Summary
单体α-突触核蛋白的结构集合影响其生理功能和理化性质。本方案描述了如何进行毫秒氢/氘交换质谱和随后的数据分析,以确定在生理条件下这种内在无序蛋白质的单体的构象信息。
Abstract
α-突触核蛋白(aSyn)是一种内在无序的蛋白质,其纤维聚集体在路易体和神经突起中含量丰富,这是帕金森病的标志。然而,它的大部分生物活性以及它的聚集,都集中在蛋白质的可溶性单体形式上。阐明aSyn生物学和病理生理学的分子机制需要结构高度解析的方法,并且对生物学条件敏感。其原生展开的,亚稳态的结构使单体aSyn难以解决许多结构生物学技术。这里描述了一种这种方法的应用:氢/氘交换质谱(HDX-MS)在毫秒时间尺度上用于研究具有低热力学稳定性和保护因子的蛋白质,例如aSyn。在毫秒时间尺度上,HDX-MS数据包含有关aSyn的溶剂可及性和氢键结构的信息,这些信息在较长的标记时间下丢失,最终产生高达氨基酸水平的结构分辨率。因此,HDX-MS可以以高结构和时间分辨率提供有关构象动力学和热力学,分子内和分子间相互作用以及突变或改变对环境条件的结构影响的信息。虽然广泛适用,但演示了如何在单体aSyn中获取,分析和解释毫秒级HDX-MS测量值。
Introduction
帕金森病(PD)是一种神经退行性疾病,影响全球数百万人1。其特征在于在大脑的黑质紧凑区域形成称为路易体和路易神经突的细胞质内含物。已发现这些细胞质包涵体含有内在无序蛋白 aSyn2 的聚集体。在PD和其他突触核蛋白病中,aSyn从可溶性无序状态转变为不溶性,高度结构化的患病状态。在其天然形式中,单体aSyn采用广泛的构象,通过其N-和C-末端之间的长程静电相互作用以及其C-末端和非淀粉样蛋白β组分(NAC)区域3,4,5,6之间的疏水相互作用而稳定。这些稳定相互作用中的任何破坏,例如突变,翻译后修饰和局部环境的变化,都可能导致单体折叠错误,从而触发聚集过程7。
虽然对aSyn8,9,10,11的低聚和纤维形式存在大量研究,但迫切需要研究蛋白质的单体形式,并更好地了解哪些构象是功能性的(以及如何),哪些容易聚集8,9,10,11.由于本质上是无序的,大小只有14 kDa,并且难以结晶,aSyn单体不适合大多数结构生物技术。然而,一种能够测量单体aSyn构象动力学的技术是毫秒HDX-MS,它最近产生了重要的结构观察结果,否则将具有挑战性或不可能获得12,13,14。毫秒 HDX-MS 通过监测酰胺氢的同位素交换来灵敏地测量蛋白质构象集合的平均值,指示溶剂可及性和特定蛋白质区域在毫秒时间尺度上的氢键网络参与情况。有必要强调HDX-MS的毫秒方面,因为由于其原生展开的元稳定性,aSyn表现出非常快的氢交换动力学,其表现形式远低于传统HDX-MS系统的下限。例如,大多数aSyn分子在细胞内条件下在不到1秒的时间内将氢完全交换为氘。现在有几个实验室已经建立了快速混合仪器;在这种情况下,使用快速混合淬火流仪器的原型,该仪器能够以50 ms的死区时间为50 ms,时间分辨率为1 ms执行HDX-MS。虽然毫秒HDX-MS最近在aSyn的研究中非常重要,但它在更广泛地研究本质无序的蛋白质/区域以及大量具有仅弱稳定的环/区域的蛋白质方面是有价值的。例如,多肽药物(例如,胰岛素;普洛斯-1/胰高血糖素;tirzepatide)和肽融合蛋白(例如,HIV抑制剂FN3-L35-T1144)是主要的药物形式,其中溶液相结构和稳定性信息可以成为药物开发决策的关键输入,然而,肽部分通常只有HDX-MS在秒级16,17,18,19,20的微弱稳定性和难处理.在秒/分钟结构域中标记的紧急HDX-MS方法已被证明可以推导出DNA G-四链体的结构信息,但应该可以通过应用毫秒级HDX-MS21将其扩展到更多样化的寡核苷酸结构。
HDX-MS实验可以在三个不同的水平上进行:(1)自下而上(标记的蛋白质被蛋白水解消化),(2)中下(标记的蛋白质被蛋白水解消化,所得的肽通过软片段化技术进一步片段化),以及(3)自上而下(软片段化技术直接片段化标记的蛋白质)22.因此,亚分子HDX-MS数据使我们能够将交换行为定位到蛋白质的特定区域,因此对于此类实验具有足够的序列覆盖率至关重要。任何HDX-MS实验的结构分辨率分别依赖于消化或软片段化时从蛋白质衍生的蛋白水解肽或片段的数量。在上面概述的三种实验类型中的每一种中,每个肽/片段的酰胺交换的变化被映射回蛋白质的主要结构,以指示蛋白质局部区域的行为。虽然最高的结构分辨率是通过软碎片实现的,但这些实验的描述超出了当前研究的范围,该研究的重点是测量aSyn单体构象。通过此处描述的常用“自下而上”工作流程可以获得出色的结果。
这里提供了以下程序:(1)如何制备和处理aSyn样品和HDX-MS缓冲液,(2)如何为自下而上的HDX-MS实验进行肽图分析,(3)如何在生理条件下,特别是在毫秒时域中获取单体aSyn上的HDX-MS数据(使用定制的仪器;用于毫秒标记的替代仪器) (4)如何处理和分析HDX-MS数据。这里举例说明了在生理pH(7.40)下在两种溶液条件下使用单体aSyn的方法。虽然在aSyn的研究中至关重要,但这些程序可以应用于任何蛋白质,而不限于内在无序的蛋白质。
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Protocol
1. 同步蛋白的蛋白表达和纯化
- 按照以前发布的报告准备 aSyn9.
- 透析到安全的储存缓冲液中(例如,Tris,pH 7.2)。
- 如果需要,浓缩样品(例如,使用3 kDa MWCO,14,000 x g 约10-30分钟的旋转过滤微量离心管,参见 材料表)。
注意:建议不要过度集中注意力。单体融合的完整性尚未超过25 μM得到验证。 - 等分试样并储存在−80°C
注意:aSyn单体蛋白在这些储存条件下稳定长达1年。
2. HDX 缓冲液制备
注意:由于Tris具有高温度系数,因此需要根据HDX反应的温度调整pH测量值,在本实验方案中为20°C。
- 通过将0.002摩尔Tris加入100 mL LC-MS级水中,制备状态A和状态B的平衡缓冲液。对于B状态,在Tris缓冲液中加入29.8毫克氯化钾,14.2毫克氯化镁2,36.8克氯化钙2和836毫克氯化钠。将pH值调节至7.40±0.05。
注意:平衡缓冲液必须包含研究aSyn的条件。在这种情况下,它是20 mM Tris,pH值为7.4 +/−盐。 - 通过将0.002摩尔Tris与100 mL氘代水中制备状态A和状态B的标记缓冲液。对于B国,在Tris标记缓冲液中加入29.8毫克氯化钾,14.2毫克氯化镁2,36.8克氯化钙2和836毫克氯化钠。标记缓冲液的pD对应于平衡缓冲液的pH值。由于 pH = pD - 0.41,因此请进行调整,使 pH 计读数为 6.99 ± 0.0523,24。
注意:标记缓冲液需要具有与平衡缓冲液相同的组分,只是它是使用氘代水制备的。 - 通过称出0.010摩尔Tris和0.050摩尔尿素来制备淬火缓冲液,并用LC-MS级水制备高达100毫升。在0.5°C下将pH调节至2.50±0.05。
注意:在HDX实验之前,必须进行淬灭缓冲液筛选,以确定目标蛋白质的最佳淬灭缓冲液。筛选不同浓度和组合的变性剂(例如尿素和盐酸胍)和还原剂(例如,三(2-羧乙基)膦)以及物理参数,例如捕获体积和温度,以有效地展开和消化淬灭的蛋白质。在pH为2.50时由100 mM Tris和0.5 M尿素组成的淬灭缓冲液是本研究的最佳选择。 - 通过将0.125摩尔盐酸胍放入Duran玻璃瓶中来制备消化柱洗涤缓冲液。加入25 mL甲醇和250μL甲酸。用LC-MS级水制作多达250毫升。
注意:对于酶解物BEH胃蛋白酶柱(参见 材料表),使用0.5 M盐酸胍,10%(v / v)甲醇和0.1%(v / v)甲酸的柱洗缓冲液。 - 通过将0.5μL甲酸移液到249.5 mL LC-MS级水中来制备注射器弱洗涤液。
- 通过混合等量的LC-MS级水,甲醇,乙腈和异丙醇来制备注射器强力洗涤。将甲酸加入最终的2%(v / v)浓度。
注意:为了防止各种缓冲液和蛋白质之间的交叉污染,并能够清洁注射口,至关重要的是准备注射器洗涤溶液,并且阀门的流路(通常称为“清洗衬里”)完全充满液体。甲酸对于注射器弱洗是可选的。
3. 肽图分析程序
- 按照以下步骤准备示例。
- 用0.22μm注射器过滤器从-80°C冰箱中过滤解冻的aSyn蛋白质储备。测量过滤后的储备蛋白在280nm处的吸光度,以通过比尔 - 兰伯特定律确定浓度。在平衡缓冲液中将蛋白质稀释至5μM的浓度(步骤2.1.)。
注意:比尔-朗伯定律: A = εcl,其中 A 是吸光度,ε是蛋白质在测量波长(此处为 280 nm)下的消光系数,单位为 M−1cm−1, c 是以 M 为单位的蛋白质浓度, l 是以 cm 为单位的路径长度。对于野生型 asyn26,ε = 5960 M−1cm−1。
- 用0.22μm注射器过滤器从-80°C冰箱中过滤解冻的aSyn蛋白质储备。测量过滤后的储备蛋白在280nm处的吸光度,以通过比尔 - 兰伯特定律确定浓度。在平衡缓冲液中将蛋白质稀释至5μM的浓度(步骤2.1.)。
- 设置液相色谱法。
- 在7000-9000 psi的压力下创建一个加载/捕获时间为3分钟的入口文件,然后在7分钟内将5%乙腈梯度为40%乙腈,然后重复5%-95%乙腈 - 水洗涤10分钟。
- 确保锁定喷雾(例如亮氨酸脑啡肽,参见 材料表)在2000 psi动并连接到质谱仪的源锁定喷雾探针。
- 设置质谱MSE 方法。
注意:MSE 是一种宽带数据无关的采集方法,没有前体质量隔离。因此,使用碰撞诱导解离(CID)27进一步破碎所选m / z范围内的所有离子。- 在 MS 方法文件中,选择 MSE 连续体 并设置 2-10 分钟之间的采集时间、电喷雾源和正分辨率模式。采集超过 50-2000 Da 的 MSE ,每 0.3 秒扫描一次。
- 对于函数1(低能量),设置陷阱并将碰撞能量传递为4 V。对于函数2(高能量),对于每个映射能级,将斜坡传输碰撞能量设置为恒定在4V,并将陷阱碰撞能量设置为 表1 中所述。
注意:也可以使用离子淌度MSE 方法。用户可自行决定使用替代映射方法(例如,依赖于数据的采集或DDA)。
- 设置自动进样机器人(请参见 材料表)。
- 将50μL5μM蛋白质加入到总回收瓶中。将小瓶放在HDX右腔室的样品位置。确保该腔室处于0.5°C。
- 将一个平衡缓冲液的试剂瓶和两个标记缓冲液的试剂瓶添加到HDX左腔室中的试剂位置1,2和3。通过设置帕尔贴温度控制器确保该腔室处于20°C(参见 材料表)。将一个试剂瓶的淬灭缓冲液加入HDX右室中的第一个试剂位置。
- 在 HDX 左室的反应位置添加 8 个总回收小瓶,在 HDX 右室的反应位置添加 8 个最大回收小瓶。
注:为确保完全清洁和分配体积的最大再现性,建议对自动进样器注射器进行注射器清洗和预洗。例如,在开始映射实验之前执行 (1) 弱洗涤、(2) 强洗涤、(3) 弱洗涤的顺序。该序列可以广泛重复,建议最多重复20次或直到注射器完全润湿。 - 在调度软件中使用适当的LC和MS方法设置示例列表并启动计划。
注:在本研究中,计时码被用作调度软件(见 材料表)。
- 处理映射数据。
- 使用适当的软件从图谱实验文件中鉴定肽(参见 材料表)。
- 使用以下肽阈值参数将肽鉴定数据导入 DynamX(参见 材料表):最小强度 = 5000,最小序列长度 = 0,最大序列长度 = 40,最小产物 = 1,每个氨基酸的最小产物 = 0.25,最小连续产物 = 2,产品的最小总和强度 = 0,最小评分 = 0,最大 MH+ 误差 (ppm) = 0。
注意:或者,根据推荐的工作流28 派生优化的设置。 - 从菜单中选择 数据 ,然后单击 导入 PLGS 结果。单击 添加 以选择光谱分配的相关数据文件。添加完所有内容后,单击“ 下一步 ”并输入上述过滤器设置。然后,单击 “完成”。
- 手动策划同位素分配,以获得DynamX中aSyn的最终肽覆盖图。
4. 毫秒氢/氘交换研究
- 在开始 HDX 实验之前,请清洁 FastHDX 原型仪器(参见 材料表)。
- 打开兼容的 HDX 软件 GUI 并允许系统初始化。
- 进入 样品室 温度为 20°C , 淬火室 温度为 0.5°C。单击“ 设置 ”以应用新温度。
- 在所有入口处设置带有LC-MS级水的离心管。
- 在 “滴定仪管道输送 ”选项卡中,检查左右注射器,然后单击 Prime 以去除管中任何潜在的气泡。重复此步骤,直到所有气泡消失。
- 在“ 宏 ”选项卡中,选中注射器的所有框。单击 “校准注射器主页位置”。单击 “清洗注射器加载循环”。 单击“ 清洗所有混合循环体积”。
- 重复步骤 4.1.5。1 倍以上。
- 如果缓冲注射器中出现任何气泡,则通过断开注射器并垂直弹出气泡来脱气。更换注射器并重新校准至零位。
- 为 HDX 实验设置快速HDX原型仪器。
- 在总回收瓶中加入500 uL过滤的5μM aSyn,并放入桌面冰箱中,以防止温度诱导的齐聚和聚集。
- 向每个缓冲液中加入50 mL平衡、标记和淬灭缓冲液(2.HDX缓冲液制备步骤1-3)入口在左侧和右侧腔室中。
- 加入50 mL柱洗缓冲液(2.HDX缓冲液制备步骤4)至胃蛋白酶洗涤入口。
- 要对蛋白质和色谱柱清洗管线进行 1x 的引置,请在 “滴定仪管道输送 ”选项卡中检查左右注射器,然后单击 “Prime”一次。
注意:任何随后的对Prime的点击都将导致Prime过程的额外重复,从而导致大量蛋白质样品的消耗。建议小心避免这种情况,即使尝试单击按钮后软件中存在延迟。 - 重复步骤 4.1.5。1 倍。
- 在 手动淬火流 选项卡中,输入步骤 4.2.7.-4.2.10 中所述的所需设置。
- 对于时程实验,请使用 “符号点 ”按钮输入时间(以毫秒为单位)。如果需要重复,请多次添加相同的时间点,例如,对于50 ms的三份,需要输入50 50 50。质谱仪软件中的样本列表(此处使用MassLynx,参见 材料表)需要完全匹配这些时间点。
注意:应使用质谱仪样品列表文件名和/或样品文本,以确保永久记录与FastHDX软件GUI中输入的HDX标记时间相对应。每个样品运行的标记时间不会存储在其他任何地方。 - 将 陷印时间(分钟) 设置为陷印时间的长度。在这里,它是3.00。
- 设置 等待 HPLC(分钟)=(陷阱时间 + 运行时间 + 1.5 分钟)。
注意:例如,对于具有3分钟陷印和17分钟梯度的实验,这将是21.50分钟。 - 仅当在示例 运行间隔运行空白 试验时,才单击“运行空白”框。如果是,请确保在每次示例运行后空白运行的软件中有一个条目(即示例列表中的有效行)。
- 在软件上准备好示例列表后,突出显示相应的条目,然后单击软件中的“ 播放 ”按钮和 FastHDX 开始在软件中运行。
注意:由于氢/氘加扰,仅使用MS方法或软碎裂技术(电子转移解离,电子捕获解离和紫外线光解离)只能使用29。对于生理pH值为7.40的aSyn,从50 ms到300 s的时间点最适用,因为它们覆盖了整个氘摄取曲线8。
5. 数据处理
- 从肽图分析实验中加载光谱分配的肽的文件。打开“ 文件 ”菜单,然后单击 DynamX 软件中的“ 打开 ”(请参阅 材料表)。
- 将原始文件导入首选的质量测量软件(例如,DynamX、HDExaminer 等)。打开“数据”菜单,然后单击 MS文件。单击“ 新状态” ,为研究的每个蛋白质状况创建状态。
- 单击“ 新曝光” 以添加每个 HDX 时间点。单击“ 新建 RAW ”以导入.raw文件。将每个.raw文件拖动到正确的位置。完成后单击 确定 。
- 首先自动分配同位素(这是按照上述步骤5.2自动分配的),然后手动管理同位素分配以确保高数据质量。
- 将簇数据导出到.csv文件中,其列按以下顺序排列:蛋白质名称、序列起始编号、序列结束编号、序列、修饰、片段、最大可能摄取量、单同位素物质的质量、状态名称、暴露时间、文件名、电荷、保留时间、强度和质心。
- 在质量测量软件中打开“ 数据 ”菜单,然后单击“ 导出群集数据”。
6. 数据分析
- 将导出的集群数据加载到首选的 HDX 分析软件中。这里,HDfleX使用30 (参见 材料表)。
- 拟合所有肽和状态的实验数据,选择适当的反向交换校正方法以获得HDX反应的观测速率常数。
- 通过首选方法计算全局显著性阈值(HDfleX 支持多个选项)并执行混合显著性测试,以确定与31,32 相比的各州之间的显著差异。
注意:如果观测到的差值大于全局阈值,并且 p 值小于所选的置信水平(例如,95%),则该差值被视为显著。
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Representative Results
由于其固有的无序性质,很难捕获aSyn在生理pH下错综复杂的结构变化。HDX-MS监测主链酰胺氢的同位素交换,探测蛋白质构象动力学和相互作用。它是在高结构和时间分辨率下获取此信息的少数技术之一。该协议广泛适用于各种蛋白质和缓冲液条件,例如在两种不同的溶液条件下测量aSyn的交换动力学:状态A和状态B8,如步骤2.1.-2.2中定义。
首先,在aSyn上进行映射实验,并获得肽覆盖图谱,如图 1所示。该图谱覆盖了100%的蛋白质序列,平均冗余度为3.79。100%的覆盖率值表明蛋白质中的所有氨基酸都是在蛋白质消化物中发现的,并且能够对aSyn的交换行为进行全面分析。冗余值表示重叠肽的数量。较高的冗余值增加了最终图谱的结构分辨率,给定重叠肽32的数据的减法扁平化。
使用快速混合淬火流仪器原型(参见 材料表),收集了A状态和B状态下pH 7.4下aSyn的高质量毫秒时间尺度HDX-MS数据(图2)。在DynamX中进行同位素分配后,获得了“粗”氘吸收曲线,如图 3A所示。它显示了在每个蛋白质结构域中选择的三种肽的摄取曲线。显示氘掺入随时间的变化。x轴位于毫秒时间尺度上,它与aSyn在生理条件下的非常快速的动力学对齐。红色阴影区域显示通常从传统 HDX 仪器获得的数据,测量从 30 秒开始。重要的是,这不能通过所谓的“时间窗口膨胀”的pH操作进一步减少;该方法对于内在无序蛋白质/区域的研究无效,因为pH值偏移会扰乱弱稳定多肽的构象集合。从这里可以看出,大多数aSyn在1秒内完全交换(图3C)。这显示了毫秒级HDX测量单体aSyn的重要性,因为可以捕获交换反应的完整动力学摄取曲线,从而产生最准确的单体构象测量。
HDfleX使用平台氘掺入进行反向交换校正。随后根据等式1拟合数据点,提供观测到的速率常数 kobs,指示该特定肽的溶剂可及性和氢键参与(图3B)。
等式 1
其中 Dt 是时间 t时的氘掺入, nExp 是指数相的数量, N 是不稳定氢的最大数量, kobs 是观察到的交换速率常数,β 是拉伸因子30,33。
在曲线拟合之后,可以通过在实验时间窗口内集成描述吸收曲线的拟合函数来计算拟合曲线下的吸收面积。对两种状态的摄取区域进行了统计显著性分析。首先,在HDfleX中以95%的置信水平计算吸收区域的全球显著性阈值。然后生成摄取面积差异图,显示状态A和状态B在两个结构分辨率水平上的差异:肽分辨率(图4A)和氨基酸分辨率(图4B)。肽分辨率差分图显示了每个肽的A状态和B状态之间的摄取面积差异,而氨基酸分辨率差异图显示了a和B状态之间在aSyn30,34的整个氨基酸序列中平坦的吸收面积的差异。两个图都表明,与A国相比,B国整个aSyn单体的整体氘吸收量更大。通过检查 图3中的氘吸收图,可以证明这一发现是合理的,其中B态吸收曲线始终高于A状态吸收曲线。此外,可以看出,C端的摄取面积差异幅度要高得多。再一次,这可以通过追溯到原始摄取曲线来证明,其中C端肽( 图3所示的肽124-140)在摄取曲线之间的差距比蛋白质的其余部分大得多。总之,B状态中的溶液条件导致整个蛋白质中溶剂暴露的增加或氢键网络参与的减少,但在C端则更是如此。
图1:野生型aSyn的肽覆盖图,共30个肽,100%序列覆盖。 aSyn的三个结构域突出显示如下:N末端(蓝色),非淀粉样蛋白β组分区域(黄色)和C末端(红色)。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:在 aSyn 上进行毫秒级 HDX-MS 实验的工作流程,请单击此处查看此图的大图。
图3:从aSyn的三个结构域中为状态A(黄色)和B状态(蓝色)选择的三个肽的示例摄取图。(B)拟合和反向交换校正的摄取图。红色阴影区域表示传统 HDX-MS 系统可获取的数据,通常从 30 秒开始。误差线对应于三个重复的标准偏差。(C)每个时间点氨基酸序列中氘摄取百分比的热图图。颜色条表示氘吸收的百分比。请点击此处查看此图的大图。
图4:最大曲线平台时间(14,084毫秒)的摄取面积差异图(A)肽残基分辨率图显示了每个肽在状态A和B状态之间的吸收区域差异。请点击此处查看此图的大图。
绘制能量级别 | 斜坡电压 (V) |
低 | 20-40 |
中等 | 25-45 |
高 | 30-50 |
非常高 | 35-55 |
表 1:映射能量水平和相应的传输斜坡电压。
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Discussion
在本文中,描述了以下程序:(1)在单体aSyn上进行肽图分析实验以获得最高的序列覆盖率,(2)在生理条件下获取单体asyn的毫秒级HDX-MS数据,以及(3)对所得HDX-MS数据进行数据分析和解释。所提供的程序通常易于执行,每个标记实验通常仅持续约8小时,用于三个重复和八个时间点,并且映射实验仅持续约2小时。鉴于这里使用的全自动仪器,可以在1天内获取完整的数据集。然而,在处理样品和制备缓冲液时,必须注意确保测量结果来自处于所需状态的弱稳定蛋白质(或蛋白质区域)。重要的是,先前的研究表明,不同的储存条件,如冷冻和冻干,导致不同的aSyn单体构象,并且表征样品处理对aSyn单体构象集合10的潜在影响非常重要。事实上,HDX-MS是这种构象扰动的高度敏感的测量方法,动态范围从微秒到至少几个月不等。此外,如果严格研究aSyn单体,强烈建议过滤以除去储存或处理时样品中可能形成的不需要的低聚物和原纤维。此外,HDX-MS缓冲液需要严格控制在所需pH或pD的0.05范围内,因为任何差异都会显着影响固有的交换率并导致不必要的错误。同样重要的是要注意,对于任何在pH,温度或盐组成上不同的蛋白质,溶液条件之间的比较将改变固有速率。因此,这些数据将需要进一步校正,例如应用pH调整因子35 或经验校正因子8,30。
在仪器仪表方面,没有市售系统允许采集毫秒级的HDX-MS数据。一些研究小组已经开发出自己的系统,从淬火流系统13,15,36 到微流控芯片37,38,39,以捕获某些蛋白质的快速交换动力学。另一种用于实现毫秒时间尺度HDX-MS数据的方法称为时间扩展方法40,41,由此降低缓冲液的pH值以减慢交换动力学。然而,该方法不适用于aSyn(或任何弱稳定的蛋白质特征),因为(1)pH值的降低会极大地改变蛋白质的电荷密度并增加8,42的聚集速率,并且(2)aSyn构象只是meta稳定的,并且很可能受到这些pH变化的干扰。由于这些原因,建议在研究单体aSyn构象时在HDX-MS缓冲液中保持一致的pH值,除非生理相关,并采用毫秒标记仪器。
大多数aSyn单体在1秒内完全交换,最多需要大约15秒才能在生理相关的pH值为7.4(反映突触前的细胞内细胞质条件)下与氘完全交换(图3)。使用传统的HDX-MS系统,从30秒开始是不合适的,因为HDX-MS数据将对应于交换反应的平台,这不提供任何有用的构象信息。然而,毫秒级HDX仪器的测量下限(对应于50 ms的“死区时间”)可以在pH 7.4下监测aSyn单体的约25%完成度的交换反应。这使我们能够捕获大部分动力学摄取曲线。将氘吸收曲线拟合到公式1提供了重要的动力学信息;它对应于观测到的速率常数 kobs 的估计值。虽然这里没有介绍,但由于HDX-MS对各种缓冲液具有高度耐受性,因此可以在与HDX-MS实验相同的溶液条件下进行聚集动力学实验并检查aSyn的原纤维形态8。因此,例如,HDX-MS实验中的 kobs 可以与聚集实验的结果相关联,以深入了解哪些构象最容易出现某些聚集行为和原纤维形态。
对于差异HDX-MS实验的简单情况,其中要比较两个或多个条件或蛋白质变体,可以对每种状态的拟合摄取曲线下的面积进行积分并相互比较。在这项研究中,在两个不同的结构分辨率水平上比较了状态A和状态B的摄取区域:肽分辨率和氨基酸分辨率,两者都有明显的优势和挑战。例如,肽分辨率数据更紧密地反映原始光谱数据,并且经过的处理最少。然而,“扁平化”氨基酸分辨率数据允许将肽和软片段化信息组合成单个输出,而不是单独的不可合并输出,并最终以最高的结构分辨率呈现数据。HDX标记的质谱检测的一个局限性是获得氨基酸分辨率的挑战。虽然“软碎片”技术,如电子转移解离(ETD),电子捕获解离(ECD)和紫外光解离(UVPD),已被证明可以有效地产生更高的分辨率,但它们仍然具有挑战性,不可预测性和低效30,43,44,45,46,47,48。
与其他结构技术相比,毫秒级HDX-MS具有在高结构和时间分辨率下捕获单体aSyn构象动力学的独特优势。由于单体的快速交换动力学不再是限制因素,因此可以在生理pH下对具有不同突变,翻译后修饰,盐组分和浓度以及结合伙伴的单体aSyn进行进一步研究。将HDX-MS结果与功能研究(如聚集动力学和原纤维形态)相关联,可以深入了解促进正常细胞功能或易患疾病的构象。最终,预计这种毫秒级HDX-MS对于发现稳定特定生理耐受构象的靶向药物可能至关重要。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
NS由大学理事会钻石禧年奖学金资助。JJP由UKRI未来领袖奖学金支持[资助编号:MR / T02223X / 1]。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column | Waters Corporation | 186002346 | Analytical column |
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | For LC mobile phases |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
Chronos | Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) | 667006090 | Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell |
Deuterium chloride | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | For HDX labelling buffers |
Deuterium oxide (99.9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Deuterated water |
DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation |
Enzymate BEH Pepsin Column | Waters Corporation | 186007233 | Pepsin digestion column |
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | For LC mobile phases |
Guanidinium hydrochloride | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
HDfleX | University of Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Salt for HDX buffers |
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot | Waters Corporation | 725000637 | Autosampler robot |
Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | For mass spectrometry lockspray calibration. |
MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software controlling inlet methods and mass spectrometer |
Maximum recovery vials | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2 |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
Millipore 0.22 µm syringe filters | Millipore | N9CA7069B | Syringe filters |
ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Salt for HDX buffers |
Peltier temperature controller | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot. |
ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors. |
Reagent pot caps | Waters Corporation | 186004632 | 100 pack |
Reagent pots for LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | 100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2 |
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | For HDX labelling buffers |
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments. |
Synapt G2-Si mass spectrometer | Waters Corporation | 176850035 | Mass spectrometer |
Total recovery vials | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2 |
Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column | Waters Corporation | 186004623 | Trap desalting column |
References
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