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Biology

Regeneração Epitelial Intestinal em Resposta à Irradiação Ionizante

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

O trato gastrointestinal é um dos órgãos mais sensíveis à lesão no tratamento radioterápico do câncer. É simultaneamente um sistema orgânico com uma das mais altas capacidades regenerativas após tais insultos. O protocolo apresentado descreve um método eficiente para estudar a capacidade regenerativa do epitélio intestinal.

Abstract

O epitélio intestinal consiste de uma única camada de células, mas contém múltiplos tipos de células terminalmente diferenciadas, que são geradas pela proliferação ativa de células-tronco intestinais localizadas no fundo das criptas intestinais. No entanto, durante eventos de lesão intestinal aguda, essas células-tronco intestinais ativas sofrem morte celular. A irradiação gama é um tratamento de câncer colorretal amplamente utilizado, que, embora terapeuticamente eficaz, tem o efeito colateral de esgotar o pool ativo de células-tronco. De fato, os pacientes frequentemente experimentam síndrome de radiação gastrointestinal durante a radioterapia, em parte devido à depleção ativa de células-tronco. A perda de células-tronco intestinais ativas em criptas intestinais ativa um pool de células-tronco intestinais de reserva tipicamente quiescentes e induz a desdiferenciação de células precursoras secretoras e enterocitárias. Se não fossem essas células, o epitélio intestinal não teria a capacidade de se recuperar da radioterapia e de outros grandes insultos teciduais. Novos avanços em tecnologias de rastreamento de linhagem permitem o rastreamento da ativação, diferenciação e migração de células durante a regeneração e têm sido empregados com sucesso para estudar isso no intestino. Este estudo tem como objetivo descrever um método para a análise de células dentro do epitélio intestinal de camundongos após lesão por radiação.

Introduction

O epitélio intestinal humano cobriria aproximadamente a superfície de meia quadra de badminton se colocado completamente plano1. Em vez disso, essa única camada de células que separa os humanos do conteúdo de seus intestinos é compactada em uma série de projeções semelhantes a dedos, vilosidades e reentrâncias, criptas que maximizam a área de superfície dos intestinos. As células do epitélio diferenciam-se ao longo de um eixo cripta-vilosidade. As vilosidades consistem principalmente de enterócitos absorvedores de nutrientes, células caliciformes secretoras de muco e células enteroendócrinas produtoras de hormônios, enquanto as criptas consistem principalmente de células Paneth produtoras de defensina, células-tronco ativas e de reserva e células progenitoras 2,3,4,5. Além disso, a comunicação bidirecional dessas células com as células estromais e imunes do compartimento mesenquimal subjacente e a microbiota do lúmen gera uma complexa rede de interações que mantém a homeostase intestinal e é fundamental para a recuperação após a lesão6,7,8.

O epitélio intestinal é o tecido que mais rapidamente se auto-renova no corpo humano, com taxa de turnover de 2-6 dias 9,10,11. Durante a homeostase, células-tronco ativas na base das criptas intestinais (células colunares da base das criptas), marcadas pela expressão do receptor acoplado à proteína G 5 (LGR5), rico em leucina, rapidamente se dividem e fornecem células progenitoras que se diferenciam em todas as outras linhagens epiteliais intestinais. No entanto, devido à sua alta taxa mitótica, as células-tronco ativas e seus progenitores imediatos são particularmente sensíveis à lesão por radiação gama e sofrem apoptose após irradiação 5,12,13,14. Ao serem perdidas, células-tronco de reserva e não-células-tronco (subpopulação de progenitores e algumas células terminalmente diferenciadas) dentro das criptas intestinais sofrem ativação e reposição do compartimento criptário basal, que pode então reconstituir populações celulares das vilosidades e, assim, regenerar o epitélio intestinal15. Utilizando técnicas de rastreamento de linhagens, vários grupos de pesquisa têm demonstrado que células-tronco de reserva (quiescentes) são capazes de suportar a regeneração após a perda de células-tronco ativas 13,16,17,18,19,20,21,22. Essas células são caracterizadas pela presença do oncogene da proteína 1 do complexo policomb (Bmi1), do gene da transcriptase reversa da telomerase de camundongo (mTert), da homeobox de Hop (Hopx) e do gene da proteína 1 de repetição rica em leucina (Lrig1). Além disso, tem sido demonstrado que as células não estaminais são capazes de repor criptas intestinais em caso de lesão23,24,25,26,27,28,29,30,31. Em particular, tem sido demonstrado que progenitores de células secretoras e enterócitos sofrem desdiferenciação após lesão, revertem para células-tronco semelhantes e suportam a regeneração do epitélio intestinal. Estudos recentes identificaram células expressando múltiplos marcadores que possuem a capacidade de adquirir características semelhantes ao tronco no momento da lesão (como DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Surpreendentemente, Yu e col. mostraram que mesmo células Paneth maduras (LYZ+) podem contribuir para a regeneração intestinal37. Além disso, além de causar apoptose das células epiteliais intestinais e interromper a função da barreira epitelial, a irradiação resulta em disbiose da flora intestinal, ativação de células imunes e início de resposta pró-inflamatória, ativação de células mesenquimais e estromais38,39.

A radiação gama é uma ferramenta terapêutica valiosa no tratamento do câncer, especialmente para os tumorescolorretais40. No entanto, a irradiação afeta significativamente a homeostase intestinal, induzindo danos às células, o que leva à apoptose. A exposição à radiação causa múltiplas perturbações que retardam a recuperação do paciente e é marcada por lesão da mucosa e inflamação na fase aguda e diarreia, incontinência, sangramento e dor abdominal a longo prazo. Essa panóplia de manifestações é referida como toxicidade por radiação gastrointestinal. Além disso, a progressão da fibrose transmural e/ou esclerose vascular induzida pela radiação só pode se manifestar anos após o tratamento38,41. Simultaneamente à própria lesão, a radiação induz uma resposta de reparo nas células intestinais que ativa as vias de sinalização responsáveis por iniciar e orquestrar a regeneração42. A doença do intestino delgado induzida pela radiação pode originar-se da radioterapia pélvica ou abdominal fornecida a outros órgãos (como colo do útero, próstata, pâncreas, reto)41,43,44,45,46. A lesão por irradiação intestinal é, portanto, um problema clínico significativo, e um melhor entendimento da fisiopatologia resultante provavelmente fará avançar o desenvolvimento de intervenções para aliviar as complicações gastrointestinais associadas à radioterapia. Existem outras técnicas que permitem investigar a finalidade regenerativa do epitélio intestinal além da radiação. Modelos murinos transgênicos e químicos para estudar a inflamação e a regeneração a partir de então têm sido desenvolvidos47. O sulfato de sódio dextran (DSS) induz inflamação no intestino e leva ao desenvolvimento de características semelhantes às da doença inflamatória intestinal48. A combinação do tratamento da ESD com o composto pró-carcinogênico azoximetano (AOM) pode resultar no desenvolvimento de câncer associado à colite48,49. A lesão induzida por isquemia e reperfusão é outro método empregado para estudar o potencial regenerativo do epitélio intestinal. Esta técnica requer experiência e conhecimento cirúrgico50. Além disso, as técnicas citadas causam diferentes tipos de lesão do que a radiação e podem levar ao envolvimento de diferentes mecanismos de regeneração. Além disso, esses modelos são demorados, enquanto a técnica de radiação é bastante breve. Recentemente, métodos in vitro utilizando enteróides e colonóides gerados a partir do intestino e cólon têm sido utilizados em combinação com a lesão por radiação para estudar os mecanismos de regeneração intestinal51,52. No entanto, essas técnicas não recapitulam completamente o órgão quemodelam53,54.

O protocolo apresentado inclui a descrição de um modelo murino de lesão por radiação gama em combinação com um modelo genético que, após o tratamento com tamoxifeno, permite o rastreamento de linhagens originárias da população de células-tronco de reserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Esse modelo utiliza uma irradiação de corpo total de 12 Gy, que induz lesão intestinal significativa o suficiente para ativar células-tronco de reserva, ao mesmo tempo em que permite a investigação subsequente da capacidade regenerativa intestinal dentro de 7 dias após a lesão55.

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Protocol

Todos os camundongos foram alojados na Divisão de Recursos Animais de Laboratório (DLAR) da Stony Brook University. O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Stony Brook University (IACUC) aprovou todos os estudos e procedimentos envolvendo cobaias animais. Os experimentos envolvendo animais foram conduzidos estritamente de acordo com o protocolo aprovado de manejo de animais (IACUC #245094).

NOTA: As estirpes de rato B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) e B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) foram obtidas comercialmente (ver Tabela de Materiais) e cruzadas para obter Bmi1-Cre ER; Camundongos Rosa26eYFP (Bmi1ctrl), como descrito anteriormente56,57,58.

1. Alojamento de Bmi1-Cre ER; Camundongos Rosa26 eYFP

  1. Manter os ratos em uma instalação animal a uma temperatura variando de 68-72 °F e umidade variando de 30-70%, em um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, com água e ração normal ad libitum.
  2. Antes dos experimentos, confirme os genótipos dos camundongos usando uma técnica padrão de genotipagem por PCR57,58.

2. Preparação de animais e materiais

  1. Transfira os camundongos para a sala de alojamento experimental pelo menos 7 dias antes de qualquer experimentação para permitir que os camundongos se aclimatem.
  2. Combinar animais experimentais e controles de acordo com sexo e idade.
  3. Submeter os animais de controlo à recombinação mediada por Cre induzida pelo tamoxifeno, mas não à irradiação (tratamento simulado, 0 Gy), assegurando simultaneamente que os animais de ensaio recebem a injeção de tamoxifeno e são expostos à irradiação gama.
  4. Prepare a solução de tamoxifeno. Ressuspender o tamoxifeno em pó em óleo de milho estéril na concentração de 30 mg/mL. Sonicar por 3 min em ciclos de 30 s ON e 30 s OFF com 60% de amplitude e depois girar no escuro por 1 h à temperatura ambiente (TR). A solução de tamoxifeno pode ser congelada a -20 °C, mas não congelar/descongelar mais do que uma vez. De preferência, prepare uma solução fresca de cada vez e não a armazene.
    NOTA: O tamoxifeno é sensível à luz. Envolva-o com papel alumínio durante a rotação à temperatura ambiente.
    CUIDADO: O tamoxifeno é uma substância potencialmente perigosa: Perigo para a saúde (GHS08) e perigo para o meio ambiente (GHS09).
  5. Preparar a solução-mãe de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU). Ressuspenda o pó de EdU em 1/5 do volume total de dimetilsulfóxido estéril (DMSO) e adicione lentamente os 4/5 restantes do volume total de água ultrapura estéril. Quando completamente dissolvido, alíquota e armazenar a -20 °C.
    CUIDADO: 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) e dimetil sulfóxido (DMSO) são substâncias potencialmente perigosas: Perigo para a saúde (H340 e H631, e H227, H315 e H319, respectivamente). EdU pode causar defeitos genéticos e é suspeito de prejudicar a fertilidade ou nascituros, e DMSO pode causar irritação da pele e dos olhos.
  6. Preparar reagentes para coleta e fixação de tecidos: diluir o etanol para preparar uma solução aquosa a 70%, resfriar o DPBS a 4 °C e preparar o tampão fixador de Bouin modificado (etanol a 50% e ácido acético a 5% em H2O destilado) e formalina tamponada a 10%.
    CUIDADO: O álcool etílico é uma substância potencialmente perigosa: Perigo para a saúde (H225-H319), inflamável (GHS02) e causa toxicidade aguda (GHS07). O ácido acético é uma substância potencialmente perigosa: perigo para a saúde (H226-H314), inflamável (GHS02) e corrosivo (GHS05). A formalina é uma substância potencialmente perigosa: Perigo para a saúde (H350, H315, H317, H318, H370) e corrosiva. A formalina pode causar câncer, irritação da pele e dos olhos, danos aos órgãos e reações alérgicas na pele.
  7. Preparar o equipamento necessário para a eutanásia de acordo com um método aprovado (câmara de CO2 , por exemplo), um kit de dissecção de ratos (tesoura, pinças), placas de Petri, uma agulha de gavagem de 16 G acoplada a uma seringa de 10 mL para lavar os intestinos e histológicas.

3. Irradiação gama (TCE) de corpo total e coleta de tecidos

  1. Dois dias antes da exposição à irradiação gama, injetar nos animais experimentais uma dose única de tamoxifeno para induzir recombinação mediada por Cre e rastreamento da linhagem celular IMC1/EYFP+ . Pesar cada animal e calcular uma dose de 40 mg/kg de peso corporal de tamoxifeno ressuspendido em óleo de milho. Desinfetar a região abdominal com etanol a 70% e administrar tamoxifeno por via intraperitoneal com agulha 27G acoplada a seringa de 1 mL.
  2. Observar os animais durante as 48 horas seguintes para excluir uma potencial toxicidade por tamoxifeno.
  3. Transfira os camundongos para a sala de irradiação, conforme especificado pela instituição local.
  4. Calcular o tempo de exposição à irradiação liberado pela fonte de 137Cs de acordo com a taxa de dose exata atual. Por exemplo, se a taxa de dose atual for igual a 75,9 rad/min (0,759 Gy min−1 = 75,9 cGy m−1), o tempo de exposição em minutos é calculado como a dose desejada/0,759. Para irradiar os animais para uma dose de 12 Gy TBI, o tempo de exposição é de ~15,81 min (15 min e 48 s).
  5. Desinfetar a câmara de amostras no irradiador gama com solução de etanol a 70%; Coloque o tapete absorvente e os animais dentro da câmara de amostragem.
    NOTA: Os animais tratados com simulação devem ser colocados na sala de irradiação, mas não expostos à irradiação gama.
  6. Coloque a tampa e feche a câmara.
  7. Programar o gamairradiador para expor os animais ao TCE de 12 Gy.
    1. Ligue a máquina girando a chave na posição START.
    2. Digite o número do operador usando um teclado numérico e confirme pressionando ENTER.
    3. Digite o número PIN usando um teclado numérico e confirme pressionando ENTER.
    4. Pressione 1 para opções.
    5. Pressione 1 para configurações de temporizador.
    6. Pressione 1 para obter o tempo de irradiação.
    7. Insira a configuração do temporizador para o próximo ciclo usando um teclado numérico (formato hh:mm:ss) e confirme pressionando ENTER.
    8. Confirme as configurações mais uma vez pressionando ENTER.
    9. Volte para o menu inicial pressionando CLEAR 2x.
    10. Pressione START para iniciar a exposição.
  8. Deixe a sala para o tempo de exposição ativa. A máquina irá parar automaticamente após o tempo predefinido passar e começará a apitar.
    CUIDADO: O césio-137 (137Cs) é uma substância perigosa mortal (Perigo para a saúde: H314). A exposição externa a grandes quantidades de 137Cs pode causar queimaduras, doença aguda por radiação e até a morte.
  9. Desligue a máquina girando a chave na posição STOP.
  10. Abra a câmara de amostras, retire a tampa, transfira os animais de volta para a gaiola e desinfete a câmara de amostras com solução de etanol a 70%.
  11. Transfira os animais de volta para a sala de alojamento convencional e observe sua condição pós-tratamento.
  12. Monitorar o peso dos animais todos os dias e eutanasiá-los imediatamente (apesar do período planejado) se quaisquer sintomas de bem-estar alterado, angústia ou perda de peso superior a 15% do peso corporal inicial forem observados.
  13. Três horas antes da eutanásia planeada, desinfetar a área abdominal e, utilizando uma seringa de insulina 28G, injetar nos ratinhos 100 μL de solução de EdU (administrada por via intraperitoneal).
  14. Coletar intestinos proximais em 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 168 h após a irradiação.
    1. Realizar a eutanásia CO2 de acordo com as normas da instituição de origem.
      CUIDADO: O dióxido de carbono é uma substância perigosa (H280). Contém gás sob pressão; pode explodir se aquecido. Pode deslocar o oxigênio e causar sufocamento rápido.
    2. Em seguida, dissecar a parte proximal do intestino delgado, remover os tecidos aderidos, lavar com DPBS fria usando uma agulha de alimentação reta de 16 G acoplada a uma seringa de 10 mL, fixar com tampão fixador de Bouin modificado usando uma agulha de alimentação reta de 16 G conectada a uma seringa de 10 mL, abrir longitudinalmente e enrolar os intestinos proximais usando a técnica swiss-roll, como descrito anteriormente59.
  15. Colocar os tecidos em um histológico e deixar por 24-48 h à temperatura ambiente em um recipiente com formalina tamponada a 10%. O volume da formalina deve ser suficiente para cobrir totalmente os histológicos. Decorrido o tempo de incubação, com pinças, transferir os histológicos para o recipiente preenchido com etanol 70%. Em seguida, proceda com a inclusão em parafina tecidual.
    NOTA: A inclusão de parafina tecidual foi realizada pelo Research Histology Core Laboratory da Stony Brook University. O procedimento pode ser interrompido aqui, e os blocos de parafina podem ser armazenados à temperatura ambiente.
    CUIDADO: A formalina é uma substância potencialmente perigosa: Perigo para a saúde (H350, H315, H317, H318, H370) e corrosiva. A formalina pode causar câncer, irritação da pele e dos olhos, danos aos órgãos e reações alérgicas na pele.

4. Análise histológica

  1. Resfriar os histológicos contendo os espécimes de tecido embebidos em parafina, colocando-os no gelo por pelo menos 1 h. Usando um micrótomo, prepare cortes de 5 μm de espessura para coloração. Cada tecido deve ser cortado horizontalmente para cobrir todo o espécime laminado.
    1. Após o corte do bloco de parafina, transfira os cortes de tecido para banho-maria aquecido a 45 °C e coloque os cortes em lâminas carregadas. Deixe as corrediças em um rack durante a noite em temperatura ambiente para secar.
      NOTA: O procedimento pode ser interrompido aqui, e as lâminas podem ser armazenadas à temperatura ambiente.
  2. Coloque as corrediças em um suporte de corrediça e leve ao forno a 65 °C durante a noite. As lâminas podem ser assadas por um tempo mais curto, 1-2 h. No entanto, isso não é aconselhável no caso de lâminas recém-cortadas (menos de 1 mês de idade).
    OBS: Coloque o conjunto de coloração manual sob o capô químico e realize as incubações com xileno, etanol e hematoxilina sob o capô químico.
  3. No dia seguinte, resfrie as lâminas colocando-as em um suporte de corrediças sob o capô químico por 10 min.
  4. Desparafinizar os tecidos colocando o suporte de lâmina em um recipiente preenchido com xilol 100% por 3 min. Repita a incubação usando 100% de xileno fresco.
    NOTA: A partir desse momento, certifique-se de que os espécimes sejam mantidos úmidos o tempo todo.
    CUIDADO: O xileno é uma substância potencialmente perigosa: inflamável (GHS02), causando toxicidade aguda (GHS07) e um perigo para a saúde (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). Os potenciais efeitos perigosos são que é fatal se ingerido ou entra nas vias aéreas e pode causar irritação na pele, nos olhos e nas vias respiratórias. Além disso, pode afetar as funções motoras, causando sonolência ou tonturas e causar danos aos órgãos em caso de exposição prolongada ou repetida.
  5. Reidratar seções em um gradiente de etanol colocando o suporte deslizante sequencialmente em recipientes cheios com as seguintes soluções: etanol 100%, 2 min; etanol 95%, 2 min; Etanol 70%, 2 min.
  6. Transfira o suporte deslizante para o recipiente cheio de água destilada e enxágue em água destilada corrente por 2 min.
  7. Coloque o suporte de corrediça em um recipiente cheio de solução de hematoxilina e core por 5 min (sob o capô químico).
  8. Transfira o suporte da corrediça para o recipiente cheio de água da torneira e enxágue em água corrente da torneira até que a coloração da hematoxilina fique azulada, normalmente após 2 minutos.
  9. Transfira o suporte deslizante para o recipiente preenchido com solução de carbonato de lítio a 5% (p/v). Mergulhe 10x.
    CUIDADO: O carbonato de lítio é uma substância potencialmente perigosa: causa toxicidade aguda (GHS07) e um perigo para a saúde (H302 - H319). É prejudicial se ingerido, prejudicial em contato com a pele e causa irritação ocular grave.
  10. Transfira o suporte deslizante para o recipiente cheio de água destilada e enxágue em água destilada corrente por 2 min.
  11. Coloque o suporte deslizante em um recipiente cheio de eosina e manche por 5 min.
  12. Transfira o suporte da corrediça para o recipiente preenchido com etanol 70% e enxágue brevemente (10 s).
  13. Desidratar as seções colocando o suporte deslizante sequencialmente nos recipientes cheios com soluções de gradiente de etanol: etanol 95%, 5 mergulhos; 100% etanol, 5 mergulhos.
  14. Limpe as lâminas colocando o suporte de corrediças no recipiente cheio com 100% de xileno por 3 min. Repita a incubação usando 100% de xileno fresco.
  15. Retire a lâmina do rack, seque a área ao redor dos tecidos usando um papel toalha e, dependendo do tamanho da amostra, adicione uma ou duas gotas de meio de montagem à base de xileno na superfície da amostra. Monte colocando suavemente uma tampa em cima da lâmina de vidro (cuidado para não deixar bolhas de ar). Pressione suavemente, se necessário. Toda a superfície do vidro deve ser coberta e selada.
  16. Seque as lâminas, deixando-as sob o capô químico durante a noite. Normalmente, o meio de montagem solidifica-se em menos de 24 horas. Para garantir que as lâminas estejam secas, uma lâmina de amostra pode ser feita. Usando uma lâmina vazia, coloque uma gota do meio de montagem e deixe sob o capô químico durante a noite. No dia seguinte, toque na gota e verifique se ela está solidificada.
  17. Quando as lâminas secarem, analise a histologia dos tecidos usando um microscópio de luz ou um microscópio mais avançado com um canal de campo brilhante.
    1. Coloque uma lâmina de microscópio no palco, mova-se até que a amostra esteja no centro do campo de visão, ajuste o foco usando o botão de foco e use uma lente objetiva de aumento de 10x e/ou 20x para analisar a histologia em comparação com os tecidos controle (sham irradiado).
    2. Se o microscópio estiver equipado com uma câmera, tire fotos também.
      NOTA: O procedimento pode ser interrompido aqui; As lâminas podem ser armazenadas em temperatura ambiente e analisadas posteriormente. Não mantenha as lâminas por mais de 30 dias, pois a coloração desaparece lentamente.

5. Coloração por imunofluorescência

  1. Resfriar os histológicos contendo espécimes de tecido embebidos em parafina, colocando-os no gelo por pelo menos 1 h. Usando um micrótomo, prepare cortes de 5 μm de espessura para coloração. Cada tecido deve ser cortado horizontalmente para cobrir todo o espécime laminado.
    1. Após o corte do bloco de parafina, transfira os cortes de tecido para banho-maria aquecido a 45 °C e coloque os cortes em lâminas carregadas. Deixe as corrediças em um rack durante a noite em temperatura ambiente para secar.
      NOTA: O procedimento pode ser interrompido aqui, e as lâminas podem ser armazenadas à temperatura ambiente.
  2. Coloque as corrediças em um suporte de corrediça e leve ao forno a 65 °C durante a noite. As lâminas podem ser assadas por um tempo mais curto, 1-2 h. No entanto, isso não é aconselhável no caso de lâminas recém-cortadas (menos de 1 mês atrás).
    NOTA: Coloque o conjunto de coloração manual sob o capô químico e realize as incubações com xileno, etanol e H 2 O2/metanol sob o capô químico.
  3. No dia seguinte, resfrie as lâminas colocando-as em um suporte de corrediças sob o capô químico por 10 min.
  4. Desparafinizar os tecidos colocando o suporte de lâmina em um recipiente preenchido com xilol 100% por 3 min. Repita a incubação usando 100% de xileno fresco.
    NOTA: A partir desse momento, certifique-se de que os espécimes sejam mantidos úmidos o tempo todo.
  5. Atenuar a peroxidase endógena incubando as lâminas por 30 min em um recipiente preenchido com solução de peróxido de hidrogênio a 2% em metanol sob a capela química.
    CUIDADO: O álcool metílico é uma substância potencialmente perigosa: Perigo para a saúde (H225-H301, H311, H331-H370), inflamável (GHS02), e causa toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação) (GHS08). O peróxido de hidrogênio é uma substância potencialmente perigosa: corrosiva (GHS05) e causa toxicidade aguda (GHS07).
  6. Reidratar as seções em um gradiente de etanol colocando o suporte deslizante sequencialmente em recipientes cheios com as seguintes soluções: etanol 100%, 3 min; etanol 95%, 3 min; Etanol 70%, 3 min.
  7. Transfira o suporte da corrediça para um recipiente cheio de água destilada e enxágue em água destilada corrente por 2 min.
  8. Para recuperar os antígenos, transferir o suporte de lâmina para um recipiente com 250 mL de solução tampão citrato (citrato de sódio 10 mM, Tween-20 a 0,05%, pH 6,0) e cozinhar a 110 °C por 10 min usando uma câmara de descamuflagem.
  9. Transfira todo o recipiente para a câmara fria e deixe o resfriamento gradual ao longo de 30 min.
  10. Após 30 min, substituir a solução tampão citrato por água destilada e enxaguar em água destilada corrente até que todos os pedaços de parafina flutuante sejam removidos.
  11. Retire as lâminas do suporte (uma de cada vez), toque em um papel toalha e seque cuidadosamente a área ao redor do espécime com um papel toalha. Desenhe uma forma fechada ao redor do espécime usando uma caneta que forneça uma barreira hidrofóbica (caneta PAP). Coloque em uma câmara umedificada.
  12. Bloquear com albumina de soro bovino (BSA) a 5% em TBS-Tween adicionando 200 μL da solução na superfície de uma amostra. Certifique-se de que não há vazamento. Incubar a 37 °C numa câmara humidificada durante 30 min.
  13. Retire a solução de bloqueio batendo a lâmina de vidro em um papel toalha. Coloque novamente em uma câmara umedecida. Adicionar 100 μL da concentração adequada dos anticorpos primários ressuspensos num tampão de bloqueio e incubar a 4 °C com balanço suave durante a noite. Para IMC1/EYFP, utilizar frango anti-GFP (diluição 1:500); para Ki-67, utilizar coelho anti-Ki-67 (diluição 1:200).
  14. Remova a solução de anticorpos batendo a lâmina de vidro em uma toalha de papel; Coloque as lâminas em um suporte de slides e transfira para o recipiente preenchido com TBS-Tween. Lave as lâminas com agitação por 5 min. Repita 3x. De cada vez, use uma nova porção de buffer TBS-Tween.
  15. Retire as lâminas do suporte (uma de cada vez), remova o excesso de solução de lavagem batendo a lâmina de vidro em um papel toalha e coloque em uma câmara umedecida. Adicionar 100 μL da concentração adequada de anticorpos secundários ressuspensos num tampão de bloqueio e incubar a 37 °C durante 30 minutos. Os anticorpos secundários devem ser conjugados com um fluoróforo. Para IMC1/EYFP, use burro anti-frango Alexa Fluor 647 (diluição 1:500); para Ki-67, use cabra anti-coelho Alexa Fluor 488 (diluição 1:500).
  16. Remova a solução de anticorpos batendo a lâmina de vidro em uma toalha de papel; Coloque as lâminas em um suporte de slides e transfira para o recipiente preenchido com TBS-Tween. Lave as lâminas com agitação por 5 min. Repita 3x. De cada vez, use uma nova porção de buffer TBS-Tween.
  17. Retire as lâminas do suporte (uma de cada vez), remova o excesso de solução de lavagem batendo a lâmina de vidro em um papel toalha e coloque em uma câmara umedecida. Adicionar 100 μL da solução corante de EdU preparada de acordo com as instruções do fabricante e utilizando o fluoroforo Alexa Fluor 555.
  18. Retire a solução de EdU batendo a lâmina de vidro em um papel toalha; Coloque as lâminas em um suporte de slides e transfira para o recipiente preenchido com TBS-Tween. Lave as lâminas com agitação por 5 min. Repita 2x. De cada vez, use uma nova porção de buffer TBS-Tween.
  19. Retire os slides do suporte (um de cada vez); Retire o excesso de solução de lavagem batendo a lâmina de vidro em um papel toalha e coloque em uma câmara umedecida. Efectuar a contracoloração Hoechst 33258 adicionando 100 μL da solução Hoechst 33258 (diluição 1:1000 em TBS-Tween) na superfície da amostra. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 5 minutos.
  20. Retire a solução Hoechst 33258 batendo a lâmina de vidro em um papel toalha; coloque as lâminas em um suporte de slides e transfira para um recipiente cheio de TBS-Tween. Lave as lâminas com agitação por 5 min.
  21. Retire a lâmina do suporte da lâmina, seque a área ao redor dos tecidos usando uma toalha de papel e, dependendo do tamanho da amostra, adicione uma ou duas gotas de meio de montagem à base de água na superfície da amostra. Monte colocando suavemente uma tampa em cima da lâmina de vidro (cuidado para não deixar bolhas de ar). Pressione suavemente, se necessário. Toda a superfície do vidro deve ser coberta e selada.
  22. Seque as lâminas, deixando-as no escuro à temperatura ambiente durante a noite. Normalmente, a mídia de montagem se solidifica em menos de 24 h. Para garantir que as lâminas estejam secas, uma lâmina de amostra pode ser feita. Use um slide vazio; Coloque uma gota do meio de montagem e deixe sob o capô químico durante a noite. No dia seguinte, toque na gota e verifique se ela está solidificada.
  23. Quando as lâminas secam, os tecidos corados podem ser analisados usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros de comprimento de onda de emissão, permitindo a visualização das colorações Ki-67, EdU e IMC1/EYFP (535 nm, 646 nm e 700 nm, respectivamente).
  24. Coloque uma lâmina de microscópio no palco, mova até que a amostra esteja no centro do campo de visão, ajuste o foco usando o botão de foco e use a lente objetiva de aumento de 10x e/ou 20x para analisar a coloração em comparação com os tecidos controle (sham irradiado). Se o microscópio estiver equipado com uma câmera, as imagens também podem ser tiradas. Tire imagens para cada canal separadamente e mescle mais tarde.
    NOTA: O procedimento pode ser interrompido aqui; as lâminas podem ser armazenadas a 4 °C e analisadas posteriormente. Não mantenha as lâminas por mais de 14 dias, pois a coloração desaparece lentamente.

6. Coloração TUNEL

  1. Resfriar os histológicos contendo espécimes de tecido embebidos em parafina, colocando-os no gelo por pelo menos 1 h. Usando um micrótomo, prepare cortes de 5 μm de espessura para coloração. Cada tecido deve ser cortado horizontalmente para cobrir todo o espécime laminado.
    1. Após o corte do bloco de parafina, transfira os cortes de tecido para banho-maria aquecido a 45 °C e coloque os cortes em lâminas carregadas. Deixe as corrediças em um rack durante a noite em temperatura ambiente para secar.
      NOTA: O procedimento pode ser interrompido aqui, e as lâminas podem ser armazenadas à temperatura ambiente.
  2. Coloque as corrediças em um suporte de corrediça e leve ao forno a 65 °C durante a noite.
    NOTA: As lâminas podem ser assadas por um tempo mais curto, 1-2 horas. No entanto, não é aconselhável no caso de lâminas recém-cortadas (há menos de 1 mês). Coloque o conjunto de coloração manual sob a coifa química e realize as incubações com xileno e etanol sob a coifa química.
  3. No dia seguinte, resfrie as lâminas colocando-as em um suporte de corrediças sob o capô químico por 10 min.
  4. Desparafinizar os tecidos colocando o suporte das lâminas em um recipiente preenchido com xileno 100% por 3 min. Repita a incubação usando 100% de xileno fresco.
    NOTA: A partir deste ponto, certifique-se de que os espécimes sejam mantidos úmidos o tempo todo.
  5. Reidratar as seções em um gradiente de etanol colocando o suporte de lâminas sequencialmente em recipientes preenchidos com as seguintes soluções: etanol 100%, 3 min; etanol 95%, 3 min; etanol 90%, 3 min; etanol 80%, 3 min; Etanol 70%, 3 min.
  6. Transfira o suporte da corrediça para um recipiente cheio de água destilada e enxágue em água destilada corrente por 1 min.
  7. Retire as lâminas do suporte (uma de cada vez), toque em um papel toalha e seque cuidadosamente a área ao redor do espécime com um papel toalha. Desenhe uma forma fechada ao redor do espécime usando uma caneta que forneça uma barreira hidrofóbica (caneta PAP). Coloque em uma câmara umedificada.
  8. Incubar com proteinase K livre de DNase. Adicionar 100 μL da solução de proteinase K livre de DNase (diluição 1:25 em DPBS) na superfície da amostra dentro da barreira hidrofóbica. Incubar à temperatura ambiente numa câmara humidificada durante 15 min.
    CUIDADO: A proteinase K é uma substância potencialmente perigosa: Perigo para a saúde (H315 - H319 - H334).
  9. Retire a solução de proteinase K batendo a lâmina de vidro em um papel toalha; coloque as lâminas em um suporte de slides e transfira para o recipiente cheio de DPBS. Lave as lâminas com agitação por 5 min. Repita 2x. De cada vez, use uma nova porção de DPBS.
  10. Preparar a mistura de reacção TUNEL: Misturar a solução do rótulo (1x) com a solução enzimática (10x). Pipetar bem.
  11. Retire os slides do suporte (um de cada vez); Retire o excesso de solução de lavagem batendo a lâmina de vidro em um papel toalha e coloque em uma câmara umedecida. Adicionar 50 μL de mistura de reacção TUNEL à superfície da amostra e incubar no escuro a 37 °C numa câmara humidificada durante 60 minutos. Para um controle negativo, use apenas a solução de rótulo (sem TdT).
  12. Retire a solução TUNEL batendo a lâmina de vidro em um papel toalha; coloque os slides em um suporte de slides e transfira para um contêiner cheio de DPBS. Lave as lâminas com agitação por 5 min. Repita 2x. De cada vez, use uma nova porção de DPBS.
  13. Retire os slides do suporte (um de cada vez); Retire o excesso de solução de lavagem batendo a lâmina de vidro em um papel toalha e coloque em uma câmara umedecida. Efectuar a contracoloração Hoechst 33258 adicionando 100 μL da solução Hoechst 33258 (diluição 1:1000 em TBS-Tween) na superfície da amostra. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 5 minutos.
  14. Retire a solução Hoechst 33258 batendo a lâmina de vidro em um papel toalha; coloque as lâminas em um suporte de slides e transfira para o recipiente cheio de DPBS. Lave as lâminas com agitação por 5 min.
  15. Retire o slide do suporte do slide; Seque a área ao redor dos tecidos usando um papel toalha e, dependendo do tamanho do espécime, adicione uma ou duas gotas de meio de montagem à base de água na superfície do espécime. Monte colocando suavemente uma tampa em cima da lâmina de vidro (cuidado para não deixar bolhas de ar). Pressione suavemente, se necessário. Toda a superfície do vidro deve ser coberta e selada.
  16. Seque as lâminas, deixando-as no escuro à temperatura ambiente durante a noite. Normalmente, o meio de montagem solidifica-se em menos de 24 horas. Para garantir que as lâminas estejam secas, uma lâmina de amostra pode ser feita. Coloque uma gota do meio de montagem e deixe no escuro em temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, toque na gota e verifique se ela está solidificada.
  17. Quando as lâminas secam, os tecidos corados podem ser analisados usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros de comprimento de onda de emissão, permitindo a visualização da coloração TUNEL (535 nm).
  18. Coloque uma lâmina de microscópio no palco, mova-se até que a amostra esteja no centro do campo de visão, ajuste o foco usando o botão de foco e use uma lente objetiva de aumento de 10x e/ou 20x para analisar a coloração em comparação com os tecidos controle (irradiação simulada). Se o microscópio estiver equipado com uma câmera, as imagens também podem ser tiradas. Tire imagens para cada canal separadamente e mescle mais tarde.
    NOTA: O procedimento pode ser interrompido aqui; as lâminas podem ser armazenadas a 4 °C e analisadas posteriormente. Não mantenha as lâminas por mais de 14 dias, pois a coloração desaparece lentamente.

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Representative Results

O uso de irradiação de corpo total (TCE) de 12 Gy em combinação com o rastreamento de linhagem genética murina permite uma análise completa das consequências da lesão por radiação no intestino. Para começar, Bmi1-CreER; Camundongos Rosa26eYFP receberam uma única injeção de tamoxifeno, que induz a expressão aumentada da proteína fluorescente amarela (EYFP) dentro de uma população de células-tronco de reserva Bmi1+ . Dois dias após a injeção de tamoxifeno, os camundongos foram submetidos à irradiação ou irradiação simulada. Três horas antes da eutanásia, os ratos foram injetados com EdU. Após a eutanásia, amostras do intestino delgado foram coletadas para análise 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 7 dias após a irradiação. Imagens representativas da hematoxilina e da eosina (H&E) (Figura 1) do curso temporal supracitado ilustram a resposta do epitélio intestinal à lesão. O tempo de 0 h é ilustrativo do epitélio intestinal homeostático (Figura 1); segue-se a fase apoptótica, caracterizada por perda de células dentro dos compartimentos das criptas entre 3 h e 48 h (Figura 1). Segue-se a fase regenerativa, onde células altamente proliferativas podem ser encontradas povoando as criptas entre 72 h e 96 h (Figura 1). Finalmente, isso leva à fase de normalização, aqui representada pelo ponto de tempo de 7 dias (Figura 1).

A Figura 2 ilustra as mudanças no status proliferativo das criptas intestinais avaliadas pela coloração imunofluorescente de EdU (marcador de células em fase S) e Ki-67 (marcador de células nas fases G1, S e G2/M), enquanto o rastreamento de linhagem (células EYFP+) marca células originárias de células-tronco de reserva Bmi1+. Durante a homeostase (Figura 2, 0 h sham), as células positivas para Bmi1+ marcadas pela expressão de EYFP ficam restritas à posição +4-+6 dentro das criptas. Durante a fase apoptótica (24 h e 48 h), as células positivas para EYFP diminuem em número (Figura 2). A fase regenerativa (72 h e 96 h) é caracterizada pela rápida proliferação de células Bmi1+ positivas e seus progenitores (Figura 2); 7 dias após a irradiação, novas proliferações e migrações reabasteceram as células das criptas intestinais e restauraram a integridade do epitélio intestinal (Figura 2).

Em camundongos sham-irradiados (controle), EdU e Ki-67 coram células proliferativas EYFP negativas das criptas intestinais, típicas da homeostase intestinal normal, estendendo-se de células-tronco ativas através da zona de amplificação do trânsito (Figura 2). O dano radioativo causa perda de células altamente proliferativas durante a fase apoptótica, como demonstrado pela redução das colorações de EdU e Ki-67 (Figura 2). A ativação de células-tronco de reserva (neste exemplo, células positivas para Bmi1+ marcadas com EYFP) e sua proliferação resultam em um aumento de células positivas para EdU e Ki-67 claramente visíveis em 72 h e 96 h após a lesão, onde as criptas são compostas quase exclusivamente por células co-coradas com EYFP, EdU e Ki-67. Os níveis de proliferação observados normalizam-se 7 dias após a lesão (Figura 2).

Para ilustrar a apoptose causada pelo dano da radiação, a coloração TUNEL foi realizada, e imagens representativas estão incluídas na Figura 3. Durante a homeostase (Figura 3), poucas células estão sofrendo apoptose, típica do turnover epitelial intestinal normalmente rápido. Um nítido aumento na coloração TUNEL pode ser observado tardiamente na fase apoptótica (24 h e 48 h) após a irradiação (Figura 3). Durante a fase regenerativa, a coloração TUNEL diminui constantemente dentro das criptas regeneradoras e é novamente quase ausente quando as criptas se normalizaram (Figura 3). O protocolo apresentado descreve um método simples e acessível de coloração por imunofluorescência utilizando uma combinação direta e amplamente empregada de técnicas de marcação (TUNEL, EdU, Ki-67, EYFP) que é capaz de fornecer informações sobre o comportamento das células intestinais após a lesão (aqui, irradiação). Esta abordagem pode ser empregada para estudar os mecanismos que regulam os processos regenerativos no epitélio intestinal em circunstâncias específicas. O emprego desta e de outras abordagens semelhantes iluminará processos regenerativos alternativos após diferentes insultos intestinais e, além disso, permitirá a investigação de estratégias terapêuticas para a prevenção da perda da função de barreira.

Figure 1
Figura 1: Imagens representativas de cortes corados pela hematoxilina e eosina (H&E) dos tecidos do intestino delgado após um curso de tempo após a irradiação corporal total. Bmi1-CreER; Camundongos Rosa26eYFP receberam uma dose de tamoxifeno 2 dias antes da irradiação de corpo total de 12 Gy ou irradiação simulada. Camundongos foram sacrificados e tecidos do intestino delgado foram coletados nos momentos indicados na figura. Todas as imagens foram obtidas em aumento de 10x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagens representativas da coloração por imunofluorescência dos cortes do intestino delgado após irradiação. Bmi1-CreER; Camundongos Rosa26eYFP receberam uma dose de tamoxifeno 2 dias antes da irradiação de corpo total de 12 Gy ou irradiação simulada. Camundongos foram sacrificados e tecidos do intestino delgado foram coletados nos momentos indicados na figura. Cortes teciduais foram corados com EdU para marcação das células em fase S (rosa) e Ki-67 para marcação das células nas fases G0, S e G2/M (amarelo). EYFP (verde) marca células Bmi1+ e seus progenitores e demonstra o rastreamento de linhagem. Os cortes foram contracorados com DAPI (azul) para visualização dos núcleos. Os dados são mostrados como imagens mescladas em aumento de 10x e inserções de colorações individuais em aumento de 20x (estas originadas de imagens de 10x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Imagens representativas da coloração TUNEL por imunofluorescência de cortes do intestino delgado após a irradiação. Bmi1-CreER; Camundongos Rosa26eYFP receberam uma dose de tamoxifeno 2 dias antes da irradiação de corpo total de 12 Gy ou irradiação simulada. Camundongos foram sacrificados e tecidos do intestino delgado foram coletados nos momentos indicados na figura. TUNEL (vermelho) cora células apoptóticas. Essas imagens foram contracoradas com DAPI (azul) para visualização dos núcleos. As imagens apresentadas foram realizadas em aumento de 20x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo descreve um modelo robusto e reprodutível de lesão por radiação. Permite a análise precisa das alterações no epitélio intestinal ao longo de 7 dias pós-lesão. É importante ressaltar que os momentos selecionados refletem estágios cruciais da lesão e são caracterizados por alterações distintas no intestino (lesão, apoptose, regeneração e fases de normalização)60. Esse modelo de irradiação foi estabelecido e cuidadosamente avaliado, demonstrando uma manifestação de lesão adequada para mimetizar aquela experimentada por pacientes submetidos à radioterapia61. Mais da metade dos pacientes com câncer colorretal e ginecológico são submetidos à radioterapia abdominal 40,62,63. Apesar dos métodos avançados de radioterapia direcionada, os pacientes experimentam irradiação de tecido intestinal saudável, o que produz fisiopatologia muito semelhante àquela observada com o modelo de irradiação de corpo total aqui apresentado. Portanto, o modelo de radiação aqui descrito pode potencialmente abordar as repercussões da exposição acidental à radiação de pacientes e/ou pessoal médico e, portanto, é vital para a saúde humana.

O Bmi1-CreER; O modelo de camundongosRosa26 eYFP carrega Cre induzível por tamoxifeno sob o controle transcricional do promotor Bmi1 de camundongo Bmi1 (Bmi1 polycomb ring finger oncogene). Além disso, esses camundongos carregam uma sequência R26-stop-EYFP, onde o códon STOP é flanqueado por lados loxP seguido pelo gene Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP) inserido no locus Gt(ROSA)26Sor. A expressão de EYFP é bloqueada por uma sequência STOP ladeada por loxP a montante, mas pode ser ativada por deleções direcionadas induzidas por tamoxifeno e mediadas por Cre, permitindo o rastreamento de linhagem de células que expressam Bmi1, uma subpopulação específica de células-tronco de reserva de células cripta. O protocolo de radiação em combinação com o Bmi1-CreER; O modelo decamundongos eYFP Rosa26 foi empregado anteriormente para estudar o papel dos fatores de transcrição na regulação da regeneração intestinal18,56. Os resultados representativos apresentados na Figura 1 a Figura 3 mostram resultados semelhantes aos apresentados em publicações recentes18,56.

Destaca-se, Bmi1-CreER; Camundongos Rosa26eYFP são apenas um dos múltiplos modelos animais transgênicos empregados para estudar a regeneração intestinal. Outros modelos de traçado de linhagem murina têm sido combinados com radiação para demonstrar o papel de células e vias específicas na capacidade regenerativa do epitélio intestinal 18,26,32,33,34,35,36,37,56,64,65,66,67 . Esses modelos são projetados para investigar o papel de diferentes populações de células-tronco reservadas, explorar os precursores de linhagens secretoras e enterocitárias e estudar a função de genes específicos dentro de cada subpopulação de células epiteliais intestinais. Resultados combinados dessas investigações ajudarão a expandir a compreensão da capacidade regenerativa do epitélio intestinal.

É importante ressaltar que, com pequenas modificações, essa técnica deve permitir a investigação das relações entre a microbiota e diferentes populações de células epiteliais, estromais e imunes após lesão por radiação. A introdução de modelos animais distintos de rastreamento de linhagens permitirá o estudo do comportamento em tempo real e a interação de várias subpopulações de células pós-lesão. Alternativamente, a coloração dos tecidos poderia ser substituída por sequenciamento de RNA, sequenciamento de RNA de célula única, classificação celular ativada por fluorescência (FACS) ou análise proteômica para obter conhecimento mais aprofundado sobre o papel de linhagens celulares específicas durante a regeneração intestinal após lesão68,69. Esse modelo de lesão poderia ser utilizado para testar novas modalidades de tratamento destinadas a minimizar os efeitos colaterais da irradiação, encurtar o tempo de recuperação e melhorar a qualidade da assistência ao paciente70. Embora o modelo de radiação aqui descrito possa servir como uma ferramenta útil para estudar a regeneração do epitélio intestinal, ele também apresenta várias limitações. A dose de radiação de corpo inteiro resulta invariavelmente em síndrome hematopoiética subsequente, o que dificulta a investigação da regeneração intestinal. Isso pode ser evitado pelo transplante de medula óssea. Além disso, a modificação de um protocolo de lesão apenas abdominal pode potencialmente amenizar alguns dos efeitos colaterais da irradiação71. No entanto, esse modelo requer etapas adicionais que podem afetar a resposta intestinal à lesão (por exemplo, anestesia). Incidentalmente, a radiação abdominal produz síndrome gastrointestinal induzida por radiação (RIGS) sem síndrome hematopoiética, diferindo da irradiação de corpo inteiro (WBI), na medida em que WBI produz sintomatologia gastrointestinal semelhante, mas inclui perda parcial da função hematopoiética após lesão71,72.

Vale ressaltar que modelos animais geneticamente modificados como os descritos neste protocolo são sofisticados e permitem o rastreamento de linhagens de células específicas. No entanto, esses modelos, embora muito benéficos, requerem esforço adicional para serem mantidos. Modelos animais transgênicos que permitem deleções gênicas condicionais são difíceis de gerar, e sua deleção oportuna após lesão pode não ser facilmente realizada. Além disso, a maioria dos modelos transgênicos permite apenas uma deleção condicional ou inativação de um gene de interesse, mas não são induzíveis e, portanto, são incapazes de restaurar a função gênica e podem impedir os estudos. Além disso, modelos animais transgênicos geralmente requerem tratamento com substâncias químicas adicionais (por exemplo, tamoxifeno, doxiciclina) para alcançar a inativação ou superexpressão do gene de interesse. O tratamento com essas substâncias pode, em algum grau, alterar a resposta do epitélio intestinal ou aumentar a gravidade da lesão 73,74,75,76. Além disso, a indução do rastreamento de linhagem pelo tamoxifeno pode ser introduzida mais perto do tempo de lesão por radiação para melhorar a marcação das células envolvidas na regeneração (por exemplo, 6-24 h antes da lesão). Assim, é possível substituir um modelo transgênico por camundongos selvagens e uma combinação de coloração de FI (por exemplo, Ki-67, PCNA, EdU, TUNEL, Caspase 3). Esse modelo permite a análise da capacidade regenerativa do intestino, embora não permita o estudo de uma subpopulação específica das células.

O protocolo descrito neste manuscrito tem várias etapas cruciais. É de extrema importância garantir que camundongos saudáveis sejam usados para experimentação, pois serão expostos à radiação e ao tratamento com produtos químicos. Se os experimentos com diferentes grupos de camundongos forem realizados com dias, semanas ou meses de intervalo, é uma boa prática aderir à mesma linha do tempo, por exemplo, injeções de tamoxifeno no mesmo horário do dia. O processo de irradiação deve ser feito imediatamente, e os camundongos devem ser devolvidos às suas gaiolas originais imediatamente. Além disso, fornecer alimentos amolecidos e muita água pode ajudar a amenizar alguns dos efeitos adversos da radiação. Sugere-se a técnica swiss-roll para permitir uma análise abrangente do tecido intestinal59. Essa técnica não é trivial, e testes prévios devem ser feitos para garantir que a qualidade impecável do tecido para coloração seja alcançada. Todas as soluções para experimentos e coloração em camundongos devem ser preparadas na hora e armazenadas em condições adequadas. Ao trabalhar com anticorpos, é importante testar lâminas usando controles positivos e negativos e, se possível, usar anticorpos com o mesmo número de catálogo e número de lote. As lâminas de imunofluorescência devem ser armazenadas a 4 °C e obtidas no prazo de 1 semana após a preparação. O armazenamento prolongado, mesmo a -20 °C, pode resultar na perda de sinal. As lâminas H&E podem ser armazenadas à temperatura ambiente, pois não há preocupação com a perda da estabilidade do fluoróforo.

Em resumo, o modelo de lesão por radiação de rastreamento de linhagem apresentado aqui é um modelo reprodutível e relevante para rastrear o destino das células intestinais após insulto e pode ser combinado com diversos modelos murinos e técnicas moleculares para melhorar a compreensão da fisiopatologia do epitélio intestinal. O conhecimento dos mecanismos moleculares e celulares que regem a regeneração do epitélio intestinal pode levar ao desenvolvimento de novos tratamentos e intervenções terapêuticas benéficas.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores desejam agradecer ao Stony Brook Cancer Center Histology Research Core pela assistência especializada com a preparação de espécimes de tecido e à Divisão de Recursos de Animais de Laboratório da Stony Brook University pela assistência com cuidados e manuseio de animais. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde DK124342 concedidos a Agnieszka B. Bialkowska e DK052230 ao Dr. Vincent W. Yang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 -
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 -
27G x 1/2" needle BD 305109 -
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 -
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 -
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 -
Corn oil Millipore-Sigma C8267 -
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 -
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV -
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. - 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 -
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 -
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 -
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT -
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 -
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL

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References

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Biologia Edição 185
Regeneração Epitelial Intestinal em Resposta à Irradiação Ionizante
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Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).

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