Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucanlı Verileri Kullanma

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64027
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

Summary

Bu protokol, dış bakterileri uzaklaştırmak için soğuk felç ve yüzey ağartmayı takiben bireysel bakteriyel olarak kolonize Caenorhabditis elegans'ın 96 kuyucuklu bir bozulmasını tanımlar. Elde edilen süspansiyon, çok sayıda bireysel solucanda bakteri yükünün doğru, orta verimli bir şekilde ölçülmesini sağlamak için agar plakaları üzerine kaplanmıştır.

Abstract

Nematod Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrop ve konakçı-mikrobiyom etkileşimleri için model bir sistemdir. Bugüne kadar yapılan birçok çalışma, bu organizmadaki bakteri yükünü ölçmek için bireysel solucan örnekleri yerine toplu sindirmeler kullanmaktadır. Burada, C. elegans bağırsağının bakteriyel kolonizasyonunda görülen bireyler arası büyük değişkenliğin bilgilendirici olduğu ve toplu sindirim yöntemlerinin, koşullar arasında doğru karşılaştırma için önemli olan bilgileri attığı iddia edilmektedir. Bu örneklere özgü varyasyonu tanımlamak çok sayıda birey gerektirdiğinden, bireysel solucanların bozulması ve koloni kaplaması için uygun bir 96 kuyucuklu plaka protokolü oluşturulmuştur.

Introduction

Konakçı-mikrop ilişkilerinde heterojenlik her yerde gözlenmektedir ve bireyler arasındaki varyasyon, rekabet ve birlikte yaşama1'den hastalık bulaşması 2,3,4'e kadar popülasyon düzeyindeki süreçlere katkıda bulunan bir faktör olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir. C. elegans'ta, izojenik popülasyonlar içindeki "gizli heterojenlik" tekrar tekrar gözlemlenmiştir; bireylerin alt popülasyonları, ısı şoku yanıtı5,6, yaşlanma ve yaşam süresi 7,8,9,10,11 ve fizyoloji ve gelişimin diğer birçok yönü 12 . Alt popülasyon yapısını tanımlamaya çalışan analizlerin çoğu, izojenik, senkronize solucanların deneysel popülasyonlarındaki iki alt popülasyon için kanıt sağlar 5,7,8, ancak diğer veriler farklı gruplardan ziyade özelliklerin popülasyon içi dağılımlarının olasılığını göstermektedir 7,12,13 . Burada önemli olan, bağırsak popülasyonlarında önemli bir heterojenlik, paylaşılan bir mikrop kaynağından 13,14,15,16 kolonize edilen solucanların izojenik popülasyonlarında bile gözlenir ve bu heterojenlik, solucanda bakteri niceliği için yaygın olarak kullanılan 17,18,19,20 parti sindirim ölçümleri ile gizlenebilir.

Bu çalışma, konakçı-mikrop ilişkisinde tek solucan ölçümlerine daha fazla güvenmenin yanı sıra tek solucan bozulmasında doğruluğu ve verimi artırmak için protokollere daha fazla güvenme ihtiyacını gösteren veriler sunmaktadır. Bu protokoller, canlı bakteri yükünün nicelleştirilmesi için çok sayıda bireysel C. elegan'ın mekanik olarak bozulmasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır, aynı zamanda bireysel solucanların havaneli bazlı bozulmasından daha iyi tekrarlanabilirlik ve numune başına daha az çaba sağlar. Solucanların, bozulmaya hazırlanmadan önce ısıl olarak öldürülen E. coli ile beslenmelerine izin verilen önerilen bir bağırsak temizleme adımı, yakın zamanda yutulan ve diğer geçici (yapışmamış) bakterilerin katkılarını en aza indirmek için dahil edilmiştir. Bu protokoller, kütikülün düşük konsantrasyonlu bir yüzey ağartıcı işlemi ile temizlenmesi için soğuk felç yöntemini içerir; yüzey ağartma, tek solucanlı bozulmada bir hazırlık adımı olarak veya canlı, harici olarak mikropsuz solucanlar hazırlamak için bir yöntem olarak kullanılabilir. Bu yüzey ağartma yöntemi, çok çeşitli dış mikropları uzaklaştırmak için yeterlidir ve soğuk işlem, geleneksel levamisol bazlı felce bir alternatif sağlar; Soğuğa duyarlı deneyler için levamisol tercih edilirken, soğuk felç tehlikeli atık akışlarına katkıları en aza indirir ve normal aktivitenin hızlı bir şekilde yeniden başlatılmasını sağlar. Tam protokol, solucanların bilinen bakterilerle kolonize edildiği bir laboratuvar deneyini tanımlarken, solucanları temizleme prosedürleri ve tek solucan bozulması, vahşi örneklerden izole edilen veya mikrokozmos deneylerinde kolonize edilen solucanlara kolayca uygulanabilir. Burada açıklanan protokoller, solucan bağırsağından ekstrakte edilen, bireysel solucanlarda koloni oluşturan birimlerin (CFU'lar) kaplanması ve nicelleştirilmesi için uygun canlı bakteriler üretir; Dizileme tabanlı bağırsak topluluğu analizi için, sonraki hücre lizisi ve nükleik asit ekstraksiyon adımları bu protokollere eklenmelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu deneylerde kullanılan solucanlar, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden elde edildi. Bristol N2 vahşi tiptir. DAF-2 / IGF mutantları daf-16 (mu86) I (CGC CF1038) ve daf-2 (e1370) III (CGC CB1370) bağırsak bakteri yükündeki farklılıkları göstermek için kullanılır.

pos-1 RNAi vektörünü taşıyan HT115(DE3) E. coli, Ahringer kütüphanesi21'dendir. C. elegans yerli bağırsak bakterileri 22'nin MYb koleksiyonu Schulenburg laboratuvarından elde edildi. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR bu laboratuvardan23. Pseudomonas mosselii bu laboratuvarda izole edildi. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP, Emory Üniversitesi'ndeki LaRock laboratuvarından elde edildi.

Tüm solucan tamponları ve ortamları, daha önce yayınlanmış literatür24'e göre küçük değişikliklerle hazırlanmıştır (bakınız Ek Dosya 1).

1. Senkronize steril C. eleganların hazırlanması

NOT: Bu bölümde, üreme açısından steril yetişkin solucanların senkronize bir popülasyonunu oluşturmak için adım adım yordamlar açıklanmaktadır. Pos-1 RNAi plakaları ile beslenmek burada döl üretimini önlemek için kullanılır, çünkü bu girişim embriyonik öldürücüdür; Pos-1 RNAi'de yetişkinliğe yükseltilen L1 larvaları yumurtlayan hermafroditlere dönüşür, ancak bu yumurtalar cansızdır25. RNAi besleme protokolü, Wormbook26'nın "Ters genetik" bölümünde olduğu gibidir.

  1. Solucanları senkronize etmeden önce, taze 10 cm NGM + pos-1 RNAi plakalarının mevcut olduğundan emin olun. Plakalar, konsantre indüklenmiş sıvı kültüründen (+Amp + IPTG) taze olarak hazırlanabilir veya NGM + 100 μg / mL ampisilin + 1 mM IPTG üzerine çimler halinde aşılanabilir ve 1 gün 27 boyunca karanlıkta25 ° C'de büyümesine izin verilebilir.
    NOT: Karbenisilin (25 μg / mL) genellikle RNAi plakalarında ampisilin yerine kullanılır. Ampisilin daha ucuz ama daha az kararlıdır; ampisilin kullanılıyorsa, plakalar kuruduktan hemen sonra tohumlanmalı ve mümkün olan en kısa sürede kullanılmalıdır (4 ° C'de <1 hafta saklanabilir)27. Burada önerilen yüksek antibiyotik konsantrasyonu, yeterli seçimin sağlanmasına yardımcı olacaktır.
  2. Büyük gravid hermafrodit popülasyonlarına sahip birkaç (tipik olarak iki ila dört) NGM plakası ile başlayın. Ağartıcı-NaOH senkronizasyonu kullanarak yumurtaları izoleedin 24.
    1. Solucanları, plaka başına 2 mL steril ddH2O kullanarak agar plakalarından yıkayın. Sıvıyı 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine eşit olarak dağıtın (plaka veya hermafrodit başına bir tüp).
    2. Yetişkinleri tüplerin dibine çekmek için tezgah üstü bir mini santrifüjde (2.000 x g) ~ 5 s aşağı doğru döndürün. Süpernatantı pipetle çıkarın ve atın.
    3. 1 mL steril ddH2O ile yıkayın; Daha önce olduğu gibi aşağı doğru dön ve süpernatanı at.
    4. Kalan bakteri kalıntılarını azaltmak için önceki adımı tekrarlayın.
    5. Her tüpün içeriğini 1 mL steril ddH2O. Her tüpe 130 μL ticari ağartıcı (% 8.25 sodyum hipoklorit) ve 130 μL 5 N sodyum hidroksit (NaOH, nihai konsantrasyon 0.5 N) ekleyin.
    6. Vorteks tüpleri, yetişkin bedenler parçalanana kadar her 2 dakikada bir en az 10-15 s boyunca kuvvetli bir şekilde tüpler. Yumurtaları öldürmekten kaçınmak için ağartıcı-NaOH tedavisinin 5 dakikadan daha uzun sürmesine izin vermeyin.
    7. Yumurtaları peletlemek için 2.000 x g'de 30-60 sn için bir mini santrifüjde döndürün. Süpernatantı pipetle çıkarın ve atın. Görünür bir pelet olabilir veya olmayabilir, bu normaldir.
    8. 1 mL M9 sonsuz tampon ekleyin ve 2000 x g'de 30-60 s döndürün. Süper natantı atın.
    9. Ağartıcı-NaOH karışımını iyice çıkarmak için durulama adımını (1.2.8) 5x tekrarlayın, yumurta peletini rahatsız etmeden süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.
    10. Yumurtaları 50 mL'lik konik tüp veya kapaklı 30 mL kültür tüpü içinde 10 mL M9 solucan tamponuna aktarın. Konik tüpler kullanıyorsanız, kapağı hafifçe sökün ve güvenli tutmak için biraz bant kullanın. Larvaların yumurtadan çıkmasına izin vermek için 25 ° C ve 200 RPM'de gece boyunca (16 saat) sallanarak inkübe edin.
  3. Yetişkinliğe büyümek için senkronize L1 larvalarını RNAi plakalarına aktarın.
    1. Her L1 tüpüne 2 mL steril M9 tampon + %0,01 Triton X-100 (bundan böyle M9TX-01) ekleyin ve tüm hacmi (12 mL) 15 mL vidalı konik boruya aktarın.
    2. Larva hareketini yavaşlatmak için 10 dakika boyunca 4 ° C'de L1 solucanları olan 15 mL tüpleri yerleştirin.
    3. 15 mL konik tüpleri büyük bir masa üstü santrifüjde döndürün (3 dakika boyunca 4 ° C'de 1.500 x g; hızlanma ve yavaşlama maksimumun% 80'inden yüksek olmamalıdır).
    4. L1 peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice pipetleyin. Süper natantı atın.
    5. Her tüpe 12 mL soğuk M9TX-01 ekleyin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süpernatanı dikkatlice pipetleyin ve atın. Her tüp ~ 200 μL kalmış olmalıdır.
    6. Solucanların plastiğe yapışmasını önlemek için M9TX-01'de 200 μL'lik bir pipet ucunu durulayın, ardından solucan peletini yeniden askıya almak için bu ucu kullanın. Süspansiyonlu solucanları, sıvı damlalarını bakteri çimlerine pipetleyerek hazırlanan pos-1 plakalarına aktarın.
    7. Plakaları yetişkinliğin ilk gününe kadar 25 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Eğer pos-1 RNAi plakalarında solucanlar büyüyorsa, solucanlar embriyonik-ölümcül fenotipin yüksek penetransını sağlamak için yetişkinliğe tamamen geçene kadar RNAi bakterileri üzerinde ad libitum beslemelidir. Plakaları 24 ve 48 saatte kontrol edin. Plakalar açlıktan ölmüş veya neredeyse aç görünüyorsa, solucanların tam boyutlu yetişkinlere büyümeyi bitirmek için taze plakalara taşınması gerekecektir. Solucanlar yetiştirilmeden önce plakaların tükenmesini önlemek için, her 10 cm'lik RNAi plakasına 250-500 L1 larva eklemeyi hedefleyin.
  4. Yetişkinleri hasat edin ve mikropsuz solucanlar oluşturmak için bağırsak E. coli'yi temizleyin.
    1. Yetişkin solucanları, plaka başına 5 mL M9TX-01 kullanarak plakalardan durulayın. Tampon + solucanları 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve yetişkinlerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
    2. Yetişkinleri, görünür bakteriyel bulanıklık kalmayana kadar (tipik olarak 1-2x) 10 mL taze M9TX-01 tamponu değişikliklerinde durulayın. Tüpler, pelet solucanlarına 30 s boyunca 700 x g'de santrifüj edilebilir veya yetişkinlerin yerçekimi ile yerleşmesine izin verilebilir.
    3. Dış bakterileri azaltmak için 10 mL M9TX-01 ile ek bir yıkama yapın.
    4. Solucanları, 5 mL S Medium + 2x ısıl öldürücü E. coli OP50 (~5 x 109 öldürülmüş hücre / mL) + 200 μg / mL gentamisin + 50 μg / mL kloramfenikol içeren 50 mL konik tüplere veya 30 mL kültür tüplerine aktarın. Konik tüpler kullanıyorsanız, kapağı hafifçe sökün ve güvenli tutmak için biraz bant kullanın. Solucanların yapışmasını önlemek için cam pipetler kullanın veya plastik pipetleri M9TX-01'de durulayın.
    5. Mikropsuz yetişkinler üretmek için yetişkinleri 25 ° C'de 200 RPM'de 24-48 saat titreme ile inkübe edin.
      NOT: Solucanlar >24 saat boyunca antibiyotiklerde kalacaksa, solucanların yeterli bir besin kaynağına sahip olmasını sağlamak için daha fazla ısı öldürücü OP50 eklenmesi gerekebilir. Tüpleri 24 saatte kontrol edin ve bulanıklık gözle görülür şekilde azalırsa ısıda öldürülen OP50 ile destekleyin.
  5. Sakkaroz, bakteriyel kolonizasyon için temiz, üreme açısından steril, senkronize yetişkinlere özel stoklar elde etmek için yetişkinleri Solucan Kitabı protokolleri24'e göre yıkayın.
    1. %60 sakaroz, M9 sonsuz tampon ve M9TX-01 soğuk hacimlerinin kullanıma hazır olduğundan emin olun. Basitlik için, bunlar bir gece önce 4 ° C'de bırakılabilir.
    2. Yıkanacak her numune için, 8 mL M9TX-01 içeren etiketli 15 mL konik tüp oluşturun ve buz üzerinde bir kenara koyun. Bunlara adım 1.5.10'da ihtiyaç duyulacaktır.
    3. L1 larvaları içeren her 50 mL tüpe 5 mL M9TX-01 ekleyin. Tüm hacmi (şimdi 10 mL) boş bir 15 mL vidalı konik tüpe aktarın ve yetişkinlerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
    4. Süpernatantı dikkatlice pipetleyin ve atın.
    5. Her tüpe 10 mL M9TX-01 ekleyin ve tüpleri 5-10 dakika boyunca bir buz kovasına taşıyın.
      NOT: Bu noktadan itibaren solucanlar ve tüm tamponlar buz üzerinde tutulmalıdır.
    6. Büyük bir masa üstü santrifüjü 4 °C'ye soğutmak için "hızlı sıcaklık" ayarını kullanın.
    7. Kalan kalıntıları durulamak için her tüpe 10 mL soğuk M9TX-01 ekleyin. Solucanların buza yerleşmesine izin verin; süpernatantı çıkarın ve atın.
    8. Sakkaroz şamandırası: Her tüpe 5 mL soğuk M9 tamponu ve 5 mL soğuk% 60 sakkaroz çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın. Daha sonra, her tüpteki sakaroz-tampon karışımının üzerine 1 mL soğuk M9 tamponunu dikkatlice yüzün. Şamandıra eklendikten sonra karıştırmayın.
      DİKKAT: Sonraki birkaç adım için hızlı hareket edin - solucanlar çok uzun süre yüksek konsantrasyonlarda sakkaroza maruz kalırsa kuruyabilir!
    9. 4 °C'de 3 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj. Canlı yetişkin solucanlar, M9 ve sakarozun arayüzünde, tüpün üstünden yaklaşık 1 mL uzakta olacaktır.
    10. Solucan tabakasını soğuk M9TX-01 ile hazırlanmış 15 mL konik tüplere aktarmak için bir cam 5 mL serolojik pipet kullanın (adım 1.5.2'den itibaren). Sakarozun çok fazla pipetlenmesinden canlı solucan tabakasını elde etmek için çok dikkatli olun.
    11. Gerekirse, 10-12 mL / tüpün eşit hacimlerini elde etmek için M9TX-01'i ekleyin. 1 dakika boyunca 4 °C'de 1500 x g'de santrifüj, ardından süpernattan pipet çekin. Solucanlar bu noktada oda sıcaklığına geri döndürülebilir.
    12. Yıkama adımı 1.5.11'i iki kez tekrarlayın, hızı 4 ° C'de 700 x g'ye ve zamanı 30 sn'ye düşürün.

2. Sıvı kültürde canlı bakteriler üzerinde solucanların beslenmesi

NOT: Bu protokol, sıvı kültüründe iyi karıştırılmış koşullarda laboratuarda yetiştirilen bakterilerle solucanları kolonize etmek için kullanılır (Ek Şekil 1). Solucanlar, saf kültürden bireysel izolatlarla (örneğin, Enterococcus faecium28,29 gibi patojenler) veya izolatların karışımlarıyla (örneğin, minimal mikrobiyom toplulukları14) kolonize edilebilir.

  1. 15 mL'lik bir konik tüpte protokol adım 1.5'ten sakkaroz yıkanmış senkronize yetişkin solucanlarla başlayın. Solucanları 12 mL S tamponunda bir kez yıkayın ve süpernatanı atın.
  2. Yıkanmış solucanları, deney için gereken S ortamının hacminde yeniden askıya alın. Deneysel koşulların hacmini, solucanların bölüneceği koşulların sayısını ve solucanların ve bakterilerin son konsantrasyonlarını düşünün.
    NOT: Solucanlarda beslenme, bakteri mevcudiyetine göre değişir30 ve solucanlar 31 kalabalık tarafından stresesokulabilir. Sıvı kültürde kolonizasyon için <1000 solucan/mL ve >107 CFU/mL önerilir; 1011 CFU / mL, E. coli32'de "ad libitum" besleme yoğunluğu olarak kabul edilir.
  3. Bakteri kültürlerini döndürün. Süper natantı dökün; aspirasyon veya pipetleme, gevşek peletler oluşturan bakteriler için süpernatantı çıkarmak için kullanılabilir.
    NOT: >5 mL kültürler için, 15 mL tüplere aktarın ve 8-10 dakika boyunca büyük bir masa üstü santrifüjde ~ 2800 x g'de döndürün. <5 mL kültürler 1,5 mL tüplere aktarılabilir ve küçük bir masa üstü santrifüjde 1-2 dakika boyunca 9000 x g'de santrifüj edilebilir. Yüksek derecede hareketli bakterilerin (örneğin, birçok Pseudomonas türü), kararlı bir pelet oluşumunu kolaylaştırmak için 4 ° C'de 10-15 dakika soğutulması gerekebilir ve 4 ° C'de santrifüj yapmak daha iyi olabilir.
  4. Bakteri kültürlerini bir hacim S tamponunda yeniden askıya alın ve tekrar pelet için santrifüj yapın. Süpernatantı daha önce olduğu gibi çıkarın ve atın.
  5. S ortamındaki bakteri kültürlerini deney için istenen yoğunlukta ve ayrıca seçim için herhangi bir antibiyotiği yeniden askıya alın. Varsa kullanılacak antibiyotikler, kolonizasyon için kullanılan bakterilerin direnç profiline bağlı olacaktır.
  6. M9TX-01 ile kaplanmış bir pipet ucu kullanarak, pipet, solucanlar S ortamında iyice askıya alınana kadar hafifçe yukarı ve aşağı doğru sallanır, daha sonra bakteriyel kolonizasyon için tüplere veya plaka kuyucuklarına aktarılır.
  7. İstenilen bakteri konsantrasyonuna ve son hacme ulaşmak için her solucan kültürüne bakteriyel süspansiyon ekleyin.
  8. Kolonizasyon için çok kuyucuklu bir plaka kullanıyorsanız, plakayı steril bir 96 delikli gaz geçirgen sızdırmazlık membranı ile örtün.
  9. Kuluçka sırasında bakterilerin yerleşmesini önlemek için 200 RPM'de sallanarak inkübe edin.

3. Bireysel solucanların 96 kuyucuklu bir formatta mekanik olarak bozulması

NOT: Bu bölümde, bireysel olarak bakteriyel olarak kolonize edilmiş C. elegans'ın mekanik bozulması için 96 delikli bir plaka formatı protokolü açıklanmaktadır. Protokoldeki ilk adımlar (3.1-3.8), yapışmamış bakterileri solucan bağırsağından temizlemek ve soğuk felç ve yüzey ağartma kullanarak solucanların dışını temizlemek için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu adımlar, bakteri içeriğinin nicelleştirilmesi için mekanik olarak bozulabilecek (3.8 uçlu) veya daha ileri deneyler için kullanılabilecek temiz, canlı yetişkin solucanlar üretecektir (Ek Şekil 1). Bu protokol, sıvı kültürde (Bölüm 2), agar plakalarında veya doğal veya mikrokozmos toprağından kolonize edilen solucanlardaki bakterileri ölçmek için uyarlanabilir.

  1. Soğutmak için buzun üzerine M9TX-01'in bir aliquot'unu yerleştirin (mL'deki numune sayısının 4-5 katı).
  2. Bir aliquot M9TX-01 + ağartıcı (% 6 sodyum hipoklorit, 1: 1000 veya 1: 2000 v / v, numune başına 1 mL + 1 mL ekstra) hazırlayın ve soğutmak için buzun üzerine yerleştirin. Bu aliquot adım 3.8'de kullanılacaktır.
  3. Bozulmuş solucan örneklerinin seri seyreltilmesi için 96 delikli plakalar hazırlayın.
    1. Kapaklı steril 300 μL kapasiteli 96 delikli plakalar elde edin; Bu protokol, sindirilen 12 solucan başına bir seyreltme plakası kullanır.
    2. Her 96 kuyucuklu plakanın (300 μL kapasiteli) B-D satırlarını 180 μL 1x PBS arabellekle doldurmak için 96 delikli çok kanallı pipetör kullanın. Üst sırayı boş bırakın. B-D satırları, solucan sindirimlerinin 10x seri seyreltilmesi haline gelecektir [0.1x, 0.01x, 0.01x].
    3. Plakaları bir kenara koyun. Seyreltme plakaları adım 3.13'te kullanılacaktır.
  4. Her solucan örneğini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL M9TX-01'de yeniden askıya alın.
  5. Tüpleri 25 °C'de düşük hızlı bir minisantrifüjde (2.000 x g) pelet yetişkinlerine kısaca (2-3 s) döndürün. Süpernatantı pipetle çıkarın ve solucan peletini rahatsız etmediğinizden emin olarak atın.
  6. Adım 3.5'teki santrifüjleme ayarlarını kullanarak, harici bakterileri azaltmak için solucanları iki kez 1 mL M9TX-01, ardından bir kez 1 mL M9 solucan tamponu ile durulayın.
  7. Yapışmamış bakterileri solucan bağırsağından temizleyin.
    1. Her solucan örneğini bir kültür tüpünde 1 mL S orta + 2x ısıl öldürücü OP50'de yeniden askıya alın.
    2. Yapışmamış bakterilerin bağırsaktan geçişine izin vermek için 20-30 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Bu aynı zamanda herhangi bir hücre dışı floresan proteinini lümenden temizleyecek ve özellikle asit hızlı floroforlar (örneğin, mCherry, dsRed) kullanıldığında, bağırsak epiteline yapışmış etiketli bakterilerin daha net görselleştirilmesini sağlayacaktır.
  8. Dış bakterileri temizlemek için yüzey ağartıcı solucanları.
    1. Temizlenmiş solucanları 1 mL soğuk M9TX-01 ile iki kez durulayın ve süpernatanı atın.
    2. Tüplerin buz üzerinde (tercih edilen) veya 4 ° C'de 10 dakika soğumasına izin verin. Bu solucanları felç edecek ve ağartıcının yutulmasını önleyecektir.
      NOT: Diğer protokoller levamisol gibi kimyasal felç ajanı kullanır; bu, tehlikeli bir atık akışının eklenmesini gerektiren yerleşik bir yaklaşım33'tür .
    3. Her tüpe 1 mL buz gibi soğuk M9 sonsuz tampon + kokusuz ağartıcı (% 8.25 sodyum hidroksit, 1:1000 veya 1:2000 v / v) ekleyin. Dış bakterileri öldürmek için tüplerin buz üzerinde (tercih edilen) veya 4 ° C'de en az 10 dakika oturmasına izin verin.
      NOT: 1:1000 konsantrasyon ağartıcıyı aşmayın. Felçli solucanlarda bile, ölüm ile sonuçlanabilir.
    4. Pipetle ağartıcı tamponunu çıkarın ve atın; Solucanların çamaşır suyu temizlenene kadar pompalamaya devam etmemesini sağlamak için tüpleri buza geri döndürün.
    5. Her tüpe 1 mL soğuk M9TX-01 ekleyin. Bir minisantrifüjde ~5 s için döndürün (25 ° C'de 2.000 x g); tüpleri buza geri döndürün. Süpernatantı çıkarın ve atın.
    6. Bu durulama adımını başka bir 1 mL soğuk M9TX-01 ile tekrarlayın ve süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu atın.
      NOT: Daha fazla deney için solucanlar kullanıyorsanız, geçirgenlik adımını (Protokol 3.9) atlayın ve bunun yerine taze yüzey ağartılmış yetişkinleri 6 cm'lik bir Petri kabında buz gibi soğuk tampona aktarın ve solucanları Protokol 3.10'da olduğu gibi deneysel koşullara ayırın. Hareketliliğin devam etmesini önlemek için solucanları soğuk tutun, ancak hızlı çalışın - solucanları buzda >30 dakika boyunca tutmak, potansiyel olarak normal aktivitenin% 100 < yeniden başlamasına neden olabilir34.
  9. Solucan kütikülünün sodyum dodesil sülfat ve ditiyotrietitol (% 0.25 SDS + 300 mM DTT) ile kimyasal geçirgenliği (35'e göre)
    DİKKAT: DTT indirgeyici bir ajan ve tahriş edicidir. KKD giyin ve kuru stokları veya çözeltileri işlerken bir duman davlumbazında çalışın. Tehlikeli bir atık akışı gereklidir.
    1. Davlumbazda, her numune için 100 μL'ye izin verecek kadar SDS/DTT çözeltisi hazırlayın. 1 mL için, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 965 μL M9 sonsuz tampona veya M9TX-01'e, 5 μL% 5 (w / v) SDS ve 30 μL 1M DTT ekleyin.
      NOT: 1 M DTT çözeltisi (sulu), potens sağlamak için taze olarak hazırlanmalı veya -20 °C'de alikotlarda saklanmalıdır. Alikotlar, aşırı donma-çözülme döngüsünü önlemek için iki ila üç deneyde kullanılacak şekilde boyutlandırılmalıdır.
    2. Yüzeyi ağartılmış solucanlar içeren mikrosantrifüj tüplerini oda sıcaklığındaki bir tüp rafına taşıyın. Her tüp ~ 20 μL tamponda solucanlar içermelidir.
    3. Her solucan örneğine 100 μL SDS/DTT çözeltisi ekleyin. Kalan SDS/DTT çözeltilerini uygun tehlikeli atık akışına atın.
    4. Yetişkin solucanların dirençli kütikülünü kısmen parçalamak için tedavinin tezgahta 8 dakikaya kadar devam etmesine izin verin. Solucanlar ölecek ve bu süre zarfında tüpün dibine yerleşecektir.
    5. Geçirgenlik süresi dolduktan sonra, SDS/DTT süpernatantını dikkatlice pipetleyin ve uygun bir SDS/DTT tehlikeli atık akışına atın.
    6. Her tüpe 1 mL M9TX-01 ekleyin. Solucanları peletlemek veya solucanların yerçekimi ile tüplerin dibine yerleşmesine izin vermek için masa üstü bir santrifüjde kısaca döndürün, ardından süpernatantı çekin ve bir SDS / DTT tehlikeli atık akışına atın.
    7. Solucanları kullanıma hazır olana kadar 1 mL M9 solucan tamponunda + %0,1 Triton X-100'de askıya alın.
  10. Solucanları, mekanik bozulma için silikon karbür kumlu derin bir 96 delikli plakaya ayırın. 96 kuyucuklu bozulma plakasını aşağıdaki gibi hazırlayın.
    1. Steril bir 2 mL derin kuyucuklu 96 delikli plaka ve buna uygun silikon 96 delikli plaka kapağı elde edin.
      NOT: Doku bozucu için 96 delikli adaptörlerle uyumlu plakaların kullanılması önemlidir. Dış boyutlardaki küçük farklılıklar, adaptörlerden çıkarılabilen bir plaka ile çıkarılamayan bir plaka arasındaki farkı oluşturur.
    2. Steril bir kepçe spatula kullanarak, bir solucan alacak plakanın her bir kuyucuğuna az miktarda steril 36 kumlu silikon karbür ekleyin. Kuyunun dibini zar zor örtmek için yeterli kum kullanın (kuyu başına yaklaşık 0.2 g). Aşırı malzeme, içeriği alırken kuyunun dibine pipet ucu almayı zorlaştıracaktır.
    3. Her bir kuyucuğa 180 μL M9 sonsuz tampon ekleyin.
    4. Her numunenin nereye gideceğini belirtmek için sütunları veya satırları etiketleyin, ardından plakayı silikon 96 delikli plaka kapağıyla gevşek bir şekilde örtün.
  11. Tek tek solucanları bozulmak için 96 kuyucuklu plakaya aktarın.
    1. Geçirgen solucanları, çanağı ~ 1 cm derinliğe kadar doldurmak için yeterli M9TX-01 içeren küçük (35 veya 60 mm) bir Petri kabına dikkatlice taşıyın.
      NOT: Çok sayıda solucan varsa, sıvı kalabalıklaşacağından ve tek tek solucanları pipetlemek zor olacağından, numunenin tamamını aktarmak mümkün olmayabilir.
    2. Diseksiyon mikroskobu veya başka bir düşük büyütme cihazı kullanarak, tek tek solucanları 20 μL hacimlerde pipetleyin ve bu solucanları 96 delikli plakanın ayrı kuyularına aktarın.
      NOT: Sadece taze öldürülmüş solucanları hasat etmek en iyisidir. Sert doğrusal bir şekle sahip solucanlardan kaçının, çünkü bu solucanlar bir süredir ölmüş olabilir. Normal brüt fizyolojisi ve sağlam bir bağırsağı olan kavisli veya S şeklinde solucanlar almaya çalışın.
    3. Her birimi aktardıktan sonra, seçilen solucanın gerçekten kuyuya atıldığından emin olun. Bunu yapmak için, Petri kabının açık bir alanından 20 μL M9TX-01 pipetleyin ve tüm hacmi tekrar tabağa bırakın; bu, normalde pipete yapışmışsa solucanı dışarı atar. Solucan sıkışmışsa, kuyudan 20 μL'yi çıkarın ve aktarımı tekrar deneyin.
    4. Tüm solucanlar aktarıldıktan sonra, 96 delikli plakayı ticari olarak temin edilebilen esnek kağıt destekli sızdırmazlık filmi (2 x 2 kare) ile örtün, sızdırmazlık filminin kağıt destekli tarafının numune kuyucuklarına baktığından emin olun. Sızdırmazlık filmini çok ince germemeye dikkat edin, aksi takdirde daha sonra çıkarılması çok zor olacaktır.
    5. Silikon sızdırmazlık paspasını esnek sızdırmazlık filminin üzerine hafifçe yerleştirin; şu anda kapağı kuyucuklara bastırmayın.
    6. 30-60 dakika soğuması için plakayı 4 ° C'ye getirin. Bu, bozulma sırasında aşırı ısınmayı önleyecek ve bu da numunelere zarar verebilir.
      NOT: Bu, protokoldeki bir kesme noktasıdır. Çoğu durumda, plaka taşlamadan önce 4 saate kadar 4 ° C'de bırakılabilir. Solucanları gece boyunca bırakmayın, çünkü bu bakteri sayımlarını değiştirecektir.
  12. Solucan dokularını parçalamak ve bağırsak bakterilerini serbest bırakmak için 96 kuyucuklu plakaları bir doku bozucuya yükleyin.
    NOT: (İsteğe bağlı) Özetler için tek sayıda 96 delikli plaka kullanılıyorsa, devam etmeden önce bir karşı ağırlık hazırlamak gerekir. Boş bir derin 96 delikli plaka kullanın ve ilk plaka ile aynı ağırlığa gelene kadar kuyuları suyla doldurun.
    1. Bir sızdırmazlık oluşturmak için silikon sızdırmazlık paspasını kuyucuklara sıkıca bastırın ve kapağın plakanın tüm yüzeyi boyunca düz durduğundan emin olun.
      NOT: Esnek sızdırmazlık filmi gerildikten sonra çok kalınsa, silikon kapağı tüm kuyucuklarda düz duracak şekilde sabitlemek zor olacaktır. Bu, yetersiz bir sızdırmazlığa ve sarsıntı sırasında kuyudan iyiye kontaminasyona neden olacaktır.
    2. 96 delikli plaka adaptörlerini kullanarak doku bozucudaki plakaları sabitleyin. Plakaları 30 Hz'de 1 dakika çalkalayın, ardından plakaları 180 ° döndürün ve 1 dakika boyunca tekrar çalkalayın. Bu, plakanın tüm kuyularında bile bozulmanın sağlanmasına yardımcı olacaktır.
    3. Esnek sızdırmazlık filminden herhangi bir kumdan kurtulmak için plakaları tezgaha iki veya üç kez sıkıca dokunun.
    4. İki adet 96 delikli plaka adaptörüne sahip büyük bir santrifüj kullanarak, tüm malzemeleri kuyucukların dibine toplamak için plakaları 2 dakika boyunca 2400 x g'de döndürün.
    5. Silikon kapağı çıkarın ve esnek sızdırmazlık filmini dikkatlice çekin.
      NOT: Esnek sızdırmazlık filmi kuyucuklardan herhangi birine yapışırsa, çıkarmak için 200 μL'lik bir pipet ucu kullanın. Bu, esnek sızdırmazlık filmi çok ince gerildiğinde yaygındır.
  13. Solucan sindirimi örneklerini 96 delikli plakalarda 300 μL'de seri olarak seyreltin.
    1. 200 μL'ye ayarlanmış çok kuyucuklu bir pipetör kullanarak, kuyucukların içeriğini yeniden karıştırmak için birkaç kez yavaşça ve dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından sıvının mümkün olduğunca çoğunu çekin. Bu sıvıyı adım 3.3'te hazırlanan 96 delikli plakaların üst sıralarına aktarın.
    2. 20 μL'ye ayarlanmış 96 delikli bir pipetör kullanarak, bu sıvı hacmini üst sıradan çıkarın ve B sırasına dağıtın. İpuçlarını atın.
    3. C satırında 0,01x seyreltme örnekleri oluşturmak için B satırındaki 0,1x örneklerden başlayarak adım 3.13.2'yi yineleyin.
    4. C satırından D satırına geçerek adım 3.13.2'yi tekrar yineleyin.
    5. Bakteri miktarı için katı agar üzerine plaka. Monokolonize solucanlar için, genellikle her seyreltmenin [1x-0.001x] 10-20 μL damlasını agar plakalarına plakalamak yeterlidir. Çok türlü kolonizasyon için, her bir seyreltmeyi 10 cm'lik bir agar plakasına 100 μL pipetleyerek ayrı ayrı plakalayın; cam kaplama boncukları kullanarak hemen yayılır.

4. Silisyum karbür kumunun yeniden kullanım için temizlenmesi

NOT: Bu prosedür, taşlama malzemesi olan silikon karbür kumu, deneylerden sonra tekrar kullanılmak üzere temizlemek ve sterilize etmek için kullanılır. Silisyum karbür kum endüstriyel bir ürün olduğundan ve önceden sterilize edilmediğinden bu protokol ilk kullanımdan önce tamamen takip edilmelidir. Si-karbür kum (3,2 g/cc), zorlu numuneleri bozmak için verimli bir şekilde çalışan yoğun, pürüzlü kenarlı bir malzemedir. Bununla birlikte, parçacıklar tekrarlanan kullanımda aşınabilir ve aşınma belirgin hale geldiğinde değiştirilmelidir. Neyse ki, malzeme ucuzdur ve tipik olarak satılan boyutlar (~ 1 lb) birçok deney için yeterlidir.

  1. Kaplama için numuneleri çıkardıktan sonra, 96 delikli plakanın tüm kuyularına% 10 ağartıcı çözeltisi ekleyin ve en az 10 dakika bekletin.
  2. 96 delikli plakayı küçük, yüksek kenarlı bir tepsinin veya tüm içeriği yakalayacak kadar büyük boş P1000 pipet ucu kabının üzerine hızla ters çevirerek kumların büyük kısmını çıkarın. Kum hemen tepsinin dibine batacaktır. Ağartıcı çözeltisini bir lavaboya dökün.
  3. 96 delikli plakayı musluk suyuyla tekrar doldurun ve kalan kumları durulamak için aynı tepsiye ters çevirin. Suyu lavaboya dökün.
  4. Plaka kumdan tamamen temizlenene kadar musluk suyuyla bir ila üç kez daha tekrarlayın.
  5. Kumları musluk suyunda 2 kat durulayın, tepsiyi her seferinde doldurun.
    NOT: 96 delikli derin kuyucuklu plaka laboratuvar bulaşık makinesinde yıkanabilir, folyo ile güvenli bir şekilde kaplanabilir ve diğer yeniden kullanılabilir plastiklerle otoklavlanabilir. Kumların hemen yıkanmasına gerek yoktur ve bu noktada bir kenara bırakılabilir. Kullanılan kum genellikle yıkama ve otoklavlamadan önce birden fazla deneyden biriktirilir.
  6. Kumu, bir laboratuvar deterjanı çözeltisinde 30 dakika boyunca yıkayın, ara sıra metal bir spatula ile döndürerek veya karıştırarak çalkalayın.
  7. Musluk suyunun birkaç (8-10) değişiminde tüm deterjan izlerini durulayın, ardından damıtılmış suyla 2x durulayın.
  8. Kumu, sığ polipropilen otoklav tepsisi gibi açık bir tepsiye yayın ve 40-70 °C'de birkaç saat kurutun.
    NOT: Kum kuruduğunda topaklanıyorsa, yeterince temizlenmemiş veya durulamamıştır. Adım 4.6'dan başlayarak temizleme protokolünü tekrarlayın ve adım 4.7'de ek durulamalar ekleyin.
  9. Temiz, kuru kumu, vidalı otoklavlanabilir cam şişelere maksimum 5-6 cm derinliğe kadar dağıtın. Sterilize etmek için 30 dakika boyunca ön vakum döngüsünde otoklav.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Canlı solucanların ağartıcı sterilizasyonu
Yüzeyde ağartılmış solucanlar, hareketlilik geri dönene ve atılım devam edene kadar etkili bir şekilde dış bakterilerden arındırılmıştır. Burada kullanılan koşullar altında, soğuk felçli solucanlarda bağırsakla ilişkili bakterileri rahatsız etmeden tampondaki bakterilerin hızlı bir şekilde yok olması gözlenir (Şekil 1A-C, Ek Şekil 2, Video 1) (Şekil 1D-F, Video 2). Bu veriler, yüzey ağartmanın, bağırsak içeriğinden ödün vermeden solucanları harici olarak sterilize etmek için etkili bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir (yüzey ağartılmış ve ağartıcı olmayan solucanla ilişkili CFU sayılarının karşılaştırılması anlamlı değildir, Wilcoxon rütbe toplamı testi p > 0.05).

Çok örnekli mekanik bozulma varyasyonları
Solucanların mekanik olarak bozulması için 96 kuyucuklu teknik, kullanılan belirli malzemelere karşı sağlamdır ve pratik hususlar, taşlama malzemesinin seçimini belirler. Önceki bir rapor33'e benzer şekilde, manuel bozulma (Şekil 2A), Si-karbür için 0.229, büyük cam boncuklar için 0.243 (Şekil 2C) ve küçük cam boncuklar için 0.227 (Şekil 2D) ile karşılaştırıldığında, tüm tampon koşullarında standart 96 kuyucuklu protokolden (silikon karbür kumu, Şekil 2B) (var(log 10 CFU) =0.499) daha fazla heterojenlikle sonuçlandı. ). Bununla birlikte, CFU / solucan dağılımlarındaki çoğu farklılık anlamlı değildi (Kruskal-Wallace, df = 3 ile p = 0.017; büyük boncuklara karşı küçük boncuklar, p = 0.021 ve büyük boncuklar ile silisyum karbür kumu, p = 0.02 için anlamlı post-hoc Wilcoxon testleri). Triton X-100'ün bir yüzey aktif madde olarak kullanılması, bireysel bir faktör olarak düşünüldüğünde verimdeki önemli bir farkla ilişkili değildi (Kruskal-Wallace, p = 0.94, df = 3), ancak büyük boncuklar (2.7 mm) kullanıldığında Triton içermeyen örneklerde verimde belirgin bir artış olmasına rağmen (Şekil 2C), muhtemelen Triton varken bu kuyularda gözlenen aşırı "köpüklenme" ye atfedilebilir. Bu sonuçlar, büyük cam boncukların, homojenizasyon tüpleri33'te kullanım için ideal olsa da, 96 kuyucuklu teknik için uygun olmadığını göstermektedir. Küçük cam boncuklar makul sonuçlar verirken (Şekil 2D), karıştırma ve kaplama sırasında sürekli olarak 200 μL pipet uçlarını tıkamışlardır. Bu tahlildeki standart malzeme olan silisyum karbür kumu, ucuzdur, standart uçları tıkamak için çok büyüktür ve cam boncuklar gibi otoklavlamadan sonra yıkanabilir ve tekrar kullanılabilir. Kum, tampona az miktarda "toz" salgılar, bu da kaplamaya müdahale etmez, ancak bozulma ürünleri akış sitometrisi için kullanılacaksa filtrelenmesi gerekir.

Yetişkin solucanlarda bakteriyel kolonizasyonda heterojenite
Bireysel solucanların başarılı bir şekilde bozulması, bakteriyel kolonizasyonda heterojenliği ortaya çıkarır. Aynı bakteri havuzunda aynı anda kolonize edilen izojenik senkronize solucan popülasyonlarından bireyler, bağırsak bakteri yükünde sürekli olarak 100 kat veya daha fazla aralık gösterir. Bu, farklı bakteri kolonistleri için (Şekil 3A) ve çok türlü bakteri topluluklarında kolonizasyon sırasında gözlenmiştir (Şekil 3B). Bu heterojenlik, solucanlar bir floresan proteini (GFP) eksprese eden bakterilerle kolonize edildiğinde floresanın bireysel solucan ölçümlerinde de belirgindir (Şekil 3C-D). Konakçının özellikleri, vahşi tip Bristol N2 solucanlarının kolonizasyonunun DAF-2 / IGF mutantlarında aynı bakteriler tarafından kolonizasyonu ile karşılaştırılmasında görülebileceği gibi, bu heterojenliğin şekillendirilmesinde rol oynar; Bu daf-16 mutantı N2 ile karşılaştırıldığında birçok bakterinin daha büyük popülasyonlarını desteklerken, daf-2 bir dizi bakteri 36 tarafından kolonizasyona karşı dirençlidir (Şekil 3B, D). Bu heterojenlik karakteristiktir, farklı konakçı ve kolonist kombinasyonları arasında varyasyon gösterirken, aynı deneyin farklı çalışmaları üzerinde tutarlı bir yapıyı korur (Şekil 3E-F).

Grupların doğru karşılaştırılması için bireysel heterojenliğin önemi
Bireysel heterojenliğin önemi, toplu özetlerin veri dağılımlarını nasıl değiştirebileceği göz önünde bulundurularak kolayca görülebilir. Doğal mikrobiyom bakterileri MYb53 (Rhodococcus erythropolis) ve MYb120 (Chryseobacteria spp.) tarafından kolonizasyon N2 yetişkinlerinde (Şekil 3A, 4A) örnek olarak kullanılmıştır. Bireysel solucan verileri dağılım açısından açıkça benzerdir (iki kuyruklu t-testi, p = 0.9, Wilcoxon rütbe toplamı, p = 0.59). Toplu özetlerin etkilerini simüle etmek için bu verileri yeniden örneklendirirken, parti ekstrapolasyonlu CFU/solucan, bu dağılımlardaki pozitif çarpıklık (ortalama > medyan) nedeniyle verilerin üst kantillerine doğru çekilir. Toplu işleme, bir parti içindeki bireyler üzerinde etkili bir şekilde ortalamaya sahip olduğundan, toplu ekstrapolasyonlu CFU / solucan, bireysel verilerin aritmetik ortalaması etrafında merkezlenecek ve partiler merkezi sınır teoremine göre büyüdükçe bu ortalamaya olan mesafe azalacaktır (Şekil 4B-D). Buna göre, biyolojik varyasyondan gelen sinyal hızla kaybolur; toplu olarak çıkarılan CFU/solucan ölçümleri, bu günlük ölçeğinde dağıtılmış verilerin temsili bir metriği olmayan ortalamaya doğru yakınsamamaktadır. Simüle edilmiş parti özetlerinde MYb53 ve MYb120 ile çıkarılan kolonizasyondaki farklılıklar hızla anlamlı hale gelir (t-testi parti 5, p = 0.049; parti 10, p = 2.27e-4; parti 20, p = 1.19e-15; Wilcoxon rütbe toplamı test grubu 5, p = 2.27e-4; parti 10, p = 2.70e-06; parti 20, p = 1.80e-09) orijinal sinyal belirsiz olduğu için.

Bireysel heterojenitenin mikrobiyal bulaşma üzerine etkileri
Bireysel solucanlar bakteriyel kolonizasyonda önemli bir heterojenlik gösterdiğinden, bu heterojenliğin aşağı yönlü etkileri olup olmadığını sormak mantıklıdır. Örneğin, bulaşmanın bağırsak bakteri yükünün bir fonksiyonu olabileceğini beklemek mantıklıdır. Bireysel yüzey ağartılmış solucanları temiz bir ortama aktararak, çevrenin atılan canlı bakterilerle aşılandığını gözlemlemek mümkündür. Bu deneylerde, kommensal Ochrobactrum MYb14-GFP veya patojenik S. aureus-GFP'nin genel olarak önemli popülasyonlarını (103-10 5 CFU / solucan, Şekil 5) taşıyan yüzeyde ağartılmış önceden kolonize edilmiş yetişkinlerin, NGM agar üzerindeki ısıl olarak öldürülmüş OP50 çimlerinde 1.5 saat boyunca dolaşmalarına izin verildi. Bu solucanlar atılım plakalarından yeniden toplandıklarında ve bakteriyel nicelleştirme için bozulduğunda, bakteri yükü ile canlı bakterilerin atılım hızı arasında anlamlı bir ilişki yoktur (Log-transforme koloniler / saat ve CFU / solucan arasındaki Pearson korelasyonları: MYb14 rho = 0.19, p = 0.45; S. aureus rho = 0.02, p = 0.9) (Şekil 5). Bir plaka üzerindeki kolonilerin varlığı / yokluğu ile bağırsak bakteri yükü arasında da anlamlı bir ilişki yoktur (faktör olarak log dönüştürülmüş CFU / solucan ile binom lojistik regresyonu: df = 53 ile p = 0.15). Plakaların önemli bir kısmı yeni büyümeden uzak kaldı (MYb14 için 9/18 plaka, S. aureus için 10/36 plaka), düşük genel atılım oranlarına işaret ediyor.

Solucanların agar plakalarına salgılanmasına izin verildiğinde, solucan başına atılan canlı bakterilerin gerçek sayısı, solucanların kolonilerden geçtiği ve yeni büyüme izleri yarattığı "çiftçilik" ile karıştırılır (Şekil 6)37. N kolonili bir plaka, canlı koloni oluşturan bakterilerin atıldığı en az bir ve en fazla n olayı temsil eder. Bu gözlemden, (1,n)'de gerçekte kaç tane atılım olayının meydana geldiğini bilmek mümkün olmadığı gibi, her olayda kaç bakterinin atıldığını bilmek de mümkün değildir. Bu nedenle, bu verileri kullanarak canlı bakterilerin bağırsaktan atılım oranlarını kesin olarak tahmin etmek mümkün değildir. Bununla birlikte, bazı sınırlar çıkarmak mümkündür. Plaka başına koloni sayısı çok bilgilendirici olmasa da, varoluş / yokluk verileri atılım oranlarının kabaca çıkarılması için kullanılabilir. Basitlik için, canlı bakterilerin atılım hızının bakteriyel yükün bir fonksiyonu olmadığı ve atılımın bir Poisson işlemi olduğu varsayılırsa, λ MYb14'te 0.33 worm-1 hr-1 ≈ 18 çalışmada en az dokuz olayı gözlemleme şansı% 50'dir. S. aureus için, 0.2 solucan-1 saat-1'≈ benzer makul λ oranları elde edilmiştir. Bu kaba hesaplamalar, canlı bakterilerin düşük atılım oranlarını gösterirken, güvenilir tahminler elde etmek için bu işlemin daha fazla sayıda bireysel solucan üzerinde daha kesin bir şekilde ölçülmesi gerekecektir.

Veri Kullanılabilirliği:
Burada gösterilen veriler Dryad'da (https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2) mevcuttur.

Figure 1
Şekil 1. Düşük konsantrasyonlu yüzey ağartma işlemi, tampondaki bakterileri hızla öldürür, ancak soğuk felçli solucanlarda bağırsak topluluklarını rahatsız etmez. (A-C) Üç farklı konsantrasyonda (1:1000, 1:2000, 1:5000 v/v; karşılaştırma için ağartılmamış kontrol) yüzey ağartma sırasında M9 solucan tamponunda bakteriyel CFU/mL, (A) S. aureus Newman, (B) S. enterica LT2 veya (C) E. coli OP50'yi hedef alır. Numuneler, maruz kaldıktan sonra 20 dakikaya kadar belirtilen zaman noktalarında alındı ve ağartıcının plakalardaki kolonileri öldürmesini önlemek için steril tamponla iki kez yıkandı. 1:1000 koşuluna ilişkin veriler, bu verilerin grafikte görünür olması için hafifçe kaydırılır. (D-F) Bireysel N2 solucanlarında bağırsak bakterileri (n = deney başına 24 solucan, ayrı günlerde iki veya üç bağımsız çalışma). Yüzey ağartılmış ve ağartıcı olmayan solucanla ilişkili CFU sayımlarının tüm karşılaştırmaları anlamlı değildir (Wilcoxon rütbe toplamı testi p > 0.05). Gri yatay çizgiler, 200 μL hacimden 10 μL alikot kaplanırken en az bir koloni gözlemleme olasılığının ~% 60 olduğu yoğunluk (40 CFU / solucan) olarak tanımlanan algılama eşiğini temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. 96 kuyulu kesinti protokolü tutarlı sonuçlar verir ve malzeme seçimine dayanıklıdır. 48 saat boyunca tek bir bakteri türü ile kolonize edilen N2 yetişkin solucanlar (P. mosselii) standart protokollere göre yüzey ağartıldı ve geçirgenleştirildi, daha sonra bireysel solucanlar (n = koşul başına 24), (A) bireysel 0.5 mL tüplerde manuel bozulma, motorlu bir havane kullanılarak veya (B-D) kullanılarak CFU kaplaması için mekanik olarak bozuldu. ) Protokolde ayrıntılı olarak açıklanan 96 kuyucuklu bozulma protokolündeki varyasyonlar. Bozulma, değişen konsantrasyonlarda Triton X-100 (x ekseni,% 0-0.1, v / v) ve (B) 36 kumlu silikon karbür, (C) küçük (425-600 μm) cam boncuklar veya (D) büyük (2.7 mm) cam boncuklardan birini içeren M9 sonsuz tamponunda gerçekleştirildi. Tüm grafikler için gösterilen veriler günlük10'dur (CFU/solucan) ve her nokta ayrı bir solucandır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. C. elegans bağırsağının heterojen bakteriyel kolonizasyonu. (A) Yöntemlerde olduğu gibi hazırlanan N2 yetişkin hermafroditlerin tek tür kolonizasyonu. Bakteriler, MYb yerli solucan mikrobiyom koleksiyonundan dört tür (Dirksen ve ark. 2016) (n = 24 solucan, her biri bir deney) ve iki patojen, Staphylococcus aureus MSSA Newman (SA) ve Salmonella enterica LT2 (SE) (n = iki / üç bağımsız deney üzerinde 96-144 solucan). Yerli mikrobiyom türleri tarafından kolonizasyon, sıvı S ortamı + 108 CFU / mL bakterilerde 25 ° C'de 48 saatlik bir inkübasyondan sonra değerlendirildi; patojenler tarafından kolonizasyon, 25 ° C'de 24 (SA) veya 48 (SE) h için NGM solucan agar üzerindeki çimlerde inkübasyondan sonra değerlendirildi. (Saat 48'de, S. aureus'taki solucanlar çoğunlukla öldü.) (B) N2, daf-16 (mu86) ve daf-2 (e1370) yetişkinlerindeki toplam CFU / solucan, sekiz tür minimal yerli mikrobiyom üzerinde sıvı ortamda 4 gün boyunca kolonileştirilmiştir (Taylor ve Vega, 2021'den elde edilen veriler)14. (C-D) GFP eksprese eden bakterilerle kolonize edilen bireysel solucanlarda yeşil floresan, büyük nesne akışı sitometrisi ile gözlenir. (C)'de, N2 yetişkinlerinin senkronize popülasyonları, (A)'da açıklandığı gibi OP50 (floresan olmayan, n = 1908 bireysel yetişkin solucanlar), S. aureus (GFP, n = 968) veya S. enterica (GFP, n = 1153) ile kolonize edildi; OP50 kontrolü, 3. gün-yetişkin N2 solucanlarında tipik yeşil kanal otofloresan seviyelerini gösterir. (D)'de, N2 (n = 1165), daf-16 (mu86) (n = 1180) ve daf-2 (e1370) (n = 2267) yetişkinlerinin senkronize popülasyonları, (A)'da tarif edildiği gibi plakalarda 2 gün boyunca kommensal Ochrobactrum MYb14-GFP ile kolonize edildi. (E-F) S. aureus (E) ve S. enterica (F) tarafından kolonizasyondaki günlük varyasyon (panel A ve Şekil 1'deki ile aynı veriler, n = deney başına 48 solucan). X ekseni örnekleme gününü gösterir. Gri yatay çizgiler, en az bir koloni gözlemleme olasılığının ~% 60 olduğu yoğunluk olarak tanımlanan algılama eşiğini temsil eder (200 μL'den sırasıyla 10 μL ve 100 μL'lik farklı kaplama hacimleri nedeniyle, tek tür kolonizasyonu için 40 CFU / solucan ve çok türlü kolonizasyon için dört CFU / solucan). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4. Toplu işleme, çarpık günlük ölçekli verilerdeki biyolojik varyasyonları siler. Şekil 3'teki CFU/solucan verileri, her toplu iş boyutu için n = 25 çoğaltılmış benzetimli veri kümesi oluşturmak üzere değiştirilerek yeniden örneklenmiştir; burada boyut, toplu iş başına tek tek solucan sayısıdır. CFU/solucan, simüle edilen her partideki toplam CFU'nun parti başına solucan sayısına bölünmesiyle elde edilir. Ham verilerde (panel A), MYb53 için ortalama CFU/solucan 4450,8 (10 3,6) ve MYb120, 1398,3 (103,1); toplu iş boyutu arttıkça toplu iş sonucu çıkarılan sayılar bu değerlere yakınsar (B, beş solucan/parti; C, 10 solucan/parti; D, 20 solucan/parti), merkezi limit teoreminden beklentilerle tutarlıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5. Canlı bakterilerin atılımı, bireysel solucanların bağırsağındaki CFU yükü ile zayıf bir şekilde ilişkilidir. Burada, N2 yetişkinleri sırasıyla 1 veya 2 gün boyunca S. aureus-GFP veya MYb14-GFP çimleri üzerinde beslenerek kolonize edildi. Tespit edilebilir GFP floresansına sahip solucanlar (toplam GFP > büyük nesne akış sitometresinde 1.8 log) toplu popülasyondan ayrıldı, Yöntemlerde açıklandığı gibi yüzey ağartıldı ve ayrı ayrı NGM + ısıdan öldürülen OP50 plakalarına aktarıldı. Log-transforme koloniler/h ve CFU/solucan arasındaki pearson korelasyonları anlamlı değildir (MYb14 rho = 0.19, p = 0.45; S. aureus rho = 0.02, p = 0.9). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6. Bakteriyel "çiftçilik", agar plakalarındaki atılım olaylarının sayısını gizler. İşte solucan dışkısından MYb14-GFP kolonileri içeren iki plaka. İlk plaka (A), solucan yolları boyunca "çiftçilik" konusunda açık kanıtlara sahiptir ve koloniler arasında GFP ekspresyonundaki (sarımsı pigmentasyon olarak görülebilir) farklılıklara dayanan en az iki ayrı atılım olayını temsil ediyor gibi görünmektedir. İkinci plaka (B) daha belirsiz olsa da, kolonilerin konumlarına dayanarak çiftçilik göz ardı edilemez. Bu deneylerde, N2 yetişkin solucanları, MYb14-GFP çimleri içeren agar plakaları üzerinde beslenerek 48 saat boyunca önceden kolonize edildi. Kolonizasyondan sonra, solucanlar hazırlandı ve Yöntemlere göre yüzey ağartıldı, daha sonra M9 solucan tamponunun 5 μL alikotuna +% 0.1 Triton X-100 ila 6 cm NGM + ısıl öldürülmüş OP50 plakalarına aktarıldı (50 μL 5x konsantre ısı ile öldürülen OP50 lekelerinin yüzeyde kurumasına izin verilerek hazırlandı). Solucanların 25 ° C'de 1,5 saat dolaşmasına izin verildi, daha sonra plakalardan toplandı ve CFU / solucan kaplaması için bozuldu (motorlu bir havan kullanılarak bireysel 0,5 mL tüplerde 20 μL tamponda manuel bozulma). Plakalar sayılmadan önce 2 gün boyunca 25 ° C'de inkübe edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1. GFP floresan S. aureus ile kolonize edilen N2 solucanlarının yüzey ağartma olmadan görselleştirilmesi. Kütikül üzerindeki az sayıda floresan hücre, görüntü solucanın gövdesinden geçerken odağın içine ve dışına doğru hareket eder ve görüş alanı vücut yüzeyinden bağırsağa doğru hareket ettikçe bağırsağın mekansal olarak heterojen kolonizasyonu görünür hale gelir. Z-yığını görüntüsü, ters çevrilmiş bir floresan mikroskopta 20x büyütmede çekildi. Parlak alan ve GFP filtreli floresan görüntüler üst üste bindirildi ve satıcı yazılımı kullanılarak Z-yığınındaki görüntüler birbirine dikildi. Görüntü, Ek Şekil 2A'dakiyle aynı slayttandır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 2. GFP floresan S. aureus ile kolonize edilmiş bir N2 solucanının yüzey ağartma ile görselleştirilmesi (20 dakika boyunca 1:1000 v/v). Floresan bakteriler tarafından mekansal olarak heterojen kolonizasyon, bu bireyin bağırsağında görülebilir ve bakteriler, ileri enfeksiyonu gösteren vücut dokularına sızmıştır. Kütikül üzerinde bakteri görülmez. Z-yığını görüntüsü, ters çevrilmiş bir floresan mikroskopta 20x büyütmede çekildi. Parlak alan ve GFP filtreli floresan görüntüler üst üste bindirildi ve satıcı yazılımı kullanılarak Z-yığınındaki görüntüler birbirine dikildi. Resim, Ek Şekil 2B'deki slaytla aynı slayttandır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1. Protokole Genel Bakış. Burada, senkronize yetişkin solucanlar kırmızı bakterilerle mono-kolonize edilir, yüzeyi ağartılır ve bireysel solucanların mekanik olarak bozulmasından önce 96 kuyucuklu bir biçimde geçirgenleştirilir. Bağırsaktan salınan bakteriler, CFU / solucan ölçümü için 10x serisinde seyreltme kaplıdır; Gösterilen plakalar gözlenen heterojenlik için tipiktir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2. GFP floresan S. aureus ile kolonize edilen N2 solucanlarının yüzey ağartmalı ve yüzey ağartmadan görselleştirilmesi (20 dakika boyunca 1:1000 v/v). (A) Ağartılmamış numunede, dış bakteriler solucanlar veya solucan gövdesi parçaları ile ilişkili olmayan yeşil floresan alanları olarak düşük büyütmede görülebilir. (B) Yüzeyde ağartılmış numunede, GFP floresansı solucan cisimlerinin içi ile sınırlıdır (bir solucan gövdesi parçası görüntünün ortasında görülebilir). Tüm görüntüler ters çevrilmiş floresan mikroskopta 4x büyütmede çekildi. Parlak alan ve GFP filtreli floresan görüntüler üst üste bindirildi ve satıcı yazılımı kullanılarak bitişik görüş alanlarından gelen görüntüler birbirine dikildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1: Tampon ve çözelti tarifleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, C. elegans'taki bakteri yükünün tek solucanlı nicelleştirilmesinin avantajları ve bu tür büyük veri kümelerinin hızlı ve tutarlı bir şekilde elde edilmesini sağlamak için 96 kuyucuklu bir bozulma protokolü hakkında veriler sunulmaktadır. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında33, bu protokoller solucandaki bağırsak mikrobiyal topluluklarının daha yüksek verimli ölçümüne izin verir.

Bu yaklaşım, hız sınırlayıcı bir adım olarak kaplamaya sahiptir ve gerçekten "yüksek verim" değildir. Büyük cisim akış sitometrisi (Şekil 3C, D), bireysel solucanlarda floresan olarak etiketlenmiş bakterileri ölçmek için yararlı bir yüksek verimli yöntemdir16, ancak eşzamanlı floroforların sayısı çok türlü topluluklarda bir sınırlamadır. Çok kuyulu plaka bozulmasını topluluk sıralamasıyla ilişkilendirmek, verimi artırmanın başka bir yoludur; Bununla birlikte, burada açıklanan 96 kuyucuklu bozulma prosedürü, bakteri hücrelerini sağlam bırakmak için özel olarak optimize edilmiştir. Hücrelerin kapsamlı bir şekilde parçalanmasının arzu edildiği dizileme tabanlı analiz, canlı bakteriler yerine hücre içeriğini çıkarmak için bir nükleik asit ekstraksiyon adımının eklenmesini veya atma protokolünün (Protokol 3.10-3.11) değiştirilmesini gerektirecektir. Tek solucanlı bozulma ve nükleik asitlerin ekstraksiyonu için protokoller başka bir yerde yayınlanmıştır38,39.

Solucan bağırsağındaki bakteriyel toplam bolluk heterojendir ve burada gösterilen veriler, parti bazlı ölçümün gruplar arasındaki karşılaştırmalarda hatalı sonuçlar üretebileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, solucandaki bakteri topluluklarının diğer ölçümleri, topaklanmanın etkilerine karşı daha az duyarlı olabilir. Not olarak, solucanla ilişkili topluluklardaki göreceli bolluklar, mikroplar arasındaki etkileşimlerin nötr olup olmadığına bakılmaksızın, toplam bağırsak popülasyonu büyüklüğü ile çok az farklılık gösteriyor gibi görünmektedir40 veya14. Sayım verileriyle karşılaştırıldığında, göreceli bolluk ölçümlerinin açıklanan yanlış pozitif oran sorununa daha az duyarlı olacağı akla yatkındır. Topluluk kompozisyonu için göreceli bolluk verileri üreten sıralama tabanlı topluluk analizi, bu nedenle tek solucanların ölçülmesini gerektirmeyebilir. Bu noktada daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Burada, yüzey ağartma için solucanları felç etmek için soğuk işlem kullanıyoruz. Diğer çalışmalar, buz üzerinde geçirilen süre 30 dakikanın altında tutulursa, solucanların normal aktiviteye hızlı bir şekilde (<15 dakika) devam ettiğini ve tam iyileşmeden önce uzun süreler gerektirebilecek kimyasal felç ajanlarının aksine, daha ileri tahlillerde derhal kullanılmasına izin verdiğini bulmuştur34. Solucanlar bakteri miktarı için derhal bozulacaksa, bu özellik vazgeçilebilir ve kimyasal felce karşı soğutmanın temel avantajı, kontrollü bir atık akışına ihtiyaç duyulmasını önlemektir. Uzatılmış soğuk tedavi, stres tepkilerini araştırırken, özellikle de sıcaklığa bilinen bir bağlantı varsa, dikkatli kullanılmalıdır. Burada açıklanan soğuk felç protokolleri, soğuk stres deneylerinde kullanılandan daha kısa akut soğuğa maruz kalmayı gerektirir (2-4 ° C'de 20-30 dakika vs 2 + saat)41,42,43 ve 1 saatlik bir soğuk şok, vahşi tip solucanlarda belirgin bir fenotip üretmez 43. 4 ° C'de kısa süreli (90 dakika) inkübasyon, soğuk stres gen ekspresyonunda değişikliklere neden olur (TMEM-135: GFP muhabirinin ifadesiyle ölçülür), ancak solucanlar oda sıcaklığına geri döndüğünde ekspresyon dakikalar içinde stressiz seviyelere geri döner34. Bununla birlikte, strese duyarlı solucan genotipleri üzerindeki etkiler vahşi tipten daha şiddetli olabilir. Bu prosedür, kullanılacak deneysel koşullar altında doğrulanmalıdır.

Burada açıklanan yüzey ağartma protokolü, deneylerde dış mikropların geçişini sınırlamanın veya ortadan kaldırmanın bir yolu olarak kullanılabilir. Bu yöntem ayrıca yüzey ağartma ve sadece L1 / L2 larvalarının taze plakalara aktarılması yoluyla mantar kirleticilerini temizlemek için kullanılmıştır (yüzey ağartılmış yetişkinlerin transferi, muhtemelen daha büyük hayvanların bağırsaklarında taşınması nedeniyle kirleticinin temizlenememesine neden olmuştur). Ağartıcı konsantrasyonunun 1:1000 v / v'yi geçmemesini sağlamak kritik öneme sahiptir, çünkü solucanlara zarar ve ölüm oranı ortaya çıkacaktır. Bu prosedür deneysel konakçı-mikrop evriminde ve konakçı-patojen etkileşimlerinde yararlı olabilir. Örneğin, burada gözlemlenen canlı bakterilerin düşük atılım hızı, hermafroditlerden yavrulara bakteri bulaşması için gözlemlenen oldukça değişken oranları açıklamaya yardımcı olabilir15. Burada gözlenen bağırsak bakteri yükü ile atılım hızı arasındaki korelasyon eksikliği ilginçtir, ancak daha fazla araştırma gerektirir; Bu gözlemin nerede tutulacağını (veya tutup tutamayacağını) belirlemek için bir dizi koşulda daha fazla sayıda veri noktasına ihtiyaç duyulacaktır.

Solucanları yüzey ağartmanın sağladığı ölçüde temizlemek her zaman gerekli olmayabilir. Steril tamponda çoklu yıkamalar, solucanlar tek bir mikropla dahili olarak kolonileştirildiğinde, beklenen minimum CFU / solucan, tampon süpernatantındaki bakteri konsantrasyonundan çok daha yüksekse (10-100 kat) muhtemelen yeterlidir, çünkü bu taşıma sayıları minimum düzeyde etkileyecektir (bkz. Şekil 1). Ek olarak, ilgilenilen mikrop (lar) öncelikle kütikülü kolonize ederse, yüzey ağartmasından açıkça kaçınılmalıdır. Kapsamlı temizlik, karışık mikrobiyal topluluklarla uğraşırken (bir numunedeki tüm kolonilerin / okumaların çevreden değil, solucanla ilişkili bakterilerden olmasını sağlamak için), kütiküle yapışan bakteriler içselleştirilmiş popülasyonun okunmasına müdahale ettiğinde, beklenen minimum CFU / solucan düşük olduğunda doğruluğu sağlamak için daha önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Yazarlar, H. Schulenberg ve C. LaRock'a bu deneylerde kullanılan bakteri suşlarının cömert paylaşımları için teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma Emory Üniversitesi ve NSF'nin (PHY2014173) finansmanıyla desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).

Tags

Biyoloji Sayı 185 Caenorhabditis elegans mikrobiyom heterojenlik konakçı-mikrop bakteri bulaşma
<em>Caenorhabditis elegans-Bakteriyel</em> Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucanlı Verileri Kullanma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S.,… More

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter