Summary
O conjunto estrutural da alfa-sinucleína monomérica afeta sua função fisiológica e propriedades fisiológicas. O presente protocolo descreve como realizar espectrometria de massa de milissegundos de hidrogênio/deutério e análises subsequentes de dados para determinar informações conformais sobre o monômero dessa proteína intrinsecamente desordenada em condições fisiológicas.
Abstract
Alfa-sinucleína (aSyn) é uma proteína intrinsecamente desordenada cujos agregados fibrilares são abundantes em corpos e neuridos de Lewy, que são as marcas da doença de Parkinson. No entanto, grande parte de sua atividade biológica, bem como sua agregação, envolve centralmente a forma de monômero solúvel da proteína. A elucidação dos mecanismos moleculares da biologia e da fisiopatologia requer métodos estruturalmente altamente resolvidos e é sensível às condições biológicas. Suas estruturas nativamente desdobradas e meta-estáveis tornam o aSyn monoméico intratável a muitas técnicas de biologia estrutural. Aqui, a aplicação de uma dessas abordagens é descrita: espectrometria de massa de hidrombútrio/deutério(HDX-MS) na escala de tempo de milissegundos para o estudo de proteínas com baixa estabilidade termodinâmica e fatores fracos de proteção, como aSyn. Na escala de tempo de milissegundos, os dados HDX-MS contêm informações sobre a acessibilidade solvente e a estrutura ligada a hidrogênio de aSyn, que são perdidas em tempos de rotulagem mais longos, resultando em resolução estrutural até o nível de aminoácido. Portanto, o HDX-MS pode fornecer informações em altas resoluções estruturais e temporais sobre dinâmica conformacional e termodinâmica, interações intra e intermárgidas, e o impacto estrutural de mutações ou alterações às condições ambientais. Embora amplamente aplicável, é demonstrado como adquirir, analisar e interpretar medidas milissegundos de HDX-MS em aSyn monomérica.
Introduction
A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa que afeta milhões de pessoas em todo o mundo1. Caracteriza-se pela formação de inclusões citoplasmáticas conhecidas como corpos de Lewy e neurites de Lewy na região substantia nigra pars compacta do cérebro. Essas inclusões citoplasmáticas têm sido encontradas para conter agregados da proteína intrinsecamente desordenada aSyn2. Em DP e outras sinucleinopatias, aSyn se transforma de um estado solúvel desordenado em um estado doente insolúvel e altamente estruturado. Em sua forma nativa, o monoméico aSyn adota uma ampla gama de conformações estabilizadas por interações eletrostáticas de longo alcance entre suas interações N e C-termini e hidrofóbicas entre sua região de componente beta C-terminus e não amiloide (NAC) 3,4,5,6. Quaisquer interrupções nessas interações estabilizadoras, como mutações, modificações pós-translacionais e mudanças no ambiente local, podem levar ao descompos do monômero, desencadeando assim o processo de agregação7.
Embora exista uma vasta quantidade de pesquisa sobre as formas oligomeméricas e fibrilares de aSyn 8,9,10,11, há uma necessidade crucial de estudar a forma monomérica da proteína e entender melhor quais conformadores são funcionais (e como) e que são propensos a agregar 8,9,10,11 . Sendo intrinsecamente desordenado, apenas 14 kDa de tamanho, e difícil de cristalizar, o monômero aSyn não é favorável à maioria das técnicas biológicas estruturais. No entanto, uma técnica capaz de medir a dinâmica conformacional do aSyn monomérico é o milissegundo HDX-MS, que recentemente gerou observações estruturais importantes que seriam desafiadoras ou impossíveis de obter de outra forma 12,13,14. Milissegundos HDX-MS mede sensivelmente a média do conjunto conformacional da proteína monitorando a troca isotópica em hidrogênios amidos, indicando acessibilidade solvente e participação de rede de ligação de hidrogênio de uma determinada região proteica na escala de tempo de milissegundos. É necessário enfatizar o aspecto milissegundo do HDX-MS, pois, devido à sua natureza nativamente desdobrada e meta-estável, aSyn exibe cinética de troca de hidrogênio muito rápida que se manifestam bem abaixo do limite inferior dos sistemas HDX-MS convencionais. Por exemplo, a maioria da molécula de ASyn tem completamente trocado hidrogênio por deutério sob condições intracelulares em menos de 1 s. Vários laboratórios já construíram uma instrumentação de mistura rápida; neste caso, um protótipo de instrumento de fluxo de sada rápida capaz de executar HDX-MS com um tempo morto de 50 ms e uma resolução temporal de 1 ms é usado15. Embora o MILISSEGUD HDX-MS tenha sido recentemente extremamente importante no estudo da ASyn, é valioso estudar proteínas/regiões intrinsecamente desordenadas de forma mais ampla e um grande número de proteínas com laços/regiões que são apenas fracamente estáveis. Por exemplo, drogas de peptídeos (por exemplo, insulina; GLP-1/glucagon; proteínas de fusão de tirzepatidas) e peptídeos (por exemplo, o inibidor do HIV FN3-L35-T1144) são os principais formatos de drogas onde informações estruturais e de estabilidade em fase de solução podem ser uma entrada crítica para decisões de desenvolvimento de medicamentos, e, ainda assim, a moiety peptídeo é muitas vezes apenas fracamente estável e intratável pelo HDX-MS na escala de tempo de segundos 16,17,18,19,20 . Métodos emergentes de HDX-MS com rotulagem nos domínios de segundos/minutos têm sido mostrados para obter informações estruturais para G-quadruplexes de DNA, mas deve ser possível estender isso a estruturas oligonucleotídeos mais diversas pela aplicação de milissegundos HDX-MS21.
Os experimentos HDX-MS podem ser realizados em três níveis diferentes: (1) de baixo para cima (pelo qual a proteína rotulada é digerida proteolítico), (2) de baixo para baixo (pelo qual a proteína rotulada é digerida proteolyticamente, e os peptídeos resultantes são fragmentados ainda mais por técnicas de fragmentação suave) e (3) de cima para baixo (pelo qual as técnicas de fragmentação macia são diretamente fragmentadas a proteína rotulada) 22 . Assim, os dados sub-moleculares do HDX-MS permitem-nos localizar o comportamento de troca para regiões específicas de uma proteína, tornando-se fundamental ter cobertura de sequência adequada para tais experimentos. A resolução estrutural de qualquer experimento HDX-MS baseia-se no número de peptídeos ou fragmentos protelíticos derivados da proteína após a digestão ou fragmentação suave, respectivamente. Em cada um dos três tipos de experimentos descritos acima, a mudança na troca de amide em cada peptídeo/fragmento é mapeada de volta à estrutura primária da proteína para indicar o comportamento das regiões localizadas da proteína. Embora a maior resolução estrutural seja alcançada através da fragmentação suave, a descrição desses experimentos está fora do escopo do presente estudo, que se concentra na medição de conformações monômeros de aSyn. Excelentes resultados podem ser obtidos com o fluxo de trabalho "de baixo para cima" comumente aplicado descrito aqui.
Aqui, são fornecidos procedimentos sobre (1) como preparar e lidar com amostras de ASyn e buffers HDX-MS, (2) como realizar mapeamento de peptídeos para um experimento HDX-MS de baixo para cima, (3) como adquirir dados HDX-MS sobre ayn monomérica em condições fisiológicas, especificamente no domínio de tempo milissegundo (usando um instrumento personalizado; instrumentos alternativos para rotulagem de milisse e (4) como processar e analisar os dados do HDX-MS. Métodos que utilizam aSyn monomérica em pH fisiológico (7.40) em duas condições de solução são exemplificados aqui. Embora criticamente úteis no estudo de aSyn, esses procedimentos podem ser aplicados a qualquer proteína e não se limitam a proteínas intrinsecamente desordenadas.
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Protocol
1. Expressão proteica e purificação de aSyn
- Prepare aSyn após um relatório publicado anteriormente9.
- Dialisar em um buffer de armazenamento seguro (por exemplo, Tris, pH 7.2 ).
- Se necessário, concentre a amostra (por exemplo, tubos de microcentrifuuge do filtro de spin usando 3 kDa MWCO, 14.000 x g por aproximadamente 10-30 min, ver Tabela de Materiais).
NOTA: É aconselhável não se concentrar excessivamente. A integridade do conjunto monômero não foi verificada além de 25 μM. - Aliquot e armazenar a −80 °C
NOTA: A proteína monômero aSyn é estável por até 1 ano nestas condições de armazenamento.
2. Preparação do buffer HDX
NOTA: Como o Tris tem um coeficiente de alta temperatura, a medição do pH precisa ser ajustada para a temperatura em que será feita a reação HDX, que é de 20 °C neste protocolo.
- Prepare o tampão de equilíbrio para o Estado A e o Estado B pesando 0,002 mol de Tris em 100 mL de água de grau LC-MS. Para o Estado B, adicione 29,8 mg de CCL, 14,2 mgs de MgCl2, 36,8 g de CaCl2 e 836 mg de NaCl ao buffer Tris. Ajuste o pH para 7,40 ± 0,05.
NOTA: O tampão de equilíbrio deve conter as condições em que a ASyn deve ser estudada. Neste caso, são 20 mM Tris em pH 7,4 +/− sais. - Prepare o tampão de rotulagem para o Estado A e o Estado B pesando 0,002 mol de Tris em 100 mL de água deuterada. Para o Estado B, adicione 29,8 mg de CCL, 14,2 mgs de MgCl2, 36,8 g de CaCl2 e 836 mg de NaCl ao buffer de rotulagem Tris. O pD do tampão de rotulagem corresponde ao pH do buffer de equilíbrio. Como pH = pD - 0,41, ajuste para que o medidor de pH leia 6,99 ± 0,0523,24.
NOTA: O tampão de rotulagem precisa ter os mesmos componentes do tampão de equilíbrio, exceto que ele é preparado usando água deuterada. - Prepare o tampão de saciar pesando 0,010 mol de Tris e 0,050 mol de ureia e faça até 100 mL com água de grau LC-MS. Ajuste o pH para 2,50 ± 0,05 a 0,5 °C.
NOTA: Uma tela tampão de saciar deve ser realizada antes dos experimentos HDX para identificar o melhor tampão de saciar para a proteína de interesse. Diferentes concentrações e combinações de denaturantes (por exemplo, cloridrato de ureia e guanidinium) e agentes redutores (por exemplo, tris(2-carboxyethyl)fosfina) são rastreados, juntamente com parâmetros físicos como volume de trapping e temperatura, para efetivamente desdobrar e digerir a proteína saciada. Um tampão de saciar composto por 100 mM Tris e 0,5 M de ureia no pH 2,50 é ideal para o presente estudo. - Prepare o tampão de lavagem da coluna de digestão pesando 0,125 mol de cloridrato de guanidinium em uma garrafa de vidro Duran. Adicione 25 mL de metanol e 250 μL de ácido fórmico. Faça até 250 mL com água de grau LC-MS.
NOTA: Para a coluna de pepsina Enzymate BEH (ver Tabela de Materiais), use um tampão de lavagem de coluna de 0,5 M de cloridrato de guanidinium, 10% (v/v) de metanol e 0,1% (v/v) ácido fórmico. - Prepare a lavagem fraca da seringa ao tubo de 0,5 μL de ácido fórmico em 249,5 mL de água de grau LC-MS.
- Prepare a lavagem forte da seringa misturando partes iguais de água de grau LC-MS, metanol, acetonitrilo e isopropanol. Adicione o ácido fórmico a uma concentração final de 2% (v/v).
NOTA: Para evitar a contaminação cruzada entre os vários buffers e a proteína e permitir a limpeza da porta de injeção, é fundamental que as soluções de lavagem de seringas sejam preparadas e que o caminho de fluxo para a válvula (muitas vezes chamado de "forro de lavagem") seja totalmente preparado com líquido. O ácido fórmico é opcional para a lavagem fraca da seringa.
3. Procedimento de mapeamento de peptídeos
- Prepare a amostra seguindo o passo abaixo.
- Filtro descongelou o estoque de proteínaSyn do congelador de −80 °C com filtros de seringa de 0,22 μm. Meça a absorvância da proteína de estoque filtrada em 280 nm para determinar a concentração pela lei Beer-Lambert. Diluir a proteína a uma concentração de 5 μM no tampão de equilíbrio (passo 2.1.).
NOTA: A lei Beer-Lambert: A = εcl, onde A é absorvente, ε é o coeficiente de extinção da proteína no comprimento de onda medido (280 nm aqui) com unidades M−1cm−1, c é a concentração proteica em M, e l é o comprimento do caminho em cm. Para o tipo selvagem aSyn26, ε = 5960 M−1cm−1.
- Filtro descongelou o estoque de proteínaSyn do congelador de −80 °C com filtros de seringa de 0,22 μm. Meça a absorvância da proteína de estoque filtrada em 280 nm para determinar a concentração pela lei Beer-Lambert. Diluir a proteína a uma concentração de 5 μM no tampão de equilíbrio (passo 2.1.).
- Configure o método de cromatografia líquida.
- Crie um arquivo de entrada com um tempo de carga/captura de 3 min a uma pressão de 7000-9000 psi, seguido por um gradiente de 5% de acetonitrila a 40% de acetonitrila em 7 min, seguido por repetidas etapas de lavagem de 5%-95% de acetonitrila-água por 10 minutos.
- Certifique-se de que o spray de bloqueio (por exemplo, enkephalina leucina, ver Tabela de Materiais) esteja fluindo a 2000 psi e conectado à sonda de pulverização de bloqueio de origem do espectrômetro de massa.
- Configure os métodos de espectrometria de massa MSE .
NOTA: O MSE é um método de aquisição independente de dados de banda larga sem isolamento de massa precursor. Portanto, todos os íons dentro da faixa m/z selecionada são fragmentados ainda mais usando dissociação induzida por colisão (CID)27.- No arquivo do método MS, escolha o MSE Continuum e configure um tempo de aquisição entre 2-10 min, fonte de eletrospray e modo de resolução positiva. Adquira MSE acima de 50-2000 Da, escaneando a cada 0.3 s.
- Para a função 1 (baixa energia), configure a armadilha e transfira energias de colisão para ser 4 V. Para a função 2 (alta energia), configure a energia de colisão de transferência de rampa para ser constante em 4V e a energia de colisão da armadilha seja conforme indicado na Tabela 1 para cada nível de energia de mapeamento.
NOTA: Os métodos MSE de mobilidade de íons também podem ser usados. Métodos alternativos de mapeamento (por exemplo, aquisição dependente de dados ou DDA) podem ser usados a critério do usuário.
- Configure o robô autosampler (ver Tabela de Materiais).
- Adicione 50 μL da proteína de 5 μM a um frasco de recuperação total. Coloque o frasco em uma posição de amostra na câmara direita HDX. Certifique-se de que esta câmara está em 0,5 °C.
- Adicione um frasco de reagente de tampão de equilíbrio e dois frascos de reagente de tampão de rotulagem para as posições de reagente um, dois e três na câmara esquerda HDX. Certifique-se de que esta câmara está a 20 °C, definindo o controlador de temperatura Peltier (ver Tabela de Materiais). Adicione um frasco de reagente de tampão de saciar à posição do reagente na câmara direita HDX.
- Adicione oito frascos de recuperação total nas posições de reação da câmara esquerda HDX e oito frascos de recuperação máxima nas posições de reação da câmara direita HDX.
NOTA: Para garantir a limpeza completa e a reprodutibilidade máxima dos volumes dispensados, é aconselhável realizar uma lavagem de seringa e uma lavagem primordial nas seringas do autopesado. Por exemplo, execute uma sequência de (1) lavagem fraca, (2) lavagem forte, (3) lavagem fraca antes de iniciar os experimentos de mapeamento. Esta sequência pode ser repetida extensivamente, e é recomendável fazê-lo até 20x ou até que a seringa esteja totalmente molhada. - Configure uma lista de amostras com métodos apropriados de LC e MS no software de agendamento e inicie o cronograma.
NOTA: Para o presente estudo, o Cronos é usado como software de agendamento (ver Tabela de Materiais).
- Processe os dados de mapeamento.
- Identifique peptídeos a partir dos arquivos de experimento de mapeamento usando software apropriado (ver Tabela de Materiais).
- Importar dados de identificação de peptídeos em DynamX (ver Tabela de Materiais) utilizando os seguintes parâmetros de limiar de peptídeo: intensidade mínima = 5000, comprimento mínimo de sequência = 0, comprimento máximo da sequência = 40, produtos mínimos = 1, produtos mínimos por aminoácido = 0,25, produtos consecutivos mínimos = 2, intensidade mínima de soma para produtos = 0, escore mínimo = 0, escore mínimo = 0, e máximo erro de MH+ (ppm) = 0.
NOTA: Alternativamente, obtenha as configurações otimizadas de acordo com um fluxo de trabalho recomendado28. - Selecione Dados no menu e clique em Importar Resultados PLGS. Clique em Adicionar para escolher os arquivos de dados relevantes para a atribuição espectral. Quando tudo tiver sido adicionado, clique em 'Próximo ' e digite as configurações do filtro acima. Em seguida, clique em Concluir.
- Faça a curadoria manual de atribuições isotópicas para obter o mapa final de cobertura de peptídeos de aSyn em DynamX.
4. Estudo de troca de hidrogênio/deutério de milissegundo
- Limpe o instrumento protótipo FastHDX (ver Tabela de Materiais) antes de iniciar experimentos HDX.
- Abra o software HDX compatível GUI e permita que o sistema inicialize.
- Insira a temperatura da Câmara de Amostra a 20 °C e a Câmara de Suto como 0,5 °C. Clique em Definir para aplicar as novas temperaturas.
- Configure os tubos de centrífugas com água de grau LC-MS em todas as entradas.
- Na guia Titrator Plumbing Delivery , verifique as seringas esquerda e direita e clique em Prime para remover quaisquer bolhas de ar latentes nos tubos. Repita até que todas as bolhas se vão.
- Na guia Macros , verifique todas as caixas para as seringas. Clique em Calibrar Seringas Posição inicial. Clique em Wash Syringe Load Loop. Clique em Lavar todos os volumes de loop de mistura.
- Repita o passo 4.1.5. 1x mais.
- Se aparecerem bolhas nas seringas tampão, degas desconectando a seringa e ejetando a bolha verticalmente. Substitua a seringa e recalibra até a posição zero.
- Configure o instrumento protótipo FastHDX para experimentos HDX.
- Adicione 500 uL de 5 μM aSyn filtrados em um frasco de recuperação total e coloque dentro de uma geladeira de mesa para evitar oligomerização e agregação induzida pela temperatura.
- Adicione 50 mL de equilíbrio, rotulagem e sacie buffers a cada buffer (2). Etapas de preparação do buffer HDX 1-3) entrada nas câmaras esquerda e direita.
- Adicione 50 mL de tampão de lavagem de coluna (2. Etapa de preparação do buffer HDX 4) para a entrada de lavagem da pepsina.
- Para preparar as linhas de lavagem de proteínas e colunas 1x, verifique as seringas esquerda e direita na guia Titrator Plumbing Delivery e clique em Prime uma vez.
NOTA: Qualquer clique subsequente no Prime causará repetições adicionais do processo primo, resultando no consumo de grandes quantidades de amostra de proteína. O cuidado é aconselhável evitar isso, mesmo quando há um atraso no software após uma tentativa de clique de botão. - Repita as etapas 4.1.5. 1x.
- Na guia Fluxo de saciamento manual , digite as configurações necessárias, explicadas nas etapas 4.2.7.-4.2.10.
- Para um experimento de curso de tempo, digite os tempos em milissegundos usando o botão pontos simbólicos . Se forem necessárias réplicas, adicione o mesmo ponto de tempo várias vezes, por exemplo, para um triplicado de 50 ms, 50 50 50 precisa ser inserido. A lista de amostras no software de espectrômetro de massa (MassLynx é usado aqui, ver Tabela de Materiais) precisa corresponder exatamente a esses pontos de tempo.
NOTA: Os nomes dos arquivos da lista de espectrômetros de massa e/ou texto de amostra devem ser usados para garantir um registro permanente dos tempos de rotulagem HDX correspondentes aos inseridos na GUI do software FastHDX. Os tempos de rotulagem para cada amostra não serão armazenados em nenhum outro lugar. - Definir tempo de armadilha (minutos) para ser o comprimento do tempo de captura. Aqui, são 3:00.
- Definir Aguarde por HPLC (minutos) = (tempo de armadilha + tempo de execução + 1,5 min).
NOTA: Por exemplo, para um experimento com 3 min de trapping e 17 min de gradiente, este será de 21,50 min. - Clique na caixa Run Blank somente se executar experimentos em branco entre as séries de amostras. Se sim, certifique-se de uma entrada (ou seja, uma linha válida na lista de amostras) no software para a execução em branco após cada amostra executada.
- Uma vez que a lista de amostras esteja pronta no software, destaque as entradas apropriadas e inicie a execução no software clicando no botão Play e fastHDX no software.
NOTA: Devido à mistura de hidrogênio/deutério, métodos somente de MS ou técnicas de fragmentação suave (dissociação de transferência de elétrons, dissociação de captura de elétrons e foto dissociação ultravioleta) podem ser usados apenas29. Para aSyn em um pH fisiológico de 7,40, pontos de tempo que variam de 50 ms a 300 s são mais aplicáveis, pois estes cobrem toda a curva de absorção de deutério8.
5. Processamento de dados
- Carregue o arquivo de peptídeos espectralmente atribuídos dos experimentos de mapeamento de peptídeos. Abra o menu Arquivo e clique em Abrir no software DynamX (ver Tabela de Materiais).
- Importe arquivos brutos para o software de medição de massa preferido (por exemplo, DynamX, HDExaminer, etc.). Abra o menu "Dados" e clique em Arquivos MS. Clique em Novo Estado para criar estados para cada condição proteica estudada.
- Clique em Nova Exposição para adicionar cada ponto de tempo HDX. Clique em New RAW para importar os arquivos .raw. Arraste cada arquivo .raw para a posição correta. Clique em OK quando terminar.
- Atribuir automaticamente isótopos primeiro (este é automático seguindo a etapa 5.2. acima), em seguida, faça a curadoria manual da atribuição isotópica para garantir a alta qualidade dos dados.
- Exporte os dados do cluster para um arquivo .csv com colunas na seguinte ordem: nome da proteína, número de início de sequência, número final de sequência, sequência, sequência, modificação, fragmento, captação máxima possível, massa de espécies monoisotópicas, nome do estado, tempo de exposição, nome do arquivo, carga, tempo de retenção, intensidade e centroide.
- Abra o menu Data no software de medição em massa e clique em Dados de Cluster de Exportação.
6. Análise de dados
- Carregue os dados de cluster exportados no software de análise HDX preferido. Aqui, o HDfleX é usado30 (ver Tabela de Materiais).
- Encaixe os dados experimentais para todos os peptídeos e estados, selecionando os métodos apropriados de correção de back-exchange para obter constantes de taxa observadas para a reação HDX.
- Calcule um limiar de significância global pelo método preferido (O HDfleX suporta várias opções para isso) e realize testes de significância híbrida para determinar as diferenças significativas entre os estados em comparação com31,32.
NOTA: Se a diferença observada for maior que o limiar global e o valor p for inferior ao nível de confiança escolhido (por exemplo, 95%), a diferença é considerada significativa.
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Representative Results
Devido à sua natureza intrinsecamente desordenada, é difícil capturar as intrincadas mudanças estruturais em aSyn no pH fisiológico. HDX-MS monitora a troca isotópica em hidrogênios de amido backbone, sondando a dinâmica e interações conformais da proteína. É uma das poucas técnicas para adquirir essas informações em altas resoluções estruturais e temporais. Este protocolo é amplamente aplicável a uma ampla gama de proteínas e condições de tampão, e isso é exemplificado pela medição da cinética cambial de aSyn em duas condições diferentes de solução: Estado A e Estado B8, conforme definido nas etapas 2.1.-2.2.
Primeiro, foi realizado um experimento de mapeamento em aSyn, e um mapa de cobertura de peptídeos foi obtido, como mostrado na Figura 1. O mapa cobre 100% da sequência proteica e tem uma redundância média de 3,79. O valor de cobertura de 100% indica que todos os aminoácidos da proteína foram encontrados nos digestores proteicos e permitirão uma análise abrangente do comportamento de troca de aSyn. O valor de redundância indica o número de peptídeos sobrepostos. Um maior valor de redundância aumenta a resolução estrutural do mapa final, dado o achatamento subtrativo dos dados para peptídeos sobrepostos32.
Utilizando o protótipo de instrumento de fluxo de saciamento de rápida mistura (ver Tabela de Materiais), foram coletados dados HDX-MS de alta qualidade e milissegundos em aSyn em pH 7.4 no Estado A e no Estado B (Figura 2). Após uma atribuição isotópica em DynamX, foram obtidas curvas de absorção de deutério "brutas", como mostrado na Figura 3A. Ele mostra curvas de absorção para três peptídeos selecionados em cada domínio de proteína. A incorporação do deutério ao longo do tempo é exibida. O eixo x está na escala de tempo de milissegundos, que se alinha com a cinética muito rápida de aSyn em condições fisiológicas. A região sombreada vermelha mostra os dados tipicamente obtidos a partir de instrumentos HDX convencionais, com medições iniciais a partir de 30 s. É importante ressaltar que isso não pode ser ainda mais reduzido pela manipulação do pH para a chamada "expansão da janela de tempo"; essa abordagem é inválida para o estudo de proteínas/regiões intrinsecamente desordenadas, pois a mudança de pH irá perturbado o conjunto conformacional do polipeptídeo fracamente estável. Como pode ser visto aqui, a maior parte de aSyn é totalmente trocada por 1 s (Figura 3C). Isso mostra a importância das medidas de HDX de milissegundos para a aSyn monomérica, pois a curva de absorção cinética completa para a reação de troca é capturada, o que produz a medição mais precisa das conformações do monômero.
O HDfleX realizou a correção de retro-troca usando a incorporação do deutério do planalto. Os pontos de dados foram posteriormente instalados de acordo com a Equação 1, fornecendo uma constante de taxa observada, kobs, indicativo da acessibilidade solvente e envolvimento de ligação de hidrogênio desse peptídeo particular (Figura 3B).
Equação 1
onde Dt é a incorporação do deutério no momento t, nExp é o número de fases exponenciais, N é o número máximo de hidrogênios labile, kobs é a constante taxa de câmbio observada, e β é um fator de alongamento30,33.
Após o encaixe da curva, a área de captação sob a curva montada pode ser calculada integrando a função montada descrevendo a curva de absorção dentro da janela de tempo experimental. Foram realizadas análises de significância estatística entre a área de captação dos dois estados. Em primeiro lugar, um limiar de significância global para a área de captação foi calculado em HDfleX a um nível de confiança de 95%. Foram então geradas parcelas de diferença de área de absorção, mostrando a diferença entre Estado A e Estado B em dois níveis de resolução estrutural: resolução de peptídeos (Figura 4A) e resolução de aminoácidos (Figura 4B). O enredo de diferença de resolução de peptídeo mostra a diferença na área de absorção entre estado A e Estado B para cada peptídeo individual, enquanto o gráfico de diferença de resolução de aminoácidos mostra a diferença na área de absorção entre estado A e Estado B achatado em toda a sequência de aminoácidos de aSyn30,34. Ambas as parcelas indicam uma maior absorção de deutério ao longo do monômero aSyn no Estado B em comparação com o Estado A. Esse achado pode ser justificado examinando os lotes de captação de deutério na Figura 3, onde a curva de captação do Estado B está sempre acima da curva de captação do Estado A. Além disso, pode-se ver que a magnitude da diferença da área de absorção é muito maior no C-terminus. Mais uma vez, isso pode ser justificado traçando de volta para as curvas originais de absorção, onde os peptídeos terminais C (peptídeos 124-140 mostrados na Figura 3) mostram uma diferença muito maior entre as curvas de absorção do que o resto da proteína. Em conclusão, as condições de solução no Estado B causam um aumento na exposição de solventes ou diminuição na participação da rede de ligação de hidrogênio em toda a proteína, mas mais ainda no c-terminus.
Figura 1: Mapa de cobertura peptídeo de aSyn tipo selvagem com um total de 30 peptídeos e cobertura de 100% de sequência. Os três domínios de aSyn são destacados da seguinte forma: N-terminus (azul), região componente beta não amiloide (amarelo) e C-terminus (vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho para um experimento HDX-MS de milissegundo em aSyn. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplos de plotções de captação de três peptídeos selecionados nos três domínios de aSyn para Estado A (amarelo) e Estado B (azul) Inaptado e não-back-exchange gráfico de absorção corrigido. (B) Parcelas de captação corrigidas e encaixadas e em troca de costas. A região sombreada vermelha representa dados obtidos por sistemas HDX-MS convencionais, normalmente a partir dos 30. As barras de erro correspondem ao desvio padrão das três réplicas. (C) Gráfico do mapa de calor da absorção percentual de deutério através da sequência de aminoácidos por ponto de tempo. A barra de cor representa a porcentagem de absorção de deutério. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Parcelas de diferença de área de absorção no tempo máximo de platô de curva (14.084 ms). (A) As parcelas de resolução de resíduos de peptídeo mostram a diferença da área de absorção de cada peptídeo entre estado A e Estado B. (B) parcela de resolução de aminoácidos mostrando a diferença de área de absorção entre Estado A e Estado B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Mapeamento do Nível de Energia | Tensão de rampa (V) |
| Baixo | 20-40 |
| Média | 25-45 |
| Alto | 30-50 |
| Muito alto | 35-55 |
Tabela 1: Mapeando os níveis de energia e as tensões correspondentes das rampas de transferência.
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Discussion
No presente artigo, são descritos os seguintes procedimentos: (1) a realização de experimentos de mapeamento de peptídeos em aSyn monomérica para obter a maior cobertura de sequência, (2) aquisição de dados milissegundos HDX-MS sobre a aSyn monomérica em condições fisiológicas e (3) a realização da análise e interpretação dos dados de HDX-MS resultantes. Os procedimentos fornecidos são geralmente simples de executar, cada experimento de rotulagem normalmente dura apenas cerca de 8h para três réplicas e oito pontos de tempo, e o experimento de mapeamento dura apenas cerca de 2 h. Dada a instrumentação totalmente automatizada utilizada aqui, um conjunto de dados completo pode ser adquirido em 1 dia. No entanto, ao manusear amostras e preparar tampões, deve-se tomar cuidado para garantir que as medidas sejam derivadas de proteínas fracamente estáveis (ou regiões proteicas) no estado desejado. É importante ressaltar que diferentes condições de armazenamento, como congelamento e liofilização, resultaram em diferentes conformadores de monômeros de aSyn e que é importante caracterizar o impacto potencial do manuseio da amostra no conjunto conformador monomer aSyn10. De fato, o HDX-MS é uma medida altamente sensível de tais perturbações conformais, com uma gama dinâmica de microsegundos a pelo menos meses. Além disso, se estudar estritamente apenas o monômero aSyn, a filtração é fortemente aconselhada a remover oligômeros e fibrilas indesejados que podem ter se formado na amostra após o armazenamento ou manuseio. Além disso, os buffers HDX-MS precisam ser fortemente controlados dentro de 0,05 do pH ou pD desejado, pois quaisquer discrepâncias afetarão significativamente a taxa de câmbio intrínseco e levarão a erros indesejados. Também é importante notar que comparações entre condições de solução para qualquer proteína que difere na composição de pH, temperatura ou sal alterarão a taxa intrínseca. Portanto, esses dados exigirão novas correções, como a aplicação de um fator de ajuste de pH35 ou um fator de correção empírica 8,30.
Em termos de instrumentação, não há sistemas comercialmente disponíveis que permitam a aquisição de dados HDX-MS milissegundos. Vários grupos de pesquisa desenvolveram seus próprios sistemas, desde sistemas de fluxo de extinção 13,15,36 até chips microfluidos 37,38,39 para capturar a cinética de troca rápida de certas proteínas. Outro método que tem sido usado para alcançar dados HDX-MS em escala de tempo de milissegundos é conhecido como o método de expansão do tempo40,41, pelo qual o pH dos buffers é reduzido para desacelerar a cinética de troca. No entanto, este método não se aplica à aSyn (ou a quaisquer características de proteína fracamente estáveis) pois (1) a redução do pH altera drasticamente a densidade de carga da proteína e aumenta a taxa de agregação 8,42, e (2) os conformadores aSyn são apenas meta-estáveis e provavelmente serão perturbados por essas alterações de pH. Por essas razões, recomenda-se manter um pH consistente nos buffers HDX-MS ao estudar conformações monoméricas de aSyn, a menos que fisiologicamente relevantes, e empregar um instrumento de rotulagem de milissegundos.
A maioria do monômero aSyn troca totalmente dentro de 1 s, e no máximo leva aproximadamente 15 s para trocar totalmente com deutério (Figura 3) em um pH fisiologicamente relevante de 7,4 (reflexo de condições citostónicas intracelulares na pré-insimação). Usando sistemas HDX-MS convencionais, a partir dos 30 s não é apropriado, pois os dados HDX-MS corresponderiam ao platô da reação de troca, que não fornece nenhuma informação conformacional útil. No entanto, o limite inferior de medição do instrumento HDX milissegundo (correspondente a um "tempo morto" de 50 ms) permite o monitoramento da reação de troca de ~25% de conclusão para o monômero aSyn em pH 7.4. Isso nos permitiu capturar a maior parte da curva de absorção cinética. A montagem da curva de absorção do deutério à Equação 1 fornece informações cinéticas importantes; corresponde a uma estimativa da constante taxa observada, kobs. Embora não esteja coberto aqui, é possível realizar experimentos de cinética de agregação e examinar morfologias fibrilais de aSyn sob as mesmas condições de solução que os experimentos HDX-MS, uma vez que o HDX-MS é altamente tolerante com uma ampla gama de buffers8. Assim, por exemplo, os k obs do experimento HDX-MS podem ser correlacionados com os resultados dos experimentos de agregação para obter insights sobre quais conformações são mais propensas a certos comportamentos de agregação e morfologias fibrilais.
Para o simples caso de experimentos diferenciais de HDX-MS, onde duas ou mais condições ou variantes proteicas devem ser comparadas, a área sob a curva de absorção equipada pode ser integrada para cada estado e comparada entre si. Neste estudo, as áreas de captação para o Estado A e o Estado B foram comparadas em dois níveis diferentes de resolução estrutural: resolução de peptídeos e resolução de aminoácidos, ambos com pontos fortes e desafios distintos. Por exemplo, os dados de resolução de peptídeos refletem os dados espectrais brutos mais de perto e foram submetidos ao menor processamento. No entanto, os dados de resolução de aminoácidos "achatados" permitem que as informações de peptídeo e de fragmentação suave sejam combinadas em uma única saída em vez de saídas não hipnotizáveis separadas e, em última instância, apresentem os dados na mais alta resolução estrutural. Uma limitação da detecção de espectrometria de massa da rotulagem HDX é o desafio de obter resolução de aminoácidos. Embora técnicas de "fragmentação suave", como a dissociação de transferência de elétrons (ETD), a dissociação da captura de elétrons (ECD) e a fotodissociação ultravioleta (UVPD), tenham sido comprovadamente eficazes na geração de resoluções mais altas, elas permanecem desafiadoras, imprevisíveis e ineficientes 30,43,44,45,46,47,48.
Comparado com outras técnicas estruturais, o MILissegundo HDX-MS tem a vantagem única de capturar a dinâmica conformacional do aSyn monomédico em altas resoluções estruturais e temporais. Como a cinética de troca rápida do monômero não é mais um fator limitante, estudos adicionais podem ser realizados em aSyn monomérica com diferentes mutações, modificações pós-translacionais, componentes e concentrações de sal e parceiros de ligação no pH fisiológico. Correlacionar os resultados do HDX-MS com estudos funcionais, como cinética de agregação e morfologias fibrilais, pode fornecer insights sobre conformadores que promovem a função celular normal ou são propensos a doenças. Em última análise, espera-se que tal milissegundo HDX-MS possa ser crucial para descobrir drogas-alvo que estabilizam conformadores fisiologicamente tolerados específicos.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
A NS é financiada pela Bolsa de Estudos do Jubileu de Diamante do Conselho Universitário. A JJP é apoiada por uma Ukri Future Leaders Fellowship [Número de subvenção: MR/T02223X/1].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column | Waters Corporation | 186002346 | Analytical column |
| Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | For LC mobile phases |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
| Chronos | Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) | 667006090 | Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell |
| Deuterium chloride | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | For HDX labelling buffers |
| Deuterium oxide (99.9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Deuterated water |
| DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation |
| Enzymate BEH Pepsin Column | Waters Corporation | 186007233 | Pepsin digestion column |
| Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | For LC mobile phases |
| Guanidinium hydrochloride | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
| HDfleX | University of Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Salt for HDX buffers |
| LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot | Waters Corporation | 725000637 | Autosampler robot |
| Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | For mass spectrometry lockspray calibration. |
| MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software controlling inlet methods and mass spectrometer |
| Maximum recovery vials | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2 |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
| Millipore 0.22 µm syringe filters | Millipore | N9CA7069B | Syringe filters |
| ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Salt for HDX buffers |
| Peltier temperature controller | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot. |
| ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors. |
| Reagent pot caps | Waters Corporation | 186004632 | 100 pack |
| Reagent pots for LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | 100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2 |
| Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | For HDX labelling buffers |
| Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments. |
| Synapt G2-Si mass spectrometer | Waters Corporation | 176850035 | Mass spectrometer |
| Total recovery vials | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2 |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
| VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column | Waters Corporation | 186004623 | Trap desalting column |
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