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Neuroscience

Spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde pour l’étude de la dynamique structurelle de l’alpha-synucléine dans des conditions physiologiques

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64050
Automatic Translation
1, 1
1Living Systems Institute, Department of Biosciences, University of Exeter

Summary

L’ensemble structurel de l’alpha-synucléine monomérique affecte sa fonction physiologique et ses propriétés physico-chimiques. Le présent protocole décrit comment effectuer une spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde et des analyses de données ultérieures pour déterminer des informations conformationnelles sur le monomère de cette protéine intrinsèquement désordonnée dans des conditions physiologiques.

Abstract

L’alpha-synucléine (aSyn) est une protéine intrinsèquement désordonnée dont les agrégats fibrillaires sont abondants dans les corps de Lewy et les neurites, qui sont les caractéristiques de la maladie de Parkinson. Pourtant, une grande partie de son activité biologique, ainsi que son agrégation, implique de manière centrale la forme monomère soluble de la protéine. L’élucidation des mécanismes moléculaires de la biologie et de la physiopathologie d’aSyn nécessite des méthodes structurellement très résolues et est sensible aux conditions biologiques. Ses structures méta-stables dépliées nativement rendent l’aSyn monomère intraitable à de nombreuses techniques de biologie structurale. Ici, l’application d’une telle approche est décrite: spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium (HDX-MS) sur l’échelle de temps de la milliseconde pour l’étude de protéines à faible stabilité thermodynamique et à faibles facteurs de protection, tels que aSyn. À l’échelle de temps de la milliseconde, les données HDX-MS contiennent des informations sur l’accessibilité des solvants et la structure liée à l’hydrogène d’aSyn, qui sont perdues à des temps d’étiquetage plus longs, ce qui donne finalement une résolution structurelle jusqu’au niveau d’acide aminé. Par conséquent, HDX-MS peut fournir des informations à des résolutions structurelles et temporelles élevées sur la dynamique conformationnelle et la thermodynamique, les interactions intra- et intermoléculaires et l’impact structurel des mutations ou des altérations des conditions environnementales. Bien que largement applicable, il est démontré comment acquérir, analyser et interpréter des mesures HDX-MS millisecondes dans aSyn monomère.

Introduction

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative qui touche des millions de personnes dans le monde1. Elle se caractérise par la formation d’inclusions cytoplasmiques connues sous le nom de corps de Lewy et de neurites de Lewy dans la région de la substantia nigra pars compacta du cerveau. Ces inclusions cytoplasmiques contiennent des agrégats de la protéine intrinsèquement désordonnée aSyn2. Dans la MP et d’autres synucléinopathies, aSyn se transforme d’un état désordonné soluble en un état malade insoluble et hautement structuré. Dans sa forme native, l’aSyn monomère adopte une large gamme de conformations stabilisées par des interactions électrostatiques à longue portée entre ses N- et C-termini et des interactions hydrophobes entre son terminus C et sa région NAC (NAC) 3,4,5,6. Toute perturbation de ces interactions stabilisatrices, telles que les mutations, les modifications post-traductionnelles et les changements dans l’environnement local, peut conduire à un mauvais repliement du monomère, déclenchant ainsi le processus d’agrégation7.

Bien qu’il existe une grande quantité de recherches sur les formes oligomères et fibrillaires d’aSyn 8,9,10,11, il est crucial d’étudier la forme monomère de la protéine et de mieux comprendre quels conformateurs sont fonctionnels (et comment) et lesquels sont sujets à l’agrégation 8,9,10,11 . Étant intrinsèquement désordonné, de seulement 14 kDa et difficile à cristalliser, le monomère aSyn ne se prête pas à la plupart des techniques biologiques structurelles. Cependant, une technique capable de mesurer la dynamique conformationnelle de l’aSyn monomère est la milliseconde HDX-MS, qui a récemment généré d’importantes observations structurelles qui seraient difficiles ou impossibles à obtenir autrement 12,13,14. Milliseconde HDX-MS mesure avec sensibilité la moyenne de l’ensemble conformationnel protéique en surveillant l’échange isotopique au niveau des hydrogènes amides, indiquant l’accessibilité au solvant et la participation au réseau de liaison hydrogène d’une région protéique particulière sur l’échelle de temps de la milliseconde. Il est nécessaire de souligner l’aspect milliseconde du HDX-MS car, en raison de sa nature méta-stable et dépliée nativement, aSyn présente une cinétique d’échange d’hydrogène très rapide qui se manifeste bien en dessous de la limite inférieure des systèmes HDX-MS conventionnels. Par exemple, la majeure partie de la molécule aSyn a complètement échangé de l’hydrogène contre du deutérium dans des conditions intracellulaires en moins de 1 s. Plusieurs laboratoires ont maintenant construit des instruments à mélange rapide; dans ce cas, un prototype d’instrument à flux de trempe à mélange rapide capable d’effectuer HDX-MS avec un temps mort de 50 ms et une résolution temporelle de 1 ms est utilisé15. Bien que la milliseconde HDX-MS ait récemment été extrêmement importante dans l’étude d’aSyn, elle est précieuse pour étudier plus largement les protéines /régions intrinsèquement désordonnées et un grand nombre de protéines dont les boucles / régions ne sont que faiblement stables. Par exemple, les médicaments peptidiques (p. ex., l’insuline; GLP-1/glucagon; tirzépatide) et les protéines de fusion peptidique (par exemple, l’inhibiteur du VIH FN3-L35-T1144) sont des formats de médicaments majeurs où les informations structurelles et de stabilité en phase de solution peuvent être un intrant critique pour les décisions de développement de médicaments, et, pourtant, la fraction peptidique n’est souvent que faiblement stable et intraitable par HDX-MS à l’échelle de tempsde seconde 16,17,18,19,20 . Il a été démontré que les méthodes émergentes HDX-MS avec marquage dans les domaines secondes/minutes dérivent des informations structurelles pour les quadruplex G de l’ADN, mais il devrait être possible de les étendre à des structures oligonucléotidiques plus diverses par l’application de HDX-MS21 millisecondes.

Les expériences HDX-MS peuvent être réalisées à trois niveaux différents : (1) ascendant (où la protéine marquée est digérée protéolytiquement), (2) intermédiaire (où la protéine marquée est digérée protéolytiquement, et les peptides résultants sont fragmentés davantage par des techniques de fragmentation douce), et (3) descendant (où les techniques de fragmentation douce fragmentent directement la protéine marquée)22 . Ainsi, les données hdX-MS sous-moléculaires nous permettent de localiser le comportement d’échange dans des régions spécifiques d’une protéine, ce qui rend essentiel d’avoir une couverture de séquence adéquate pour de telles expériences. La résolution structurelle de toute expérience HDX-MS repose sur le nombre de peptides protéolytiques ou de fragments dérivés de la protéine lors de la digestion ou de la fragmentation douce, respectivement. Dans chacun des trois types d’expériences décrits ci-dessus, le changement d’échange d’amide à chaque peptide / fragment est mappé sur la structure primaire de la protéine pour indiquer le comportement des régions localisées de la protéine. Bien que la résolution structurelle la plus élevée soit obtenue par fragmentation douce, la description de ces expériences est hors du cadre de la présente étude, qui se concentre sur la mesure des conformations de monomères aSyn. D’excellents résultats peuvent être obtenus avec le flux de travail « ascendant » couramment appliqué décrit ici.

Ici, des procédures sont fournies sur (1) comment préparer et manipuler des échantillons aSyn et des tampons HDX-MS, (2) comment effectuer une cartographie peptidique pour une expérience HDX-MS ascendante, (3) comment acquérir des données HDX-MS sur aSyn monomère dans des conditions physiologiques, en particulier dans le domaine temporel milliseconde (en utilisant un instrument personnalisé; des instruments alternatifs pour le marquage milliseconde ont également été décrits), et (4) comment traiter et analyser les données HDX-MS. Les méthodes utilisant l’aSyn monomère à pH physiologique (7,40) dans deux conditions de solution sont illustrées ici. Bien qu’elles soient d’une utilité critique dans l’étude d’aSyn, ces procédures peuvent être appliquées à n’importe quelle protéine et ne se limitent pas aux protéines intrinsèquement désordonnées.

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Protocol

1. Expression des protéines et purification d’aSyn

  1. Préparez aSyn à la suite d’un rapport9 publié précédemment.
  2. Dialyze dans un tampon de stockage sûr (par exemple, Tris, pH 7,2 ).
  3. Au besoin, concentrer l’échantillon (p. ex., tubes de microcentrifugation à filtre rotatif utilisant 3 kDa MWCO, 14 000 x g pendant environ 10 à 30 min, voir tableau des matériaux).
    REMARQUE: Il est conseillé de ne pas se concentrer excessivement. L’intégrité de l’ensemble monomère n’a pas été vérifiée au-delà de 25 μM.
  4. Aliquote et conserver à −80 °C
    REMARQUE: La protéine monomère aSyn est stable jusqu’à 1 an dans ces conditions de stockage.

2. Préparation du tampon HDX

REMARQUE: Étant donné que Tris a un coefficient de température élevé, la mesure du pH doit être ajustée en fonction de la température à laquelle la réaction HDX sera effectuée, qui est de 20 ° C dans ce protocole.

  1. Préparer un tampon d’équilibre pour l’état A et l’état B en pesant 0,002 mol de Tris dans 100 mL d’eau de qualité LC-MS. Pour l’état B, ajouter 29,8 mg de KCl, 14,2 mg de MgCl2, 36,8 g de CaCl2 et 836 mg de NaCl au tampon Tris. Ajustez le pH à 7,40 ± 0,05.
    REMARQUE: Le tampon d’équilibre doit contenir les conditions dans lesquelles aSyn doit être étudié. Dans ce cas, il s’agit de 20 mM de Tris à pH 7,4 +/− sels.
  2. Préparer le tampon d’étiquetage pour l’état A et l’état B en pesant 0,002 mol de Tris dans 100 mL d’eau deutérée. Pour l’état B, ajouter 29,8 mg de KCl, 14,2 mg de MgCl2, 36,8 g de CaCl2 et 836 mg de NaCl au tampon d’étiquetage Tris. Le du tampon d’étiquetage correspond au pH du tampon d’équilibre. Puisque pH = - 0,41, ajuster de sorte que le pH-mètre indique 6,99 ± 0,0523,24.
    REMARQUE: Le tampon d’étiquetage doit avoir les mêmes composants que le tampon d’équilibre, sauf qu’il est préparé à l’aide d’eau deutérée.
  3. Préparer un tampon de trempe en pesant 0,010 mol de Tris et 0,050 mol d’urée et compléter jusqu’à 100 mL avec de l’eau de qualité LC-MS. Ajuster le pH à 2,50 ± 0,05 à 0,5 °C.
    REMARQUE: Un écran de tampon de trempe doit être effectué avant les expériences HDX pour identifier le meilleur tampon de trempe pour la protéine d’intérêt. Différentes concentrations et combinaisons de dénaturants (p. ex. urée et chlorhydrate de guanidinium) et d’agents réducteurs (p. ex. tris(2-carboxyéthyl)phosphine) sont examinées, ainsi que des paramètres physiques tels que le volume et la température de piégeage, pour déplier et digérer efficacement la protéine trempée. Un tampon de trempe comprenant 100 mM de Tris et 0,5 M d’urée à un pH de 2,50 est optimal pour la présente étude.
  4. Préparer le tampon de lavage de la colonne de digestion en pesant 0,125 mol de chlorhydrate de guanidinium dans une bouteille en verre Duran. Ajouter 25 mL de méthanol et 250 μL d’acide formique. Compléter jusqu’à 250 mL avec de l’eau de qualité LC-MS.
    REMARQUE : Pour la colonne de pepsine Enzymate BEH (voir tableau des matériaux), utilisez un tampon de lavage de colonne de 0,5 M de chlorhydrate de guanidinium, de méthanol à 10 % (v/v) et d’acide formique à 0,1 % (v/v).
  5. Préparer le lavage faible de la seringue en pipetant 0,5 μL d’acide formique dans 249,5 mL d’eau de qualité LC-MS.
  6. Préparez le lavage fort de la seringue en mélangeant des parties égales d’eau de qualité LC-MS, de méthanol, d’acétonitrile et d’isopropanol. Ajouter l’acide formique à une concentration finale de 2 % (v/v).
    REMARQUE: Pour éviter la contamination croisée entre les différents tampons et la protéine et pour permettre le nettoyage de l’orifice d’injection, il est essentiel que des solutions de lavage à seringue soient préparées et que le chemin d’écoulement vers la valve (souvent appelé « doublure de lavage ») soit entièrement apprêté avec du liquide. L’acide formique est facultatif pour le lavage faible de la seringue.

3. Procédure de cartographie des peptides

  1. Préparez l’exemple en suivant l’étape ci-dessous.
    1. Filtrez le stock de protéines aSyn décongelé du congélateur à −80 °C avec des filtres à seringue de 0,22 μm. Mesurer l’absorbance de la protéine mère filtrée à 280 nm pour déterminer la concentration par la loi de Beer-Lambert. Diluer la protéine à une concentration de 5 μM dans le tampon d’équilibre (étape 2.1.).
      NOTE: La loi de Beer-Lambert: A = εcl, où A est l’absorbance, ε est le coefficient d’extinction de la protéine à la longueur d’onde mesurée (280 nm ici) avec les unités M−1cm−1, c est la concentration en protéines dans M, et l est la longueur du chemin en cm. Pour aSyn26 de type sauvage, ε = 5960 M−1cm−1.
  2. Configurez la méthode de chromatographie liquide.
    1. Créez un fichier d’entrée avec un temps de chargement/piégeage de 3 min à une pression de 7000-9000 psi, suivi d’un gradient de 5% d’acétonitrile à 40% d’acétonitrile en 7 min, suivi d’étapes de lavage répétées de 5% à 95% d’acétonitrile-eau pendant 10 min.
    2. S’assurer que le spray de verrouillage (p. ex. enképhaline de leucine, voir tableau des matériaux) s’écoule à 2000 psi et est connecté à la sonde de pulvérisation de verrouillage source du spectromètre de masse.
  3. Configurez les méthodes MSE de spectrométrie de masse.
    REMARQUE: MSE est une méthode d’acquisition indépendante des données à large bande sans isolation de masse précurseur. Par conséquent, tous les ions dans la plage m/z sélectionnée sont fragmentés davantage à l’aide de la dissociation induite par collision (CID)27.
    1. Dans le fichier de méthode MS, choisissez MSE Continuum et configurez un temps d’acquisition compris entre 2 et 10 minutes, une source d’électropulvérisation et un mode de résolution positive. Acquérez MSE sur 50-2000 Da, en scannant toutes les 0,3 s.
    2. Pour la fonction 1 (basse énergie), configurez le piège et transférez les énergies de collision à 4 V. Pour la fonction 2 (haute énergie), configurez l’énergie de collision de transfert de rampe pour qu’elle soit constante à 4 V et l’énergie de collision du piège comme indiqué dans le tableau 1 pour chaque niveau d’énergie de cartographie.
      REMARQUE: Les méthodes MSE de mobilité ionique peuvent également être utilisées. D’autres méthodes de cartographie (p. ex., acquisition dépendante des données ou DDA) peuvent être utilisées à la discrétion de l’utilisateur.
  4. Configurez le robot échantillonneur automatique (voir Tableau des matériaux).
    1. Ajouter 50 μL de la protéine 5 μM à un flacon de récupération totale. Placez le flacon en position d’échantillon dans la chambre droite HDX. Assurez-vous que cette chambre est à 0,5 °C.
    2. Ajouter un flacon de réactif de tampon d’équilibre et deux flacons de réactif de tampon d’étiquetage aux positions de réactif un, deux et trois dans la chambre gauche HDX. Assurez-vous que cette chambre est à 20 °C en réglant le régulateur de température Peltier (voir Tableau des matériaux). Ajoutez un flacon de réactif de tampon de trempe à la position de réactif un dans la chambre droite HDX.
    3. Ajouter huit flacons de récupération totale dans les positions de réaction de la chambre gauche HDX et huit flacons de récupération maximale dans les positions de réaction de la chambre droite HDX.
      REMARQUE: Pour assurer un nettoyage complet et une reproductibilité maximale des volumes distribués, il est conseillé d’effectuer un lavage à la seringue et un lavage d’amorçage sur les seringues d’échantillonnage automatique. Par exemple, exécutez une séquence de (1) lavage faible, (2) lavage fort, (3) lavage faible avant de commencer les expériences de cartographie. Cette séquence peut être répétée abondamment, et il est recommandé de le faire jusqu’à 20x ou jusqu’à ce que la seringue soit complètement mouillée.
    4. Configurez un exemple de liste avec les méthodes LC et MS appropriées dans le logiciel de planification et démarrez la planification.
      NOTE: Pour la présente étude, Chronos est utilisé comme logiciel de planification (voir Tableau des matériaux).
  5. Traiter les données cartographiques.
    1. Identifiez les peptides à partir des fichiers d’expérience de cartographie à l’aide d’un logiciel approprié (voir tableau des matériaux).
    2. Importez les données d’identification peptidique dans DynamX (voir tableau des matériaux) en utilisant les paramètres de seuil peptidique suivants : intensité minimale = 5000, longueur minimale de la séquence = 0, longueur maximale de la séquence = 40, produits minimaux = 1, produits minimaux par acide aminé = 0,25, produits consécutifs minimaux = 2, intensité de somme minimale pour les produits = 0, score minimum = 0 et erreur MH+ maximale (ppm) = 0.
      REMARQUE: Vous pouvez également dériver les paramètres optimisés en fonction d’un flux de travail recommandé28.
    3. Sélectionnez Données dans le menu et cliquez sur Importer les résultats PLGS. Cliquez sur Ajouter pour choisir les fichiers de données pertinents pour l’affectation spectrale. Lorsque tous ont été ajoutés, cliquez sur Suivant et entrez les paramètres de filtre ci-dessus. Ensuite, cliquez sur Terminer.
    4. Organisez manuellement des affectations isotopiques pour obtenir la carte finale de couverture peptidique d’aSyn dans DynamX.

4. Étude d’échange hydrogène/deutérium à la milliseconde

  1. Nettoyez l’instrument prototype FastHDX (voir Tableau des matériaux) avant de commencer les expériences HDX.
    1. Ouvrez l’interface graphique du logiciel HDX compatible et autorisez le système à s’initialiser.
    2. Entrez la température de la chambre d’échantillonnage à 20 °C et la chambre de trempe à 0,5 °C. Cliquez sur Définir pour appliquer les nouvelles températures.
    3. Installez les tubes de centrifugeuse avec de l’eau de qualité LC-MS à toutes les entrées.
    4. Dans l’onglet Livraison de plomberie du titreur , vérifiez les seringues gauche et droite et cliquez sur Prime pour éliminer les bulles d’air latentes dans les tubes. Répétez jusqu’à ce que toutes les bulles aient disparu.
    5. Dans l’onglet Macros , cochez toutes les cases correspondant aux seringues. Cliquez sur Calibrer la position d’accueil des seringues. Cliquez sur Wash Syringe Load Loop. Cliquez sur Laver tous les volumes de la boucle de mélange.
    6. Répétez l’étape 4.1.5. 1x plus.
    7. Si des bulles apparaissent dans les seringues tampons, dégazez en dégayant la seringue et en éjectant la bulle verticalement. Remplacez la seringue et recalibrez-la à la position zéro.
  2. Configurez l’instrument prototype FastHDX pour les expériences HDX.
    1. Ajouter 500 uL d’aSyn filtré de 5 μM dans un flacon de récupération totale et placer à l’intérieur d’un réfrigérateur de table pour éviter l’oligomérisation et l’agrégation induites par la température.
    2. Ajouter 50 mL de tampons d’équilibre, d’étiquetage et de trempe à chaque tampon (2. Préparation du tampon HDX étapes 1-3) entrée dans les chambres gauche et droite.
    3. Ajouter 50 mL de tampon de lavage de colonne (2. Préparation du tampon HDX étape 4) à l’entrée de lavage de la pepsine.
    4. Pour amorcer les lignes de lavage des protéines et des colonnes 1x, vérifiez les seringues gauche et droite dans l’onglet Livraison de plomberie du titreur et cliquez sur Prime une fois.
      REMARQUE: Tout clic ultérieur sur Prime entraînera des répétitions supplémentaires du processus prime, entraînant la consommation de grandes quantités d’échantillon de protéines. Il est conseillé d’éviter cela, même en cas de retard dans le logiciel après une tentative de clic sur un bouton.
    5. Répétez les étapes 4.1.5. 1x.
    6. Dans l’onglet Manual Quench Flow , entrez les paramètres requis, expliqués aux étapes 4.2.7.-4.2.10.
    7. Pour une expérience de cours temporel, entrez les temps en millisecondes à l’aide du bouton Points symboliques . Si des réplications sont nécessaires, ajoutez le même point temporel plusieurs fois, par exemple, pour un triple de 50 ms, 50 50 50 doivent être saisis. La liste d’exemples dans le logiciel de spectromètre de masse (MassLynx est utilisé ici, voir Tableau des matériaux) doit correspondre exactement à ces points temporels.
      REMARQUE: Les noms de fichiers de la liste d’échantillons de spectromètres de masse et/ou l’exemple de texte doivent être utilisés pour garantir un enregistrement permanent des temps d’étiquetage HDX correspondant à ceux saisis dans l’interface graphique du logiciel FastHDX. Les temps d’étiquetage pour chaque exécution d’échantillon ne seront stockés nulle part ailleurs.
    8. Définissez le temps de recouvrement (minutes) sur la durée du temps de piégeage. Ici, il est 3.00.
    9. Définir Attendre HPLC (mins) = (temps d’interruption + durée d’exécution + 1,5 min).
      REMARQUE: Par exemple, pour une expérience avec un piégeage de 3 minutes et un gradient de 17 minutes, ce sera 21,50 minutes.
    10. Cliquez sur la case Exécuter vide uniquement si vous exécutez des expériences vides entre des exemples d’exécutions. Si oui, assurez-vous qu’une entrée (c’est-à-dire une ligne valide dans la liste d’exemples) dans le logiciel pour l’exécution vide après chaque exécution d’échantillon.
    11. Une fois que la liste d’exemples est prête sur le logiciel, mettez en surbrillance les entrées appropriées et démarrez l’exécution dans le logiciel en cliquant sur le bouton Lecture et FastHDX dans le logiciel.
      REMARQUE: En raison du brouillage hydrogène/deutérium, les méthodes MS uniquement ou les techniques de fragmentation douce (dissociation par transfert d’électrons, dissociation par capture d’électrons et photoconsiliation ultraviolette) ne peuvent être utilisées que29. Pour aSyn à un pH physiologique de 7,40, des points temporels allant de 50 ms à 300 s sont les plus applicables car ils couvrent toute la courbe d’absorption du deutérium8.

5. Traitement des données

  1. Chargez le fichier des peptides attribués spectralement à partir des expériences de cartographie des peptides. Ouvrez le menu Fichier et cliquez sur Ouvrir dans le logiciel DynamX (voir Tableau des matériaux).
  2. Importez des fichiers bruts dans le logiciel de mesure de masse préféré (par exemple, DynamX, HDExaminer, etc.). Ouvrez le menu « Données » et cliquez sur MS Files. Cliquez sur Nouvel état pour créer des états pour chaque condition de protéine étudiée.
    1. Cliquez sur Nouvelle exposition pour ajouter chaque point temporel HDX. Cliquez sur Nouveau RAW pour importer les fichiers .raw. Faites glisser chaque fichier .raw vers la position correcte. Cliquez sur OK lorsque vous avez terminé.
  3. Attribuez d’abord automatiquement les isotopes (ceci est automatique à la suite de l’étape 5.2. ci-dessus), puis organisez manuellement l’affectation isotopique pour assurer une qualité de données élevée.
  4. Exportez les données du cluster dans un fichier .csv avec des colonnes dans l’ordre suivant : nom de la protéine, numéro de début de la séquence, numéro de fin de séquence, séquence, modification, fragment, absorption maximale possible, masse d’espèces monoisotopiques, nom de l’état, temps d’exposition, nom du fichier, charge, temps de rétention, intensité et centroïde.
  5. Ouvrez le menu Données dans le logiciel de mesure de masse et cliquez sur Exporter les données du cluster.

6. Analyse des données

  1. Chargez les données de cluster exportées dans le logiciel d’analyse HDX préféré. Ici, HDfleX est utilisé30 (voir tableau des matériaux).
  2. Adaptez les données expérimentales pour tous les peptides et états, en sélectionnant les méthodes de correction de rétro-échange appropriées pour obtenir les constantes de vitesse observées pour la réaction HDX.
  3. Calculez un seuil de signification globale par la méthode préférée (HDfleX prend en charge plusieurs options pour cela) et effectuez des tests de signification hybride pour déterminer les différences significatives entre les États par rapport à31,32.
    REMARQUE : Si la différence observée est supérieure au seuil global et que la valeur de p est inférieure au niveau de confiance choisi (p. ex., 95 %), la différence est considérée comme significative.

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Representative Results

En raison de sa nature intrinsèquement désordonnée, il est difficile de capturer les changements structurels complexes dans aSyn à pH physiologique. HDX-MS surveille l’échange isotopique au niveau des hydrogènes amides dorsaux, sondant la dynamique et les interactions conformationnelles des protéines. C’est l’une des rares techniques pour acquérir ces informations à des résolutions structurelles et temporelles élevées. Ce protocole est largement applicable à un large éventail de protéines et de conditions tampons, et cela est illustré par la mesure de la cinétique d’échange d’aSyn dans deux conditions de solution différentes: l’état A et l’état B8, tels que définis aux étapes 2.1.-2.2.

Tout d’abord, une expérience de cartographie sur aSyn a été réalisée et une carte de couverture peptidique a été obtenue, comme le montre la figure 1. La carte couvre 100% de la séquence protéique et a une redondance moyenne de 3,79. La valeur de couverture de 100% indique que tous les acides aminés de la protéine ont été trouvés dans les digestions protéiques et permettra une analyse complète du comportement d’échange d’aSyn. La valeur de redondance indique le nombre de peptides qui se chevauchent. Une valeur de redondance plus élevée augmente la résolution structurelle de la carte finale, compte tenu de l’aplatissement soustractif des données pour les peptides qui se chevauchent32.

À l’aide du prototype d’instrument à écoulement de trempe à mélange rapide (voir Tableau des matériaux), des données HDX-MS de haute qualité à l’échelle de la milliseconde sur aSyn à pH 7,4 dans les états A et B ont été recueillies (figure 2). À la suite d’une assignation isotopique dans DynamX, des courbes d’absorption du deutérium « brut » ont été obtenues, comme le montre la figure 3A. Il montre des courbes d’absorption pour trois peptides sélectionnés dans chaque domaine protéique. L’incorporation du deutérium au fil du temps est affichée. L’axe des x est sur l’échelle de temps de la milliseconde, ce qui s’aligne sur la cinétique très rapide d’aSyn dans des conditions physiologiques. La région ombragée en rouge montre les données généralement obtenues à partir d’instruments HDX conventionnels, avec des mesures de départ à partir de 30 s. Il est important de noter que cela ne peut pas être encore réduit par la manipulation du pH pour ce que l’on appelle « l’expansion de la fenêtre temporelle »; cette approche n’est pas valide pour l’étude des protéines/régions intrinsèquement désordonnées, car le changement de pH perturbera l’ensemble conformationnel du polypeptide faiblement stable. Comme on peut le voir ici, la majeure partie d’aSyn est entièrement échangée par 1 s (Figure 3C). Cela montre l’importance des mesures HDX millisecondes pour l’aSyn monomère car la courbe d’absorption cinétique complète pour la réaction d’échange est capturée, ce qui donne la mesure la plus précise des conformations monomères.

HDfleX a effectué une correction de rétro-échange en utilisant l’incorporation de deutérium de plateau. Les points de données ont ensuite été ajustés conformément à l’équation 1, fournissant une constante de vitesse observée, kobs, indiquant l’accessibilité au solvant et l’implication de liaison hydrogène de ce peptide particulier (figure 3B).

Equation 1Équation 1

où Dt est l’incorporation du deutérium au temps t, nExp est le nombre de phases exponentielles, N est le nombre maximal d’hydrogènes labiles, kobs est la constante de taux de change observée et β est un facteur d’étirement30,33.

Après ajustement de la courbe, la zone d’absorption sous la courbe ajustée peut être calculée en intégrant la fonction ajustée décrivant la courbe d’absorption dans la fenêtre de temps expérimentale. Des analyses de signification statistique entre la zone d’absorption des deux États ont été effectuées. Tout d’abord, un seuil d’importance globale pour la zone d’absorption a été calculé dans HDfleX à un niveau de confiance de 95%. Des diagrammes de différence de zone d’absorption ont ensuite été générés, montrant la différence entre l’état A et l’état B à deux niveaux de résolution structurelle : la résolution peptidique (figure 4A) et la résolution des acides aminés (figure 4B). Le diagramme de différence de résolution peptidique montre la différence de zone d’absorption entre l’état A et l’état B pour chaque peptide individuel, tandis que le graphique de différence de résolution des acides aminés montre la différence de zone d’absorption entre l’état A et l’état B aplatie sur l’ensemble de la séquence d’acides aminés de aSyn30,34. Les deux graphiques indiquent une absorption globale plus importante de deutérium dans l’ensemble du monomère aSyn dans l’état B par rapport à l’état A. Cette constatation peut être justifiée en examinant les diagrammes d’absorption du deutérium de la figure 3, où la courbe d’absorption de l’état B est toujours au-dessus de la courbe d’absorption de l’état A. En outre, on peut voir que l’ampleur de la différence de zone d’absorption est beaucoup plus élevée au terminus C. Encore une fois, cela peut être justifié en remontant aux courbes d’absorption d’origine, où les peptides C-terminaux (peptides 124-140 illustrés à la figure 3) montrent un écart beaucoup plus grand entre les courbes d’absorption que le reste de la protéine. En conclusion, les conditions de solution dans l’état B provoquent une augmentation de l’exposition aux solvants ou une diminution de la participation au réseau de liaison hydrogène dans l’ensemble de la protéine, mais plus encore au terminus C.

Figure 1
Figure 1 : Carte de couverture peptidique de l’aSyn de type sauvage avec un total de 30 peptides et une couverture de séquence de 100 %. Les trois domaines d’aSyn sont mis en évidence comme suit : N-terminus (bleu), région de composant bêta non amyloïde (jaune) et C-terminus (rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Flux de travail pour une expérience HDX-MS d’une milliseconde sur aSyn. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Exemples de diagrammes d’absorption de trois peptides sélectionnés dans les trois domaines d’aSyn pour l’état A (jaune) et l’état B (bleu). (A) Diagramme d’absorption corrigé non ajusté et non rétro-échange. (B) Placettes d’absorption corrigées ajustées et rétro-échangées. La région ombrée rouge représente les données pouvant être obtenues par les systèmes HDX-MS conventionnels, généralement à partir de 30 s. Les barres d’erreur correspondent à l’écart-type des trois répétitions. (C) Graphique thermique du pourcentage d’absorption de deutérium dans la séquence d’acides aminés par point temporel. La barre de couleur représente le pourcentage d’absorption de deutérium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Diagrammes de différence de zone d’absorption au temps maximal de plateau de la courbe (14 084 ms). (A) Les diagrammes de résolution des résidus peptidiques montrent la différence de zone d’absorption de chaque peptide entre l’état A et l’état B. (B) Graphique de résolution des acides aminés montrant la différence de zone d’absorption entre l’état A et l’état B aplatie dans la séquence d’acides aminés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cartographie du niveau d’énergie Tension de rampe (V)
Bas 20-40
Douleur moyenne 25-45
Haut 30-50
Très élevé 35-55

Tableau 1 : Cartographie des niveaux d’énergie et des tensions de rampe de transfert correspondantes.

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Discussion

Dans le présent article, les procédures suivantes sont décrites: (1) effectuer des expériences de cartographie peptidique sur aSyn monomère pour obtenir la couverture de séquence la plus élevée, (2) acquérir des données HDX-MS millisecondes sur aSyn monomère dans des conditions physiologiques, et (3) effectuer l’analyse des données et l’interprétation des données HDX-MS résultantes. Les procédures fournies sont généralement simples à exécuter, chaque expérience d’étiquetage ne dure généralement qu’environ 8 h pour trois réplications et huit points temporels, et l’expérience de cartographie ne dure qu’environ 2 h. Compte tenu de l’instrumentation entièrement automatisée utilisée ici, un ensemble de données complet peut être acquis en 1 jour. Cependant, lors de la manipulation d’échantillons et de la préparation de tampons, il faut veiller à ce que les mesures soient dérivées de protéines faiblement stables (ou de régions protéiques) dans l’état souhaité. Il est important de noter qu’une étude antérieure a montré que différentes conditions de stockage, telles que la congélation et la lyophilisation, entraînaient différents conformateurs de monomères aSyn et qu’il était important de caractériser l’impact potentiel de la manipulation des échantillons sur l’ensemble conformationnel des monomères aSyn10. En effet, HDX-MS est une mesure très sensible de ces perturbations conformationnelles, avec une plage dynamique allant de microsecondes à au moins des mois. De plus, si l’on étudie strictement uniquement le monomère aSyn, il est fortement conseillé de filtrer les oligomères et les fibrilles indésirables qui pourraient s’être formés dans l’échantillon lors du stockage ou de la manipulation. En outre, les tampons HDX-MS doivent être étroitement contrôlés à moins de 0,05 du pH ou du souhaité, car toute divergence affectera considérablement le taux de change intrinsèque et entraînera des erreurs indésirables. Il est également important de noter que les comparaisons entre les conditions de solution pour toute protéine qui diffère par le pH, la température ou la composition en sel modifieront le taux intrinsèque. Par conséquent, ces données nécessiteront d’autres corrections, telles que l’application d’un facteur d’ajustement du pH35 ou d’un facteur de correction empirique 8,30.

En termes d’instrumentation, il n’existe aucun système disponible dans le commerce qui permette l’acquisition de données HDX-MS millisecondes. Plusieurs groupes de recherche ont développé leurs propres systèmes, des systèmes d’écoulement de trempe 13,15,36 aux puces microfluidiques 37,38,39 pour capturer la cinétique d’échange rapide de certaines protéines. Une autre méthode qui a été utilisée pour obtenir des données HDX-MS à l’échelle de temps de la milliseconde est connue sous le nom de méthode d’expansion temporelle 40,41, par laquelle le pH des tampons est réduit pour ralentir la cinétique d’échange. Cependant, cette méthode ne s’applique pas à aSyn (ni à toute caractéristique protéique faiblement stable) car (1) l’abaissement du pH modifie radicalement la densité de charge de la protéine et augmente le taux d’agrégation 8,42, et (2) les conformateurs aSyn ne sont que méta-stables et sont susceptibles d’être perturbés par ces altérations du pH. Pour ces raisons, il est recommandé de maintenir un pH constant dans les tampons HDX-MS lors de l’étude des conformations monomères d’aSyn, sauf si cela est physiologiquement pertinent, et d’utiliser un instrument d’étiquetage milliseconde.

La plupart des monomères d’aSyn s’échangent complètement en 1 s, et au maximum, il faut environ 15 s pour s’échanger complètement avec le deutérium (Figure 3) à un pH physiologiquement pertinent de 7,4 (reflétant les conditions cytosoliques intracellulaires à la presynapse). En utilisant des systèmes HDX-MS conventionnels, il n’est pas approprié de commencer à 30 s car les données HDX-MS correspondraient au plateau de la réaction d’échange, ce qui ne fournit aucune information conformationnelle utile. Cependant, la limite inférieure de mesure de l’instrument HDX milliseconde (correspondant à un « temps mort » de 50 ms) permet de surveiller la réaction d’échange à partir d’environ 25% d’achèvement pour le monomère aSyn à pH 7,4. Cela nous a permis de capturer la majorité de la courbe d’absorption cinétique. L’ajustement de la courbe d’absorption du deutérium à l’équation 1 fournit des informations cinétiques importantes; elle correspond à une estimation de la constante de vitesse observée, kobs. Bien qu’il ne soit pas couvert ici, il est possible de réaliser des expériences de cinétique d’agrégation et d’examiner les morphologies des fibrilles d’aSyn dans les mêmes conditions de solution que les expériences HDX-MS puisque HDX-MS est très tolérant à une large gamme de tampons8. Ainsi, par exemple, les kobs de l’expérience HDX-MS peuvent être corrélés avec les résultats des expériences d’agrégation pour mieux comprendre quelles conformations sont les plus sujettes à certains comportements d’agrégation et morphologies de fibrilles.

Pour le cas simple des expériences DIFFÉRENTIELLEs HDX-MS, où deux ou plusieurs conditions ou variantes de protéines doivent être comparées, l’aire sous la courbe d’absorption ajustée peut être intégrée pour chaque état et comparée l’une à l’autre. Dans cette étude, les zones d’absorption de l’état A et de l’état B ont été comparées à deux niveaux différents de résolution structurelle: la résolution peptidique et la résolution des acides aminés, qui ont toutes deux des forces et des défis distincts. Par exemple, les données de résolution peptidique reflètent plus étroitement les données spectrales brutes et ont subi le moins de traitement. Cependant, les données de résolution des acides aminés « aplaties » permettent de combiner les informations sur les peptides et la fragmentation douce en une seule sortie plutôt que de séparer les sorties non fusionnables et, en fin de compte, de présenter les données à la résolution structurelle la plus élevée. L’une des limites de la détection par spectrométrie de masse du marquage HDX est le défi d’obtenir une résolution des acides aminés. Bien que les techniques de « fragmentation douce », telles que la dissociation par transfert d’électrons (ETD), la dissociation par capture d’électrons (ECD) et la photodissociation ultraviolette (UVPD), se soient avérées efficaces pour générer des résolutions plus élevées, elles restent difficiles, imprévisibles et inefficaces 30,43,44,45,46,47,48.

Par rapport à d’autres techniques structurelles, la milliseconde HDX-MS a l’avantage unique de capturer la dynamique conformationnelle de l’aSyn monomère à des résolutions structurelles et temporelles élevées. Comme la cinétique d’échange rapide du monomère n’est plus un facteur limitant, d’autres études peuvent être effectuées sur l’aSyn monomère avec différentes mutations, modifications post-traductionnelles, composants et concentrations de sel et partenaires de liaison au pH physiologique. La corrélation des résultats de HDX-MS avec des études fonctionnelles, telles que la cinétique d’agrégation et les morphologies des fibrilles, peut fournir un aperçu des conformateurs qui favorisent la fonction cellulaire normale ou sont sujets aux maladies. En fin de compte, on s’attend à ce qu’une telle milliseconde HDX-MS puisse être cruciale pour découvrir des médicaments ciblés qui stabilisent des conformateurs physiologiquement tolérés spécifiques.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

NS est financé par la bourse du jubilé de diamant du Conseil de l’Université. JJP est soutenu par une bourse UKRI Future Leaders [Numéro de subvention : MR/T02223X/1].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column  Waters Corporation 186002346 Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv VWR 20060.420 For LC mobile phases
CaCl2 Sigma Aldrich C5670 Salt for HDX buffers
Chronos Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) 667006090 Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell
Deuterium chloride Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-2-50 For HDX labelling buffers
Deuterium oxide (99.9% D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-4 Deuterated water
DynamX 3.0 Waters Corporation 176016027 Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation
Enzymate BEH Pepsin Column Waters Corporation 186007233 Pepsin digestion column
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade Fisher Scientific 10596814 For LC mobile phases
Guanidinium hydrochloride Sigma Aldrich RDD001-500G Chaotrope/Denaturant
HDfleX University of Exeter N/A https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KCl Sigma Aldrich P3911 Salt for HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot Waters Corporation 725000637 Autosampler robot
Leucine enkephalin Waters Corporation 186006013 For mass spectrometry lockspray calibration.
MassLynx Waters Corporation 667004007 Software controlling inlet methods and mass spectrometer
Maximum recovery vials Waters Corporation 600000670CV 100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Salt for HDX buffers
Millipore 0.22 µm syringe filters Millipore N9CA7069B Syringe filters
ms2min Applied Photophysics Ltd N/A fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaCl Sigma Aldrich S9888 Salt for HDX buffers
Peltier temperature controller LEAP Technologies Inc. HP115-COOL/D Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.
ProteinLynx Global Server 3.0 Waters Corporation 715001030 Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.
Reagent pot caps Waters Corporation 186004632 100 pack
Reagent pots for LEAP HDX-2 Waters Corporation 186001420 100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-57 For HDX labelling buffers
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) Amicon (Merck Sigma Aldrich) UFC5003 Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.
Synapt G2-Si mass spectrometer Waters Corporation 176850035 Mass spectrometer
Total recovery vials Waters Corporation 600000671CV 100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253-250G Buffer
Trizma base Sigma Aldrich T60040-B2005 Buffer
Urea Sigma Aldrich U5378-1KG Chaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column  Waters Corporation 186004623 Trap desalting column

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Neurosciences numéro 184 Alpha-synucléine trouble intrinsèque spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde biologie structurale dynamique
Spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde pour l’étude de la dynamique structurelle de l’alpha-synucléine dans des conditions physiologiques
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Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (184), e64050, doi:10.3791/64050 (2022).

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