Summary
Het structurele ensemble van monomeer alfa-synucleïne beïnvloedt de fysiologische functie en fysisch-chemische eigenschappen. Het huidige protocol beschrijft hoe milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie en daaropvolgende data-analyses kunnen worden uitgevoerd om conformatie-informatie over het monomeer van dit intrinsiek ongeordende eiwit onder fysiologische omstandigheden te bepalen.
Abstract
Alfa-synucleïne (aSyn) is een intrinsiek ongeordend eiwit waarvan de fibrillaire aggregaten overvloedig aanwezig zijn in Lewy-lichamen en neurieten, die de kenmerken zijn van de ziekte van Parkinson. Toch is veel van zijn biologische activiteit, evenals de aggregatie ervan, centraal betrokken bij de oplosbare monomeervorm van het eiwit. Opheldering van de moleculaire mechanismen van aSyn biologie en pathofysiologie vereist structureel sterk opgeloste methoden en is gevoelig voor biologische omstandigheden. De oorspronkelijk uitgevouwen, meta-stabiele structuren maken monomere aSyn onhandelbaar voor veel structurele biologietechnieken. Hier wordt de toepassing van een dergelijke benadering beschreven: waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) op de milliseconde tijdschaal voor de studie van eiwitten met lage thermodynamische stabiliteit en zwakke beschermingsfactoren, zoals aSyn. Op de milliseconde tijdschaal bevatten HDX-MS-gegevens informatie over de toegankelijkheid van oplosmiddelen en waterstofgebonden structuur van aSyn, die verloren gaan bij langere etiketteringstijden, wat uiteindelijk een structurele resolutie tot het aminozuurniveau oplevert. Daarom kan HDX-MS informatie verstrekken met hoge structurele en temporele resoluties over conformatiedynamica en thermodynamica, intra- en intermoleculaire interacties en de structurele impact van mutaties of veranderingen in omgevingsomstandigheden. Hoewel breed toepasbaar, wordt aangetoond hoe milliseconde HDX-MS-metingen in monomere aSyn kunnen worden verkregen, geanalyseerd en geïnterpreteerd.
Introduction
De ziekte van Parkinson (PD) is een neurodegeneratieve ziekte die wereldwijd miljoenen mensen treft1. Het wordt gekenmerkt door de vorming van cytoplasmatische insluitsels bekend als Lewy bodies en Lewy neurites in de substantia nigra pars compacta regio van de hersenen. Deze cytoplasmatische insluitsels blijken aggregaten van het intrinsiek ongeordende eiwit aSyn2 te bevatten. Bij PD en andere synucleinopathieën transformeert aSyn van een oplosbare ongeordende toestand in een onoplosbare, sterk gestructureerde zieke toestand. In zijn oorspronkelijke vorm neemt monomere aSyn een breed scala aan conformaties aan, gestabiliseerd door elektrostatische interacties op lange afstand tussen zijn N- en C-termini en hydrofobe interacties tussen zijn C-terminus en niet-amyloïde bètacomponent (NAC) regio 3,4,5,6. Eventuele verstoringen in die stabiliserende interacties, zoals mutaties, posttranslationele modificaties en veranderingen in de lokale omgeving, kunnen leiden tot het verkeerd vouwen van het monomeer, waardoor het proces van aggregatiewordt geactiveerd 7.
Hoewel er een enorme hoeveelheid onderzoek bestaat naar de oligomere en fibrillaire vormen van aSyn 8,9,10,11, is er een cruciale behoefte om de monomere vorm van het eiwit te bestuderen en beter te begrijpen welke conformers functioneel zijn (en hoe) en welke vatbaar zijn voor aggregaat 8,9,10,11 . Omdat het intrinsiek ongeordend is, slechts 14 kDa groot is en moeilijk te kristalliseren, is het aSyn-monomeer niet vatbaar voor de meeste structurele biologische technieken. Een techniek die in staat is om de conformatiedynamiek van monomere aSyn te meten, is milliseconde HDX-MS, die onlangs belangrijke structurele waarnemingen heeft gegenereerd die uitdagend of onmogelijk te verkrijgen zouden zijn anders 12,13,14. Milliseconde HDX-MS meet gevoelig het gemiddelde van het eiwitconformatie-ensemble door de isotopische uitwisseling bij amidewaterstoffen te monitoren, wat wijst op de toegankelijkheid van oplosmiddelen en de deelname van het waterstofbindingsnetwerk van een bepaald eiwitgebied op de millisecondetijdschaal. Het is noodzakelijk om het milliseconde-aspect van de HDX-MS te benadrukken, omdat aSyn, vanwege zijn native uitgevouwen, meta-stabiele aard, een zeer snelle waterstofuitwisselingskinetiek vertoont die zich ver onder de ondergrens van conventionele HDX-MS-systemen manifesteert. Het grootste deel van het aSyn-molecuul heeft bijvoorbeeld waterstof volledig uitgewisseld voor deuterium onder intracellulaire omstandigheden in minder dan 1 s. Verschillende laboratoria hebben inmiddels snelmenginstrumenten gebouwd; in dit geval wordt een prototype snel mengend quench-flow instrument gebruikt dat HDX-MS kan uitvoeren met een dead-time van 50 ms en een temporele resolutie van 1 ms15. Hoewel milliseconde HDX-MS onlangs acuut belangrijk is geweest in de studie van aSyn, is het waardevol bij het bestuderen van intrinsiek ongeordende eiwitten / regio's op grotere schaal en een groot aantal eiwitten met lussen / regio's die slechts zwak stabiel zijn. Bijvoorbeeld peptidegeneesmiddelen (bijv. Insuline; GLP-1/glucagon; tirzepatide) en peptidefusie-eiwitten (bijv. de HIV-remmer FN3-L35-T1144) zijn belangrijke medicijnformaten waarbij structurele en stabiliteitsinformatie in de oplossingsfase een kritische input kan zijn voor beslissingen over de ontwikkeling van geneesmiddelen, en toch is het peptidegedeelte vaak slechts zwak stabiel en onhandelbaar door HDX-MS op de secondentijdschaal 16,17,18,19,20 . Van opkomende HDX-MS-methoden met labeling in de seconden/minuten-domeinen is aangetoond dat ze structurele informatie afleiden voor DNA G-quadruplexen, maar het zou mogelijk moeten zijn om dit uit te breiden naar meer diverse oligonucleotidestructuren door de toepassing van milliseconde HDX-MS21.
HDX-MS-experimenten kunnen op drie verschillende niveaus worden uitgevoerd: (1) bottom-up (waarbij het gelabelde eiwit proteolytisch wordt verteerd), (2) middle-down (waarbij het gelabelde eiwit proteolytisch wordt verteerd en de resulterende peptiden verder worden gefragmenteerd door soft-fragmentation technieken), en (3) top-down (waarbij soft-fragmentation technieken het gelabelde eiwit direct fragmenteren)22 . Submoleculaire HDX-MS-gegevens stellen ons dus in staat om het uitwisselingsgedrag te lokaliseren naar specifieke regio's van een eiwit, waardoor het van cruciaal belang is om voldoende sequentiedekking voor dergelijke experimenten te hebben. De structurele resolutie van elk HDX-MS-experiment is afhankelijk van het aantal proteolytische peptiden of fragmenten afgeleid van het eiwit bij vertering of zachte fragmentatie, respectievelijk. In elk van de drie hierboven beschreven experimenttypen wordt de verandering in amide-uitwisseling bij elk peptide / fragment teruggekoppeld naar de primaire structuur van het eiwit om het gedrag van gelokaliseerde gebieden van het eiwit aan te geven. Hoewel de hoogste structurele resolutie wordt bereikt door zachte fragmentatie, valt de beschrijving van deze experimenten buiten het bereik van de huidige studie, die zich richt op het meten van aSyn monomeer conformaties. Uitstekende resultaten kunnen worden verkregen met de vaak toegepaste "bottom-up" workflow die hier wordt beschreven.
Hier worden procedures gegeven over (1) hoe aSyn-monsters en HDX-MS-buffers te bereiden en te verwerken, (2) hoe peptidemapping uit te voeren voor een bottom-up HDX-MS-experiment, (3) hoe HDX-MS-gegevens over monomere aSyn te verkrijgen onder fysiologische omstandigheden, met name in het millisecondetijddomein (met behulp van een op maat gemaakt instrument; alternatieve instrumenten voor milliseconde-etikettering zijn ook beschreven), en (4) hoe de HDX-MS-gegevens te verwerken en te analyseren. Methoden met behulp van monomere aSyn bij fysiologische pH (7,40) in twee oplossingsomstandigheden worden hier geïllustreerd. Hoewel kritisch nuttig in de studie van aSyn, kunnen deze procedures worden toegepast op elk eiwit en zijn ze niet beperkt tot intrinsiek ongeordende eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Eiwitexpressie en zuivering van aSyn
- Bereid aSyn voor naar aanleiding van een eerder gepubliceerd rapport9.
- Dialyseren in een veilige opslagbuffer (bijv. Tris, pH 7,2 ).
- Concentreer het monster indien nodig (bijv. spinfiltermicrocentrifugebuizen met 3 kDa MWCO, 14.000 x g gedurende ongeveer 10-30 minuten, zie materiaaltabel).
OPMERKING: Het wordt geadviseerd om niet overmatig te concentreren. De integriteit van het monomeerensemble is niet geverifieerd boven 25 μM. - Aliquot en bewaren bij −80 °C
OPMERKING: Het aSyn monomeer eiwit is stabiel voor maximaal 1 jaar in deze opslagomstandigheden.
2. HDX buffer voorbereiding
OPMERKING: Aangezien Tris een hoge temperatuurcoëfficiënt heeft, moet de pH-meting worden aangepast aan de temperatuur waarbij de HDX-reactie zal worden uitgevoerd, wat in dit protocol 20 °C is.
- Bereid evenwichtsbuffer voor toestand A en toestand B voor door 0,002 mol Tris te wegen in 100 ml water van LC-MS-kwaliteit. Voeg voor toestand B 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 en 836 mg NaCl toe aan de Tris-buffer. Stel de pH in op 7,40 ± 0,05.
OPMERKING: De evenwichtsbuffer moet de omstandigheden bevatten waaronder aSyn moet worden bestudeerd. In dit geval gaat het om 20 mM Tris bij pH 7,4 +/− zouten. - Bereid de etiketteringsbuffer voor toestand A en toestand B voor door 0,002 mol Tris in 100 ml gedeutereerd water te wegen. Voeg voor toestand B 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 en 836 mg NaCl toe aan de Tris-etiketteringsbuffer. De pD van de etiketteringsbuffer komt overeen met de pH van de evenwichtsbuffer. Aangezien pH = pD - 0,41, zo instellen dat de pH-meter 6,99 ± 0,0523,24.
OPMERKING: De etiketteringsbuffer moet dezelfde componenten hebben als de evenwichtsbuffer, behalve dat deze wordt bereid met gedeutereerd water. - Bereid de blusbuffer voor door 0,010 mol Tris en 0,050 mol ureum af te wegen en vul aan tot 100 ml met water van LC-MS-kwaliteit. Stel de pH in op 2,50 ± 0,05 bij 0,5 °C.
OPMERKING: Voorafgaand aan HDX-experimenten moet een quenchbufferscherm worden uitgevoerd om de beste quenchbuffer voor het eiwit van belang te identificeren. Verschillende concentraties en combinaties van denaturanten (bijv. ureum en guanidiniumhydrochloride) en reductiemiddelen (bijv. Tris (2-carboxyethyl)fosfine) worden gescreend, samen met fysieke parameters zoals vangvolume en temperatuur, om het gebluste eiwit effectief te ontvouwen en te verteren. Een blusbuffer bestaande uit 100 mM Tris en 0,5 M ureum bij een pH van 2,50 is optimaal voor dit onderzoek. - Bereid de wasbuffer van de verteringskolom voor door 0,125 mol guanidiniumhydrochloride in een glazen fles van Duran te wegen. Voeg 25 ml methanol en 250 μl mierenzuur toe. Maak tot 250 ml met water van LC-MS-kwaliteit.
OPMERKING: Gebruik voor de Enzymate BEH pepsinekolom (zie Tabel met materialen) een kolomwasbuffer van 0,5 M guanidiniumhydrochloride, 10% (v/v) methanol en 0,1% (v/v) mierenzuur. - Bereid de zwakke wassing van de spuit voor door 0,5 μL mierenzuur te pipetteren in 249,5 ml water van LC-MS-kwaliteit.
- Bereid de spuit sterke was voor door gelijke delen water van LC-MS-kwaliteit, methanol, acetonitril en isopropanol te mengen. Voeg mierenzuur toe aan een uiteindelijke concentratie van 2% (v/v).
OPMERKING: Om kruisbesmetting tussen de verschillende buffers en het eiwit te voorkomen en om reiniging van de injectiepoort mogelijk te maken, is het van cruciaal belang dat spuitwasoplossingen worden bereid en dat het stroompad naar de klep (vaak de "wasvoering" genoemd) volledig is geprimed met vloeistof. Het mierenzuur is optioneel voor de zwakke wassing van de spuit.
3. Peptide mapping procedure
- Bereid het voorbeeld voor volgens de onderstaande stap.
- Filter ontdooide aSyn eiwitvoorraad uit de −80 °C vriezer met 0,22 μm spuitfilters. Meet de absorptie van het gefilterde voorraadeiwit bij 280 nm om de concentratie volgens de Beer-Lambert-wet te bepalen. Verdun het eiwit tot een concentratie van 5 μM in de evenwichtsbuffer (stap 2.1.).
OPMERKING: De beer-lambertuswet: A = εcl, waarbij A absorptie is, ε de extinctiecoëfficiënt is van het eiwit op de gemeten golflengte (280 nm hier) met eenheden M−1cm−1, c is de eiwitconcentratie in M en l is de padlengte in cm. Voor wild-type aSyn26, ε = 5960 M−1cm−1.
- Filter ontdooide aSyn eiwitvoorraad uit de −80 °C vriezer met 0,22 μm spuitfilters. Meet de absorptie van het gefilterde voorraadeiwit bij 280 nm om de concentratie volgens de Beer-Lambert-wet te bepalen. Verdun het eiwit tot een concentratie van 5 μM in de evenwichtsbuffer (stap 2.1.).
- Stel de vloeistofchromatografiemethode in.
- Maak een inlaatbestand met een laad-/vangtijd van 3 minuten bij een druk van 7000-9000 psi, gevolgd door een gradiënt van 5% acetonitril tot 40% acetonitril in 7 minuten, gevolgd door herhaalde wasstappen van 5%-95% acetonitrilwater gedurende 10 minuten.
- Zorg ervoor dat slotspray (bijv. leucine-enkefaline, zie Materiaaltabel) met 2000 psi stroomt en is aangesloten op de bronvergrendelingsspraysonde van de massaspectrometer.
- Stel de massaspectrometrie MSE-methoden in.
OPMERKING: MSE is een breedbandgegevensonafhankelijke acquisitiemethode zonder precursor massa-isolatie. Daarom worden alle ionen binnen het geselecteerde m/z-bereik verder gefragmenteerd met behulp van botsing-geïnduceerde dissociatie (CID)27.- Kies in het MS-methodebestand MSE Continuum en stel een acquisitietijd in tussen 2-10 minuten, elektrospraybron en positieve resolutiemodus. Verkrijg MSE meer dan 50-2000 Da en scan elke 0,3 s.
- Voor functie 1 (lage energie) stelt u de val in en draagt u botsingsenergieën over op 4 V. Stel voor functie 2 (hoge energie) de botsingsenergie voor rampoverdracht in op constant bij 4V en de trapbotsingsenergie op basis van tabel 1 voor elk energieniveau.
OPMERKING: Ionenmobiliteit MSE-methoden kunnen ook worden gebruikt. Alternatieve toewijzingsmethoden (bijv. gegevensafhankelijke acquisitie of DDA) kunnen naar goeddunken van de gebruiker worden gebruikt.
- Stel de autosampler-robot in (zie Materiaalopgave).
- Voeg 50 μL van het 5 μM eiwit toe aan een injectieflacon met totaal herstel. Plaats de injectieflacon in een monsterpositie in de rechterkamer van HDX. Zorg ervoor dat deze kamer op 0,5 °C is.
- Voeg één reagensflacon met evenwichtsbuffer en twee reagensflacons met etiketteringsbuffer toe aan de reagensposities één, twee en drie in de linker hdx-kamer. Zorg ervoor dat deze kamer op 20 °C staat door de Peltier-temperatuurregelaar in te stellen (zie Materiaaltabel). Voeg één reagensflacon met blusbuffer toe aan de reagenspositie in de rechterkamer van HDX.
- Voeg acht totale herstelflacons toe in de reactieposities van de linker HDX-kamer en acht maximale herstelflacons in de reactieposities van de hdx-rechterkamer.
OPMERKING: Om volledige reiniging en maximale reproduceerbaarheid van de gedoseerde volumes te garanderen, wordt geadviseerd om een spuitwassing en prime wash op de autosampler-spuiten uit te voeren. Voer bijvoorbeeld een reeks uit van (1) zwakke was, (2) sterke was, (3) zwakke was voordat u de mappingexperimenten start. Deze volgorde kan uitgebreid worden herhaald en het wordt aanbevolen om dit tot 20x te doen of totdat de spuit volledig bevochtigd is. - Stel een voorbeeldlijst in met de juiste LC- en MS-methoden in de planningssoftware en start de planning.
OPMERKING: Voor deze studie wordt Chronos gebruikt als planningssoftware (zie Materiaaltabel).
- Verwerk de kaartgegevens.
- Identificeer peptiden uit de mapping experimentbestanden met behulp van de juiste software (zie Tabel met materialen).
- Importeer peptide-identificatiegegevens in DynamX (zie Materiaaltabel) met behulp van de volgende peptidedrempelparameters: minimale intensiteit = 5000, minimale sequentielengte = 0, maximale sequentielengte = 40, minimumproducten = 1, minimumproducten per aminozuur = 0,25, minimale opeenvolgende producten = 2, minimale somintensiteit voor producten = 0, minimumscore = 0 en maximale MH+ Fout (ppm) = 0.
OPMERKING: U kunt ook de geoptimaliseerde instellingen afleiden volgens een aanbevolen workflow28. - Selecteer Gegevens in het menu en klik op PLGS-resultaten importeren. Klik op Toevoegen om de relevante gegevensbestanden voor de spectrale toewijzing te kiezen. Wanneer alles is toegevoegd, klikt u op Volgende en voert u de bovenstaande filterinstellingen in. Klik vervolgens op Voltooien.
- Beheer handmatig isotopische toewijzingen om de uiteindelijke peptidedekkingskaart van aSyn in DynamX te verkrijgen.
4. Milliseconde waterstof/deuterium uitwisselingsstudie
- Reinig het FastHDX-prototype-instrument (zie Materiaaltabel) voordat u HDX-experimenten start.
- Open de compatibele HDX-software-GUI en laat het systeem initialiseren.
- Voer de temperatuur van de monsterkamer in als 20 °C en de bluskamer als 0,5 °C. Klik op Instellen om de nieuwe temperaturen toe te passen.
- Plaats de centrifugebuizen met water van LC-MS-kwaliteit bij alle inlaten.
- Controleer op het tabblad Titrator Plumbing Delivery zowel de linker- als de rechterspuit en klik op Prime om eventuele latente luchtbellen in de buizen te verwijderen. Herhaal dit totdat alle bubbels verdwenen zijn.
- Vink op het tabblad Macro's alle vakjes voor de spuiten aan. Klik op Kalibreer spuiten thuispositie. Klik op Wash Syringe Load Loop. Klik op Wash All Mixing Loop Volumes.
- Herhaal stap 4.1.5. 1x meer.
- Als er belletjes in de bufferspuiten verschijnen, ontgas dan door de spuit los te koppelen en de bel verticaal uit te werpen. Vervang de spuit en kalibreer opnieuw naar de nulpositie.
- Stel het FastHDX-prototype-instrument in voor HDX-experimenten.
- Voeg 500 uL gefilterde 5 μM aSyn toe aan een injectieflacon met totaal herstel en plaats in een tafelkoelkast om temperatuurgeïnduceerde oligomerisatie en aggregatie te voorkomen.
- Voeg 50 ml evenwichts-, etiketterings- en blusbuffers toe aan elke buffer (2. HDX-buffervoorbereidingsstappen 1-3) inlaat in de linker- en rechterkamer.
- Voeg 50 ml kolomwasbuffer toe (2. HDX-bufferbereiding stap 4) naar de pepsinewasinlaat.
- Om de eiwit- en kolomwaslijnen 1x te primen, controleert u zowel de linker- als de rechterspuiten op het tabblad Titrator Plumbing Delivery en klikt u eenmaal op Prime.
OPMERKING: Elke volgende klik op Prime zal extra herhalingen van het prime-proces veroorzaken, wat resulteert in de consumptie van grote hoeveelheden eiwitmonster. Voorzichtigheid is geboden om dit te voorkomen, zelfs als er een vertraging in de software is nadat een klik op de knop is geprobeerd. - Herhaal stap 4.1.5. 1x.
- Voer op het tabblad Handmatige quenchflow de vereiste instellingen in, die worden uitgelegd in de stappen 4.2.7.-4.2.10.
- Voor een tijdsverloopexperiment voert u de tijden in milliseconden in met de knop Symbolische stippen . Als replica's vereist zijn, voeg dan hetzelfde tijdspunt meerdere keren toe, bijvoorbeeld voor een drievoud van 50 ms moet 50 50 50 worden ingevoerd. De voorbeeldlijst in de massaspectrometersoftware (MassLynx wordt hier gebruikt, zie Tabel met materialen) moet precies overeenkomen met die tijdspunten.
OPMERKING: De bestandsnamen en/of voorbeeldtekst van de massaspectrometer moeten worden gebruikt om te zorgen voor een permanente registratie van de HDX-labeltijden die overeenkomen met die welke zijn ingevoerd in de FastHDX-software-GUI. Labeltijden voor elke monsterrun worden nergens anders opgeslagen. - Stel Traptijd (mins) in op de lengte van de overvultijd. Hier is het 3.00 uur.
- Wacht op HPLC (mins) = (traptijd + looptijd + 1,5 min) in.
OPMERKING: Voor een experiment met 3 minuten overvullen en een verloop van 17 minuten is dit bijvoorbeeld 21,50 minuten. - Klik alleen op het vak Leeg uitvoeren als u lege experimenten uitvoert tussen voorbeeldruns. Zo ja, zorg dan voor een vermelding (d.w.z. een geldige rij in de voorbeeldlijst) in de software voor de lege run na elke samplerun.
- Zodra de voorbeeldlijst klaar is op de software, markeert u de juiste vermeldingen en start u de uitvoering in de software door op de knop Afspelen en FastHDX in de software te klikken.
OPMERKING: Vanwege waterstof / deuterium scrambling kunnen MS-only methoden of zachte fragmentatietechnieken (elektronenoverdracht dissociatie, elektronenvangst dissociatie en ultraviolette fotodissociatie) slechtsworden gebruikt 29. Voor aSyn bij een fysiologische pH van 7,40 zijn tijdspunten variërend van 50 ms tot 300 s het meest van toepassing, omdat deze de gehele deuteriumopnamecurve8 bestrijken.
5. Gegevensverwerking
- Laad het bestand met spectraal toegewezen peptiden uit de peptide mapping experimenten. Open het menu Bestand en klik op Openen in de DynamX-software (zie Materiaaltabel).
- Importeer RAW-bestanden in de gewenste massameetsoftware (bijv. DynamX, HDExaminer, enz.). Open het menu "Gegevens" en klik op MS Files. Klik op Nieuwe toestand om toestanden te maken voor elke bestudeerde eiwitconditie.
- Klik op Nieuwe belichting om elk HDX-tijdspunt toe te voegen. Klik op Nieuwe RAW om de .raw bestanden te importeren. Sleep elk .raw bestand naar de juiste positie. Klik op OK als u klaar bent.
- Wijs eerst automatisch isotopen toe (dit is automatisch volgens stap 5.2. hierboven) en beheer vervolgens handmatig de isotopische toewijzing om een hoge gegevenskwaliteit te garanderen.
- Exporteer de clustergegevens naar een .csv bestand met kolommen in de volgende volgorde: eiwitnaam, volgordestartnummer, volgeindnummer, volgorde, modificatie, fragment, maximaal mogelijke opname, massa van mono-isotopensoorten, staatsnaam, blootstellingstijd, bestandsnaam, lading, retentietijd, intensiteit en centroïde.
- Open het menu Gegevens in de software voor massameting en klik op Clustergegevens exporteren.
6. Data-analyse
- Laad de geëxporteerde clustergegevens in de gewenste HDX-analysesoftware. Hier wordt HDfleX gebruikt30 (zie Materiaaltabel).
- Pas de experimentele gegevens voor alle peptiden en toestanden aan en selecteer de juiste back-exchange correctiemethoden om waargenomen snelheidsconstanten voor de HDX-reactie te krijgen.
- Bereken een globale significantiedrempel met de voorkeursmethode (HDfleX ondersteunt hiervoor verschillende opties) en voer hybride significantietests uit om de significante verschillen tussen de staten te bepalen, vergelekenmet 31,32.
OPMERKING: Als het waargenomen verschil groter is dan de globale drempel en de p-waarde lager is dan het gekozen betrouwbaarheidsniveau (bijv. 95%), wordt het verschil als significant beschouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vanwege de intrinsiek ongeordende aard is het moeilijk om de ingewikkelde structurele veranderingen in aSyn bij fysiologische pH vast te leggen. HDX-MS bewaakt de isotopische uitwisseling bij backboneamidehydrogenen en onderzoekt de eiwitconformatiedynamiek en interacties. Het is een van de weinige technieken om deze informatie te verkrijgen met hoge structurele en temporele resoluties. Dit protocol is breed toepasbaar op een breed scala aan eiwitten en buffercondities, en dit wordt geïllustreerd door de meting van de uitwisselingskinetiek van aSyn in twee verschillende oplossingsomstandigheden: toestand A en toestand B8, zoals gedefinieerd in stappen 2.1.-2.2.
Eerst werd een mapping experiment op aSyn uitgevoerd en een peptide dekkingskaart verkregen, zoals weergegeven in figuur 1. De kaart beslaat 100% van de eiwitsequentie en heeft een gemiddelde redundantie van 3,79. De 100% dekkingswaarde geeft aan dat alle aminozuren in het eiwit werden gevonden in de eiwitverteerbaarheden en zal een uitgebreide analyse van het uitwisselingsgedrag van aSyn mogelijk maken. De redundantiewaarde geeft het aantal overlappende peptiden aan. Een hogere redundantiewaarde verhoogt de structurele resolutie van de uiteindelijke kaart, gezien subtractieve afvlakking van de gegevens voor overlappende peptiden32.
Met behulp van het prototype van het snel mengende quench-flow instrument (zie Materiaaltabel) werden hoogwaardige HDX-MS-gegevens op milliseconde tijdschaal verzameld over aSyn bij pH 7,4 in toestand A en toestand B (figuur 2). Na een isotopische toewijzing in DynamX werden "ruwe" deuteriumopnamecurven verkregen, zoals weergegeven in figuur 3A. Het toont opnamecurves voor drie peptiden geselecteerd in elk eiwitdomein. De deuteriumincorporatie in de loop van de tijd wordt weergegeven. De x-as bevindt zich op de milliseconde tijdschaal, die overeenkomt met de zeer snelle kinetiek van aSyn bij fysiologische omstandigheden. Het rood gearceerde gebied toont de gegevens die typisch worden verkregen van conventionele HDX-instrumenten, met startmetingen vanaf 30 s. Belangrijk is dat dit niet verder kan worden verminderd door pH-manipulatie voor zogenaamde "time-window expansion"; die benadering is ongeldig voor de studie van intrinsiek ongeordende eiwitten/regio's, omdat de pH-verschuiving het conformatie-ensemble van het zwak stabiele polypeptide zal verstoren. Zoals hier te zien is, wordt het grootste deel van aSyn volledig geruild door 1 s (figuur 3C). Dit toont het belang aan van milliseconde HDX-metingen voor monomere aSyn, aangezien de volledige kinetische opnamecurve voor de uitwisselingsreactie wordt vastgelegd, wat de meest nauwkeurige meting van de monomeerconformaties oplevert.
HDfleX voerde back-exchange correctie uit met behulp van de plateau deuterium incorporatie. De gegevenspunten werden vervolgens aangebracht volgens vergelijking 1, die een waargenomen snelheidsconstante, kobs, leverden die indicatief was voor de toegankelijkheid van oplosmiddelen en de betrokkenheid van waterstofbinding van dat specifieke peptide (figuur 3B).
Vergelijking 1
waarbij Dt de deuteriumincorporatie is op tijdstip t, nExp het aantal exponentiële fasen, N het maximale aantal labiele waterstofatomen, kobs de waargenomen wisselkoersconstante en β een rekfactor30,33 is.
Na het aanbrengen van de curve kan het opnamegebied onder de aangepaste curve worden berekend door de aangepaste functie te integreren die de opnamecurve beschrijft binnen het experimentele tijdvenster. Statistische significantieanalyses tussen het opnamegebied van de twee staten werden uitgevoerd. Ten eerste werd een globale significantiedrempel voor het opnamegebied berekend in HDfleX met een betrouwbaarheidsniveau van 95%. Vervolgens werden diagrammen van opnamegebiedsverschillen gegenereerd, die het verschil tussen toestand A en toestand B op twee niveaus van structurele resolutie lieten zien: peptideresolutie (figuur 4A) en aminozuurresolutie (figuur 4B). De peptide resolutie verschil plot toont het verschil in opnamegebied tussen staat A en toestand B voor elk individueel peptide, terwijl de aminozuurresolutie verschil plot het verschil in opnamegebied tussen toestand A en toestand B afgevlakt over de gehele aminozuursequentie van aSyn30,34. Beide plots wijzen op een over het algemeen grotere deuteriumopname in het aSyn monomeer in staat B in vergelijking met toestand A. Deze bevinding kan worden gerechtvaardigd door de deuteriumopnamepercelen in figuur 3 te onderzoeken, waar de opnamecurve van staat B altijd boven de opnamecurve van staat A ligt. Verder is te zien dat de omvang van het verschil in opnamegebied veel groter is bij de C-terminus. Nogmaals, dit kan worden gerechtvaardigd door terug te gaan naar de oorspronkelijke opnamecurven, waar de C-terminale peptiden (peptiden 124-140 weergegeven in figuur 3) een veel grotere kloof vertonen tussen de opnamecurven dan de rest van het eiwit. Concluderend kan worden gesteld dat de oplossingsomstandigheden in toestand B een toename van de blootstelling aan oplosmiddelen of een afname van de deelname van het waterstofbindingsnetwerk in het hele eiwit veroorzaken, maar meer nog aan de C-terminus.
Figuur 1: Peptide dekkingskaart van wild-type aSyn met een totaal van 30 peptiden en 100% sequentiedekking. De drie domeinen van aSyn worden als volgt gemarkeerd: N-terminus (blauw), niet-amyloïde bètacomponentgebied (geel) en C-terminus (rood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Workflow voor een milliseconde HDX-MS experiment op aSyn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeldopnameplots van drie peptiden geselecteerd over de drie domeinen van aSyn voor staat A (geel) en toestand B (blauw). (A) Niet-gemonteerde en niet-back-uitwisseling gecorrigeerde opnameplot. (B) Aan- en terugruilde gecorrigeerde opnamepercelen. Het rood gearceerde gebied vertegenwoordigt gegevens die kunnen worden verkregen door conventionele HDX-MS-systemen, meestal vanaf 30 s. Foutbalken komen overeen met de standaarddeviatie van de drie replicaties. (C) Heatmapplot van het percentage deuteriumopname in aminozuursequentie per tijdspunt. De kleurenbalk vertegenwoordigt het percentage deuteriumopname. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Uptake area difference plots bij maximale curve plateau tijd (14.084 ms). (A) Peptide residu resolutie plots tonen het opnamegebiedsverschil van elk peptide tussen Staat A en Toestand B. (B) Aminozuurresolutieplot toont het opnamegebiedverschil tussen Toestand A en Toestand B afgevlakt over de aminozuursequentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Energieniveau in kaart brengen | Ramp spanning (V) |
| Laag | 20-40 |
| Gemiddeld | 25-45 |
| Hoog | 30-50 |
| Zeer hoog | 35-55 |
Tabel 1: In kaart brengen van energieniveaus en bijbehorende overdrachtshellingsspanningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel worden de volgende procedures beschreven: (1) het uitvoeren van peptide mapping experimenten op monomere aSyn om de hoogste sequentiedekking te verkrijgen, (2) het verkrijgen van milliseconde HDX-MS gegevens op monomere aSyn onder fysiologische omstandigheden, en (3) het uitvoeren van data-analyse en interpretatie van de resulterende HDX-MS data. De verstrekte procedures zijn over het algemeen eenvoudig uit te voeren, elk labelexperiment duurt meestal slechts ongeveer 8 uur voor drie replicaties en acht tijdspunten, en het mappingexperiment duurt slechts ongeveer 2 uur. Gezien de volledig geautomatiseerde instrumentatie die hier wordt gebruikt, kan in 1 dag een volledige dataset worden verkregen. Bij het hanteren van monsters en het bereiden van buffers moet er echter voor worden gezorgd dat de metingen worden afgeleid van zwak stabiele eiwit( of eiwitgebieden) in de gewenste toestand. Belangrijk is dat een eerdere studie aantoonde dat verschillende opslagomstandigheden, zoals bevriezen en lyofiliseren, resulteerden in verschillende aSyn monomeer conformers en dat het belangrijk is om de potentiële impact van monsterbehandeling op het aSyn monomeer conformationaal ensemble10 te karakteriseren. HDX-MS is inderdaad een zeer gevoelige maat voor dergelijke conformatieverstoringen, met een dynamisch bereik van microseconden tot ten minste maanden. Bovendien, als strikt alleen het aSyn-monomeer wordt bestudeerd, wordt filtratie sterk aanbevolen om ongewenste oligomeren en fibrillen te verwijderen die zich mogelijk in het monster hebben gevormd bij opslag of behandeling. Bovendien moeten de HDX-MS-buffers strak worden gecontroleerd binnen 0,05 van de gewenste pH of pD, omdat eventuele discrepanties de intrinsieke wisselkoers aanzienlijk zullen beïnvloeden en tot ongewenste fouten zullen leiden. Het is ook belangrijk op te merken dat vergelijkingen tussen oplossingsomstandigheden voor elk eiwit dat verschilt in pH, temperatuur of zoutsamenstelling de intrinsieke snelheid zullen veranderen. Daarom zullen deze gegevens verdere correcties vereisen, zoals het toepassen van een pH-aanpassingsfactor35 of een empirische correctiefactor 8,30.
In termen van instrumentatie zijn er geen commercieel beschikbare systemen die de verwerving van milliseconde HDX-MS-gegevens mogelijk maken. Verschillende onderzoeksgroepen hebben hun eigen systemen ontwikkeld, van quench-flow systemen 13,15,36 tot microfluïdische chips 37,38,39 om de snelle uitwisselingskinetiek van bepaalde eiwitten vast te leggen. Een andere methode die is gebruikt om milliseconde timescale HDX-MS-gegevens te bereiken, staat bekend als de tijduitbreidingsmethode40,41, waarbij de pH van de buffers wordt verlaagd om de uitwisselingskinetiek te vertragen. Deze methode is echter niet van toepassing op aSyn (of op zwak stabiele eiwitkenmerken) omdat (1) het verlagen van de pH de ladingsdichtheid van het eiwit drastisch verandert en de aggregatiesnelheidverhoogt 8,42, en (2) de aSyn-conformers alleen meta-stabiel zijn en waarschijnlijk worden verstoord door deze pH-veranderingen. Om deze redenen wordt aanbevolen om een consistente pH in de HDX-MS-buffers te handhaven bij het bestuderen van monomere aSyn-conformaties, tenzij fysiologisch relevant, en een milliseconde-etiketteringsinstrument te gebruiken.
Het grootste deel van het aSyn monomeer wisselt volledig uit binnen 1 s, en het duurt maximaal ongeveer 15 s om volledig uit te wisselen met deuterium (figuur 3) bij een fysiologisch relevante pH van 7,4 (weerspiegeling van intracellulaire cytosolische omstandigheden bij de presynapse). Met behulp van conventionele HDX-MS-systemen is beginnen bij 30 s niet geschikt omdat de HDX-MS-gegevens overeenkomen met het plateau van de uitwisselingsreactie, die geen bruikbare conformatie-informatie oplevert. De ondergrens van de meting van het milliseconde HDX-instrument (overeenkomend met een "dead-time" van 50 ms) maakt het echter mogelijk om de uitwisselingsreactie te monitoren vanaf ~ 25% voltooiing voor het aSyn-monomeer bij pH 7,4. Hierdoor konden we het grootste deel van de kinetische opnamecurve vastleggen. Het afstemmen van de deuteriumopnamecurve op vergelijking 1 levert belangrijke kinetische informatie op; het komt overeen met een schatting van de waargenomen snelheidsconstante , kobs. Hoewel het hier niet wordt behandeld, is het mogelijk om aggregatiekinetische experimenten uit te voeren en fibrilmorfologieën van aSyn te onderzoeken onder dezelfde oplossingsomstandigheden als de HDX-MS-experimenten, aangezien HDX-MS zeer tolerant is voor een breed scala aan buffers8. Zo kunnen bijvoorbeeld de kobs uit het HDX-MS-experiment worden gecorreleerd met de resultaten van de aggregatie-experimenten om inzicht te krijgen in welke conformaties het meest vatbaar zijn voor bepaald aggregatiegedrag en fibrilmorfologieën.
Voor het eenvoudige geval van differentiële HDX-MS-experimenten, waarbij twee of meer condities of eiwitvarianten moeten worden vergeleken, kan het gebied onder de aangepaste opnamecurve voor elke toestand worden geïntegreerd en met elkaar worden vergeleken. In deze studie werden de opnamegebieden voor staat A en toestand B vergeleken op twee verschillende niveaus van structurele resolutie: peptideresolutie en aminozuurresolutie, die beide verschillende sterke punten en uitdagingen hebben. De peptideresolutiegegevens weerspiegelen bijvoorbeeld de ruwe spectrale gegevens nauwer en hebben de minste verwerking ondergaan. De "afgevlakte" aminozuurresolutiegegevens maken het echter mogelijk om zowel peptide- als softfragmentatie-informatie te combineren tot een enkele output in plaats van afzonderlijke onmergeerbare outputs en presenteren de gegevens uiteindelijk met de hoogste structurele resolutie. Een beperking van de massaspectrometriedetectie van HDX-etikettering is de uitdaging van het verkrijgen van aminozuurresolutie. Hoewel "soft-fragmentation" -technieken, zoals elektronenoverdrachtdissociatie (ETD), elektronenvangstdissociatie (ECD) en ultraviolette fotodissociatie (UVPD), effectief zijn gebleken bij het genereren van hogere resoluties, blijven ze uitdagend, onvoorspelbaar en inefficiënt 30,43,44,45,46,47,48.
In vergelijking met andere structurele technieken heeft milliseconde HDX-MS het unieke voordeel dat het de conformatiedynamiek van monomere aSyn bij hoge structurele en temporele resoluties vastlegt. Aangezien de snelle uitwisselingskinetiek van het monomeer niet langer een beperkende factor is, kunnen verdere studies worden uitgevoerd op monomere aSyn met verschillende mutaties, posttranslationele modificaties, zoutcomponenten en -concentraties en bindende partners bij fysiologische pH. Het correleren van de HDX-MS-resultaten met functionele studies, zoals aggregatiekkinetiek en fibrilmorfologieën, kan inzicht geven in conformers die ofwel de normale cellulaire functie bevorderen of ziektegevoelig zijn. Uiteindelijk wordt verwacht dat een dergelijke milliseconde HDX-MS cruciaal kan zijn voor het ontdekken van gerichte geneesmiddelen die specifieke fysiologisch getolereerde conformers stabiliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
NS wordt gefinancierd door de Universiteitsraad Diamond Jubilee Scholarship. JJP wordt ondersteund door een UKRI Future Leaders Fellowship [Subsidienummer: MR/T02223X/1].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column | Waters Corporation | 186002346 | Analytical column |
| Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | For LC mobile phases |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
| Chronos | Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) | 667006090 | Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell |
| Deuterium chloride | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | For HDX labelling buffers |
| Deuterium oxide (99.9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Deuterated water |
| DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation |
| Enzymate BEH Pepsin Column | Waters Corporation | 186007233 | Pepsin digestion column |
| Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | For LC mobile phases |
| Guanidinium hydrochloride | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
| HDfleX | University of Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Salt for HDX buffers |
| LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot | Waters Corporation | 725000637 | Autosampler robot |
| Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | For mass spectrometry lockspray calibration. |
| MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software controlling inlet methods and mass spectrometer |
| Maximum recovery vials | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2 |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
| Millipore 0.22 µm syringe filters | Millipore | N9CA7069B | Syringe filters |
| ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Salt for HDX buffers |
| Peltier temperature controller | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot. |
| ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors. |
| Reagent pot caps | Waters Corporation | 186004632 | 100 pack |
| Reagent pots for LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | 100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2 |
| Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | For HDX labelling buffers |
| Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments. |
| Synapt G2-Si mass spectrometer | Waters Corporation | 176850035 | Mass spectrometer |
| Total recovery vials | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2 |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
| VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column | Waters Corporation | 186004623 | Trap desalting column |
References
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N.
- Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
- Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
- McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
- Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
- Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 1 240-255 (2015).
- Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
- Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820 (2020).
- Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
- Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712 (2018).
- Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
- Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
- Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. Biochemistry. 56 (31), 4064-4072 (2017).
- Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
- El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
- Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
- Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424 (2022).
- Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
- Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
- Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
- Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
- Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
- Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
- Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
- Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer. New York. 571-607 (2005).
- Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
- Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
- Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
- Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
- Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
- Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
- Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
- Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
- Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. Biochemistry. 53 (43), 6849-6856 (2014).
- Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
- Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
- Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
- Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
- Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
- Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
- Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
- Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
- Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
- Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
- Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).
