar el agotamiento de las placas antes de que crezcan los gusanos, trate de agregar 250-500 larvas L1 a cada placa de ARNi de 10 cm.
  4. Cosecha adultos y elimina la E. coli intestinal para crear gusanos libres de gérmenes.
    1. Enjuague los gusanos adultos de las placas con 5 ml de M9TX-01 por placa. Transfiera el tampón + gusanos a un tubo cónico de 15 ml y permita que los adultos se asienten en el fondo del tubo.
    2. Enjuague a los adultos en cambios de 10 ml de tampón M9TX-01 fresco hasta que no quede turbidez bacteriana visible (típicamente 1-2x). Los tubos se pueden centrifugar a 700 x g durante 30 s para gletear gusanos, o se puede permitir que los adultos se asienten por gravedad.
    3. Realice un lavado adicional con 10 ml de M9TX-01 para reducir las bacterias externas.
    4. Transfiera gusanos a tubos cónicos de 50 ml o tubos de cultivo de 30 ml que contengan 5 ml de medio S + 2 veces E. coli OP50 muerta por calor (~5 x 109 células muertas/ml) + 200 μg/ml de gentamicina + 50 μg/ml de cloranfenicol. Si usa tubos cónicos, deje la tapa desenroscada ligeramente y use un poco de cinta adhesiva para mantenerla segura. Use pipetas de vidrio o enjuague pipetas de plástico en M9TX-01 para evitar que los gusanos se peguen.
    5. Incubar adultos a 25 °C con agitación a 200 RPM durante 24-48 h para producir adultos libres de gérmenes.
      NOTA: Si los gusanos van a permanecer en antibióticos durante >24 h, es posible que se deba agregar más OP50 muerto por calor para garantizar que los gusanos tengan una fuente de alimento adecuada. Revise los tubos a las 24 h y complemente con OP50 muerto por calor si la turbidez se reduce visiblemente.
  5. La lave con sacarosa a los adultos de acuerdo con los protocolos24 del libro de gusanos para obtener existencias limpias, reproductivamente estériles y sincronizadas solo para adultos para la colonización bacteriana.
    1. Asegúrese de que los volúmenes fríos de sacarosa al 60%, tampón de gusano M9 y M9TX-01 estén listos para el uso. Para simplificar, estos se pueden dejar a 4 ° C la noche anterior.
    2. Para cada muestra a lavar, cree un tubo cónico etiquetado de 15 ml que contenga 8 ml de M9TX-01 y cuéntelo sobre hielo. Estos serán necesarios en el paso 1.5.10.
    3. Agregue 5 ml de M9TX-01 a cada tubo de 50 ml que contenga larvas de L1. Transfiera todo el volumen (ahora 10 ml) a un tubo cónico de 15 ml de rosca vacío y permita que los adultos se asienten en la parte inferior del tubo.
    4. Pipetee con cuidado el sobrenadante y deseche.
    5. Agregue 10 ml M9TX-01 a cada tubo y mueva los tubos a un cubo de hielo durante 5-10 minutos.
      NOTA: A partir de este punto, los gusanos y todos los tampones deben mantenerse en hielo.
    6. Utilice el ajuste de "temperatura rápida" para enfriar una centrífuga de mesa grande a 4 °C.
    7. Agregue 10 ml de M9TX-01 frío a cada tubo para enjuagar cualquier residuo restante. Deje que los gusanos se asienten en el hielo; retire el sobrenadante y deseche.
    8. Flotador de sacarosa: Agregue 5 ml de tampón frío M9 y 5 ml de solución fría de sacarosa al 60% a cada tubo, mezclando bien. Luego, flote cuidadosamente 1 ml de tampón frío M9 sobre la mezcla de tampón de sacarosa en cada tubo. No mezcle después de que se haya agregado el flotador.
      PRECAUCIÓN: Muévase rápidamente durante los siguientes pasos: ¡los gusanos pueden desecar si se exponen a altas concentraciones de sacarosa durante demasiado tiempo!
    9. Centrifugadora a 1500 x g durante 3 min a 4 °C. Los gusanos adultos vivos estarán en la interfaz del M9 y la sacarosa, aproximadamente a 1 ml de la parte superior del tubo.
    10. Utilice una pipeta serológica de vidrio de 5 ml para transferir la capa de gusano a tubos cónicos preparados de 15 ml con M9TX-01 frío (a partir del paso 1.5.2). Tenga mucho cuidado de obtener la capa de gusanos vivos sin pipetear demasiado de la sacarosa.
    11. Si es necesario, agregue M9TX-01 para obtener volúmenes iguales de 10-12 ml / tubo. Centrifugar a 1500 x g a 4 °C durante 1 min, luego pipetear el sobrenadante. Los gusanos se pueden devolver a temperatura ambiente en este punto.
    12. Repita el paso de lavado 1.5.11 dos veces, reduciendo la velocidad a 700 x g a 4 °C y el tiempo a 30 s.

2. Alimentación de gusanos con bacterias vivas en cultivo líquido

NOTA: Este protocolo se utiliza para colonizar gusanos con bacterias cultivadas en laboratorio en condiciones bien mezcladas en cultivo líquido (Figura suplementaria 1). Los gusanos pueden colonizarse con aislados individuales de cultivo puro (por ejemplo, patógenos como Enterococcus faecium28,29) o mezclas de aislados (por ejemplo, comunidades mínimas de microbioma14).

  1. Comience con gusanos adultos sincronizados lavados con sacarosa del paso de protocolo 1.5 en un tubo cónico de 15 ml. Lave los gusanos una vez en 12 ml de tampón S y deseche el sobrenadante.
  2. Resuspend los gusanos lavados en el volumen de medio S necesario para el experimento. Considere el volumen de condiciones experimentales, el número de condiciones sobre las cuales se dividirán los gusanos y las concentraciones finales de gusanos y bacterias.
    NOTA: La alimentación en gusanos varía con la disponibilidad bacteriana30 y los gusanos pueden estresarse por aglomeración31. Para la colonización en cultivo líquido, se recomiendan <1000 gusanos/ml y >107 UFC/ml; 1011 UFC/ml se considera densidad de alimentación "ad libitum" en E. coli32.
  3. Spin down cultivos bacterianos. Vierta el sobrenadante; la aspiración o el pipeteo se pueden usar para eliminar el sobrenadante para las bacterias que forman gránulos sueltos.
    NOTA: Para cultivos >5 ml, transfiera a tubos de 15 ml y gire a ~ 2800 x g en una centrífuga de mesa grande durante 8-10 minutos. Los cultivos <5 ml se pueden transferir a tubos de 1,5 ml y centrifugar a 9000 x g durante 1-2 min en una pequeña centrífuga de mesa. Las bacterias altamente móviles (por ejemplo, muchas especies de Pseudomonas) pueden necesitar enfriarse a 4 ° C durante 10-15 minutos para facilitar la formación de un gránulo estable, y puede ser mejor centrifugar a 4 ° C.
  4. Resuspendir cultivos bacterianos en un volumen de tampón S y centrifugar de nuevo a pellet. Retire y deseche el sobrenadante como antes.
  5. Resuspend cultivos bacterianos en medio S a la densidad deseada para el experimento, más cualquier antibiótico para la selección. Los antibióticos a utilizar, si los hubiera, dependerán del perfil de resistencia de las bacterias utilizadas para la colonización.
  6. Usando una punta de pipeta recubierta en M9TX-01, los gusanos de pipeta suben y bajan suavemente hasta que los gusanos se resuspenden completamente en medio S, luego se transfieren a tubos o pozos de placa para la colonización bacteriana.
  7. Agregue suspensión bacteriana a cada cultivo de gusanos para alcanzar la concentración bacteriana deseada y el volumen final.
  8. Si utiliza una placa de varios pocillos para la colonización, cubra la placa con una membrana de sellado estéril permeable al gas de 96 pocillos.
  9. Incubar con agitación a 200 RPM para evitar que las bacterias se asienten durante la incubación.

3. Interrupción mecánica de gusanos individuales en un formato de 96 pocillos

NOTA: Esta sección describe un protocolo de formato de placa de 96 pocillos para la interrupción mecánica de C. elegans colonizada bacterianamente individual. Los primeros pasos en el protocolo (3.1-3.8) describen un método para purgar las bacterias no adheridas del intestino del gusano y limpiar el exterior de los gusanos mediante parálisis fría y blanqueamiento de la superficie. Estos pasos producirán gusanos adultos limpios y vivos que pueden interrumpirse mecánicamente para cuantificar el contenido bacteriano (extremo 3.8) o usarse para experimentos adicionales (Figura suplementaria 1). Este protocolo se puede adaptar para cuantificar bacterias en gusanos colonizados en cultivo líquido (Sección 2), en placas de agar, o de suelo natural o microcosmos.

  1. Coloque una alícuota de M9TX-01 sobre hielo para enfriar (4-5 veces el número de muestras en ml).
  2. Preparar una alícuota de M9TX-01 + lejía (hipoclorito de sodio al 6%, 1:1000 o 1:2000 v/v, 1 mL por muestra + 1 mL extra) y colocar sobre hielo para enfriar. Esta alícuota se utilizará en el paso 3.8.
  3. Prepare placas de 96 pocillos para la dilución en serie de muestras de gusanos interrumpidos.
    1. Obtener placas estériles de 300 μL de capacidad de 96 pocillos con tapas; este protocolo utiliza una placa de dilución por cada 12 gusanos digeridos.
    2. Utilice un pipeteador multicanal de 96 pocillos para llenar las filas B-D de cada placa de 96 pocillos (capacidad de 300 μL) con 180 μL de búfer PBS 1x. Deje la fila superior vacía. Las filas B-D se convertirán en diluciones en serie 10x de los resúmenes del gusano [0.1x, 0.01x, 0.01x].
    3. Deja los platos a un lado. Las placas de dilución se utilizarán en el paso 3.13.
  4. Resuspender cada muestra de gusano en 1 mL de M9TX-01 en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL.
  5. Girar tubos brevemente (2-3 s) en una minicentrífuga de baja velocidad (2.000 x g) a 25 °C a adultos gletizados. Retire la pipeta del sobrenadante y deseche, asegurándose de no molestar la bolita del gusano.
  6. Usando la configuración de centrifugación en el paso 3.5, enjuague los gusanos dos veces con 1 ml de M9TX-01, luego una vez con 1 ml de tampón de gusanos M9, para reducir las bacterias externas.
  7. Purgue las bacterias no adheridas del intestino del gusano.
    1. Resuspender cada muestra de gusanos en 1 mL de medio S + 2x OP50 muerto por calor en un tubo de cultivo.
    2. Incubar a 25 °C durante 20-30 min para permitir el paso de cualquier bacteria no adherida desde el intestino.
      NOTA: Esto también purgará cualquier proteína fluorescente extracelular de la luz y permitirá una visualización más clara de las bacterias marcadas adheridas al epitelio intestinal, particularmente cuando se utilizan fluoróforos ácido-resistentes (por ejemplo, mCherry, dsRed).
  8. Gusanos blanqueadores superficiales para eliminar las bacterias externas.
    1. Enjuague los gusanos purgados dos veces con 1 ml de M9TX-01 frío y deseche el sobrenadante.
    2. Deje que los tubos se enfríen durante 10 minutos sobre hielo (preferiblemente) o a 4 °C. Esto paralizará los gusanos y evitará la ingestión de lejía.
      NOTA: Otros protocolos utilizan un agente químico de parálisis como el levamisol; se trata de un enfoque establecido33 que requiere la adición de un flujo de residuos peligrosos.
    3. Agregue 1 ml de tampón de gusano M9 helado + lejía sin perfume (hidróxido de sodio al 8.25%, 1: 1000 o 1: 2000 v / v) a cada tubo. Permita que los tubos se asienten sobre hielo (preferiblemente) o a 4 ° C durante al menos 10 minutos para matar las bacterias externas.
      NOTA: No exceda la concentración de lejía de 1:1000. Incluso en gusanos paralizados, la mortalidad puede resultar.
    4. Pipete el tampón de lejía y deseche; devolver los tubos al hielo para garantizar que los gusanos no reanuden el bombeo hasta que se elimine la lejía.
    5. Añadir 1 ml de M9TX-01 frío a cada tubo. Girar durante ~5 s en una minicentrífuga (2.000 x g a 25 °C); devolver los tubos al hielo. Retire el sobrenadante y deseche.
    6. Repita este paso de enjuague con otro 1 ml de M9TX-01 frío, desechando la mayor cantidad posible del sobrenadante.
      NOTA: Si usa gusanos para experimentos adicionales, omita el paso de permeabilización (Protocolo 3.9) y en su lugar transfiera adultos recién blanqueados de superficie a un tampón helado en una placa de Petri de 6 cm y separe los gusanos en condiciones experimentales como en el Protocolo 3.10. Mantenga a los gusanos fríos para evitar que la motilidad se reanude, pero trabaje rápidamente: mantener a los gusanos durante >30 minutos en hielo puede resultar en <100% de reanudación de la actividad normal34.
  9. Permeabilización química de la cutícula de gusanos con dodecil sulfato de sodio y ditiotritol (0,25% SDS + 300 mM TDT) (basado en35)
    PRECAUCIÓN: La TDT es un agente reductor e irritante. Use EPP y trabaje en una campana extractora de humos cuando manipule existencias o soluciones secas. Se requiere un flujo de residuos peligrosos.
    1. En la campana extractora, prepare suficiente solución SDS/TDT para permitir 100 μL para cada muestra. Para 1 ml, a 965 μL de tampón de gusano M9 o M9TX-01 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agregue 5 μL de SDS al 5% (p/v) y 30 μL de TDT de 1 M.
      NOTA: 1 M de solución de TDT (acuosa) debe prepararse fresca o almacenarse en alícuotas a -20 °C para garantizar la potencia. Las alícuotas deben dimensionarse para ser utilizadas en dos o tres experimentos para evitar ciclos excesivos de congelación y descongelación.
    2. Mueva los tubos de microcentrífuga que contienen gusanos blanqueados en la superficie a un estante de tubos a temperatura ambiente. Cada tubo debe contener gusanos en ~20 μL de tampón.
    3. Añadir 100 μL de solución SDS/TDT a cada muestra de gusano. Deseche cualquier solución SDS/TDT restante en el flujo de residuos peligrosos apropiado.
    4. Deje que el tratamiento continúe durante hasta 8 minutos en el banco para descomponer parcialmente la cutícula resistente de los gusanos adultos. Los gusanos morirán y se asentarán en el fondo del tubo durante este tiempo.
    5. Una vez finalizado el tiempo de permeabilización, pipetee cuidadosamente el sobrenadante SDS/TDT y deséchelo en un flujo de residuos peligrosos SDS/TDT adecuado.
    6. Agregue 1 ml de M9TX-01 a cada tubo. Gire brevemente en una centrífuga de mesa para peletizar los gusanos o permita que los gusanos se asienten por gravedad en la parte inferior de los tubos, luego extraiga el sobrenadante y deséchelo en un flujo de desechos peligrosos SDS / TDT.
    7. Resuspend gusanos en tampón de gusano m9 M9 + 0.1% Triton X-100 hasta que estén listos para usar.
  10. Separe los gusanos en una placa profunda de 96 pocillos con grano de carburo de silicio para interrupciones mecánicas. Prepare la placa de interrupción de 96 pocillos como se indica a continuación.
    1. Obtenga una placa estéril de 2 ml de pozo profundo de 96 pocillos y una cubierta de placa de silicio de 96 pocillos a juego.
      NOTA: Es importante utilizar placas que sean compatibles con los adaptadores de 96 pocillos para el disruptor tisular. Pequeñas diferencias en las dimensiones externas hacen la diferencia entre una placa que se puede quitar de los adaptadores y una que no puede.
    2. Usando una espátula de cuchara estéril, agregue una pequeña cantidad de carburo de silicio estéril de 36 granos a cada pocillo de la placa que recibirá un gusano. Use suficiente arena para cubrir apenas el fondo del pozo (aproximadamente 0,2 g por pozo). El exceso de material dificultará la obtención de una punta de pipeta en el fondo del pozo al recuperar el contenido.
    3. Agregue 180 μL de tampón de gusano M9 a cada pozo.
    4. Etiquete las columnas o filas para indicar a dónde irá cada muestra, luego cubra la placa libremente con la cubierta de la placa de silicio de 96 pocillos.
  11. Transfiera gusanos individuales a la placa de 96 pocillos para detectar interrupciones.
    1. Mueva los gusanos permeabilizados con cuidado a una placa de Petri pequeña (35 o 60 mm) que contenga suficiente M9TX-01 para llenar el plato a una profundidad de ~ 1 cm.
      NOTA: Si hay una gran cantidad de gusanos presentes, es posible que no sea factible transferir toda la muestra, ya que el líquido se llenará y será difícil pipetear gusanos individuales.
    2. Usando un microscopio de disección u otro dispositivo de bajo aumento, pipetee gusanos individuales en volúmenes de 20 μL y transfiera estos gusanos a pozos individuales de la placa de 96 pocillos.
      NOTA: Es mejor cosechar solo gusanos recién muertos. Evite los gusanos con una forma lineal rígida, ya que estos gusanos pueden haber estado muertos durante algún tiempo. Trate de tomar gusanos que sean curvos o en forma de S, con fisiología gruesa normal y un intestino intacto.
    3. Después de transferir cada volumen, asegúrese de que el gusano seleccionado haya sido realmente expulsado al pozo. Para hacer esto, pipetee hasta 20 μL de M9TX-01 desde un área clara de la placa de Petri y suelte el volumen completo de nuevo en el plato; esto normalmente expulsará el gusano si está pegado a la pipeta. Si el gusano estaba atascado, retire 20 μL del pozo e intente la transferencia nuevamente.
    4. Una vez que se hayan transferido todos los gusanos, cubra la placa de 96 pocillos con una hoja de película de sellado flexible con respaldo de papel disponible en el mercado (2 x 2 cuadrados), asegurándose de que el lado con respaldo de papel de la película de sellado esté orientado hacia abajo en los pozos de muestra. Tenga cuidado de no estirar la película de sellado demasiado delgada, o será muy difícil de quitar más tarde.
    5. Coloque la alfombra de sellado de silicio ligeramente encima de la película de sellado flexible; no presione la cubierta hacia abajo en los pozos en este momento.
    6. Mueva la placa a 4 °C para enfriar durante 30-60 min. Esto evitará el sobrecalentamiento durante la interrupción, lo que puede dañar las muestras.
      NOTA: Este es un punto de interrupción en el protocolo. En la mayoría de los casos, la placa se puede dejar a 4 ° C durante un máximo de 4 h antes de la molienda. No deje los gusanos durante la noche, ya que esto cambiará los recuentos bacterianos.
  12. Cargue placas de 96 pocillos en un disruptor tisular para romper los tejidos del gusano y liberar bacterias intestinales.
    NOTA: (Opcional) Si se utiliza un número impar de placas de 96 pocillos para los resúmenes, es necesario preparar un contrapeso antes de continuar. Use una placa vacía profunda de 96 pocillos y llene los pozos con agua hasta que pese lo mismo que la primera placa.
    1. Presione la alfombra de sellado de silicio firmemente hacia abajo en los pozos para crear un sello, asegurándose de que la tapa se encuentre plana en toda la superficie de la placa.
      NOTA: Si la película de sellado flexible es demasiado gruesa después del estiramiento, será difícil asegurar la tapa de silicio de tal manera que quede plana en todos los pozos. Esto resultará en un sello insuficiente y contaminación de pozo a pozo durante el temblor.
    2. Asegure las placas en el disruptor de tejido utilizando los adaptadores de placa de 96 pocillos. Agite las placas durante 1 minuto a 30 Hz, luego gire las placas 180 ° y agite nuevamente durante 1 min. Esto ayudará a garantizar una interrupción uniforme en todos los pozos de la placa.
    3. Golpee las placas firmemente en el banco dos o tres veces para desalojar cualquier grano de la película de sellado flexible.
    4. Usando una centrífuga grande con dos adaptadores de placa de 96 pocillos, haga girar las placas hacia abajo a 2400 x g durante 2 minutos para reunir todo el material en el fondo de los pozos.
    5. Retire la tapa de silicio y retire con cuidado la película de sellado flexible.
      NOTA: Si la película de sellado flexible se adhiere a cualquiera de los pozos, use una punta de pipeta de 200 μL para retirarla. Esto es común cuando la película de sellado flexible se estiró demasiado delgada.
  13. Diluya en serie las muestras de digestión del gusano en 300 μL en placas de 96 pocillos.
    1. Usando un pipettor de múltiples pocillos ajustado a 200 μL, pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces lenta y cuidadosamente para volver a mezclar el contenido de los pozos, luego extraiga la mayor cantidad de líquido posible. Transfiera este líquido a las filas superiores de las placas de 96 pocillos preparadas en el paso 3.3.
    2. Usando un pipeteador de 96 pocillos ajustado a 20 μL, retire este volumen de líquido de la fila superior y suministre en la fila B. Pipete hacia arriba y hacia abajo 8-10x para mezclar. Descarte los consejos.
    3. Repita el paso 3.13.2, a partir de las muestras 0.1x de la fila B para crear muestras de dilución 0.01x en la fila C.
    4. Repita de nuevo el paso 3.13.2, pasando de la fila C a la fila D.
    5. Placa sobre agar sólido para cuantificación bacteriana. Para los gusanos monocolonizados, generalmente es suficiente colocar gotas de 10-20 μL de cada dilución [1x-0.001x] en placas de agar. Para la colonización multiespecie, placa cada dilución por separado mediante pipeteo de 100 μL sobre una placa de agar de 10 cm; extender inmediatamente usando cuentas de revestimiento de vidrio.

4. Limpieza de la arena de carburo de silicio para su reutilización

NOTA: Este procedimiento se utiliza para limpiar y esterilizar el material de molienda, la arena de carburo de silicio, para su reutilización después de los experimentos. Este protocolo debe seguirse en su totalidad antes del primer uso, ya que la arena de carburo de silicio es un producto industrial y no viene preesterilizada. La arena de carburo de Si (3,2 g / cc) es un material denso y de bordes ásperos que funciona de manera eficiente para interrumpir muestras difíciles. Sin embargo, las partículas pueden desgastarse con el uso repetido y deben reemplazarse cuando el desgaste se hace evidente. Afortunadamente, el material es barato, y los tamaños que normalmente se venden (~ 1 lb) son suficientes para muchos experimentos.

  1. Después de retirar las muestras para el emplatado, agregue una solución de lejía al 10% a todos los pocillos de la placa de 96 pocillos y deje reposar durante al menos 10 minutos.
  2. Retire la mayor parte de la arena invirtiendo rápidamente la placa de 96 pocillos sobre una pequeña bandeja de lados altos o un recipiente vacío de punta de pipeta P1000 lo suficientemente grande como para atrapar todo el contenido. La arena se hundirá inmediatamente en el fondo de la bandeja. Vierta la solución de lejía en un fregadero.
  3. Vuelva a llenar la placa de 96 pocillos con agua del grifo e invierta en la misma bandeja para enjuagar la arena restante. Vierta el agua en el fregadero.
  4. Repita de una a tres veces más con agua del grifo hasta que el plato esté completamente libre de arena.
  5. Enjuague la arena 2x en agua del grifo, llenando la bandeja cada vez.
    NOTA: La placa de pozo profundo de 96 pocillos se puede lavar en un lavavajillas de laboratorio, cubrirse de forma segura con papel de aluminio y esterilizarse en autoclave con otros plásticos reutilizables. La arena no necesita lavarse inmediatamente y se puede reservar en este punto. La arena usada generalmente se acumula de múltiples experimentos antes del lavado y el autoclave.
  6. Lave la arena en una solución de detergente de laboratorio durante 30 minutos, agitando ocasionalmente girando o mezclándola con una espátula de metal.
  7. Enjuague todos los rastros de detergente en varios (8-10) cambios de agua del grifo, luego enjuague 2x con agua destilada.
  8. Extienda la arena en una bandeja abierta, como una bandeja de autoclave de polipropileno poco profunda, y séquela a 40-70 ° C durante varias horas.
    NOTA: Si la arena es grumosa cuando está seca, no se limpió ni se enjuagó lo suficiente. Repita el protocolo de limpieza a partir del paso 4.6, agregando enjuagues adicionales en el paso 4.7.
  9. Distribuya arena limpia y seca en botellas de vidrio autoclavables con tapa de rosca a una profundidad máxima de 5-6 cm. Autoclave en ciclo de pre-vacío durante 30 min para esterilizar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Esterilización con lejía de gusanos vivos
Los gusanos blanqueados superficialmente están efectivamente libres de bacterias externas hasta que la motilidad regresa y se reanuda la excreción. En las condiciones utilizadas aquí, se observa una rápida extinción de bacterias en el tampón (Figura 1A-C, Figura suplementaria 2, Video 1) sin perturbar las bacterias asociadas al intestino en gusanos paralizados por el frío (Figura 1D-F, Video 2). Estos datos indican que el blanqueamiento de la superficie se puede utilizar de manera efectiva para desinfectar los gusanos externamente sin comprometer el contenido intestinal (las comparaciones de los recuentos de UFC asociadas a gusanos blanqueados en la superficie frente a los no blanqueadores no son significativas, la prueba de suma de rangos de Wilcoxon p > 0.05).

Variaciones en la disrupción mecánica de múltiples muestras
La técnica de 96 pocillos para la interrupción mecánica de gusanos es robusta a los materiales específicos utilizados, y las consideraciones prácticas dictan la elección del material de molienda. Al igual que en un informe anterior33, la interrupción manual (Figura 2A) dio lugar a más heterogeneidad que el protocolo estándar de 96 pocillos (grano de carburo de silicio, Figura 2B) (var(log10UFC) = 0,499) en todas las condiciones tampón, en comparación con 0,229 para el carburo de Si, 0,243 para las perlas de vidrio grandes (Figura 2C) y 0,227 para las perlas de vidrio pequeñas (Figura 2D) ). No obstante, la mayoría de las diferencias en las distribuciones ufc/gusano no fueron significativas (Kruskal-Wallace, p = 0,017 con df = 3; pruebas significativas post-hoc de Wilcoxon para cuentas grandes vs. cuentas pequeñas, p = 0,021, y perlas grandes vs. grano de carburo de silicio, p = 0,02). El uso de Triton X-100 como surfactante no se asoció con ninguna diferencia significativa en el rendimiento cuando se consideró como un factor individual (Kruskal-Wallace, p = 0.94, df = 3), aunque hay un aumento aparente en el rendimiento en muestras sin Tritón vs. que contienen Tritón cuando se utilizaron perlas grandes (2,7 mm) (Figura 2C), posiblemente atribuible a la excesiva "espuma" observada en estos pozos cuando Tritón estaba presente. Estos resultados indican que las grandes perlas de vidrio, aunque son ideales para su uso en tubos de homogeneización33, no son adecuadas para la técnica de 96 pocillos. Si bien las pequeñas perlas de vidrio produjeron resultados razonables (Figura 2D), obstruyeron constantemente las puntas de pipeta de 200 μL durante la mezcla y el revestimiento. El material estándar en este ensayo, la arena de carburo de silicio, es barato, demasiado grande para obstruir las puntas estándar, y al igual que las perlas de vidrio se pueden lavar y reutilizar después del autoclave. La arena libera una pequeña cantidad de "polvo" en el tampón, que no interfiere con el recubrimiento, pero debe filtrarse si los productos de la interrupción se van a utilizar para la citometría de flujo.

Heterogeneidad en la colonización bacteriana en gusanos adultos
La interrupción exitosa de gusanos individuales revela heterogeneidad en la colonización bacteriana. Los individuos de poblaciones isogénicas sincronizadas de gusanos, colonizados al mismo tiempo en el mismo grupo de bacterias, muestran consistentemente un rango de 100 veces o más en la carga bacteriana intestinal. Esto se observa para diferentes colonos bacterianos (Figura 3A) y durante la colonización en comunidades bacterianas de múltiples especies (Figura 3B). Esta heterogeneidad también es evidente en las mediciones de fluorescencia de gusanos individuales cuando los gusanos son colonizados con bacterias que expresan una proteína fluorescente (GFP) (Figura 3C-D). Las propiedades del huésped juegan un papel en la configuración de esta heterogeneidad, como se puede ver al comparar la colonización de gusanos Bristol N2 de tipo salvaje con la colonización por la misma bacteria en mutantes DAF-2 / IGF; este mutante daf-16 soporta poblaciones más grandes de muchas bacterias en comparación con N2, mientras que daf-2 es resistente a la colonización por un rango de bacterias36 (Figura 3B, D). Esta heterogeneidad es característica, mostrando variación entre diferentes combinaciones de huésped y colono(es), al tiempo que conserva una estructura consistente en diferentes ejecuciones del mismo experimento (Figura 3E-F).

Importancia de la heterogeneidad individual para una comparación precisa de los grupos
La importancia de la heterogeneidad individual se puede ver fácilmente al considerar cómo los resúmenes de lotes podrían alterar las distribuciones de los datos. Colonización por bacterias nativas del microbioma MYb53 (Rhodococcus erythropolis) y MYb120 (Chryseobacteria spp.) (Figura 3A, 4A) en N2 adultos se utilizan como ejemplos. Los datos individuales del gusano son claramente similares en distribución (prueba t de dos colas, p = 0,9, suma de rango de Wilcoxon, p = 0,59). Al volver a muestrear estos datos para simular los efectos de los resúmenes de lotes, la UFC/gusano extrapolado por lotes tira hacia los cuantiles superiores de los datos debido al sesgo positivo en estas distribuciones (media > mediana). Como el procesamiento por lotes promedia efectivamente sobre los individuos dentro de un lote, la UFC/ gusano extrapolado por lotes se centrará alrededor de la media aritmética de los datos individuales, con una distancia decreciente a esta media a medida que los lotes se vuelven grandes de acuerdo con el teorema del límite central (Figura 4B-D). En consecuencia, la señal de la variación biológica se pierde rápidamente; Las mediciones de UFC/gusano inferidas por lotes convergen hacia el promedio, que no es una métrica representativa de estos datos distribuidos a escala logarítmica. Las diferencias en la colonización inferida por MYb53 vs. MYb120 rápidamente se vuelven significativas en los resúmenes de lotes simulados (lote de prueba t 5, p = 0.049; lote 10, p = 2.27e-4; lote 20, p = 1.19e-15; Lote de prueba de suma de rango de Wilcoxon 5, p = 2.27e-4; lote 10, p = 2.70e-06; lote 20, p = 1.80e-09) ya que la señal original está oscurecida.

Efectos de la heterogeneidad individual en la transmisión microbiana
Como los gusanos individuales muestran una heterogeneidad sustancial en la colonización bacteriana, es razonable preguntarse si esta heterogeneidad tiene efectos posteriores. Por ejemplo, es razonable esperar que la transmisión pueda ser una función de la carga bacteriana intestinal. Al transferir gusanos blanqueados de superficie individuales a un ambiente limpio, es posible observar la inoculación del ambiente con bacterias vivas excretadas. En estos experimentos, a los adultos precolonizados blanqueados en la superficie, portadores de poblaciones generalmente sustanciales (103-10 5 UFC/gusano, Figura 5) de Ochrobactrum comensal MYb14-GFP o S. aureus-GFP patógeno, se les permitió vagar en céspedes OP50 muertos por calor en agar NGM durante 1,5 h. Cuando estos gusanos se vuelven a cosechar de las placas de excreción y se interrumpen para la cuantificación bacteriana, no existe una relación significativa entre la carga bacteriana y la tasa de excreción de bacterias vivas (correlaciones de Pearson entre colonias transformadas en logaribo/hr y UFC/gusano: MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9) (Figura 5). Tampoco existe una relación significativa entre la presencia/ausencia de colonias en una placa y la carga bacteriana intestinal (regresión logística binomial con UFC/gusano transformado logarítmicamente como factor: p = 0,15 con df = 53). Una fracción sustancial de placas permaneció libre de nuevo crecimiento (placas 9/18 para MYb14, placas 10/36 para S. aureus), lo que indica bajas tasas de excreción general.

Cuando se permite que los gusanos excreten en placas de agar, el número real de bacterias vivas excretadas por gusano se confunde con la "agricultura", donde los gusanos pasan a través de colonias y crean rastros de nuevo crecimiento (Figura 6)37. Una placa con n colonias representa al menos uno, y a lo sumo n, eventos donde se excretaron bacterias formadoras de colonias vivas. A partir de esta observación, no es posible saber cuántos eventos de excreción en (1,n) ocurrieron realmente, ni es posible saber cuántas bacterias se excretaron en cada evento. Por lo tanto, no es posible estimar con precisión las tasas de excreción de bacterias vivas del intestino utilizando estos datos. Sin embargo, es posible inferir algunos límites. Aunque el número de colonias por placa no es muy informativo, los datos de presencia / ausencia se pueden utilizar para la inferencia aproximada de las tasas de excreción. Para simplificar, si se asume que la tasa de excreción de bacterias vivas no es una función de la carga bacteriana y que la excreción es un proceso de Poisson, hay una probabilidad de ~ 50% de observar al menos nueve eventos en 18 ensayos cuando λ ≈ 0.33 gusano-1 hr-1 en MYb14. Para S. aureus, se obtienen tasas plausibles similares de λ ≈ 0.2 gusano-1 hr-1 . Si bien estos cálculos aproximados sugieren bajas tasas de excreción de bacterias vivas, será necesaria una cuantificación más precisa de este proceso sobre un mayor número de gusanos individuales para obtener estimaciones confiables.

Disponibilidad de datos:
Los datos que se muestran aquí están disponibles en Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2).

Figure 1
Figura 1. El tratamiento de blanqueamiento superficial de baja concentración mata rápidamente las bacterias en el tampón, pero no perturba las comunidades intestinales en gusanos paralizados por el frío. (A-C) UFC/ml bacteriana en tampón de gusano M9 durante el blanqueamiento superficial a tres concentraciones diferentes (1:1000, 1:2000, 1:5000 v/v; control sin blanquear para comparación), dirigida a (A) S. aureus Newman, (B) S. enterica LT2, o (C) E. coli OP50. Las muestras se tomaron en los puntos de tiempo indicados hasta 20 minutos después de la exposición y se lavaron dos veces con tampón estéril para evitar que la lejía matara las colonias en las placas. Los datos para la condición 1:1000 se desplazan ligeramente para que estos datos sean visibles en la gráfica. (D-F) Bacterias intestinales en gusanos N2 individuales (n = 24 gusanos por experimento, dos o tres ejecuciones independientes en días separados). Todas las comparaciones de los recuentos de UFC asociadas a gusanos blanqueadores superficiales y sin lejía no son significativas (prueba de suma de rango de Wilcoxon p > 0,05). Las líneas horizontales grises representan el umbral de detección, definido como la densidad (40 UFC/gusano) a la que la probabilidad de observar al menos una colonia es de ~ 60% cuando se enchapan alícuotas de 10 μL de volúmenes de 200 μL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. El protocolo de interrupción de 96 pocillos produce resultados consistentes y es robusto para la elección de materiales. Los gusanos adultos N2 colonizados con una sola especie bacteriana durante 48 h (P. mosselii) fueron blanqueados superficialmente y permeabilizados de acuerdo con los protocolos estándar, luego los gusanos individuales (n = 24 por condición) fueron alterados mecánicamente para el recubrimiento de UFC utilizando (A) interrupción manual en tubos individuales de 0.5 ml, usando un mortero motorizado o (B-D ) variaciones del protocolo de interrupción de 96 pocillos descrito detalladamente en el Protocolo. La interrupción se llevó a cabo en el tampón de gusano M9 que contenía concentraciones variables de Tritón X-100 (eje x, 0-0,1%, v / v) y uno de (B) carburo de silicio de 36 granos, (C) perlas de vidrio pequeñas (425-600 μm) o (D) perlas de vidrio grandes (2,7 mm). Para todas las gráficas, los datos mostrados son log10 (CFU/gusano), y cada punto es un gusano individual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Colonización bacteriana heterogénea del intestino de C. elegans. (A) Colonización de una sola especie de hermafroditas adultos N2 preparados como en Métodos. Las bacterias son cuatro especies de la colección de microbiomas de gusanos nativos MYb (Dirksen et al. 2016) (n = 24 gusanos, un experimento cada uno) y dos patógenos, Staphylococcus aureus MSSA Newman (SA) y Salmonella enterica LT2 (SE) (n = 96-144 gusanos en dos/tres experimentos independientes). La colonización por especies nativas de microbioma se evaluó después de una incubación de 48 h a 25 °C en medio S líquido + 108 UFC/ml de bacterias; la colonización por patógenos se evaluó después de la incubación en céspedes con agar gusano NGM durante 24 (SA) o 48 (SE) h a 25 °C. (A las 48 h, los gusanos en S. aureus han muerto en su mayoría). (B) Total de UFC/gusano en adultos N2, daf-16(mu86) y daf-2(e1370) colonizados durante 4 días en medios líquidos en un microbioma nativo mínimo de ocho especies (datos de Taylor y Vega, 2021)14. (C-D) Fluorescencia verde en gusanos individuales colonizados con bacterias que expresan GFP, observada por citometría de flujo de objetos grandes. En (C), las poblaciones sincronizadas de adultos N2 fueron colonizadas con OP50 (no fluorescente, n = 1908 gusanos adultos individuales), S. aureus (GFP, n = 968) o S. enterica (GFP, n = 1153) como se describe en (A); el control OP50 indica niveles típicos de autofluorescencia de canal verde en gusanos N2 adultos del día 3. En (D), poblaciones sincronizadas de N2 (n = 1165), daf-16(mu86) (n = 1180) y daf-2(e1370) (n = 2267) adultos fueron colonizados con Ochrobactrum comensal MYb14-GFP durante 2 días en placas como se describe en (A). (E-F) Variación diaria en la colonización por S. aureus (E) y S. enterica (F) (mismos datos que en el panel A y la Figura 1, n = 48 gusanos por experimento). El eje x indica el día del muestreo. Las líneas horizontales grises representan el umbral de detección, definido como la densidad a la que la probabilidad de observar al menos una colonia es de ~ 60% (40 UFC / gusano para la colonización de una sola especie y cuatro UFC / gusano para la colonización de múltiples especies, debido a diferentes volúmenes de recubrimiento de 10 μL y 100 μL respectivamente de 200 μL). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. El procesamiento por lotes borra la variación biológica en los datos sesgados a escala logarítmica. Los datos de UFC/gusano de la Figura 3 se volvieron a muestrear con reemplazo para crear n = 25 conjuntos replicados de datos simulados para cada tamaño de lote, donde el tamaño es el número de gusanos individuales por lote. UFC/gusano es la UFC total en cada lote simulado dividido sobre el número de gusanos por lote. En los datos brutos (panel A), el promedio de UFC/gusano para MYb53 es de 4450.8 (103.6), y para MYb120, 1398.3 (103.1); los números inferidos por lotes convergen a estos valores a medida que aumenta el tamaño del lote (B, cinco gusanos/lote; C, 10 gusanos/lote; D, 20 gusanos/lote), consistente con las expectativas del teorema del límite central. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. La excreción de bacterias vivas está mal correlacionada con la carga de UFC en el intestino de gusanos individuales. Aquí, los adultos N2 fueron colonizados alimentándose durante 1 o 2 días respectivamente en céspedes de S. aureus-GFP o MYb14-GFP. Los gusanos con fluorescencia GFP detectable (GFP total > 1,8 registros en citómetros de flujo de objetos grandes) se clasificaron de la población a granel, se blanquearon la superficie como se describe en Métodos y se transfirieron individualmente a placas OP50 NGM + muertas por calor. Las correlaciones de Pearson entre colonias transformadas logarítmicamente/h y UFC/gusano no son significativas (MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. La "agricultura" bacteriana oscurece el número de eventos de excreción en las placas de agar. Aquí hay dos placas con colonias MYb14-GFP de excrementos de gusanos. La primera placa (A) tiene evidencia clara de "cultivo" a lo largo de las trayectorias de los gusanos y parece representar al menos dos eventos de excreción separados basados en las diferencias en la expresión de GFP (visible como pigmentación amarillenta) a través de las colonias. Si bien la segunda placa (B) es más ambigua, no se puede descartar la agricultura en función de las posiciones de las colonias. En estos experimentos, los gusanos adultos N2 fueron precolonizados durante 48 h alimentándose de placas de agar que contenían céspedes de MYb14-GFP. Después de la colonización, los gusanos se prepararon y se blanquearon la superficie de acuerdo con los métodos, luego se transfirieron en alícuotas de 5 μL de tampón de gusano M9 + 0.1% Tritón X-100 a 6 cm NGM + placas OP50 muertas por calor (preparadas permitiendo que las manchas de 50 μL de OP50 concentradas muertas por calor se sequen en la superficie). A los gusanos se les permitió deambular durante 1,5 h a 25 ° C, luego se recogieron de las placas y se interrumpieron para el recubrimiento de UFC / gusano (interrupción manual en el tampón de 20 μL en tubos individuales de 0,5 ml, utilizando un mortero motorizado). Las placas se incubaron a 25 ° C durante 2 días antes de contar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1. Visualización de gusanos N2 colonizados con S. aureus fluorescente GFP sin blanqueamiento superficial. Un pequeño número de células fluorescentes en la cutícula entran y salen del foco a medida que la imagen pasa a través del cuerpo del gusano, y la colonización espacialmente heterogénea del intestino se hace visible a medida que el campo de visión se mueve desde la superficie corporal hacia el intestino. La imagen de la pila Z se tomó a un aumento de 20x en un microscopio fluorescente invertido. Las imágenes fluorescentes filtradas de campo brillante y GFP se superpusieron, y las imágenes a través de la pila Z se unieron, utilizando el software del proveedor. La imagen es de la misma diapositiva que en la Figura Suplementaria 2A. Haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo 2. Visualización de un gusano N2 colonizado con S. aureus fluorescente GFP con blanqueamiento superficial (1:1000 v/v durante 20 min). La colonización espacialmente heterogénea por bacterias fluorescentes es visible en el intestino de este individuo, y las bacterias se han infiltrado en los tejidos del cuerpo, lo que indica una infección avanzada. No hay bacterias visibles en la cutícula. La imagen de la pila Z se tomó a un aumento de 20x en un microscopio fluorescente invertido. Las imágenes fluorescentes filtradas de campo brillante y GFP se superpusieron, y las imágenes a través de la pila Z se unieron, utilizando el software del proveedor. La imagen es de la misma diapositiva que en la Figura Suplementaria 2B. Haga clic aquí para descargar este video.

Figura suplementaria 1. Visión general del Protocolo. Aquí, los gusanos adultos sincronizados son monocolonizados con bacterias rojas, blanqueados superficialmente y permeabilizados antes de la interrupción mecánica de gusanos individuales en un formato de 96 pocillos. Las bacterias liberadas del intestino se diluyen en series 10x para la cuantificación de UFC / gusano; las placas mostradas son típicas de la heterogeneidad observada. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2. Visualización de gusanos N2 colonizados con S. aureus fluorescente GFP con y sin blanqueamiento superficial (1:1000 v/v durante 20 min). (A) En la muestra sin blanquear, las bacterias externas son visibles a bajo aumento como áreas de fluorescencia verde no asociadas con gusanos o fragmentos del cuerpo del gusano. (B) En la muestra blanqueada superficialmente, la fluorescencia GFP está restringida al interior de los cuerpos de gusanos (un fragmento de cuerpo de gusano es visible a mitad de la imagen). Todas las imágenes se tomaron con un aumento de 4x en un microscopio fluorescente invertido. Las imágenes fluorescentes filtradas de campo brillante y GFP se superpusieron, y las imágenes de los campos de visión adyacentes se unieron, utilizando el software del proveedor. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: Recetas de búfer y solución. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aquí se presentan datos sobre las ventajas de la cuantificación de la carga bacteriana en C. elegans, junto con un protocolo de interrupción de 96 pocillos para permitir la adquisición rápida y consistente de grandes conjuntos de datos de este tipo. En comparación con los métodos existentes33, estos protocolos permiten una medición de mayor rendimiento de las comunidades microbianas intestinales en el gusano.

Este enfoque tiene el recubrimiento como un paso de limitación de velocidad y no es realmente de "alto rendimiento". La citometría de flujo de objetos grandes (Figura 3C, D) es un método útil de alto rendimiento para cuantificar bacterias marcadas fluorescentemente en gusanos individuales16, aunque el número de fluoróforos simultáneos es una limitación en comunidades de múltiples especies. Vincular la interrupción de placas de múltiples pocillos con la secuenciación comunitaria es otra forma de aumentar el rendimiento; sin embargo, el procedimiento de interrupción de 96 pocillos descrito aquí se optimizó específicamente para dejar intactas las células bacterianas. El análisis basado en la secuenciación, donde es deseable una lisis exhaustiva de las células, requerirá la adición de un paso de extracción de ácido nucleico o la modificación del protocolo de latido (Protocolo 3.10-3.11) para extraer el contenido celular en lugar de bacterias vivas. Los protocolos para la interrupción de un solo gusano y la extracción de ácidos nucleicos se han publicado en otros lugares38,39.

La abundancia total bacteriana en el intestino del gusano es heterogénea, y los datos que se muestran aquí sugieren que la medición basada en lotes puede producir resultados erróneos en comparaciones entre grupos. Sin embargo, otras medidas de las comunidades bacterianas en el gusano pueden ser menos sensibles a los efectos del procesamiento por lotes. Cabe destacar que las abundancias relativas en las comunidades asociadas a gusanos parecen variar muy poco, si es que lo hacen, con el tamaño total de la población intestinal, independientemente de si las interacciones entre microbios son neutrales40 o no14. Es plausible que, en comparación con los datos de conteo, las medidas de abundancia relativa sean menos susceptibles al problema de la tasa de falsos positivos descrito. Por lo tanto, el análisis comunitario basado en la secuenciación, que genera datos de abundancia relativa para la composición de la comunidad, puede no requerir la medición de gusanos individuales. Se necesita más investigación sobre este punto.

Aquí, utilizamos el tratamiento en frío para paralizar los gusanos para el blanqueamiento de la superficie. Otro trabajo ha encontrado que los gusanos reanudan la actividad normal rápidamente (<15 min) si el tiempo en hielo se mantiene por debajo de 30 min, lo que permite el uso inmediato en ensayos adicionales, en contraste con los agentes de parálisis química que pueden requerir períodos prolongados antes de la recuperación completa34. Si los gusanos deben interrumpirse inmediatamente para la cuantificación bacteriana, esta característica es prescindible, y la principal ventaja del enfriamiento frente a la parálisis química es evitar la necesidad de un flujo de desechos controlado. El tratamiento prolongado en frío debe usarse con precaución al investigar las respuestas al estrés, particularmente si hay una conexión conocida con la temperatura. Los protocolos de parálisis por frío descritos aquí implican una exposición aguda al frío más corta que la utilizada en experimentos para el estrés por frío (20-30 min vs 2+ h a 2-4°C)41,42,43, y un choque frío de 1 h no produce fenotipo aparente en gusanos de tipo salvaje 43. La incubación a corto plazo (90 min) a 4 °C induce cambios en la expresión génica de estrés frío (medida por la expresión de un reportero TMEM-135::GFP), pero la expresión vuelve a niveles no estresados en cuestión de minutos una vez que los gusanos vuelven a temperatura ambiente34. Sin embargo, los efectos sobre los genotipos de gusanos sensibles al estrés pueden ser más graves que en los de tipo salvaje. Este procedimiento debe validarse en las condiciones experimentales que se vayan a utilizar.

El protocolo de blanqueamiento de superficies descrito aquí se puede utilizar como una forma de limitar o eliminar el paso de microbios externos en experimentos. Este método también se ha utilizado para eliminar los contaminantes fúngicos mediante el blanqueamiento de la superficie y la transferencia de solo larvas L1 / L2 a placas frescas (la transferencia de adultos blanqueados en la superficie resultó en la falta de eliminación del contaminante, presumiblemente debido al transporte en los intestinos de los animales más grandes). Es de vital importancia asegurarse de que la concentración de lejía no exceda de 1: 1000 v / v, ya que se producirá daño a los gusanos y mortalidad. Este procedimiento puede ser útil en la evolución experimental huésped-microbio y las interacciones huésped-patógeno. Por ejemplo, la baja tasa de excreción de bacterias vivas observada aquí puede ayudar a explicar las tasas altamente variables observadas para la transmisión bacteriana de hermafroditas a la descendencia15. La falta de correlación entre la carga bacteriana intestinal y la tasa de excreción observada aquí es interesante, pero requiere más investigación; se necesitará un mayor número de puntos de datos en una variedad de condiciones para determinar dónde (o si) se mantendrá esta observación.

Puede que no siempre sea necesario limpiar los gusanos en la medida en que lo proporciona el blanqueamiento de la superficie. Es probable que los lavados múltiples en tampón estéril sean suficientes cuando los gusanos se colonizan internamente con un solo microbio si la UFC/gusano mínima esperada es mucho mayor (10-100 veces) que la concentración de bacterias en el sobrenadante tampón, ya que este arrastre afectará mínimamente los recuentos (ver Figura 1). Además, si el microbio (s) de interés coloniza principalmente la cutícula, se debe evitar claramente el blanqueamiento de la superficie. La limpieza a fondo es más importante para garantizar la precisión cuando se trata de comunidades microbianas mixtas (para garantizar que todas las colonias / lecturas en una muestra sean de bacterias asociadas a gusanos y no del medio ambiente), cuando las bacterias adheridas a la cutícula interfieren con la lectura de la población internalizada, cuando el mínimo esperado de UFC / gusano es bajo, etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer a H. Schulenberg y C. LaRock por su generoso intercambio de cepas bacterianas utilizadas en estos experimentos. Este trabajo fue apoyado por fondos de la Universidad de Emory y NSF (PHY2014173).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).

Tags

Biología Número 185 Caenorhabditis elegans microbioma heterogeneidad huésped-microbio bacterias transmisión
Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones <em>caenorhabditis elegans-bacterianas</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S.,… More

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter