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Biology

Rigenerazione epiteliale intestinale in risposta all'irradiazione ionizzante

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

Il tratto gastrointestinale è uno degli organi più sensibili alle lesioni sui trattamenti radioterapeutici contro il cancro. È allo stesso tempo un sistema di organi con una delle più alte capacità rigenerative a seguito di tali insulti. Il protocollo presentato descrive un metodo efficace per studiare la capacità rigenerativa dell'epitelio intestinale.

Abstract

L'epitelio intestinale è costituito da un singolo strato di cellule ma contiene più tipi di cellule terminalmente differenziate, che sono generate dalla proliferazione attiva delle cellule staminali intestinali situate sul fondo delle cripte intestinali. Tuttavia, durante gli eventi di danno intestinale acuto, queste cellule staminali intestinali attive subiscono la morte cellulare. L'irradiazione gamma è un trattamento del cancro del colon-retto ampiamente utilizzato che, sebbene terapeuticamente efficace, ha l'effetto collaterale di esaurire il pool di cellule staminali attive. Infatti, i pazienti sperimentano frequentemente la sindrome da radiazioni gastrointestinali durante la radioterapia, in parte a causa della deplezione di cellule staminali attive. La perdita di cellule staminali intestinali attive nelle cripte intestinali attiva un pool di cellule staminali intestinali di riserva tipicamente quiescenti e induce la dedifferenziazione delle cellule precursori secretorie ed enterocitarie. Se non fosse per queste cellule, l'epitelio intestinale mancherebbe della capacità di recuperare dalla radioterapia e da altri importanti insulti tissutali. I nuovi progressi nelle tecnologie di tracciamento del lignaggio consentono il monitoraggio dell'attivazione, della differenziazione e della migrazione delle cellule durante la rigenerazione e sono stati impiegati con successo per studiarlo nell'intestino. Questo studio mira a rappresentare un metodo per l'analisi delle cellule all'interno dell'epitelio intestinale del topo dopo lesioni da radiazioni.

Introduction

L'epitelio intestinale umano coprirebbe approssimativamente la superficie di mezzo campo da badminton se posizionato completamente piatto1. Invece, questo singolo strato cellulare che separa gli esseri umani dal contenuto delle loro viscere è compattato in una serie di proiezioni simili a dita, villi e rientranze, cripte che massimizzano la superficie dell'intestino. Le cellule dell'epitelio si differenziano lungo un asse crypt-villus. I villi sono costituiti principalmente da enterociti che assorbono i nutrienti, cellule caliciformi che secernono muco e cellule enteroendocrine che producono ormoni, mentre le cripte consistono principalmente di cellule di Paneth produttrici di defensina, cellule staminali attive e di riserva e cellule progenitrici 2,3,4,5. Inoltre, la comunicazione bidirezionale che queste cellule hanno con le cellule stromali e immunitarie del compartimento mesenchimale sottostante e il microbiota del lume generano una complessa rete di interazioni che mantiene l'omeostasi intestinale ed è fondamentale per il recupero dopo l'infortunio 6,7,8.

L'epitelio intestinale è il tessuto auto-rinnovante più rapidamente nel corpo umano, con un tasso di turnover di 2-6 giorni 9,10,11. Durante l'omeostasi, le cellule staminali attive alla base delle cripte intestinali (cellule colonnari della base della cripta), contrassegnate dall'espressione del recettore 5 accoppiato alla proteina G contenente ripetizioni ricco di leucina (LGR5), si dividono rapidamente e forniscono cellule progenitrici che si differenziano in tutte le altre linee epiteliali intestinali. Tuttavia, a causa del loro alto tasso mitotico, le cellule staminali attive e i loro progenitori immediati sono particolarmente sensibili alle lesioni da radiazioni gamma e subiscono apoptosi dopo irradiazione 5,12,13,14. Alla loro perdita, le cellule staminali di riserva e le cellule non staminali (sottopopolazioni di progenitori e alcune cellule terminalmente differenziate) all'interno delle cripte intestinali subiscono l'attivazione e ricostituiscono il compartimento della cripta basale, che può quindi ricostituire le popolazioni cellulari dei villi e, quindi, rigenerare l'epitelio intestinale15. Utilizzando tecniche di tracciamento del lignaggio, diversi gruppi di ricerca hanno dimostrato che le cellule staminali di riserva (quiescenti) sono in grado di supportare la rigenerazione dopo la perdita di cellule staminali attive 13,16,17,18,19,20,21,22. Queste cellule sono caratterizzate dalla presenza dell'oncogene della proteina 1 del complesso polycomb (Bmi1), del gene della trascrittasi inversa della telomerasi di topo (mTert), dell'omeobox Hop (Hopx) e del gene della proteina 1 di ripetizione ricco di leucina (Lrig1). Inoltre, è stato dimostrato che le cellule non staminali sono in grado di ricostituire le cripte intestinali in caso di lesioni 23,24,25,26,27,28,29,30,31. In particolare, è stato dimostrato che i progenitori delle cellule secretorie e degli enterociti subiscono una dedifferenziazione in caso di lesione, ritornano a cellule staminali e supportano la rigenerazione dell'epitelio intestinale. Studi recenti hanno identificato cellule che esprimono marcatori multipli che possiedono la capacità di acquisire caratteristiche simili a staminali in caso di lesione (come DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Sorprendentemente, Yu et al. hanno dimostrato che anche le cellule di Paneth mature (LYZ +) possono contribuire alla rigenerazione intestinale37. Inoltre, oltre a causare l'apoptosi delle cellule epiteliali intestinali e ad interrompere la funzione della barriera epiteliale, l'irradiazione provoca disbiosi della flora intestinale, attivazione delle cellule immunitarie e inizio di una risposta pro-infiammatoria e attivazione delle cellule mesenchimali e stromali38,39.

La radiazione gamma è un prezioso strumento terapeutico nel trattamento del cancro, soprattutto per i tumori del colon-retto40. Tuttavia, l'irradiazione influisce significativamente sull'omeostasi intestinale inducendo danni alle cellule, che portano all'apoptosi. L'esposizione alle radiazioni provoca molteplici perturbazioni che rallentano il recupero di un paziente ed è caratterizzata da lesioni e infiammazioni della mucosa nella fase acuta e diarrea, incontinenza, sanguinamento e dolore addominale a lungo termine. Questa panoplia di manifestazioni è indicata come tossicità da radiazioni gastrointestinali. Inoltre, la progressione indotta dalle radiazioni della fibrosi transmurale e/o della sclerosi vascolare può manifestarsi solo anni dopo il trattamento38,41. Contemporaneamente alla lesione stessa, la radiazione induce una risposta di riparazione nelle cellule intestinali che attiva le vie di segnalazione responsabili dell'avvio e dell'orchestrazione della rigenerazione42. La malattia dell'intestino tenue indotta da radiazioni può originarsi dalla radioterapia pelvica o addominale fornita ad altri organi (come cervice, prostata, pancreas, retto)41,43,44,45,46. Il danno da irradiazione intestinale è, quindi, un problema clinico significativo e una migliore comprensione della fisiopatologia risultante è probabile che faccia avanzare lo sviluppo di interventi per alleviare le complicanze gastrointestinali associate alla radioterapia. Esistono altre tecniche che consentono di indagare lo scopo rigenerativo dell'epitelio intestinale oltre alle radiazioni. Sono stati sviluppati modelli murini transgenici e chimici per studiare l'infiammazione e la successiva rigenerazione47. Il destrano solfato di sodio (DSS) induce infiammazione nell'intestino e porta allo sviluppo di caratteristiche simili a quelle della malattia infiammatoria intestinale48. Una combinazione di trattamento DSS con il composto pro-cancerogeno azoxymethane (AOM) può provocare lo sviluppo di cancro associato alla colite48,49. La lesione indotta da ischemia da riperfusione è un altro metodo impiegato per studiare il potenziale rigenerativo dell'epitelio intestinale. Questa tecnica richiede esperienza e conoscenza chirurgica50. Inoltre, le suddette tecniche causano diversi tipi di lesioni rispetto alle radiazioni e possono portare al coinvolgimento di diversi meccanismi di rigenerazione. Inoltre, questi modelli richiedono molto tempo, mentre la tecnica di radiazione è abbastanza breve. Recentemente, metodi in vitro che utilizzano enteroidi e colonoidi generati dall'intestino e dal colon sono stati utilizzati in combinazione con lesioni da radiazioni per studiare i meccanismi di rigenerazione intestinale51,52. Tuttavia, queste tecniche non ricapitolano completamente l'organo che modellano53,54.

Il protocollo presentato include la descrizione di un modello murino di danno da radiazioni gamma in combinazione con un modello genetico che, a seguito del trattamento con tamoxifene, consente di tracciare linee originate dalla popolazione di cellule staminali di riserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Questo modello utilizza un'irradiazione totale corporea di 12 Gy, che induce lesioni intestinali abbastanza significative da attivare le cellule staminali di riserva, consentendo comunque la successiva indagine della capacità rigenerativa intestinale entro 7 giorni dalla lesione55.

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Protocol

Tutti i topi sono stati ospitati nella Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) della Stony Brook University. Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Stony Brook University (IACUC) ha approvato tutti gli studi e le procedure che coinvolgono soggetti animali. Gli esperimenti che coinvolgono soggetti animali sono stati condotti rigorosamente in conformità con il protocollo di gestione degli animali approvato (IACUC # 245094).

NOTA: I ceppi di topo B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) e B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) sono stati ottenuti commercialmente (vedi tabella dei materiali) e incrociati per ottenere Bmi1-Cre ER; Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) topi, come descritto in precedenza56,57,58.

1. Alloggiamento di Bmi1-Cre ER; Mouse Rosa26 eYFP

  1. Tenere i topi in una struttura per animali a una temperatura compresa tra 68-72 ° F e umidità compresa tra 30-70%, in un ciclo luce / buio di 12 ore / 12 ore, con acqua e normale chow ad libitum.
  2. Prima degli esperimenti, confermare i genotipi dei topi utilizzando una tecnica di genotipizzazione PCR standard57,58.

2. Preparazione di animali e materiali

  1. Trasferire i topi nella stanza sperimentale almeno 7 giorni prima di qualsiasi sperimentazione per consentire ai topi di acclimatarsi.
  2. Abbina gli animali sperimentali e di controllo in base al sesso e all'età.
  3. Sottoporre gli animali di controllo a ricombinazione Cre-mediata indotta da tamoxifene, ma non a irradiazione (trattamento fittizio, 0 Gy), assicurandosi nel contempo che gli animali da esperimento ricevano l'iniezione di tamoxifene e siano esposti all'irradiazione gamma.
  4. Preparare la soluzione di tamoxifene. Risospendere la polvere di tamoxifene in olio di mais sterile ad una concentrazione di 30 mg/ml. Sonicare per 3 minuti in cicli di 30 s ON e 30 s OFF con ampiezza del 60% e quindi ruotare al buio per 1 ora a temperatura ambiente (RT). La soluzione di tamoxifene può essere congelata a -20 °C ma non congelarla/scongelarla più di una volta. Preferibilmente, preparare una soluzione fresca ogni volta e non conservarla.
    NOTA: Il tamoxifene è sensibile alla luce. Avvolgerlo con carta stagnola durante la rotazione a temperatura ambiente.
    ATTENZIONE: Il tamoxifene è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolo per la salute (GHS08) e pericolo per l'ambiente (GHS09).
  5. Preparare la soluzione madre di 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU). Risospendere la polvere di EdU in 1/5 del volume totale di dimetilsolfossido sterile (DMSO) e aggiungere lentamente i restanti 4/5 del volume totale di acqua ultrapura sterile. A completa dissoluzione, aliquote e conservare a -20 °C.
    ATTENZIONE: 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU) e dimetilsolfossido (DMSO) sono sostanze potenzialmente pericolose: pericolo per la salute (H340 e H631 e H227, H315 e H319, rispettivamente). EdU può causare difetti genetici ed è sospettato di danneggiare la fertilità o i bambini non ancora nati, e DMSO può causare irritazione della pelle e degli occhi.
  6. Preparare i reagenti per la raccolta e la fissazione dei tessuti: diluire l'etanolo per preparare una soluzione acquosa al 70%, raffreddare DPBS a 4 °C e preparare il tampone fissativo di Bouin modificato (50% etanolo e 5% acido acetico in H2O distillato) e formalina tamponata al 10%.
    ATTENZIONE: L'alcol etilico è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolo per la salute (H225-H319), infiammabile (GHS02) e causa tossicità acuta (GHS07). L'acido acetico è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolosa per la salute (H226-H314), infiammabile (GHS02) e corrosiva (GHS05). La formalina è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolosa per la salute (H350, H315, H317, H318, H370) e corrosiva. La formalina può causare cancro, irritazione della pelle e degli occhi, danni agli organi e reazioni allergiche cutanee.
  7. Preparare l'attrezzatura necessaria per l'eutanasia secondo un metodo approvato (camera CO2 , per esempio), un kit di dissezione dei topi (forbici, pinze), piastre di Petri, un ago da 16 G gavage attaccato a una siringa da 10 ml per lavare l'intestino e cassette istologiche.

3. Irradiazione gamma total-body (TBI) e raccolta di tessuti

  1. Due giorni prima dell'esposizione all'irradiazione gamma, iniettare agli animali da esperimento una singola dose di tamoxifene per indurre la ricombinazione Cre-mediata e il tracciamento del lignaggio cellulare BMI1/EYFP+ . Pesare ogni animale e calcolare una dose di 40 mg/kg di peso corporeo di tamoxifene risospeso in olio di mais. Disinfettare la zona addominale con etanolo al 70% e somministrare tamoxifene per via intraperitoneale utilizzando un ago da 27G collegato a una siringa da 1 ml.
  2. Osservare gli animali per le successive 48 ore per escludere potenziali tossicità da tamoxifene.
  3. Trasferire i topi nella sala di irradiazione come specificato dall'istituzione locale.
  4. Calcolare il tempo di esposizione all'irradiazione rilasciato dalla sorgente di 137Cs in base all'attuale intensità di dose esatta. Ad esempio, se l'intensità di dose corrente è pari a 75,9 rad/min (0,759 Gy min−1 = 75,9 cGy m−1), il tempo di esposizione in minuti è calcolato come dose desiderata/0,759. Per irradiare gli animali ad una dose di 12 Gy TBI, il tempo di esposizione è ~15,81 min (15 min e 48 s).
  5. Disinfettare la camera del campione nell'irradiatore gamma con una soluzione di etanolo al 70%; Posizionare il tappetino assorbente e gli animali all'interno della camera del campione.
    NOTA: Gli animali trattati con finzione devono essere collocati nella sala di irradiazione ma non esposti all'irradiazione gamma.
  6. Posizionare il coperchio e chiudere la camera.
  7. Programmare l'irradiatore gamma per esporre gli animali a 12 Gy TBI.
    1. Accendere la macchina ruotando la chiave nella posizione START.
    2. Immettere il numero dell'operatore utilizzando una tastiera numerica e confermare premendo INVIO.
    3. Immettere il numero PIN utilizzando una tastiera numerica e confermare premendo INVIO.
    4. Premere 1 per le opzioni.
    5. Premere 1 per le impostazioni del timer.
    6. Premere 1 per il tempo di irradiazione.
    7. Immettere l'impostazione del timer per il ciclo successivo utilizzando una tastiera numerica (formato hh:mm:ss) e confermare premendo INVIO.
    8. Confermare nuovamente le impostazioni premendo INVIO.
    9. Tornare al menu Home premendo CLEAR 2x.
    10. Premere START per avviare l'esposizione.
  8. Lasciare la stanza per il tempo di esposizione attiva. La macchina si arresterà automaticamente allo scadere del tempo preimpostato e inizierà a emettere un segnale acustico.
    ATTENZIONE: Il cesio-137 (137Cs) è una sostanza pericolosa mortale (pericolo per la salute: H314). L'esposizione esterna a grandi quantità di 137C può causare ustioni, malattie acute da radiazioni e persino la morte.
  9. Spegnere la macchina ruotando la chiave in posizione STOP.
  10. Aprire la camera di campionamento, togliere il coperchio, trasferire gli animali nella gabbia e disinfettare la camera di campionamento con una soluzione di etanolo al 70%.
  11. Trasferire gli animali nella stanza di stabulazione convenzionale e osservare le loro condizioni dopo il trattamento.
  12. Monitorare il peso degli animali ogni giorno e eutanasia immediatamente (nonostante il punto temporale pianificato) se si osservano sintomi di alterato benessere, angoscia o perdita di peso superiore al 15% del peso corporeo iniziale.
  13. Tre ore prima dell'eutanasia pianificata disinfettare la zona addominale e, utilizzando una siringa da insulina da 28G, iniettare nei topi 100 μL di soluzione madre di EdU (somministrata per via intraperitoneale).
  14. Raccogliere gli intestini prossimali a 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 168 h dopo l'irradiazione.
    1. Eseguire l'eutanasia CO2 secondo gli standard dell'istituzione di origine.
      ATTENZIONE: L'anidride carbonica è una sostanza pericolosa (H280). Contiene gas sotto pressione; può esplodere se riscaldato. Può spostare l'ossigeno e causare un rapido soffocamento.
    2. Quindi, sezionare la parte prossimale dell'intestino tenue, rimuovere i tessuti attaccati, sciacquare con DPBS freddo usando un ago di alimentazione dritto da 16 G collegato a una siringa da 10 ml, fissare con il tampone fissativo di Bouin modificato usando un ago di alimentazione dritto da 16 G collegato a una siringa da 10 ml, tagliare longitudinalmente e arrotolare l'intestino prossimale usando la tecnica swiss-roll come descritto in precedenza59.
  15. Mettere i tessuti in una cassetta istologica e lasciare per 24-48 ore a temperatura ambiente in un contenitore con formalina tamponata al 10%. Il volume della formalina dovrebbe essere sufficiente a coprire completamente le cassette istologiche. Allo scadere del tempo di incubazione, utilizzando una pinza, trasferire le cassette istologiche nel contenitore riempito con etanolo al 70%. Quindi, procedere con l'incorporazione di paraffina tissutale.
    NOTA: L'incorporazione di paraffina tissutale è stata eseguita dal Research Histology Core Laboratory della Stony Brook University. La procedura può essere interrotta qui e i blocchi di paraffina possono essere conservati a temperatura ambiente.
    ATTENZIONE: La formalina è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolosa per la salute (H350, H315, H317, H318, H370) e corrosiva. La formalina può causare cancro, irritazione della pelle e degli occhi, danni agli organi e reazioni allergiche cutanee.

4. Analisi istologica

  1. Raffreddare le cassette istologiche contenenti i campioni di tessuto incorporati in paraffina mettendole sul ghiaccio per almeno 1 ora. Usando un microtomo, preparare sezioni spesse 5 μm per la colorazione. Ogni tessuto deve essere affettato orizzontalmente per coprire l'intero campione arrotolato.
    1. Dopo aver tagliato il blocco di paraffina, trasferire le sezioni di tessuto a bagnomaria riscaldato fino a 45 °C e posizionare le sezioni su vetrini carichi. Lasciare asciugare i vetrini su una griglia durante la notte a temperatura ambiente.
      NOTA: La procedura può essere interrotta qui e le diapositive possono essere conservate a temperatura ambiente.
  2. Posizionare i vetrini in un portavetrini e cuocere in forno a 65 °C per una notte. Le diapositive possono essere cotte per un tempo più breve, 1-2 h. Tuttavia, questo non è consigliabile nel caso di vetrini appena tagliati (meno di 1 mese).
    NOTA: posizionare il set di colorazione manuale sotto il cappuccio chimico ed eseguire le incubazioni con xilene, etanolo ed ematossilina sotto il cappuccio chimico.
  3. Il giorno dopo, raffreddare i vetrini posizionandoli in un portavetrini sotto la cappa chimica per 10 minuti.
  4. Deparaffinizzare i tessuti posizionando il portavetrino in un contenitore riempito con xilene al 100% per 3 minuti. Ripetere l'incubazione utilizzando xilene fresco al 100%.
    NOTA: Da quel momento, assicurarsi che i campioni siano sempre bagnati.
    ATTENZIONE: Lo xilene è una sostanza potenzialmente pericolosa: infiammabile (GHS02), che causa tossicità acuta (GHS07) e pericolo per la salute (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). I potenziali effetti pericolosi sono che è fatale se ingerito o entra nelle vie aeree e può causare irritazione della pelle, degli occhi e delle vie respiratorie. Inoltre, può influenzare le funzioni motorie causando sonnolenza o vertigini e causare danni agli organi in caso di esposizione prolungata o ripetuta.
  5. Reidratare le sezioni in un gradiente di etanolo posizionando il portavetrino in sequenza in contenitori riempiti con le seguenti soluzioni: 100% etanolo, 2 min; 95% etanolo, 2 min; 70% etanolo, 2 min.
  6. Trasferire il portavetrino nel contenitore pieno di acqua distillata e risciacquare in acqua distillata corrente per 2 minuti.
  7. Posizionare il portavetrino in un contenitore riempito con soluzione di ematossilina e colorare per 5 minuti (sotto il cappuccio chimico).
  8. Trasferire il portavetrino nel contenitore pieno di acqua di rubinetto e risciacquare con acqua corrente fino a quando la colorazione dell'ematossilina diventa bluastra, in genere dopo 2 minuti.
  9. Trasferire il portavetrino nel contenitore riempito con una soluzione di carbonato di litio al 5% (p/v). Immergere 10x.
    ATTENZIONE: Il carbonato di litio è una sostanza potenzialmente pericolosa: causa tossicità acuta (GHS07) e pericolo per la salute (H302 - H319). È dannoso se ingerito, dannoso a contatto con la pelle e provoca gravi irritazioni agli occhi.
  10. Trasferire il portavetrino nel contenitore pieno di acqua distillata e risciacquare in acqua distillata corrente per 2 minuti.
  11. Posizionare il portavetrini in un contenitore pieno di eosina e colorare per 5 minuti.
  12. Trasferire il portavetrino nel contenitore riempito con etanolo al 70% e risciacquare brevemente (10 s).
  13. Disidratare le sezioni posizionando il portavetrino in sequenza nei contenitori riempiti con soluzioni di gradiente di etanolo: etanolo al 95%, 5 immersioni; 100% etanolo, 5 tuffi.
  14. Pulire i vetrini posizionando il portavetrini nel contenitore riempito con xilene al 100% per 3 minuti. Ripetere l'incubazione utilizzando xilene fresco al 100%.
  15. Estrarre il vetrino dal rack, asciugare l'area intorno ai tessuti con un tovagliolo di carta e, a seconda delle dimensioni del campione, aggiungere una goccia o due di supporto di montaggio a base di xilene sulla superficie del campione. Montare posizionando delicatamente una vetrina sopra il vetrino (fare attenzione a non lasciare bolle d'aria). Premere delicatamente se necessario. L'intera superficie del vetro deve essere coperta e sigillata.
  16. Asciugare i vetrini lasciandoli sotto il cappuccio chimico durante la notte. In genere, il mezzo di montaggio si solidifica in meno di 24 ore. Per garantire che i vetrini siano asciutti, è possibile creare un vetrino campione. Utilizzando una slitta vuota, posizionare una goccia del mezzo di montaggio e lasciare sotto il cappuccio chimico durante la notte. Il giorno dopo, tocca la goccia e controlla se è solidificata.
  17. Quando i vetrini si asciugano, analizzare l'istologia dei tessuti utilizzando un microscopio ottico o un microscopio più avanzato con un canale di campo luminoso.
    1. Posizionare un vetrino da microscopio sul palco, spostarsi fino a quando il campione è al centro del campo visivo, regolare la messa a fuoco utilizzando la manopola di messa a fuoco e utilizzare una lente dell'obiettivo di ingrandimento 10x e / o 20x per analizzare l'istologia rispetto ai tessuti di controllo (fittizi irradiati).
    2. Se il microscopio è dotato di una fotocamera, scattare anche le immagini.
      NOTA: la procedura può essere interrotta qui; I vetrini possono essere conservati a temperatura ambiente e analizzati in seguito. Non tenere i vetrini più a lungo di 30 giorni poiché la colorazione svanisce lentamente.

5. Colorazione con immunofluorescenza

  1. Raffreddare le cassette istologiche contenenti campioni di tessuto incorporati in paraffina ponendoli sul ghiaccio per almeno 1 ora. Usando un microtomo, preparare sezioni spesse 5 μm per la colorazione. Ogni tessuto deve essere affettato orizzontalmente per coprire l'intero campione arrotolato.
    1. Dopo aver tagliato il blocco di paraffina, trasferire le sezioni di tessuto a bagnomaria riscaldato a 45 °C e posizionare le sezioni su vetrini carichi. Lasciare asciugare i vetrini su una griglia durante la notte a temperatura ambiente.
      NOTA: La procedura può essere interrotta qui e le diapositive possono essere conservate a temperatura ambiente.
  2. Posizionare i vetrini in un portavetrini e cuocere in forno a 65 °C per una notte. Le diapositive possono essere cotte per un tempo più breve, 1-2 h. Tuttavia, questo non è consigliabile nel caso di diapositive appena tagliate (meno di 1 mese fa).
    NOTA: Posizionare il set di colorazione manuale sotto il cappuccio chimico ed eseguire le incubazioni con xilene, etanolo e H2 O2 / metanolo sotto il cappuccio chimico.
  3. Il giorno dopo, raffreddare i vetrini posizionandoli in un portavetrini sotto la cappa chimica per 10 minuti.
  4. Deparaffinizzare i tessuti posizionando il portavetrino in un contenitore riempito con xilene al 100% per 3 minuti. Ripetere l'incubazione utilizzando xilene fresco al 100%.
    NOTA: Da quel momento, assicurarsi che i campioni siano sempre bagnati.
  5. Spegnere la perossidasi endogena incubando i vetrini per 30 minuti in un contenitore riempito con soluzione di perossido di idrogeno al 2% in metanolo sotto il cappuccio chimico.
    ATTENZIONE: L'alcol metilico è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolo per la salute (H225-H301, H311, H331-H370), infiammabile (GHS02) e causa tossicità acuta (orale, cutanea, inalazione) (GHS08). Il perossido di idrogeno è una sostanza potenzialmente pericolosa: corrosiva (GHS05) e causa tossicità acuta (GHS07).
  6. Reidratare le sezioni in un gradiente di etanolo posizionando il portavetrino in sequenza in contenitori riempiti con le seguenti soluzioni: 100% etanolo, 3 min; 95% etanolo, 3 min; 70% etanolo, 3 min.
  7. Trasferire il portavetrino in un contenitore pieno di acqua distillata e risciacquare in acqua distillata corrente per 2 minuti.
  8. Per recuperare gli antigeni, trasferire il portavetrino in un contenitore con 250 mL di soluzione tampone citrato (10 mM di citrato di sodio, 0,05% Tween-20, pH 6,0) e cuocere a 110 °C per 10 minuti utilizzando una camera di decloaking.
  9. Trasferire l'intero contenitore nella cella frigorifera e consentire un raffreddamento graduale nel corso di 30 minuti.
  10. Dopo 30 minuti, sostituire la soluzione tampone citrato con acqua distillata e risciacquare in acqua distillata corrente fino a rimuovere tutti i pezzi di paraffina galleggianti.
  11. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta), toccare un tovagliolo di carta e asciugare accuratamente l'area intorno al campione con un tovagliolo di carta. Disegna una forma chiusa attorno al campione usando una penna che fornisce una barriera idrofobica (penna PAP). Mettere in una camera umidificata.
  12. Bloccare con albumina sierica bovina (BSA) al 5% in TBS-Tween aggiungendo 200 μL della soluzione sulla superficie di una provetta. Assicurarsi che non vi siano perdite. Incubare a 37 °C in camera umidificata per 30 min.
  13. Rimuovere la soluzione di blocco toccando il vetrino su un tovagliolo di carta. Riporre in una camera umidificata. Aggiungere 100 μL della concentrazione appropriata degli anticorpi primari risospesi in un tampone bloccante e incubare a 4 °C con un leggero oscillolio durante la notte. Per BMI1/EYFP, utilizzare pollo anti-GFP (diluizione 1:500); per Ki-67, usare coniglio anti-Ki-67 (diluizione 1:200).
  14. Rimuovere la soluzione anticorpale toccando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare le diapositive in un portavetrini e trasferirle nel contenitore riempito con TBS-Tween. Lavare i vetrini agitando per 5 minuti. Ripetere 3 volte. Ogni volta, utilizzare una nuova porzione di buffer TBS-Tween.
  15. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta), rimuovere la soluzione di lavaggio in eccesso picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta e riporli in una camera umidificata. Aggiungere 100 μL della concentrazione appropriata di anticorpi secondari risospesi in un tampone bloccante e incubare a 37 °C per 30 minuti. Gli anticorpi secondari devono essere coniugati con un fluoroforo. Per BMI1/EYFP, utilizzare l'asino anti-pollo Alexa Fluor 647 (diluizione 1:500); per Ki-67, utilizzare capra anti-coniglio Alexa Fluor 488 (diluizione 1:500).
  16. Rimuovere la soluzione anticorpale toccando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare le diapositive in un portavetrini e trasferirle nel contenitore riempito con TBS-Tween. Lavare i vetrini agitando per 5 minuti. Ripetere 3 volte. Ogni volta, utilizzare una nuova porzione di buffer TBS-Tween.
  17. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta), rimuovere la soluzione di lavaggio in eccesso picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta e riporli in una camera umidificata. Aggiungere 100 μL della soluzione colorante EdU preparata secondo le istruzioni del produttore e utilizzando il fluoroforo Alexa Fluor 555.
  18. Rimuovere la soluzione EdU toccando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare le diapositive in un portavetrini e trasferirle nel contenitore riempito con TBS-Tween. Lavare i vetrini agitando per 5 minuti. Ripetere 2 volte. Ogni volta, utilizzare una nuova porzione di buffer TBS-Tween.
  19. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta); Rimuovere la soluzione di lavaggio in eccesso picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta e riporre in una camera umidificata. Eseguire la controcolorazione di Hoechst 33258 aggiungendo 100 μL della soluzione di Hoechst 33258 (diluizione 1:1000 in TBS-Tween) sulla superficie del campione. Incubare al buio a temperatura ambiente per 5 min.
  20. Rimuovere la soluzione di Hoechst 33258 picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare le diapositive in un portavetrini e trasferirle in un contenitore pieno di TBS-Tween. Lavare i vetrini agitando per 5 min.
  21. Estrarre il vetrino dal portavetrino, asciugare l'area intorno ai tessuti con un tovagliolo di carta e, a seconda delle dimensioni del campione, aggiungere una goccia o due di mezzo di montaggio a base di acqua sulla superficie del campione. Montare posizionando delicatamente una vetrina sopra il vetrino (fare attenzione a non lasciare bolle d'aria). Premere delicatamente se necessario. L'intera superficie del vetro deve essere coperta e sigillata.
  22. Asciugare i vetrini lasciandoli al buio a temperatura ambiente durante la notte. In genere, il supporto di montaggio si solidifica in meno di 24 ore. Per garantire che i vetrini siano asciutti, è possibile creare un vetrino campione. Utilizzare una diapositiva vuota; Posizionare una goccia del mezzo di montaggio e lasciare sotto il cappuccio chimico durante la notte. Il giorno dopo, tocca la goccia e controlla se è solidificata.
  23. Quando i vetrini si asciugano, i tessuti colorati possono essere analizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri a lunghezza d'onda di emissione che consentono la visualizzazione della colorazione Ki-67, EdU e BMI1/EYFP (535 nm, 646 nm e 700 nm, rispettivamente).
  24. Posizionare un vetrino da microscopio sul palco, spostarsi fino a quando il campione è al centro del campo visivo, regolare la messa a fuoco utilizzando la manopola di messa a fuoco e utilizzare l'obiettivo con ingrandimento 10x e/o 20x per analizzare la colorazione rispetto ai tessuti di controllo (fittizia irradiata). Se il microscopio è dotato di una fotocamera, è possibile acquisire anche immagini. Scatta immagini per ciascun canale separatamente e uniscile in seguito.
    NOTA: la procedura può essere interrotta qui; i vetrini possono essere conservati a 4 °C e successivamente analizzati. Non tenere i vetrini più a lungo di 14 giorni poiché la colorazione svanisce lentamente.

6. Colorazione TUNEL

  1. Raffreddare le cassette istologiche contenenti campioni di tessuto incorporati in paraffina ponendoli sul ghiaccio per almeno 1 ora. Usando un microtomo, preparare sezioni spesse 5 μm per la colorazione. Ogni tessuto deve essere affettato orizzontalmente per coprire l'intero campione arrotolato.
    1. Dopo aver tagliato il blocco di paraffina, trasferire le sezioni di tessuto a bagnomaria riscaldato fino a 45 °C e posizionare le sezioni su vetrini carichi. Lasciare asciugare i vetrini su una griglia durante la notte a temperatura ambiente.
      NOTA: La procedura può essere interrotta qui e le diapositive possono essere conservate a temperatura ambiente.
  2. Posizionare i vetrini in un portavetrini e cuocere in forno a 65 °C per una notte.
    NOTA: Le diapositive possono essere cotte per un tempo più breve, 1-2 ore. Tuttavia, non è consigliabile nel caso di vetrini appena tagliati (meno di 1 mese fa). Posizionare il set manuale di colorazione sotto il cappuccio chimico ed eseguire le incubazioni con xilene ed etanolo sotto il cappuccio chimico.
  3. Il giorno dopo, raffreddare i vetrini posizionandoli in un portavetrini sotto la cappa chimica per 10 minuti.
  4. Deparaffinizzare i tessuti posizionando il supporto dei vetrini in un contenitore riempito con xilene al 100% per 3 minuti. Ripetere l'incubazione utilizzando xilene fresco al 100%.
    NOTA: Da questo punto, assicurarsi che i campioni siano sempre bagnati.
  5. Reidratare le sezioni in un gradiente di etanolo posizionando il portavetrini in sequenza in contenitori riempiti con le seguenti soluzioni: 100% etanolo, 3 min; 95% etanolo, 3 min; 90% etanolo, 3 min; 80% etanolo, 3 min; 70% etanolo, 3 min.
  6. Trasferire il portavetrino in un contenitore pieno di acqua distillata e risciacquare in acqua distillata corrente per 1 minuto.
  7. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta), toccare un tovagliolo di carta e asciugare accuratamente l'area intorno al campione con un tovagliolo di carta. Disegna una forma chiusa attorno al campione usando una penna che fornisce una barriera idrofobica (penna PAP). Mettere in una camera umidificata.
  8. Incubare con proteinasi K libera da DNasi. Aggiungere 100 μL della soluzione di proteinasi K libera da DNasi (diluizione 1:25 in DPBS) sulla superficie del campione all'interno della barriera idrofobica. Incubare a temperatura ambiente in camera umidificata per 15 min.
    ATTENZIONE: La proteinasi K è una sostanza potenzialmente pericolosa: pericolo per la salute (H315 - H319 - H334).
  9. Rimuovere la soluzione di proteinasi K picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare i vetrini in un portavetrini e trasferirli nel contenitore riempito con DPBS. Lavare i vetrini agitando per 5 minuti. Ripetere 2 volte. Ogni volta, utilizzare una nuova porzione di DPBS.
  10. Preparare la miscela di reazione TUNEL: mescolare la soluzione dell'etichetta (1x) con la soluzione enzimatica (10x). Pipetta bene.
  11. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta); Rimuovere la soluzione di lavaggio in eccesso picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta e riporre in una camera umidificata. Aggiungere 50 μL di miscela di reazione TUNEL sulla superficie del campione e incubare al buio a 37 °C in una camera umidificata per 60 minuti. Per un controllo negativo, utilizzare solo la soluzione per etichette (senza TdT).
  12. Rimuovere la soluzione TUNEL picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare i vetrini in un portavetrini e trasferirli in un contenitore pieno di DPBS. Lavare i vetrini agitando per 5 minuti. Ripetere 2 volte. Ogni volta, utilizzare una nuova porzione di DPBS.
  13. Estrarre i vetrini dal supporto (uno alla volta); Rimuovere la soluzione di lavaggio in eccesso picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta e riporre in una camera umidificata. Eseguire la controcolorazione di Hoechst 33258 aggiungendo 100 μL della soluzione di Hoechst 33258 (diluizione 1:1000 in TBS-Tween) sulla superficie del campione. Incubare al buio a temperatura ambiente per 5 min.
  14. Rimuovere la soluzione di Hoechst 33258 picchiettando il vetrino su un tovagliolo di carta; posizionare i vetrini in un portavetrini e trasferirli nel contenitore riempito con DPBS. Lavare i vetrini agitando per 5 min.
  15. Estrarre la diapositiva dal portavetrina; Asciugare l'area intorno ai tessuti con un tovagliolo di carta e, a seconda delle dimensioni del campione, aggiungere una goccia o due di mezzo di montaggio a base di acqua sulla superficie del campione. Montare posizionando delicatamente una vetrina sopra il vetrino (fare attenzione a non lasciare bolle d'aria). Premere delicatamente se necessario. L'intera superficie del vetro deve essere coperta e sigillata.
  16. Asciugare i vetrini lasciandoli al buio a temperatura ambiente durante la notte. In genere, il mezzo di montaggio si solidifica in meno di 24 ore. Per garantire che i vetrini siano asciutti, è possibile creare un vetrino campione. Posizionare una goccia del mezzo di montaggio e lasciare al buio a temperatura ambiente durante la notte. Il giorno dopo, tocca la goccia e controlla se è solidificata.
  17. Quando i vetrini si asciugano, i tessuti colorati possono essere analizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri a lunghezza d'onda ad emissione che consentono la visualizzazione della colorazione TUNEL (535 nm).
  18. Posizionare un vetrino da microscopio sul palco, spostarsi fino a quando il campione è al centro del campo visivo, regolare la messa a fuoco utilizzando la manopola di messa a fuoco e utilizzare una lente dell'obiettivo con ingrandimento 10x e / o 20x per analizzare la colorazione rispetto ai tessuti di controllo (fittizia irradiata). Se il microscopio è dotato di una fotocamera, è possibile acquisire anche immagini. Scatta immagini per ciascun canale separatamente e uniscile in seguito.
    NOTA: la procedura può essere interrotta qui; i vetrini possono essere conservati a 4 °C e analizzati in seguito. Non tenere i vetrini più a lungo di 14 giorni poiché la colorazione svanisce lentamente.

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Representative Results

L'uso dell'irradiazione totale corporea (TBI) a 12 Gy in combinazione con il tracciamento del lignaggio genetico murino consente un'analisi approfondita delle conseguenze delle lesioni da radiazioni nell'intestino. Per iniziare, Bmi1-CreER; I topi Rosa26eYFP hanno ricevuto una singola iniezione di tamoxifene, che induce una maggiore espressione di proteine fluorescenti gialle (EYFP) all'interno di una popolazione di cellule staminali di riserva Bmi1+ . Due giorni dopo l'iniezione di tamoxifene, i topi sono stati sottoposti a irradiazione o irradiazione fittizia. Tre ore prima dell'eutanasia, ai topi è stato iniettato EdU. Dopo l'eutanasia, sono stati raccolti campioni di intestino tenue per l'analisi a 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 7 giorni dopo l'irradiazione. Le immagini rappresentative dell'ematossilina e dell'eosina (H & E) (Figura 1) del suddetto corso temporale illustrano la risposta dell'epitelio intestinale alla lesione. Il punto temporale 0 h è illustrativo dell'epitelio intestinale omeostatico (Figura 1); segue la fase apoptotica, caratterizzata da una perdita di cellule all'interno dei compartimenti della cripta tra 3 h e 48 h (Figura 1). Segue poi la fase rigenerativa, dove si possono trovare cellule altamente proliferative che popolano le cripte tra 72 h e 96 h (Figura 1). Infine, questo porta alla fase di normalizzazione, qui rappresentata dal punto temporale di 7 giorni (Figura 1).

La Figura 2 illustra i cambiamenti nello stato proliferativo delle cellule criptate intestinali valutati mediante colorazione immunofluorescente di EdU (marker di cellule in fase S) e Ki-67 (marker di cellule nelle fasi G1, S e G2/M), mentre il tracciamento della linea (cellule EYFP +) contrassegna le cellule provenienti da cellule staminali di riserva Bmi1+ . Durante l'omeostasi (Figura 2, 0 h sham), le cellule Bmi1+-positive contrassegnate dall'espressione di EYFP sono limitate alla posizione +4-+6 all'interno delle cripte. Durante la fase apoptotica (24 ore e 48 ore), le cellule EYFP-positive diminuiscono di numero (Figura 2). La fase rigenerativa (72 h e 96 h) è caratterizzata dalla rapida proliferazione delle cellule Bmi1+-positive e dei loro progenitori (Figura 2); entro 7 giorni dall'irradiazione, un'ulteriore proliferazione e migrazione hanno reintegrato le cellule della cripta intestinale e ripristinato l'integrità dell'epitelio intestinale (Figura 2).

Nei topi sham-irradiati (controllo), EdU e Ki-67 colorano le cellule proliferative EYFP negative delle cripte intestinali, tipiche della normale omeostasi intestinale, che si estendono dalle cellule staminali attive attraverso la zona di amplificazione del transito (Figura 2). Il danno da radiazioni provoca una perdita di cellule altamente proliferative durante la fase apoptotica, come dimostrato dalla riduzione della colorazione di EdU e Ki-67 (Figura 2). L'attivazione delle cellule staminali di riserva (in questo esempio, cellule Bmi1+ positive marcate con EYFP) e la loro proliferazione determinano un aumento delle cellule EdU e Ki-67 positive chiaramente visibili a 72 ore e 96 ore dopo l'infortunio, dove le cripte sono composte quasi esclusivamente da cellule co-colorate con EYFP, EdU e Ki-67. I livelli osservati di proliferazione si normalizzano 7 giorni dopo l'infortunio (Figura 2).

Al fine di illustrare l'apoptosi causata da danni da radiazioni, è stata eseguita la colorazione TUNEL e le immagini rappresentative sono incluse nella Figura 3. Durante l'omeostasi (Figura 3), poche cellule sono sottoposte ad apoptosi, tipica del turnover epiteliale intestinale normalmente rapido. Un netto aumento della colorazione del TUNEL può essere osservato tardi nella fase apoptotica (24 ore e 48 ore) dopo l'irradiazione (Figura 3). Durante la fase rigenerativa, la colorazione TUNEL diminuisce costantemente all'interno delle cripte rigeneranti ed è di nuovo quasi assente quando le cripte si sono normalizzate (Figura 3). Il protocollo presentato descrive un metodo di colorazione immunofluorescente semplice e accessibile che utilizza una combinazione diretta e ampiamente impiegata di tecniche di etichettatura (TUNEL, EdU, Ki-67, EYFP) che è in grado di fornire informazioni sul comportamento delle cellule intestinali dopo la lesione (qui, irradiazione). Questo approccio può essere impiegato per studiare i meccanismi che regolano i processi rigenerativi nell'epitelio intestinale in circostanze specifiche. L'impiego di questo e di approcci simili illuminerà processi rigenerativi alternativi a seguito di diversi insulti intestinali e, inoltre, consentirà lo studio di strategie terapeutiche per la prevenzione della perdita della funzione barriera.

Figure 1
Figura 1: Immagini rappresentative di sezioni colorate con ematossilina ed eosina (H & E) dei piccoli tessuti intestinali seguendo un decorso temporale dopo l'irradiazione corporea totale. Bmi1-CreER; I topi Rosa26eYFP hanno ricevuto una dose di tamoxifene 2 giorni prima dell'irradiazione totale corporea a 12 Gy o dell'irradiazione fittizia. I topi sono stati sacrificati e i tessuti dell'intestino tenue sono stati raccolti nei punti temporali indicati nella figura. Tutte le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 10x. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagini rappresentative della colorazione immunofluorescente delle sezioni dell'intestino tenue dopo irradiazione. Bmi1-CreER; I topi Rosa26eYFP hanno ricevuto una dose di tamoxifene 2 giorni prima dell'irradiazione totale corporea a 12 Gy o dell'irradiazione fittizia. I topi sono stati sacrificati e i tessuti dell'intestino tenue sono stati raccolti nei punti temporali indicati nella figura. Le sezioni di tessuto sono state colorate con EdU per marcare le cellule in fase S (rosa) e con Ki-67 per marcare le cellule nelle fasi G0, S e G2 / M (giallo). EYFP (verde) contrassegna le cellule Bmi1+ e i loro progenitori e dimostra il tracciamento del lignaggio. Le sezioni sono state ulteriormente controcolorate con DAPI (blu) per visualizzare i nuclei. I dati sono mostrati come immagini unite con ingrandimento 10x e inserti di singole macchie con ingrandimento 20x (questi hanno avuto origine da immagini 10x). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Immagini rappresentative della colorazione immunofluorescente TUNEL delle sezioni dell'intestino tenue dopo irradiazione. Bmi1-CreER; I topi Rosa26eYFP hanno ricevuto una dose di tamoxifene 2 giorni prima dell'irradiazione totale corporea a 12 Gy o dell'irradiazione fittizia. I topi sono stati sacrificati e i tessuti dell'intestino tenue sono stati raccolti nei punti temporali indicati nella figura. TUNEL (rosso) colora le cellule apoptotiche. Queste immagini sono state controcolorate con DAPI (blu) per visualizzare i nuclei. Le immagini mostrate sono state scattate con un ingrandimento di 20x. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo descrive un modello di danno da radiazioni robusto e riproducibile. Consente l'analisi precisa dei cambiamenti nell'epitelio intestinale nel corso di 7 giorni dopo l'infortunio. È importante sottolineare che i punti temporali selezionati riflettono fasi cruciali della lesione e sono caratterizzati da distinte alterazioni dell'intestino (lesioni, apoptosi, rigenerazione e fasi di normalizzazione)60. Questo modello di irradiazione è stato stabilito e attentamente valutato, dimostrando un'adeguata manifestazione di lesione per imitare quella sperimentata dai pazienti sottoposti a radioterapia61. Più della metà dei pazienti con cancro del colon-retto e tumori ginecologici sottoposti a radioterapia addominale 40,62,63. Nonostante i metodi avanzati per indirizzare la radioterapia, i pazienti sperimentano l'irradiazione del tessuto intestinale sano, che produce una fisiopatologia molto simile a quella osservata con il modello di irradiazione di tutto il corpo qui presentato. Pertanto, il modello di radiazione qui descritto può potenzialmente affrontare le ripercussioni dell'esposizione accidentale alle radiazioni dei pazienti e / o del personale medico e, quindi, è vitale per la salute umana.

Il Bmi1-CreER; Il modello di topi Rosa26eYFP porta Cre inducibile dal tamoxifene sotto il controllo trascrizionale del promotore del topo Bmi1 (Bmi1 polycomb ring finger oncogene). Inoltre, questi topi portano una sequenza R26-stop-EYFP, in cui il codone STOP è affiancato da lati loxP seguiti dal gene Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP) inserito nel locus Gt(ROSA)26Sor. L'espressione di EYFP è bloccata da una sequenza STOP affiancata da loxP a monte, ma può essere attivata da delezioni mirate indotte dal tamoxifene, mediate da Cre, consentendo il tracciamento del lignaggio delle cellule che esprimono Bmi1, una sottopopolazione specifica di cellule criptate specifica delle cellule staminali di riserva. Il protocollo di radiazione in combinazione con il Bmi1-CreER; Il modello di topi Rosa26eYFP è stato precedentemente impiegato per studiare il ruolo dei fattori di trascrizione nella regolazione della rigenerazione intestinale18,56. I risultati rappresentativi presentati nella figura da 1 a 3 mostrano risultati simili a quelli presentati nelle pubblicazioni recenti18,56.

Da segnalare, Bmi1-CreER; I topi Rosa26eYFP sono solo uno dei molteplici modelli animali transgenici impiegati per studiare la rigenerazione intestinale. Altri modelli di tracciamento del lignaggio murino sono stati combinati con la radiazione per dimostrare i ruoli di cellule e percorsi specifici nella capacità rigenerativa dell'epitelio intestinale 18,26,32,33,34,35,36,37,56,64,65,66,67 . Questi modelli sono progettati per studiare il ruolo di diverse popolazioni di cellule staminali riservate, esplorare i precursori delle linee secretorie ed enterocitarie e studiare la funzione di geni specifici all'interno di ciascuna sottopopolazione delle cellule epiteliali intestinali. I risultati combinati di queste indagini contribuiranno ad ampliare la comprensione della capacità rigenerativa dell'epitelio intestinale.

È importante sottolineare che, con piccole modifiche, questa tecnica dovrebbe consentire lo studio delle relazioni tra microbiota e diverse popolazioni di cellule epiteliali, stromale e immunitarie in caso di danno da radiazioni. L'introduzione di modelli animali distinti che tracciano il lignaggio consentirà lo studio del comportamento in tempo reale e l'interazione di varie sottopopolazioni di cellule dopo la lesione. In alternativa, la colorazione dei tessuti potrebbe essere sostituita dal sequenziamento dell'RNA, dal sequenziamento dell'RNA a singola cellula, dalla selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) o dall'analisi proteomica per raccogliere conoscenze più approfondite sul ruolo di specifiche linee cellulari durante la rigenerazione intestinale dopo la lesione68,69. Questo modello di lesione potrebbe essere utilizzato per testare nuove modalità di trattamento intese a ridurre al minimo gli effetti collaterali dell'irradiazione, ridurre i tempi di recupero e migliorare la qualità dell'assistenza ai pazienti70. Sebbene il modello di radiazione qui descritto possa servire come strumento utile per studiare la rigenerazione dell'epitelio intestinale, ha anche diverse limitazioni. La dose di radiazioni per tutto il corpo provoca invariabilmente la successiva sindrome ematopoietica, che ostacola lo studio della rigenerazione intestinale. Questo può essere evitato dal trapianto di midollo osseo. Inoltre, la modifica di un protocollo di lesione solo addominale può potenzialmente migliorare alcuni degli effetti collaterali dell'irradiazione71. Tuttavia, questo modello richiede ulteriori passaggi che possono influenzare la risposta intestinale alla lesione (ad esempio, l'anestesia). Per inciso, la radiazione addominale produce la sindrome gastrointestinale indotta da radiazioni (RIGS) senza sindrome ematopoietica, diversa dall'irradiazione di tutto il corpo (WBI), in quanto WBI produce una sintomatologia gastrointestinale simile ma include la perdita parziale della funzione ematopoietica a seguito di lesione71,72.

Da notare che i modelli animali geneticamente modificati come quelli descritti in questo protocollo sono sofisticati e consentono il tracciamento del lignaggio di cellule specifiche. Tuttavia, questi modelli, sebbene molto utili, richiedono uno sforzo aggiuntivo per essere mantenuti. I modelli animali transgenici che consentono delezioni geniche condizionali sono difficili da generare e la loro cancellazione tempestiva dopo la lesione potrebbe non essere facilmente realizzata. Inoltre, la maggior parte dei modelli transgenici consente solo una delezione condizionale o l'inattivazione di un gene di interesse, ma non sono inducibili e quindi sono incapaci di ripristinare la funzione genica e possono ostacolare gli studi. Inoltre, i modelli animali transgenici di solito richiedono un trattamento con sostanze chimiche aggiuntive (ad esempio, tamoxifene, doxiciclina) per ottenere l'inattivazione o la sovraespressione del gene di interesse. I trattamenti con queste sostanze possono, in una certa misura, alterare la risposta dell'epitelio intestinale o aggiungere alla gravità della lesione 73,74,75,76. Inoltre, l'induzione del tracciamento del lignaggio da parte del tamoxifene può essere introdotta più vicino al momento della lesione da radiazioni per migliorare l'etichettatura delle cellule coinvolte nella rigenerazione (ad esempio, 6-24 ore prima della lesione). Pertanto, è possibile sostituire un modello transgenico con topi wild-type e una combinazione di colorazione IF (ad esempio, Ki-67, PCNA, EdU, TUNEL, Caspase 3). Questo modello consente l'analisi della capacità rigenerativa dell'intestino, sebbene non consenta lo studio di una specifica sottopopolazione delle cellule.

Il protocollo descritto in questo manoscritto ha diversi passaggi cruciali. È della massima importanza garantire che i topi sani siano utilizzati per la sperimentazione, poiché saranno esposti a radiazioni e trattamenti con sostanze chimiche. Se gli esperimenti con diversi gruppi di topi vengono eseguiti a giorni, settimane o mesi di distanza, è buona norma aderire alla stessa tempistica, ad esempio iniezioni di tamoxifene alla stessa ora del giorno. Il processo di irradiazione dovrebbe essere fatto prontamente e i topi dovrebbero essere riportati immediatamente alle loro gabbie originali. Inoltre, fornire cibo addolcito e molta acqua può aiutare a migliorare alcuni degli effetti negativi delle radiazioni. La tecnica swiss-roll è suggerita per consentire un'analisi completa del tessuto intestinale59. Questa tecnica non è banale e dovrebbero essere fatte prove precedenti per garantire che si raggiunga una qualità impeccabile del tessuto per la colorazione. Tutte le soluzioni per esperimenti sui topi e colorazione devono essere preparate fresche e conservate in condizioni appropriate. Quando si lavora con gli anticorpi, è importante testare i vetrini utilizzando controlli positivi e negativi e, se possibile, utilizzare anticorpi con lo stesso numero di catalogo e numero di lotto. I vetrini di immunofluorescenza devono essere conservati a 4 °C e sottoposti a imaging entro 1 settimana dalla preparazione. La conservazione prolungata, anche a -20 °C, può causare la perdita di segnale. I vetrini H & E possono essere conservati a temperatura ambiente in quanto non vi è alcuna preoccupazione di perdita di stabilità del fluoroforo.

In sintesi, il modello di danno da radiazioni che traccia il lignaggio qui presentato è un modello riproducibile e rilevante per tracciare il destino delle cellule intestinali dopo l'insulto e può essere combinato con diversi modelli murini e tecniche molecolari per migliorare la comprensione della fisiopatologia dell'epitelio intestinale. La comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari che governano la rigenerazione dell'epitelio intestinale potrebbe portare allo sviluppo di nuovi trattamenti e interventi terapeutici benefici.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori desiderano riconoscere lo Stony Brook Cancer Center Histology Research Core per l'assistenza di esperti nella preparazione dei campioni di tessuto e la Divisione delle risorse animali da laboratorio presso la Stony Brook University per l'assistenza nella cura e nella gestione degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health DK124342 assegnate ad Agnieszka B. Bialkowska e DK052230 al Dr. Vincent W. Yang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 -
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 -
27G x 1/2" needle BD 305109 -
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 -
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 -
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 -
Corn oil Millipore-Sigma C8267 -
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 -
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV -
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. - 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 -
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 -
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 -
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT -
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 -
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL

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Biologia Numero 185
Rigenerazione epiteliale intestinale in risposta all'irradiazione ionizzante
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Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).

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