Summary
이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.
Abstract
선충류 Caenorhabditis elegans 는 숙주 - 미생물 및 숙주 - 미생물 상호 작용을위한 모델 시스템입니다. 현재까지 많은 연구는이 유기체의 박테리아 부하를 정량화하기 위해 개별 웜 샘플보다는 배치 다이제스트를 사용합니다. 여기서 C. elegans 장의 박테리아 식민지화에서 볼 수있는 큰 개인 간 변동성은 유익하며, 배치 소화 방법은 조건 간 정확한 비교에 중요한 정보를 폐기한다고 주장합니다. 이러한 샘플에 내재 된 변형을 설명하는 것은 많은 수의 개인을 필요로하기 때문에 개별 웜의 파괴 및 콜로니 도금을위한 편리한 96 웰 플레이트 프로토콜이 확립됩니다.
Introduction
숙주-미생물 연관성에서의 이질성은 유비쿼터스적으로 관찰되며, 개인들 사이의 변이는 경쟁과 공 존1에서 질병 전달 2,3,4에 이르는 집단 수준 과정에 기여하는 요인으로 점점 더 인식되고 있다. C. elegans에서, isogenic 집단 내의 "숨겨진 이질성"이 반복적으로 관찰되었으며, 열 충격 반응 5,6, 노화 및 수명 7,8,9,10,11 및 생리학 및 발달의 많은 다른 측면에서 뚜렷한 표현형을 보이는 개인의 하위 집단 12 . 하위 집단 구조를 확인하려는 대부분의 분석은 동종 동기화 된 웜5,7,8의 실험 집단에서 두 개의 하위 집단에 대한 증거를 제공하지만, 다른 데이터는 별개의 그룹보다는 형질의 인구 내 분포의 가능성을 시사합니다 7,12,13 . 여기서와 관련성이 있는 경우, 미생물 13,14,15,16의 공유 공급원으로부터 콜로니화된 웜의 isogenic 집단 내에서도 장 집단에서의 실질적인 이질성이 관찰되며, 이러한 이질성은 웜의 박테리아 정량화를 위해 널리 사용되는 배치 다이제스트 측정치(17,18,19,20)에 의해 은폐될 수 있다.
이 연구는 숙주-미생물 연관에서 단일 웜 측정에 대한 의존도가 높아질 필요성을 시사하는 데이터와 단일 웜 중단에서 정확도와 처리량을 높이기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 생존 가능한 박테리아 부하의 정량화를 위해 많은 수의 개별 C. elegans 의 기계적 파괴를 촉진하도록 설계되었으며, 개별 웜의 유역 기반 파괴보다 샘플 당 더 나은 반복성과 낮은 노력을 제공합니다. 벌레가 파괴를 준비하기 전에 열로 죽인 대장균 을 먹일 수 있도록 허용하는 권장 장 정화 단계가 포함되어 최근에 섭취 한 박테리아 및 기타 일시적 (부착되지 않은) 박테리아의 기여를 최소화합니다. 이들 프로토콜은 저농도 표면 표백제 처리로 큐티클을 세척하기 위한 냉 마비 방법; 표면 표백은 단일 웜 파괴의 준비 단계 또는 살아있는 외부 세균이없는 웜을 준비하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 이러한 표면-표백 방법은 광범위한 외부 미생물을 제거하기에 충분하며, 냉간 처리는 종래의 레바미솔-기반 마비에 대한 대안을 제공한다; 레바미솔은 감기에 민감한 실험에 선호되는 반면, 냉간 마비는 위험한 폐기물 흐름에 대한 기여를 최소화하고 정상적인 활동을 신속하게 재개 할 수있게합니다. 전체 프로토콜은 웜이 알려진 박테리아로 식민지화되는 실험실 실험을 설명하지만, 웜 및 단일 웜 파괴를 청소하는 절차는 야생 샘플에서 분리되거나 소우주 실험에서 식민지화 된 웜에 쉽게 적용될 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 웜 장에서 추출 된 살아있는 박테리아를 생산하며, 개별 웜에서 콜로니 형성 단위 (CFU)의 도금 및 정량화에 적합합니다. 시퀀싱 기반 장 군집 분석을 위해, 후속 세포 용해 및 핵산 추출 단계가 이들 프로토콜에 추가되어야 한다.
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Protocol
이 실험에 사용 된 웜은 NIH Office of Research Infrastructure Program (P40 OD010440)이 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetic Center에서 얻었습니다. 브리스톨 N2는 야생형입니다. DAF-2/IGF 돌연변이체 daf-16(mu86) I(CGC CF1038) 및 daf-2 (e1370) III(CGC CB1370) 는 장내 박테리아 부하의 차이를 설명하기 위해 사용된다.
포즈-1 RNAi 벡터를 운반하는 HT115(DE3) 대장균은 아링거 라이브러리(21)로부터 유래한다. C. elegans 천연 장내 박테리아22의 MYb 수집은 Schulenburg 실험실로부터 수득되었다. 살모넬라 엔테리카 LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR은 이 실험실23에서 나온 것입니다. 슈도모나스 모셀리(Pseudomonas mosselii)는 이 실험실에서 격리되었다. 황색포도상구균 MSSA Newman pTRKH3-mGFP는 Emory University의 LaRock 실험실에서 입수했습니다.
모든 웜 버퍼 및 매체는 이전에 발표된 문헌(24 )에 따라 약간의 수정으로 제조된다( 보충 파일 1 참조).
1. 동기화된 멸균 C. 엘레간스의 제조
참고: 이 섹션에서는 생식적으로 멸균된 성인 웜의 동기화된 개체군을 생성하기 위한 단계별 절차에 대해 설명합니다. pos-1 RNAi 플레이트에 먹이를주는 것은이 간섭이 배아 치명적이기 때문에 자손의 생산을 방지하기 위해 여기에서 사용됩니다. pos-1 RNAi에서 성인기까지 자란 L1 유충은 알을 낳는 헤르마프로디트로 발전하지만,이 알은 생존 할 수없는25입니다. RNAi 먹이 프로토콜은 웜북26의 "역 유전학"장에서와 같습니다.
- 웜을 동기화하기 전에 신선한 10cm NGM + pos-1 RNAi 플레이트를 사용할 수 있는지 확인하십시오. 플레이트는 농축된 유도 액체 배양 (+Amp +IPTG)으로부터 신선하게 제조되거나 NGM + 100 μg/mL 암피실린 + 1 mM IPTG에 잔디밭으로 접종되고 25°C에서 1일 동안27일 동안 성장하도록 허용될 수 있다.
참고: 카베니실린(25μg/mL)은 RNAi 플레이트의 암피실린 대신 자주 사용됩니다. 암피실린은 덜 비싸지 만 덜 안정적입니다. 암피실린을 사용하는 경우, 플레이트는 즉시 건조 후 즉시 시딩하고 가능한 한 빨리 사용해야합니다 (4 °C에서 <1 주 동안 보관할 수 있음)27. 여기에 권장되는 높은 항생제 농도는 적절한 선택을 보장하는 데 도움이됩니다. - gravid hermaphrodites의 큰 개체군을 가진 여러 (일반적으로 두 개에서 네 개의) NGM 플레이트로 시작하십시오. 표백제-NaOH 동기화24를 사용하여 계란을 분리하십시오.
- 플레이트 당 2mL의 멸균 ddH2O를 사용하여 한천 플레이트에서 웜을씻어냅니다. 액체를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브 (플레이트 당 하나의 튜브 또는 헤르마프로디트)에 고르게 분배하십시오.
- 벤치탑 미니원심분리기(2,000 x g)에서 ~5초 동안 회전하여 성인을 튜브 바닥으로 당깁니다. 상층액을 피펫에서 떼어 내고 버립니다.
- 1 mL의 멸균ddH2O로 세척하고; 이전과 같이 아래로 회전하고 상층액을 버립니다.
- 남은 박테리아 파편을 줄이기 위해 이전 단계를 반복하십시오.
- 각 튜브의 내용물을 1 mL의 멸균ddH2O에 재현탁시키고 130 μL의 상업용 표백제 (8.25 % 차아 염소산나트륨) 및 130 μL의 5 N 수산화 나트륨 (NaOH, 최종 농도 0.5 N)을 각 튜브에 첨가한다.
- 소용돌이 튜브는 성인 신체가 해체 될 때까지 2 분마다 적어도 10-15 초 동안 격렬하게 튜브를 사용합니다. 계란을 죽이지 않도록 표백제 - NaOH 치료가 5 분 이상 진행되지 않도록하십시오.
- 2,000 x g 에서 30-60 초 동안 미니 원심 분리기에서 회전하여 계란을 펠릿화하십시오. 상층액을 피펫에서 떼어 내고 버립니다. 가시적 인 펠릿이있을 수도 있고 없을 수도 있으며, 이것은 정상입니다.
- M9 웜 버퍼 1 mL를 넣고 2000 x g에서 30-60 초 동안 회전 하십시오. 상층액을 버리십시오.
- 헹굼 단계 (1.2.8)를 5x 반복하여 표백제 - NaOH 혼합물을 철저히 제거하고 계란 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상등액을 제거하십시오.
- 계란을 50mL 원뿔형 튜브 또는 캡이 있는 30mL 배양 튜브의 M9 웜 버퍼 10mL로 옮깁니다. 원뿔형 튜브를 사용하는 경우 뚜껑을 약간 풀고 약간의 테이프를 사용하여 안전하게 유지하십시오. 유충이 부화할 수 있도록 25°C 및 200RPM에서 밤새 (16시간) 흔들면서 배양한다.
- 동기화 된 L1 유충을 RNAi 플레이트로 옮겨 성인기까지 성장시킵니다.
- 멸균 M9 버퍼 2 mL + 0.01% 트리톤 X-100(이후 M9TX-01)을 각 L1 튜브에 첨가하고 전체 부피(12mL)를 15mL 스크류 탑 코니컬 튜브로 옮깁니다.
- L1 웜이 있는 15 mL 튜브를 4°C에서 10분 동안 두어 애벌레의 움직임을 늦춘다.
- 대형 탁상용 원심분리기에서 15mL 원뿔형 튜브를 회전시킵니다(4°C에서 3분 동안 1,500 x g , 가속 및 감속은 최대치의 80%를 넘지 않아야 함).
- L1 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 피펫 오프하십시오. 상층액을 버리십시오.
- 차가운 M9TX-01 12mL를 각 튜브에 넣습니다. 원심분리를 반복한다. 조심스럽게 피펫을 떼어 내고 상청액을 버리십시오. 각 튜브에는 ~ 200 μL가 남아 있어야합니다.
- M9TX-01에서 200μL 피펫 팁을 헹구어 웜이 플라스틱에 달라붙지 않도록 한 다음 이 팁을 사용하여 웜 펠릿을 재현탁시킵니다. 재현탁 된 웜을 박테리아 잔디밭에 액체 방울을 피펫팅하여 준비된 pos-1 플레이트로 옮깁니다.
- 플레이트를 성인기의 첫날까지 25°C에서 인큐베이션한다.
참고 : pos-1 RNAi 플레이트에서 웜을 키우는 경우, 웜은 배아 치명적인 표현형의 높은 침투를 보장하기 위해 성인기로 완전히 전환 될 때까지 RNAi 박테리아에 Ad libitum 을 공급해야합니다. 24 및 48 h에서 플레이트를 확인하십시오. 접시가 굶주리거나 거의 굶주린 것처럼 보이면 웜을 신선한 접시로 옮겨 풀 사이즈 성인으로 성장해야합니다. 웜이 자라기 전에 플레이트가 고갈되는 것을 피하려면 각 10cm RNAi 플레이트에 250-500 L1 유충을 추가하는 것을 목표로하십시오.
- 성인을 수확하고 장내 대장균 을 맑게 하여 세균이 없는 웜을 만듭니다.
- 접시 당 5 mL의 M9TX-01을 사용하여 접시에서 성인 웜을 헹구십시오. 버퍼 + 웜을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 성인이 튜브 바닥에 정착 할 수 있도록하십시오.
- 신선한 M9TX-01 버퍼 10 mL의 변화로 성인을 헹구어 박테리아 탁도가 보이지 않을 때까지 (일반적으로 1-2x). 튜브는 펠릿 웜에 대해 30 초 동안 700 x g 에서 원심 분리되거나 성인은 중력에 의해 침전되도록 허용 할 수 있습니다.
- 외부 박테리아를 줄이기 위해 10mL의 M9TX-01로 한 번 더 세척하십시오.
- 웜을 5mL S 배지 + 2x 열사멸된 대장균 OP50(~5 x 109 사멸 세포/mL) + 200 μg/mL의 겐타마이신 + 50 μg/mL의 클로람페니콜이 들어있는 50mL 원뿔형 튜브 또는 30mL 배양 튜브로 옮깁니다. 원뿔형 튜브를 사용하는 경우 뚜껑을 약간 풀고 약간의 테이프를 사용하여 안전하게 유지하십시오. 유리 피펫을 사용하거나 M9TX-01에서 플라스틱 피펫을 헹구어 웜이 달라 붙지 않도록하십시오.
- 25°C에서 24-48시간 동안 200RPM에서 진탕하면서 성인을 배양하여 세균이 없는 성인을 생산합니다.
참고 : 웜이 >24 시간 동안 항생제에 남아 있으려면 웜에 적절한 식량 공급원이 있는지 확인하기 위해 더 많은 열이 죽인 OP50을 첨가해야 할 수도 있습니다. 24 시간에 튜브를 확인하고 탁도가 눈에 띄게 감소하면 열 사멸 OP50을 보충하십시오.
- Sucrose는 Wormbook 프로토콜24 에 따라 성인을 세척하여 박테리아 식민지화를위한 깨끗하고 생식 적으로 멸균되고 동기화 된 성인 전용 주식을 얻습니다.
- 60% 자당, M9 웜 버퍼 및 M9TX-01의 차가운 부피를 사용할 준비가 되었는지 확인하십시오. 단순화를 위해, 이들은 전날 밤 4°C에서 방치될 수 있다.
- 세척할 각 샘플에 대해, 8 mL의 M9TX-01을 함유하는 라벨링된 15 mL 원뿔형 튜브를 만들고 얼음 위에 따로 놓는다. 1.5.10 단계에서 필요합니다.
- 5 mL의 M9TX-01을 L1 유충이 들어있는 각 50 mL 튜브에 첨가한다. 전체 부피 (현재 10mL)를 빈 15mL 스크류 상단 원뿔형 튜브로 옮기고 성인이 튜브 바닥에 정착 할 수 있도록하십시오.
- 조심스럽게 상청액을 피펫에서 떼어 내고 버리십시오.
- 각 튜브에 10 mL M9TX-01을 넣고 튜브를 얼음 통으로 5-10 분 동안 옮깁니다.
참고: 이 시점부터 웜과 모든 버퍼는 얼음 위에 보관해야 합니다. - "빠른 온도" 설정을 사용하여 대형 탁상 원심분리기를 4°C로 냉각합니다.
- 차가운 M9TX-01 10mL를 각 튜브에 넣어 남은 이물질을 헹구십시오. 벌레가 얼음에 정착하게하십시오. 상층액을 제거하고 버리십시오.
- 자당 부유물: 차가운 M9 버퍼 5mL와 차가운 60% 수크로오스 용액 5mL를 각 튜브에 넣고 완전히 혼합합니다. 그런 다음, 차가운 M9 완충액 1 mL를 각 튜브의 수크로스-완충액 혼합물의 상부에 조심스럽게 부유시킨다. 플로트를 추가한 후에는 혼합하지 마십시오.
주의: 다음 몇 단계 동안 빠르게 움직입니다 - 웜은 너무 오랫동안 고농도의 자당에 노출되면 건조될 수 있습니다! - 4°C에서 3분 동안 1500 x g 에서 원심분리한다. 살아있는 성인 웜은 튜브 상단에서 약 1 mL의 M9과 수크로오스의 계면에있을 것입니다.
- 유리 5 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 웜 층을 차가운 M9TX-01로 준비된 15 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다 (단계 1.5.2로부터). 자당을 너무 많이 피펫팅하지 않고 살아있는 웜 층을 얻는 데 매우주의하십시오.
- 필요한 경우 M9TX-01을 추가하여 동일한 부피의 10-12 mL / 튜브를 얻으십시오. 4°C에서 1분 동안 1500 x g 에서 원심분리한 다음, 상청액을 피펫 오프한다. 웜은이 시점에서 실온으로 되돌릴 수 있습니다.
- 세척 단계 1.5.11을 두 번 반복하고, 속도를 4°C에서 700 x g 으로 감소시키고, 시간을 30 s로 감소시켰다.
2. 액체 배양에서 살아있는 박테리아에 벌레를 먹이기
참고 :이 프로토콜은 액체 배양에서 잘 혼합 된 조건에서 실험실에서 자란 박테리아로 웜을 식민지화하는 데 사용됩니다 (보충 그림 1). 웜은 순수한 배양물(예를 들어, 엔테로코커스 패시움28,29와 같은 병원체) 또는 단리물의 혼합물(예를 들어, 최소 마이크로바이옴 군집(14))으로부터의 개별 단리물로 콜로니화될 수 있다.
- 프로토콜 단계 1.5로부터 수크로오스 세척된 동기화된 성인 웜을 15 mL 원뿔형 튜브에서 시작한다. 웜을 12mL의 S 버퍼에 한 번 세척하고 상층액을 버립니다.
- 세척된 웜을 실험에 필요한 S 배지의 부피에 재현탁시킨다. 실험 조건의 양, 웜이 분열 될 조건의 수 및 웜과 박테리아의 최종 농도를 고려하십시오.
참고 : 웜의 먹이는 박테리아 가용성30에 따라 다르며 웜은31을 혼잡하게함으로써 스트레스를 받을 수 있습니다. 액체 배양물에서의 식민지화를 위해서는 <1000 웜 / mL 및 >107 CFU / mL가 권장됩니다. 1011 CFU/mL는 대장균32에서 "Ad libitum" 공급 밀도로 간주됩니다. - 박테리아 배양물을 스핀 다운하십시오. 상청액을 붓는다. 흡인 또는 피펫팅은 느슨한 펠릿을 형성하는 박테리아에 대한 상청액을 제거하기 위해 사용될 수 있다.
참고: 배양물 >5 mL의 경우, 15 mL 튜브로 옮기고 대형 탁상용 원심분리기에서 ∼2800 x g 에서 8-10분 동안 회전시킨다. 배양물 <5 mL는 1.5 mL 튜브로 옮기고 작은 탁상 원심분리기에서 1-2분 동안 9000 x g 에서 원심분리할 수 있다. 고도의 운동성 박테리아 (예를 들어, 슈 도모나스의 많은 종)는 안정한 펠릿의 형성을 용이하게 하기 위해 4°C에서 10-15분 동안 냉각될 필요가 있을 수 있고, 4°C에서 원심분리하는 것이 더 나을 수 있다. - 박테리아 배양물을 한 부피의 S 완충액에 재현탁시키고 다시 원심분리하여 펠릿으로 한다. 이전과 같이 상층액을 제거하고 버리십시오.
- 실험을 위해 원하는 밀도로 S 배지에서 박테리아 배양물을 재현탁하고 선택을위한 항생제를 더합니다. 사용되는 항생제는 존재하는 경우, 콜로니화에 사용되는 박테리아의 내성 프로파일에 의존할 것이다.
- M9TX-01에 코팅된 피펫 팁을 사용하여 웜이 S 배지에 완전히 재현탁될 때까지 피펫 웜을 부드럽게 위아래로 웜한 다음 박테리아 콜로니화를 위해 튜브 또는 플레이트 웰로 옮깁니다.
- 각 웜 배양물에 박테리아 현탁액을 추가하여 원하는 박테리아 농도와 최종 부피에 도달하십시오.
- 콜로니화를 위해 다중 웰 플레이트를 사용하는 경우, 플레이트를 멸균 96-웰 가스 투과성 밀봉 멤브레인으로 덮으십시오.
- 배양 중에 박테리아가 침전하는 것을 방지하기 위해 200RPM에서 진탕으로 배양하십시오.
3. 96-well 형식의 개별 웜의 기계적 파괴
참고: 이 섹션에서는 박테리아 식민지화된 C. elegans의 개별 파괴를 위한 96웰 플레이트 형식 프로토콜에 대해 설명합니다. 프로토콜 (3.1-3.8)의 첫 번째 단계는 웜 장에서 부착되지 않은 박테리아를 제거하고 차가운 마비 및 표면 표백을 사용하여 웜의 외부를 청소하는 방법을 설명합니다. 이 단계는 박테리아 내용물의 정량화 (3.8-end)를 위해 기계적으로 파괴되거나 추가 실험에 사용될 수있는 깨끗하고 살아있는 성인 웜을 생산합니다 (보충 그림 1). 이 프로토콜은 액체 배양 (섹션 2), 한천 플레이트 또는 자연 또는 소우주 토양에서 식민지화 된 웜의 박테리아를 정량화하기 위해 적용될 수 있습니다.
- M9TX-01의 분취량을 얼음 위에 올려 놓고 차가워집니다 (mL의 샘플 수의 4-5 배).
- M9TX-01 + 표백제 (6 % 차아 염소산 나트륨, 1 : 1000 또는 1 : 2000 v / v, 샘플 당 1 mL + 추가 1 mL)의 분취량을 준비하고 얼음 위에 올려 놓고 차갑게하십시오. 이 분취량은 단계 3.8에서 사용될 것이다.
- 파괴된 웜 샘플의 연속 희석을 위해 96웰 플레이트를 준비합니다.
- 뚜껑이 있는 멸균 300 μL 용량 96-웰 플레이트를 수득하고; 이 프로토콜은 소화 된 12 개의 웜 당 하나의 희석 플레이트를 사용합니다.
- 96웰 다채널 피펫터를 사용하여 각 96웰 플레이트(300μL 용량)의 행 B-D를 180μL의 1x PBS 버퍼로 채운다. 맨 위 행은 비워 둡니다. 행 B-D는 웜 다이제스트[0.1x, 0.01x, 0.01x]의 10x 직렬 희석이 됩니다.
- 접시를 따로 두십시오. 희석 플레이트는 단계 3.13에서 사용될 것이다.
- 각 웜 샘플을 1 mL의 M9TX-01에 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 재현탁시킨다.
- 튜브를 25°C에서 저속 미니원심분리기(2,000 x g)에서 간략하게(2-3 s) 스핀성인 펠릿화한다. 상층액을 피펫에서 떼어 내고 버리고, 웜 펠릿을 방해하지 않도록하십시오.
- 단계 3.5의 원심분리 설정을 사용하여 M9TX-01 1mL로 웜을 두 번 헹구고 M9 웜 버퍼 1mL로 한 번 헹구어 외부 박테리아를 줄입니다.
- 웜 내장에서 부착되지 않은 박테리아를 제거하십시오.
- 웜의 각 샘플을 1mL의 S 배지 + 2x 열사열 OP50에 배양 튜브에 재현탁시킨다.
- 25°C에서 20-30분 동안 인큐베이션하여 장으로부터 임의의 부착되지 않은 박테리아의 통과를 허용한다.
참고: 이것은 또한 루멘으로부터 임의의 세포외 형광 단백질을 제거하고, 특히 산-고속 형광단(예를 들어, mCherry, dsRed)이 사용되는 경우, 장 상피에 부착된 표지된 박테리아의 보다 명확한 시각화를 가능하게 할 것이다.
- 표면 표백제 웜은 외부 박테리아를 제거합니다.
- 퍼지 된 웜을 차가운 M9TX-01 1mL로 두 번 헹구고 상층액을 버리십시오.
- 튜브를 얼음 (선호) 또는 4 °C에서 10 분 동안 식히십시오. 이것은 웜을 마비시키고 표백제 섭취를 방지합니다.
참고: 다른 프로토콜은 레바미솔과 같은 화학적 마비제를 사용합니다. 이것은 유해 폐기물 스트림의 추가를 요구하는 확립된 접근법(33 )이다. - 얼음처럼 차가운 M9 웜 버퍼 1mL와 무향 표백제(8.25% 수산화나트륨, 1:1000 또는 1:2000 v/v)를 각 튜브에 넣습니다. 튜브가 얼음 (선호) 또는 4 °C에서 적어도 10 분 동안 앉아 외부 박테리아를 죽일 수 있도록하십시오.
참고: 표백제 농도가 1:1000을 초과하지 마십시오. 마비 된 웜에서도 사망률이 발생할 수 있습니다. - 표백제 버퍼를 피펫 오프하고 버리고; 튜브를 얼음으로 돌려 보내 표백제가 제거 될 때까지 웜이 펌핑을 재개하지 않도록하십시오.
- 차가운 M9TX-01 1mL를 각 튜브에 넣습니다. 미니원심분리기(25°C에서 2,000 x g )에서 ~5초 동안 스핀; 튜브를 얼음으로 되돌려 놓습니다. 상층액을 제거하고 버리십시오.
- 차가운 M9TX-01 1mL와 함께 이 헹굼 단계를 반복하여 상층액을 최대한 많이 버립니다.
참고: 추가 실험을 위해 웜을 사용하는 경우 투과 단계(프로토콜 3.9)를 건너뛰고 대신 갓 표면 표백된 성인을 6cm 페트리 접시의 얼음처럼 차가운 완충액으로 옮기고 프로토콜 3.10에서와 같이 웜을 실험 조건으로 분리합니다. 운동성이 재개되는 것을 방지하기 위해 웜을 차갑게 유지하지만 신속하게 작업하십시오 - 얼음 위에서 >30 분 동안 웜을 유지하면 잠재적으로 정상적인 활동을 <100 % 재개 할 수 있습니다34.
- 소듐 도데실 설페이트 및 디티오트리에톨(0.25% SDS + 300 mM DTT)을 사용한 웜 큐티클의 화학적 투과화(35 기준)
주의: DTT는 환원제이자 자극제입니다. PPE를 착용하고 건조한 스톡이나 용액을 취급 할 때 흄 후드에서 작업하십시오. 위험한 폐기물 흐름이 필요합니다.- 흄 후드에서 각 샘플에 대해 100μL를 허용하기에 충분한 SDS/DTT 용액을 준비하십시오. 1mL의 경우, 1.5mL 마이크로원심분리 튜브에 965μL의 M9 웜 버퍼 또는 M9TX-01을 첨가하고, 5μL의 5%(w/v) SDS 및 30μL의 1M DTT를 첨가한다.
참고: 1 M DTT 용액 (수성)은 효능을 보장하기 위해 신선하게 준비하거나 -20 °C의 분취량으로 보관해야합니다. Aliquots는 과도한 동결 해동 사이클링을 피하기 위해 두세 번의 실험에서 사용할 수 있도록 크기를 조정해야합니다. - 표면 표백 웜이 포함된 마이크로 원심분리 튜브를 실온 튜브 랙으로 옮깁니다. 각 튜브는 ~ 20 μL의 완충액에 웜을 포함해야합니다.
- 100μL의 SDS/DTT 용액을 각 웜 샘플에 추가합니다. 남아있는 SDS/DTT 용액은 적절한 유해 폐기물 흐름에 폐기하십시오.
- 성인 웜의 내성 큐티클을 부분적으로 분해하기 위해 벤치에서 최대 8 분 동안 치료를 진행하십시오. 웜은이 시간 동안 죽고 튜브 바닥에 정착합니다.
- 투과 시간이 끝나면 SDS/DTT 상청액을 조심스럽게 피펫팅하여 적절한 SDS/DTT 유해 폐기물 흐름에 폐기하십시오.
- M9TX-01 1mL를 각 튜브에 넣습니다. 테이블 상단 원심 분리기에서 잠깐 회전하여 웜을 펠릿화하거나 웜이 중력에 의해 튜브 바닥에 정착 할 수있게 한 다음 상층액을 뽑아 SDS / DTT 유해 폐기물 스트림에 처분하십시오.
- 사용할 준비가 될 때까지 웜을 1mL M9 웜 버퍼 + 0.1% 트리톤 X-100에 재현탁합니다.
- 흄 후드에서 각 샘플에 대해 100μL를 허용하기에 충분한 SDS/DTT 용액을 준비하십시오. 1mL의 경우, 1.5mL 마이크로원심분리 튜브에 965μL의 M9 웜 버퍼 또는 M9TX-01을 첨가하고, 5μL의 5%(w/v) SDS 및 30μL의 1M DTT를 첨가한다.
- 웜을 실리콘 카바이드 그릿이 있는 깊은 96웰 플레이트로 분리하여 기계적 파괴를 일으킵니다. 96웰 파괴판을 아래와 같이 준비한다.
- 멸균 2 mL 딥 웰 96-웰 플레이트 및 매칭 실리콘 96-웰 플레이트 커버를 얻었다.
참고: 조직 파괴자용 96웰 어댑터와 호환되는 플레이트를 사용하는 것이 중요합니다. 외부 치수의 작은 차이는 어댑터에서 제거 할 수있는 플레이트와 할 수없는 플레이트의 차이를 만듭니다. - 멸균 스쿱 주걱을 사용하여 웜을 수용 할 플레이트의 각 웰에 소량의 멸균 36 그릿 탄화 규소를 추가하십시오. 우물 바닥을 간신히 덮을 수있는 충분한 모래를 사용하십시오 (우물 당 약 0.2g). 과도한 재료는 내용물을 검색 할 때 우물 바닥에 피펫 팁을 얻는 것을 어렵게 만듭니다.
- 180μL의 M9 웜 버퍼를 각 웰에 첨가한다.
- 열이나 행에 레이블을 지정하여 각 샘플이 어디로 갈지를 표시한 다음 실리콘 96웰 플레이트 커버로 플레이트를 느슨하게 덮습니다.
- 멸균 2 mL 딥 웰 96-웰 플레이트 및 매칭 실리콘 96-웰 플레이트 커버를 얻었다.
- 파괴를 위해 개별 웜을 96 웰 플레이트로 옮깁니다.
- 투과 된 웜을 ~ 1cm 깊이까지 접시를 채우기에 충분한 M9TX-01이 들어있는 작은 (35 또는 60mm) 페트리 접시로 조심스럽게 옮깁니다.
참고 : 많은 수의 웜이 존재하는 경우, 액체가 붐비게되고 개별 웜을 피펫하는 것이 어려울 것이므로 전체 샘플을 옮기는 것이 불가능할 수 있습니다. - 해부 현미경 또는 기타 저배율 장치를 사용하여 20μL 부피의 개별 웜을 피펫팅하고 이러한 웜을 96웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다.
참고 : 갓 죽인 웜 만 수확하는 것이 가장 좋습니다. 이 웜은 한동안 죽었을 수 있으므로 단단한 선형 모양의 웜을 피하십시오. 구부러진 또는 S 자형 인 웜을 정상적인 총 생리학과 손상되지 않은 내장으로 가져 가보십시오. - 각 볼륨을 옮긴 후 선택한 웜이 실제로 우물로 배출되었는지 확인하십시오. 이렇게하려면 페트리 접시의 맑은 영역에서 20 μL의 M9TX-01을 피펫팅하고 전체 부피를 접시에 다시 방출하십시오. 이것은 일반적으로 피펫에 붙어있는 경우 웜을 배출합니다. 웜이 막힌 경우 웰에서 20μL를 제거하고 다시 옮겨 보십시오.
- 모든 웜이 이송되면 96웰 플레이트를 시중에서 판매되는 유연한 용지 지원 씰링 필름(2 x 2 정사각형) 시트로 덮고 밀봉 필름의 종이 지지면이 샘플 웰 위로 향하고 있는지 확인합니다. 밀봉 필름을 너무 얇게 연신하지 않도록 주의하거나 나중에 제거하기가 매우 어려울 수 있습니다.
- 실리콘 밀봉 매트를 플렉시블 실링 필름의 상부에 가볍게 놓으십시오; 이때 덮개를 우물 안으로 누르지 마십시오.
- 플레이트를 4°C로 옮겨 30-60분 동안 식힌다. 이렇게하면 파괴 중에 과열이 방지되어 샘플이 손상 될 수 있습니다.
참고: 이것은 프로토콜의 중단점입니다. 대부분의 경우, 플레이트는 분쇄하기 전에 4°C에서 최대 4시간 동안 방치할 수 있습니다. 박테리아 수를 바꿀 것이므로 웜을 밤새 두지 마십시오.
- 투과 된 웜을 ~ 1cm 깊이까지 접시를 채우기에 충분한 M9TX-01이 들어있는 작은 (35 또는 60mm) 페트리 접시로 조심스럽게 옮깁니다.
- 96웰 플레이트를 조직 파괴기에 적재하여 웜 조직을 분해하고 장내 박테리아를 방출합니다.
참고: (선택 사항) 다이제스트에 홀수 96웰 플레이트를 사용하는 경우, 진행하기 전에 카운터웨이트를 준비해야 합니다. 빈 깊은 96웰 플레이트를 사용하고 첫 번째 플레이트와 같은 무게가 나갈 때까지 우물을 물로 채 웁니다.- 실리콘 씰링 매트를 웰에 단단히 눌러 씰을 만들고 뚜껑이 플레이트의 전체 표면에 평평하게 놓여 있는지 확인하십시오.
주: 연신 후 플렉시블 씰링 필름이 너무 두꺼우면 실리콘 뚜껑을 고정하여 모든 웰에 평평하게 놓기가 어려울 수 있습니다. 이로 인해 씰이 불충분하고 흔들림 중에 잘 오염됩니다. - 96-웰 플레이트 어댑터를 사용하여 조직 파괴자에 플레이트를 고정하십시오. 플레이트를 30Hz에서 1분 동안 흔든 다음 플레이트를 180° 회전하고 1분 동안 다시 흔든다. 이것은 판의 모든 우물에서 심지어 혼란을 보장하는 데 도움이 될 것입니다.
- 플레이트를 벤치에 두세 번 단단히 두세 번 탭하여 유연한 씰링 필름에서 그릿을 제거합니다.
- 두 개의 96웰 플레이트 어댑터가 있는 대형 원심분리기를 사용하여 플레이트를 2400 x g 에서 2분 동안 아래로 돌려 모든 재료를 웰 바닥에 모으십시오.
- 실리콘 뚜껑을 분리하고 플렉시블 씰링 필름을 조심스럽게 떼어냅니다.
참고: 플렉시블 씰링 필름이 웰에 달라붙으면 200μL 피펫 팁을 사용하여 제거하십시오. 이것은 플렉시블 실링 필름이 너무 얇게 연신되었을 때 일반적입니다.
- 실리콘 씰링 매트를 웰에 단단히 눌러 씰을 만들고 뚜껑이 플레이트의 전체 표면에 평평하게 놓여 있는지 확인하십시오.
- 웜 다이제스트 샘플을 96웰 플레이트에서 300μL로 연속 희석합니다.
- 200 μL로 설정된 다중 웰 피펫터를 사용하여 여러 번 천천히 조심스럽게 피펫을 위아래로 피펫하여 웰의 내용물을 다시 혼합 한 다음 가능한 한 많은 액체를 뽑습니다. 이 액체를 단계 3.3에서 준비된 96-웰 플레이트의 맨 위 행으로 옮깁니다.
- 20μL로 설정된 96웰 피펫터를 사용하여 이 부피의 액체를 맨 위 행에서 제거하고 B행 피펫에 8-10x 위아래로 분배하여 혼합합니다. 팁을 버리십시오.
- 행 B의 0.1x 샘플부터 시작하여 3.13.2단계를 반복하여 행 C에서 0.01x 희석 샘플을 만듭니다.
- 3.13.2단계를 다시 반복하여 C 행에서 D 행으로 이동합니다.
- 박테리아 정량화를 위해 고체 한천 위에 플레이트. 모노콜로니화된 웜의 경우, 일반적으로 한천 플레이트 상에 각 희석액[1x-0.001x]의 10-20 μL 방울을 플레이트화하는 것으로 충분하다. 다종 콜로니화를 위해, 플레이트 각각을 100 μL 10 cm 한천 플레이트 상에 피펫팅하여 개별적으로 희석하고; 유리 도금 구슬을 사용하여 즉시 퍼뜨립니다.
4. 재사용을 위한 실리콘 카바이드 모래 청소
참고 :이 절차는 실험 후 재사용을 위해 연삭 재료 인 탄화 규소 그릿을 청소하고 살균하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 실리콘 카바이드 그릿이 산업 제품이며 사전 멸균되지 않으므로 처음 사용하기 전에 완전히 따라야합니다. Si-carbide grit (3.2 g / cc)는 거친 샘플을 파괴하기 위해 효율적으로 작동하는 조밀하고 거친 가장자리의 재료입니다. 그러나 입자는 반복 사용으로 마모 될 수 있으며 마모가 분명 해지면 교체해야합니다. 다행히도이 재료는 저렴하며 일반적으로 판매되는 크기 (~ 1lb)는 많은 실험에 충분합니다.
- 도금을 위해 샘플을 제거한 후 96 웰 플레이트의 모든 웰에 10 % 표백제 용액을 넣고 적어도 10 분 동안 그대로 두십시오.
- 96웰 플레이트를 작은 하이사이드 트레이 또는 모든 내용물을 잡을 수 있을 만큼 충분히 큰 빈 P1000 피펫 팁 용기 위로 빠르게 뒤집어 그릿의 대부분을 제거합니다. 그릿은 트레이 바닥으로 즉시 가라 앉습니다. 표백제 용액을 싱크대에 붓습니다.
- 96웰 플레이트를 수돗물로 다시 채우고 같은 트레이에 뒤집어 남은 그릿을 헹구십시오. 싱크대에 물을 붓습니다.
- 접시에 모래가 완전히 제거 될 때까지 수돗물로 한 세 번 더 반복하십시오.
- 수돗물에 그릿 2 배를 헹구고 매번 트레이를 채 웁니다.
참고: 96웰 딥웰 플레이트는 실험실 식기 세척기에서 세척하고, 호일로 안전하게 덮고, 다른 재사용 가능한 플라스틱으로 오토클레이브할 수 있습니다. 그릿은 즉시 씻을 필요가 없으며이 시점에서 따로 보관할 수 있습니다. 사용 된 그릿은 일반적으로 세척 및 오토 클레이빙 전에 여러 실험에서 축적됩니다. - 실험실 세제 용액에서 그릿을 30 분 동안 씻고 소용돌이 치거나 금속 주걱과 혼합하여 때때로 동요시킵니다.
- 수돗물의 여러 가지 (8-10) 변화로 세제의 모든 흔적을 헹구고 증류수로 2x를 헹구십시오.
- 그릿을 얕은 폴리프로필렌 오토클레이브 트레이와 같은 열린 트레이에 퍼뜨리고, 40-70°C에서 수 시간 동안 건조시킨다.
참고 : 건조 할 때 모래가 뭉툭한 경우 청소하거나 충분히 헹구지 않았습니다. 단계 4.6부터 세척 프로토콜을 반복하고 4.7단계에서 헹굼을 추가합니다. - 깨끗하고 건조한 그릿을 스크류 탑 오토클레이브 가능한 유리 병에 최대 깊이 5-6cm까지 분배하십시오. 살균하기 위해 30 분 동안 사전 진공 사이클에 오토클레이브.
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Representative Results
살아있는 벌레의 표백제 살균
표면 표백 된 웜은 운동성이 회복되고 배설이 재개 될 때까지 외부 박테리아가 효과적으로 없습니다. 여기에 사용된 조건 하에서, 냉마비 웜에서 장-관련 박테리아를 방해하지 않으면서 완충액 내의 박테리아의 급속한 멸종이 관찰된다(도 1A-C, 보충 그림 2, 비디오 1). 이러한 데이터는 표면 표백이 장 내용물을 손상시키지 않고 외부에서 웜을 살균하는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 나타냅니다 (표면 표백 된 웜과 표백되지 않은 웜 관련 CFU 카운트의 비교는 중요하지 않습니다, Wilcoxon 랭크 합계 테스트 p > 0.05).
다중 샘플 기계적 중단에 대한 변형
웜의 기계적 파괴에 대한 96-well 기술은 사용 된 특정 재료에 견고하며 실질적인 고려 사항은 연삭 재료의 선택을 지시합니다. 이전 보고서33과 유사하게, 수동 중단(그림 2A)은 Si-carbide의 경우 0.229, 대형 유리 비드의 경우 0.243(그림 2C), 소형 유리 비드의 경우 0.227(그림 2D)과 비교하여 모든 버퍼 조건에서 표준 96웰 프로토콜(탄화규소 그릿, 그림 2B)(var(log10CFU) = 0.499)보다 더 많은 이질성을 초래했습니다. ). 그럼에도 불구하고 CFU / 웜 분포의 대부분의 차이는 유의하지 않았습니다 (Kruskal-Wallace, df = 3의 p = 0.017; 큰 비드 대 작은 비드에 대한 중요한 사후 Wilcoxon 테스트, p = 0.021 및 대형 비드 대 탄화 규소 그릿, p = 0.02). 계면활성제로서 Triton X-100의 사용은 개별 인자로서 고려되었을 때 수율의 어떠한 유의한 차이와도 관련되지 않았으며(Kruskal-Wallace, p = 0.94, df = 3), 비록 큰 비드(2.7 mm)가 사용되었을 때 트리톤 대 트리톤 함유 샘플에서 수율의 명백한 증가가 존재하였을 때(도 2C), 아마도 트리톤이 존재할 때 이들 웰에서 관찰된 과도한 "발포"에 기인할 수 있다. 이들 결과는 큰 유리 비드가 균질화 튜브(33)에 사용하기에 이상적이긴 하지만, 96-웰 기술에는 적합하지 않다는 것을 나타낸다. 작은 유리 비드는 합리적인 결과를 산출했지만 (그림 2D), 혼합 및 도금 중에 200μL 피펫 팁이 지속적으로 막혔습니다. 이 분석의 표준 재료 인 탄화 규소 그릿은 저렴하고 표준 팁을 막기에는 너무 크며 유리 비드와 마찬가지로 오토 클레이빙 후 세척하고 재사용할 수 있습니다. 그릿은 소량의 "먼지"를 버퍼로 방출하여 도금을 방해하지 않지만 파괴 생성물을 유세포 측정에 사용하려면 필터링해야합니다.
성인 웜의 박테리아 식민지화의 이질성
개별 웜의 성공적인 파괴는 박테리아 식민지화에서 이질성을 나타냅니다. 동일한 박테리아 풀에서 동시에 식민지화 된 웜의 isogenic 동기화 된 집단의 개인은 장내 박테리아 부하에서 지속적으로 100 배 이상의 범위를 보여줍니다. 이것은 상이한 박테리아 콜로니스트(도 3A) 및 다종 박테리아 군집 상의 콜로니화 동안(도 3B)에 대해 관찰된다. 이러한 이질성은 웜이 형광 단백질(GFP)을 발현하는 박테리아로 콜로니화될 때 형광의 개인-웜 측정에서도 명백하다(도 3C-D). 숙주의 특성은 야생형 브리스톨 N2 웜의 콜로니화를 DAF-2/IGF 돌연변이체에서 동일한 박테리아에 의한 콜로니화와 비교함으로써 알 수 있는 바와 같이, 이러한 이질성을 형성하는 데 중요한 역할을 한다; 이 daf-16 돌연변이체는 N2와 비교하여 많은 박테리아의 더 큰 집단을 지원하는 반면, daf-2는 박테리아 36의 범위에 의한 식민지화에 내성이 있다(도 3B, D). 이 이질성은 숙주와 콜로니스트(들)의 상이한 조합에 걸쳐 변화를 보여주면서 동일한 실험의 상이한 실행에 걸쳐 일관된 구조를 유지하는 특징이다(그림 3E-F).
그룹의 정확한 비교를 위한 개별 이질성의 중요성
개별 이질성의 중요성은 배치 다이제스트가 데이터의 분포를 어떻게 바꿀 수 있는지 고려함으로써 쉽게 알 수 있습니다. 천연 미생물 박테리아 MYb53 (로도코커스 에리스로폴리스) 및 MYb120 (크리서균 spp.)에 의한 식민지화 N2 성인에서 (도 3A, 4A)가 예로서 사용된다. 개별 웜 데이터는 분포에서 분명히 유사하다(두 꼬리 t-검정, p = 0.9, Wilcoxon 순위 합, p = 0.59). 배치 다이제스트의 효과를 시뮬레이션하기 위해 이러한 데이터를 리샘플링할 때 배치 외삽된 CFU/웜은 이러한 분포의 양의 스큐(평균 > 중앙값)로 인해 데이터의 상위 분위수로 이동합니다. 배치 배치가 배치 내의 개인에 대해 효과적으로 평균화되기 때문에 배치 외삽된 CFU/웜은 개별 데이터의 산술 평균을 중심으로 하며, 중앙 한계 정리에 따라 배치가 커짐에 따라 이 평균까지의 거리가 감소합니다(그림 4B-D). 따라서, 생물학적 변이로부터의 신호는 빠르게 손실된다; 일괄 추론된 CFU/웜 측정은 평균으로 수렴되며, 이는 이러한 로그 스케일 분산 데이터의 대표적인 메트릭이 아닙니다. MYb53 대 MYb120에 의한 추론된 콜로니화의 차이는 시뮬레이션된 배치 다이제스트에서 빠르게 유의하게 된다(t-검정 배치 5, p = 0.049; 배치 10, p = 2.27e-4; 배치 20, p = 1.19e-15; 윌콕슨 랭크 합 테스트 배치 5, p = 2.27e-4; 배치 10, p = 2.70e-06; 배치 20, p = 1.80e-09)로서 원래 신호가 가려진다.
미생물 전달에 대한 개별 이질성의 영향
개별 웜은 박테리아 식민지화에서 상당한 이질성을 보이기 때문에이 이질성이 하류 영향을 미치는지 여부를 묻는 것이 합리적입니다. 예를 들어, 전달이 장내 박테리아 부하의 기능 일 수 있다고 기대하는 것이 합리적입니다. 개별 표면 표백 된 웜을 깨끗한 환경으로 옮기면 배설 된 살아있는 박테리아로 환경의 접종을 관찰 할 수 있습니다. 이 실험에서, 공생 Ochrobactrum MYb14-GFP 또는 병원성 S. aureus-GFP의 일반적으로 상당한 개체군 (103-10 5 CFU / 웜, 그림 5)을 운반하는 표면 표백 된 사전 식민지화 된 성인은 NGM 한천에서 열사멸 된 OP50 잔디밭에서 1.5 시간 동안 돌아 다닐 수있었습니다. 이러한 웜이 배설 플레이트에서 재수확되고 박테리아 정량화를 위해 파괴될 때, 살아있는 박테리아의 박테리아 부하와 배설 속도 사이에는 유의한 관계가 없다(통나무-형질전환된 콜로니/hr과 CFU/웜 사이의 피어슨 상관관계: MYb14 rho = 0.19, p = 0.45; S. 아우레우스 로= 0.02, p=0.9)(그림 5). 또한 플레이트에 콜로니의 존재 / 부재와 장내 박테리아 부하 (로그 변환 CFU / 웜을 요인으로 사용하는 이항 로지스틱 회귀 : p = 0.15 및 df = 53) 사이에는 중요한 관계가 없습니다. 플레이트의 상당 부분이 새로운 성장 (MYb14의 경우 9/18 플레이트, S. aureus의 경우 10/36 플레이트)이 없었으며 이는 전반적인 배설률이 낮음을 나타냅니다.
웜이 한천 판으로 배설 될 때, 웜 당 살아있는 배설 박테리아의 실제 수는 웜이 식민지를 통과하여 새로운 성장의 흔적을 만드는 "농업"에 의해 혼란 스럽습니다 (그림 6)37. n 개의 콜로니를 가진 플레이트는 살아있는 콜로니 형성 박테리아가 배설되는 적어도 하나, 그리고 최대 n의 사건을 나타낸다. 이 관찰을 통해 (1,n)에서 실제로 얼마나 많은 배설 사건이 발생했는지 알 수 없으며 각 사건에서 얼마나 많은 박테리아가 배설되었는지 알 수도 없습니다. 따라서 이러한 데이터를 사용하여 장내에서 살아있는 박테리아의 배설 속도를 정확하게 추정하는 것은 불가능합니다. 그러나 일부 경계를 추론 할 수 있습니다. 플레이트 당 콜로니의 수는별로 유익하지 않지만, 존재 / 부재 데이터는 배설률의 대략적인 추론에 사용될 수 있습니다. 간단히하기 위해 살아있는 박테리아의 배설 속도가 박테리아 부하의 함수가 아니며 배설이 푸아송 과정이라고 가정하면 MYb14에서 λ가 0.33 worm-1 hr-1 일 때 18 번의 시험에서 적어도 9 개의 사건을 관찰 ≈할 확률이 ~ 50 %입니다. S. 아우레우스의 경우, 0.2 웜-1 hr-1 ≈ λ의 유사한 그럴듯한 비율이 얻어진다. 이러한 거친 계산은 살아있는 박테리아의 배설 속도가 낮다는 것을 암시하지만, 신뢰할 수있는 추정치를 얻기 위해서는 더 많은 수의 개별 웜에 대해이 과정을보다 정확하게 정량화해야합니다.
데이터 가용성:
여기에 표시된 데이터는 Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2)에서 사용할 수 있습니다.
그림 1. 저농도 표면 표백 처리는 완충액에서 박테리아를 빠르게 죽이지 만 감기 마비 된 웜의 장 공동체를 방해하지는 않습니다. (A-C) 세 가지 농도(1:1000, 1:2000, 1:5000 v/v; 비교를 위한 표백되지 않은 대조군)에서 표면 표백 동안 M9 웜 버퍼의 박테리아 CFU/mL, 표적화 (A) S. 아우레우스 뉴먼, (B) S. enterica LT2 또는 (C) 대장균 OP50. 샘플을 노출 후 20분까지 지시된 시점에서 취하고, 표백제가 플레이트 상의 콜로니를 죽이는 것을 방지하기 위해 멸균 완충액으로 두 번 세척하였다. 1:1000 조건에 대한 데이터는 이러한 데이터가 플롯에 표시되도록 약간 오프셋됩니다. (D-F) 개별 N2 웜의 장내 박테리아 (실험 당 n = 24 개의 웜, 별도의 날에 2 개 또는 세 개의 독립적 인 실행). 표면 표백 및 표백제 웜 관련 CFU 카운트의 모든 비교는 중요하지 않습니다 (Wilcoxon rank-sum test p > 0.05). 회색 수평선은 200μL 부피에서 10μL 분취량을 도금할 때 적어도 하나의 콜로니를 관찰할 확률이 ~60%인 밀도(40CFU/웜)로 정의되는 검출 임계값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 96웰 중단 프로토콜은 일관된 결과를 제공하며 재료 선택에 견고합니다. 48시간 동안 단일 박테리아 종으로 콜로니화된 N2 성인 웜(P. mosselii)을 표준 프로토콜에 따라 표면 표백 및 투과시킨 다음, 개별 웜(조건당 n=24)을 기계적으로 파쇄하여 (A) 전동식 페슬을 사용하여 개별 0.5 mL 튜브에서 수동 파쇄 또는 (B-D ) 프로토콜에 상세히 설명된 96-웰 중단 프로토콜에 대한 변형. 파쇄는 다양한 농도의 Triton X-100 (x축, 0-0.1%, v/v) 및 (B) 36-그릿 탄화규소, (C) 소형(425-600μm) 유리 비드 또는 (D) 대형(2.7mm) 유리 비드 중 하나를 포함하는 M9 웜 버퍼에서 수행되었다. 모든 플롯에 대해 표시된 데이터는 log10(CFU/worm)이며 각 점은 하나의 개별 웜입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. C. elegans 장의 이질적인 박테리아 식민지화. (a) 방법에서와 같이 제조된 N2성인 헤르마프로디트의 단일 종 식민지화. 박테리아는 MYb 천연 웜 마이크로바이옴 수집 (Dirksen et al. 2016) (n = 24 웜, 각각 하나의 실험)과 2 개의 병원체, 스타필로코커스 아우레우스 MSSA 뉴먼 (SA) 및 살모넬라 엔테리카 LT2 (SE) (n = 96-144 웜 2/세 개의 독립적 인 실험에 걸쳐)에서 4 종이다. 천연 마이크로바이옴 종에 의한 콜로니화는 액체 S 배지 + 108 CFU/mL 박테리아에서 25°C에서 48시간 인큐베이션한 후 평가되었다; 병원균에 의한 콜로니화는 NGM 웜 한천 상의 잔디밭에서 25°C에서 24(SA) 또는 48(SE)h에 대해 인큐베이션한 후 평가하였다. (48 시간에, S. aureus의 웜은 대부분 죽었다.) (B) N2, daf-16 (mu86) 및 daf-2 (e1370) 성인의 총 CFU / 웜은 8 종의 최소 천연 미생물에 액체 배지에서 4 일 동안 식민지화되었습니다 (Taylor and Vega, 2021의 데이터)14. (C-D) GFP 발현 박테리아로 콜로니화된 개별 웜에서의 녹색 형광은, 큰 개체 유동 세포측정에 의해 관찰된다. (C)에서, N2 성인의 동기화된 집단은 (A)에 기재된 바와 같이 OP50 (비형광, n=1908 개별 성인 웜), S. 아우레우스 (GFP, n=968), 또는 S. enterica (GFP, n = 1153)로 콜로니화되었고; OP50 대조군은 3일째 성인 N2 웜에서 녹색 채널 자가형광의 전형적인 수준을 나타낸다. (D)에서, N2 (n=1165), daf-16 (mu86) (n=1180), 및 daf-2(e1370) (n=2267)의 동기화된 집단을 성인 (A)에 기재된 바와 같이 플레이트 상에서 2일 동안 공생 오크로박트럼 MYb14-GFP로 콜로니화시켰다. (E-F) S. aureus (E) 및 S. enterica (F)에 의한 식민지화의 일상적인 변화 (패널 A 및 그림 1에서와 동일한 데이터, 실험 당 n = 48 웜). x축은 샘플링 날짜를 나타냅니다. 회색 수평선은 검출 임계값을 나타내며, 밀도는 적어도 하나의 콜로니를 관찰할 확률이 ~60%(단일 종 콜로니화의 경우 40CFU/웜, 다종 콜로니화의 경우 4개의 CFU/웜, 200μL에서 각각 10μL 및 100μL의 도금 부피가 다르기 때문에)로 정의됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 일괄 처리는 왜곡된 로그 스케일 데이터에서 생물학적 변화를 지웁니다. 그림 3의 CFU/웜 데이터는 각 배치 크기에 대해 n=25개의 복제 데이터 복제 세트를 만들기 위해 대체하여 다시 샘플링되었으며, 여기서 크기는 배치당 개별 웜의 수입니다. CFU/웜은 배치당 웜 수로 나뉘어진 각 시뮬레이션된 배치의 총 CFU입니다. 원시 데이터 (패널 A)에서 MYb53의 평균 CFU / 웜은 4450.8 (10 3.6)이고 MYb120의 경우 1398.3 (103.1)입니다. 배치 유추 된 숫자는 배치 크기가 증가함에 따라 이러한 값으로 수렴됩니다 (B, 다섯 개의 웜 / 배치; C, 10 웜 / 배치; D, 20 웜 / 배치), 중앙 한계 정리의 기대치와 일치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 살아있는 박테리아의 배설은 개별 웜의 장에있는 CFU 부하와 잘 관련이 없습니다. 여기서, N2 성인은 S. aureus-GFP 또는 MYb14-GFP의 잔디밭에서 각각 1 또는 2일 동안 먹이서 콜로니화하였다. 검출가능한 GFP 형광을 갖는 웜 (대형 물체 유동 세포계에서 총 GFP > 1.8 로그)을 벌크 집단으로부터 분류하고, 방법에 기재된 바와 같이 표면 표백하고, NGM + 열 사멸 OP50 플레이트로 개별적으로 옮겼다. 로그 변환 콜로니/h와 CFU/웜 사이의 피어슨 상관관계는 유의하지 않다(MYb14 rho = 0.19, p = 0.45; S. 아우레우스 로= 0.02, p=0.9). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 박테리아 "농업"은 한천 판에서 배설 사건의 수를 모호하게합니다. 다음은 웜 배설물에서 MYb14-GFP 식민지가있는 두 개의 플레이트입니다. 첫 번째 플레이트 (A)는 웜 경로를 따라 "농사지는"것에 대한 명확한 증거를 가지고 있으며 콜로니에 걸친 GFP 발현 (황색 색소 침착으로 보임)의 차이에 따라 적어도 두 개의 분리 된 배설 사건을 나타내는 것으로 보입니다. 두 번째 판 (B)은 더 모호하지만 식민지의 위치에 따라 농업을 배제 할 수는 없습니다. 이들 실험에서, N2 성인 웜은 MYb14-GFP의 잔디밭을 함유하는 한천 플레이트에 먹이를 주어 48시간 동안 사전 콜로니화하였다. 콜로니화 후, 웜을 제조하고 방법에 따라 표면 표백한 다음, M9 웜 버퍼 + 0.1% 트리톤 X-100 내지 6 cm NGM+ 열-사멸 OP50 플레이트의 5 μL 분취량으로 옮겼다(5x 농축된 열 사멸된 OP50의 50 μL 스팟이 표면 상에서 건조되도록 함으로써 제조됨). 웜은 25°C에서 1.5시간 동안 로밍할 수 있도록 허용한 다음, 플레이트에서 뽑아 CFU/웜 도금(전동 페슬을 사용하여 개별 0.5mL 튜브에서 20μL 버퍼에서 수동 파쇄)을 위해 파쇄했습니다. 플레이트를 계수하기 전에 2일 동안 25°C에서 인큐베이션하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1. 표면 표백없이 GFP 형광 S. 아우레우스 로 식민지화 된 N2 웜의 시각화. 큐티클의 소수의 형광 세포는 이미지가 웜의 몸체를 통과 할 때 초점 안팎으로 이동하며, 시야가 신체 표면에서 장으로 이동함에 따라 공간적으로 이질적인 장내 식민지화가 보입니다. Z-스택 이미지는 반전된 형광 현미경 상에서 20x 배율로 촬영되었다. 밝은 필드 및 GFP 필터링된 형광 이미지가 겹쳐졌고, Z-스택 전체의 이미지는 공급업체 소프트웨어를 사용하여 함께 꿰매어졌습니다. 이미지는 보충 그림 2A에서와 동일한 슬라이드에서 가져온 것입니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2. 표면 표백으로 GFP 형광 S. 아우레우스 로 식민지화 된 N2 웜의 시각화 (20 분 동안 1:1000 v / v). 형광 박테리아에 의한 공간적으로 이질적인 식민지화는이 개체의 장에서 볼 수 있으며 박테리아는 신체 조직에 침투하여 진행된 감염을 나타냅니다. 큐티클에는 박테리아가 보이지 않습니다. Z-스택 이미지는 반전된 형광 현미경 상에서 20x 배율로 촬영되었다. 밝은 필드 및 GFP 필터링된 형광 이미지가 겹쳐졌고, Z-스택 전체의 이미지는 공급업체 소프트웨어를 사용하여 함께 꿰매어졌습니다. 이미지는 보충 그림 2B에서와 동일한 슬라이드에서 가져온 것입니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1. 프로토콜 개요. 여기서 동기화 된 성인 웜은 적색 박테리아로 단일 식민지화되고, 표면 표백되고, 96 웰 형식으로 개별 웜이 기계적으로 파괴되기 전에 투과됩니다. 장에서 방출 된 박테리아는 CFU / 웜 정량화를 위해 10x 시리즈로 희석 도금됩니다. 표시된 플레이트는 관찰된 이질성에 대해 전형적이다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2. 표면 표백 유무에 관계없이 GFP 형광 S. 아우레우스 로 식민지화 된 N2 웜의 시각화 (20 분 동안 1:1000 v / v). (A) 표백되지 않은 샘플에서, 외부 박테리아는 웜 또는 웜 바디 단편과 관련이없는 녹색 형광의 영역으로서 낮은 배율로 볼 수 있습니다. (B) 표면 표백 샘플에서, GFP 형광은 웜바디의 내부로 제한된다(하나의 웜바디 단편은 중간 이미지로 보인다). 모든 이미지는 거꾸로 된 형광 현미경 상에서 4x 배율로 촬영되었다. 밝은 필드 및 GFP 필터링된 형광 이미지를 오버레이하고, 벤더 소프트웨어를 사용하여 인접한 시야각의 이미지를 함께 꿰매었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 버퍼 및 용액 조리법. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 데이터는 C. elegans의 박테리아 부하의 단일 웜 정량화의 이점과 96-well 파괴 프로토콜에 대해 제시되어 이러한 유형의 대규모 데이터 세트를 신속하고 일관되게 수집 할 수 있습니다. 기존의 방법(33)과 비교하여, 이들 프로토콜은 웜 내의 장내 미생물 군집의 더 높은 처리량 측정을 허용한다.
이 접근법은 도금을 속도 제한 단계로 가지며 진정한 "높은 처리량"이 아닙니다. 대개체 유세포 분석기(도 3C,D)는 개별 웜(16)에서 형광 표지된 박테리아를 정량화하는 데 유용한 고처리량 방법이지만, 동시 형광단의 수는 다종 군집에서는 한계가 있다. 다중 웰 플레이트 중단을 커뮤니티 시퀀싱과 연결하는 것은 처리량을 늘리는 또 다른 방법입니다. 그러나, 여기에 기술된 96-웰 파괴 절차는 박테리아 세포를 온전하게 남겨두도록 특별히 최적화되었다. 세포의 철저한 용해가 바람직한 시퀀싱 기반 분석은 살아있는 박테리아 대신 세포 내용물을 추출하기 위해 핵산 추출 단계 또는 박동 프로토콜 (프로토콜 3.10-3.11)의 변형을 추가해야합니다. 단일 웜 파괴 및 핵산의 추출을위한 프로토콜은 다른 곳에서 출판되었습니다38,39.
웜 장의 박테리아 총 풍부도는 이질적이며, 여기에 표시된 데이터는 배치 기반 측정이 그룹 간의 비교에서 잘못된 결과를 생성 할 수 있음을 시사합니다. 그러나 웜에있는 박테리아 군집의 다른 조치는 일괄 처리의 효과에 덜 민감 할 수 있습니다. 참고로, 웜 관련 공동체의 상대적 풍부도는 미생물 간의 상호 작용이 중립40 인지 아닌지에 관계없이 총 장 인구 규모가14 인 경우 거의 변하지 않는 것으로 보입니다. 카운트 데이터와 비교할 때, 상대적 풍부도 측정은 설명 된 거짓 양성 비율 문제에 덜 취약 할 것이라는 것은 그럴듯합니다. 따라서 커뮤니티 구성을 위해 상대적 풍부도 데이터를 생성하는 시퀀싱 기반 커뮤니티 분석은 단일 웜의 측정이 필요하지 않을 수 있습니다. 이 점에 대한 추가 조사가 필요합니다.
여기에서는 표면 표백을 위해 웜을 마비시키기 위해 냉간 처리를 사용합니다. 다른 연구에 따르면 얼음 위의 시간이 30 분 미만으로 유지되면 웜이 정상 활동을 빠르게 재개 (<15 분)하여 완전한 회복 전에 오랜 기간이 필요할 수있는 화학 마비 제와 달리 추가 분석에서 즉시 사용할 수 있습니다34. 박테리아 정량화를 위해 웜을 즉시 파괴해야하는 경우,이 기능은 필수 불가결하며, 냉장 대 화학 마비의 주요 이점은 통제 된 폐기물 흐름의 필요성을 피하는 것입니다. 연장 된 냉간 처리는 스트레스 반응을 조사 할 때, 특히 온도에 대한 알려진 연결이있는 경우주의해서 사용해야합니다. 여기에 설명된 냉간 마비 프로토콜은 감기 스트레스(20-30분 vs 2-4°C에서 2+h)41,42,43에 대한 실험에서 사용된 것보다 더 짧은 급성 냉기 노출을 수반하며, 1시간 냉 충격은 야생형 웜(43)에서 명백한 표현형을 생성하지 않는다. 4°C에서 단기간(90분) 인큐베이션은 콜드 스트레스 유전자 발현의 변화(TMEM-135::GFP 리포터의 발현에 의해 측정됨)를 유도하지만, 웜이 실온(34)으로 복귀되면 발현은 몇 분 내에 스트레스되지 않은 수준으로 되돌아간다. 그러나 스트레스에 민감한 웜 유전자형에 대한 영향은 야생형보다 더 심각 할 수 있습니다. 이 절차는 사용할 실험 조건 하에서 검증되어야 한다.
여기에 설명 된 표면 표백 프로토콜은 실험에서 외부 미생물의 통과를 제한하거나 제거하는 방법으로 사용될 수 있습니다. 이 방법은 표면 표백으로 곰팡이 오염 물질을 제거하고 L1 / L2 유충 만 신선한 판으로 옮기는 데 추가로 사용되었습니다 (표면 표백 된 성인의 이송으로 인해 오염 물질을 제거하지 못했을 것입니다. 아마도 더 큰 동물의 장에서의 운송으로 인해). 표백제 농도가 1:1000 v/v를 초과하지 않도록 하는 것이 매우 중요하며, 이는 웜의 손상과 사망률이 발생할 수 있기 때문입니다. 이 절차는 실험적 숙주-미생물 진화 및 숙주-병원체 상호작용에 유용할 수 있다. 예를 들어, 여기에서 관찰되는 살아있는 박테리아의 낮은 배설 속도는 헤르마프로디트에서 자손15로의 박테리아 전달에 대해 관찰된 매우 가변적인 비율을 설명하는 데 도움이 될 수 있다. 여기에서 관찰 된 장내 박테리아 부하와 배설 속도 사이의 상관 관계가 없다는 것은 흥미 롭지 만 추가 조사가 필요합니다. 이 관측치가 보유할 위치(또는 보유 여부)를 결정하기 위해 조건 범위에 걸쳐 더 많은 수의 데이터 요소가 필요합니다.
표면 표백에 의해 제공되는 범위 내에서 웜을 청소할 필요가 항상 필요한 것은 아닙니다. 멸균 완충액의 다중 세척은 최소 예상 CFU/웜이 완충 상청액의 박테리아 농도보다 훨씬 높은(10-100배) 경우 웜이 단일 미생물로 내부적으로 콜로니화될 때 충분할 수 있습니다( 그림 1 참조). 또한, 관심있는 미생물이 주로 큐티클을 식민지화하면 표면 표백을 분명히 피해야합니다. 혼합 미생물 군집을 다룰 때 (샘플의 모든 콜로니 / 판독이 환경이 아닌 웜 관련 박테리아에서 나온 것임을 보장하기 위해), 큐티클에 부착 된 박테리아가 내재 된 집단을 읽는 것을 방해 할 때, 예상되는 최소 CFU / 웜이 낮을 때 정확성을 보장하기 위해 철저한 청소가 더 중요합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 H. Schulenberg와 C. LaRock이이 실험에 사용 된 박테리아 균주를 관대하게 공유 한 것을 인정하고 싶습니다. 이 작업은 Emory University와 NSF (PHY2014173)의 기금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
| 96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
| 96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
| 96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
| Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
| Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
| Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
| BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
| Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
| Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
| Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
| Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
| DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
| Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
| Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
| Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
| Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
| Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
| Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
| Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
| Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
| PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
| Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
| Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
| Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
| Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
| Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
| Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |
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