Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Millisekund hydrogen / deuterium-udveksling massespektrometri til undersøgelse af alfa-synuclein strukturel dynamik under fysiologiske forhold

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64050
Automatic Translation
1, 1
1Living Systems Institute, Department of Biosciences, University of Exeter

Summary

Det strukturelle ensemble af monomer alfa-synuclein påvirker dets fysiologiske funktion og fysisk-kemiske egenskaber. Denne protokol beskriver, hvordan man udfører millisekund hydrogen/ deuteriumudvekslingsmassespektrometri og efterfølgende dataanalyser for at bestemme konformationsoplysninger om monomeren af dette iboende uordnede protein under fysiologiske forhold.

Abstract

Alfa-synuclein (aSyn) er et iboende uordnet protein, hvis fibrillære aggregater er rigelige i Lewy-kroppe og neuritter, som er kendetegnende for Parkinsons sygdom. Alligevel involverer meget af dets biologiske aktivitet såvel som dets aggregering centralt den opløselige monomerform af proteinet. Belysning af de molekylære mekanismer i aSyn biologi og patofysiologi kræver strukturelt stærkt opløste metoder og er følsom over for biologiske forhold. Dens naturligt udfoldede, metastabile strukturer gør monomer aSyn uhåndterlig for mange strukturelle biologiske teknikker. Her beskrives anvendelsen af en sådan tilgang: hydrogen/deuterium-udvekslingsmassespektrometri (HDX-MS) på millisekundets tidsskala for undersøgelse af proteiner med lav termodynamisk stabilitet og svage beskyttelsesfaktorer, såsom aSyn. På millisekundets tidsskala indeholder HDX-MS-data oplysninger om opløsningsmiddeltilgængelighed og hydrogenbundet struktur af aSyn, som går tabt på længere mærkningstider, hvilket i sidste ende giver strukturel opløsning op til aminosyreniveauet. Derfor kan HDX-MS give information ved høje strukturelle og tidsmæssige opløsninger om konformationsdynamik og termodynamik, intra- og intermolekylære interaktioner og den strukturelle virkning af mutationer eller ændringer i miljøforhold. Selvom det er bredt anvendeligt, demonstreres det, hvordan man erhverver, analyserer og fortolker millisekund HDX-MS-målinger i monomerisk aSyn.

Introduction

Parkinsons sygdom (PD) er en neurodegenerativ sygdom, der påvirker millioner af mennesker over hele verden1. Det er kendetegnet ved dannelsen af cytoplasmatiske indeslutninger kendt som Lewy-kroppe og Lewy-neuritter i hjernens substantia nigra pars compacta-region. Disse cytoplasmatiske indeslutninger har vist sig at indeholde aggregater af det iboende uordnede protein aSyn2. I PD og andre synukleinopatier omdannes aSyn fra en opløselig uordnet tilstand til en uopløselig, stærkt struktureret syg tilstand. I sin oprindelige form vedtager monomer aSyn en bred vifte af konformationer stabiliseret af langtrækkende elektrostatiske interaktioner mellem dets N- og C-termini og hydrofobe interaktioner mellem dets C-endestation og ikke-amyloid beta-komponent (NAC) region 3,4,5,6. Eventuelle forstyrrelser i disse stabiliserende interaktioner, såsom mutationer, posttranslationelle modifikationer og ændringer i det lokale miljø, kan føre til fejlfoldning af monomeren og dermed udløse aggregeringsprocessen7.

Mens der findes en enorm mængde forskning om de oligomere og fibrillarformer af aSyn 8,9,10,11, er der et afgørende behov for at studere den monomere form af proteinet og bedre forstå, hvilke konforme der er funktionelle (og hvordan), og hvilke der er tilbøjelige til at aggregere 8,9,10,11 . At være iboende uordnet, kun 14 kDa i størrelse og vanskelig at krystallisere, er aSyn monomeren ikke modtagelig for de fleste strukturelle biologiske teknikker. En teknik, der er i stand til at måle konformationsdynamikken i monomer aSyn, er imidlertid millisekund HDX-MS, som for nylig har genereret vigtige strukturelle observationer, der ville være udfordrende eller umulige at opnå ellers 12,13,14. Millisekunder HDX-MS måler følsomt gennemsnittet af proteinkonformationsensemblet ved at overvåge isotopudvekslingen ved amidhydrogener, hvilket indikerer opløsningsmiddeltilgængelighed og hydrogenbindingsnetværksdeltagelse for et bestemt proteinområde på millisekundets tidsskala. Det er nødvendigt at understrege millisekundaspektet af HDX-MS, da aSyn på grund af sin naturligt udfoldede, metastabile natur udviser meget hurtig hydrogenudvekslingskinetik, der manifesterer sig langt under den nedre grænse for konventionelle HDX-MS-systemer. For eksempel har det meste af aSyn-molekylet fuldstændigt udvekslet hydrogen til deuterium under intracellulære forhold på mindre end 1 s. Flere laboratorier har nu bygget hurtigblandingsinstrumentering; i dette tilfælde anvendes et prototype hurtigblandende slukningsflowinstrument, der er i stand til at udføre HDX-MS med en dødtid på 50 ms og en tidsmæssig opløsning på 1 ms15. Mens millisekund HDX-MS for nylig har været akut vigtig i studiet af aSyn, står det til at være værdifuldt at studere iboende uordnede proteiner / regioner mere bredt og et stort antal proteiner med sløjfer / regioner, der kun er svagt stabile. For eksempel peptidlægemidler (f.eks. Insulin; GLP-1/glukagon; tirzepatid) og peptidfusionsproteiner (f.eks. HIV-hæmmeren FN3-L35-T1144) er vigtige lægemiddelformater, hvor opløsningsfasestruktur- og stabilitetsoplysninger kan være et kritisk input til beslutninger om lægemiddeludvikling, og alligevel er peptiddelen ofte kun svagt stabil og uhåndterlig af HDX-MS på sekundernes tidsskala 16,17,18,19,20 . Emergent HDX-MS-metoder med mærkning i sekunder / minutter domæner har vist sig at udlede strukturelle oplysninger for DNA G-quadruplexes, men det skulle være muligt at udvide dette til mere forskellige oligonukleotidstrukturer ved anvendelse af millisekund HDX-MS21.

HDX-MS-eksperimenter kan udføres på tre forskellige niveauer: (1) bottom-up (hvorved det mærkede protein fordøjes proteolytisk), (2) middle-down (hvorved det mærkede protein fordøjes proteolytisk, og de resulterende peptider fragmenteres yderligere ved hjælp af bløde fragmenteringsteknikker) og (3) top-down (hvorved bløde fragmenteringsteknikker direkte fragmenterer det mærkede protein)22 . Således giver submolekylære HDX-MS-data os mulighed for at lokalisere udvekslingsadfærden til bestemte regioner af et protein, hvilket gør det kritisk at have tilstrækkelig sekvensdækning for sådanne eksperimenter. Den strukturelle opløsning af ethvert HDX-MS-eksperiment afhænger af antallet af proteolytiske peptider eller fragmenter afledt af proteinet ved henholdsvis fordøjelse eller blød fragmentering. I hver af de tre eksperimenttyper, der er skitseret ovenfor, kortlægges ændringen i amidudveksling ved hvert peptid / fragment tilbage på proteinets primære struktur for at indikere opførsel af lokaliserede regioner af proteinet. Mens den højeste strukturelle opløsning opnås gennem blød fragmentering, er beskrivelsen af disse eksperimenter uden for rammerne af den nuværende undersøgelse, der fokuserer på måling af aSyn monomer konformationer. Fremragende resultater kan opnås med den almindeligt anvendte "bottom-up" arbejdsgang beskrevet her.

Her gives procedurer for (1) hvordan man forbereder og håndterer aSyn-prøver og HDX-MS-buffere, (2) hvordan man udfører peptidkortlægning til et bottom-up HDX-MS-eksperiment, (3) hvordan man erhverver HDX-MS-data om monomere aSyn under fysiologiske forhold, specifikt i millisekundets tidsdomæne (ved hjælp af et specialbygget instrument; alternative instrumenter til millisekundmærkning er også beskrevet), og (4) hvordan man behandler og analyserer HDX-MS-dataene. Metoder, der anvender monomer aSyn ved fysiologisk pH (7,40) i to opløsningsbetingelser, er eksemplificeret her. Selvom de er kritisk nyttige i undersøgelsen af aSyn, kan disse procedurer anvendes på ethvert protein og er ikke begrænset til iboende uordnede proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Proteinekspression og oprensning af aSyn

  1. Forbered aSyn efter en tidligere offentliggjort rapport9.
  2. Dialysere i en sikker opbevaringsbuffer (f.eks. Tris, pH 7.2 ).
  3. Koncentrer om nødvendigt prøven (f.eks. centrifugeringsfiltermikrocentrifugerør ved hjælp af 3 kDa MWCO, 14.000 x g i ca. 10-30 min, se Materialetabel).
    BEMÆRK: Det anbefales ikke at koncentrere sig overdrevent. Integriteten af det monomere ensemble er ikke blevet verificeret ud over 25 μM.
  4. Aliquot og opbevares ved -80 °C
    BEMÆRK: aSyn monomerproteinet er stabilt i op til 1 år under disse opbevaringsforhold.

2. Forberedelse af HDX-buffer

BEMÆRK: Da Tris har en høj temperaturkoefficient, skal pH-målingen justeres for den temperatur, hvor HDX-reaktionen skal udføres, hvilket er 20 ° C i denne protokol.

  1. Forbered ligevægtsbuffer for tilstand A og tilstand B ved at veje 0,002 mol Tris i 100 ml vand af LC-MS-kvalitet. For stat B tilsættes 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 og 836 mg NaCl til Tris-bufferen. PH-værdien justeres til 7,40 ± 0,05.
    BEMÆRK: Ligevægtsbufferen skal indeholde de betingelser, hvorunder aSyn skal undersøges. I dette tilfælde er det 20 mM Tris ved pH 7,4 +/− salte.
  2. Forbered mærkningsbuffer til tilstand A og tilstand B ved at veje 0,002 mol Tris i 100 ml deutereret vand. For stat B tilsættes 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 og 836 mg NaCl til Tris-mærkningsbufferen. Mærkningsbufferens pD svarer til ligevægtsbufferens pH. Da pH = pD - 0,41, justeres, så pH-måleren læser 6,99 ± 0,0523,24.
    BEMÆRK: Mærkningsbufferen skal have de samme komponenter som ligevægtsbufferen, bortset fra at den fremstilles ved hjælp af deutereret vand.
  3. Forbered slukningsbuffer ved at veje 0,010 mol Tris og 0,050 mol urinstof og lav op til 100 ml med vand af LC-MS-kvalitet. pH-værdien justeres til 2,50 ± 0,05 ved 0,5 °C.
    BEMÆRK: En slukningsbufferskærm skal udføres forud for HDX-eksperimenter for at identificere den bedste slukningsbuffer for det pågældende protein. Forskellige koncentrationer og kombinationer af denatureringsmidler (f.eks. urinstof og guanidiniumhydrochlorid) og reduktionsmidler (f.eks. Tris (2-carboxyethyl)phosphin) screenes sammen med fysiske parametre såsom fangstvolumen og temperatur for effektivt at udfolde og fordøje det slukkede protein. En slukningsbuffer bestående af 100 mM Tris og 0,5 M urinstof ved pH 2,50 er optimal for denne undersøgelse.
  4. Forbered fordøjelseskolonnevaskebuffer ved at veje 0,125 mol guanidiniumhydrochlorid i en Duran-glasflaske. Der tilsættes 25 ml methanol og 250 μL myresyre. Der fyldes op til 250 ml med vand af LC-MS-kvalitet.
    BEMÆRK: Til kolonnen Enzymat BEH pepsin (se Materialetabel) skal du bruge en kolonnevaskebuffer på 0,5 M guanidiniumhydrochlorid, 10% (v/v) methanol og 0,1% (v/v) myresyre.
  5. Forbered sprøjtens svage vask ved at pipettere 0,5 μL myresyre i 249,5 ml vand af LC-MS-kvalitet.
  6. Forbered sprøjtens stærke vask ved at blande lige dele vand af LC-MS-kvalitet, methanol, acetonitril og isopropanol. Myresyre tilsættes til en endelig koncentration på 2 % (v/v).
    BEMÆRK: For at forhindre krydskontaminering mellem de forskellige buffere og proteinet og for at muliggøre rengøring af injektionsporten er det afgørende, at sprøjtevaskeopløsninger fremstilles, og at strømningsvejen til ventilen (ofte kaldet "vaskeforingen") er fuldt grundet med væske. Myresyren er valgfri til sprøjtens svage vask.

3. Procedure for kortlægning af peptider

  1. Forbered prøven ved at følge nedenstående trin.
    1. Filter optøet aSyn proteinlager fra -80 °C fryseren med 0,22 μm sprøjtefiltre. Absorbansen af det filtrerede stamprotein måles ved 280 nm for at bestemme koncentrationen efter Beer-Lambert-loven. Proteinet fortyndes til en koncentration på 5 μM i ligevægtsbufferen (trin 2.1).
      BEMÆRK: Beer-Lambert-loven: A = εcl, hvor A er absorbans, ε er proteinets udryddelseskoefficient ved den målte bølgelængde (280 nm her) med enheder M-1 cm-1, c er proteinkoncentrationen i M, og l er stilængden i cm. For vildtype aSyn26, ε = 5960 M−1cm−1.
  2. Indstil væskekromatografimetoden.
    1. Opret en indløbsfil med en indlæsnings-/fangsttid på 3 minutter ved et tryk på 7000-9000 psi efterfulgt af en gradient på 5% acetonitril til 40% acetonitril på 7 minutter efterfulgt af gentagne vasketrin på 5% -95% acetonitrilvand i 10 minutter.
    2. Sørg for, at låsespray (f.eks. Leucinenkephalin, se Materialetabel) flyder ved 2000 psi og er forbundet til massespektrometerets kildelåsspraysonde.
  3. Konfigurer massespektrometri MSE-metoderne .
    BEMÆRK: MSE er en dataindsamlingsuafhængig bredbåndsmetode uden masseisolering af prækursorer. Derfor fragmenteres alle ioner inden for det valgte m/z-område yderligere ved hjælp af kollisionsinduceret dissociation (CID)27.
    1. I MS-metodefilen skal du vælge MSE Continuum og indstille en anskaffelsestid mellem 2-10 minutter, elektrospraykilde og positiv opløsningstilstand. Få MSE over 50-2000 Da, scanning hver 0,3 s.
    2. For funktion 1 (lavenergi) skal fælden indstilles, og kollisionsenergierne overføres til 4 V. For funktion 2 (høj energi) indstilles rampeoverførselskollisionsenergien til at være konstant ved 4V og fældekollisionsenergien til at være som angivet i tabel 1 for hvert kortlægningsenerginiveau.
      BEMÆRK: Ion-mobilitet MSE-metoder kan også bruges. Alternative kortlægningsmetoder (f.eks. dataafhængig indsamling eller DDA) kan bruges efter brugerens skøn.
  4. Konfigurer autosamplerrobotten (se Materialetabel).
    1. Der tilsættes 50 μL af 5 μM-proteinet til et hætteglas med total recovery. Hætteglasset anbringes i en prøveposition i HDX's højre kammer. Sørg for, at dette kammer er ved 0,5 °C.
    2. Tilsæt et reagensglas med ligevægtsbuffer og to reagensglas med mærkningsbuffer til reagensposition et, to og tre i HDX's venstre kammer. Sørg for, at dette kammer er ved 20 °C ved at indstille Peltier-temperaturregulatoren (se Materialetabel). Tilsæt et reagensglas med slukningsbuffer til reagensposition et i HDX højre kammer.
    3. Tilsæt otte samlede genvindingshætteglas i reaktionspositionerne i HDX venstre kammer og otte maksimale genopretningshætteglas i reaktionspositionerne i HDX højre kammer.
      BEMÆRK: For at sikre fuld rengøring og maksimal reproducerbarhed af dispenserede mængder anbefales det at udføre en sprøjtevask og primærvask på autosamplersprøjterne. Udfør f.eks. en sekvens af (1) svag vask, (2) stærk vask, (3) svag vask, inden kortlægningseksperimenterne startes. Denne sekvens kan gentages i vid udstrækning, og det anbefales at gøre det op til 20x eller indtil sprøjten er fuldt fugtet.
    4. Opret en eksempelliste med passende LC- og MS-metoder i planlægningssoftwaren, og start tidsplanen.
      BEMÆRK: Til denne undersøgelse bruges Chronos som planlægningssoftware (se Materialetabel).
  5. Behandl tilknytningsdataene.
    1. Identificer peptider fra kortlægningseksperimentfilerne ved hjælp af passende software (se Materialetabel).
    2. Importer peptididentifikationsdata til DynamX (se materialetabel) ved hjælp af følgende peptidtærskelparametre: minimumintensitet = 5000, minimumsekvenslængde = 0, maksimal sekvenslængde = 40, minimumsprodukter = 1, minimumsprodukter pr. aminosyre = 0,25, minimum på hinanden følgende produkter = 2, minimum sumintensitet for produkter = 0, minimum score = 0 og maksimal MH + -fejl (ppm) = 0.
      BEMÆRK: Alternativt kan du udlede de optimerede indstillinger i henhold til en anbefalet arbejdsgang28.
    3. Vælg Data i menuen, og klik på Importer PLGS-resultater. Klik på Tilføj for at vælge de relevante datafiler til spektraltildelingen. Når alle er tilføjet, skal du klikke på Næste og indtaste ovenstående filterindstillinger. Klik derefter på Udfør.
    4. Kuratere isotopopgaver manuelt for at opnå det endelige peptiddækningskort over aSyn i DynamX.

4. Undersøgelse af udveksling af hydrogen/deuterium på millisekunder

  1. Rengør FastHDX-prototypeinstrumentet (se Materialetabel), før du starter HDX-eksperimenter.
    1. Åbn den kompatible HDX-software-GUI, og lad systemet initialisere.
    2. Prøvekammerets temperatur angives som 20 °C og slukningskammeret som 0,5 °C. Klik på Indstil for at anvende de nye temperaturer.
    3. Opsæt centrifugerørene med vand af LC-MS-kvalitet ved alle indløb.
    4. På fanen Titrator VVS-levering skal du kontrollere både venstre og højre sprøjter og klikke på Prime for at fjerne eventuelle latente luftbobler i rørene. Gentag, indtil alle bobler er væk.
    5. På fanen Makroer skal du markere alle felterne for sprøjterne. Klik på Kalibrer sprøjter hjemmeposition. Klik på Vask sprøjtebelastningssløjfe. Klik på Vask alle blandesløjfevolumener.
    6. Gentag trin 4.1.5. 1x mere.
    7. Hvis der vises bobler i buffersprøjterne, skal du afgasse ved at frakoble sprøjten og skubbe boblen lodret ud. Sæt sprøjten på igen, og kalibrer til nulpositionen.
  2. Konfigurer FastHDX-prototypeinstrumentet til HDX-eksperimenter.
    1. Tilsæt 500 uL filtreret 5 μM aSyn i et hætteglas med total recovery, og anbring det i et bordkøleskab for at forhindre temperaturinduceret oligomerisering og aggregering.
    2. Tilsæt 50 ml ligevægts-, mærknings- og slukbuffere til hver buffer (2. HDX-bufferforberedelse trin 1-3) indløb i venstre og højre kammer.
    3. Der tilsættes 50 ml søjlevaskebuffer (2. HDX-bufferforberedelse trin 4) til pepsinvaskindløbet.
    4. For at prime protein- og søjlevaskelinjerne 1x skal du kontrollere både venstre og højre sprøjter i fanen Titrator VVS-levering og klikke på Prime en gang.
      BEMÆRK: Ethvert efterfølgende klik på Prime vil medføre yderligere gentagelser af prime-processen, hvilket resulterer i forbrug af store mængder proteinprøve. Pas på at undgå dette, selv når der er en forsinkelse i softwaren, efter at et knapklik er forsøgt.
    5. Gentag trin 4.1.5. 1x.
    6. Under fanen Manuel slukningsflow skal du indtaste de nødvendige indstillinger, der er forklaret i trin 4.2.7.-4.2.10.
    7. For et tidskursuseksperiment skal du indtaste tiderne i millisekunder ved hjælp af knappen Symbolske prikker . Hvis replikater er påkrævet, skal du tilføje det samme tidspunkt flere gange, f.eks. for en tredobling på 50 ms, skal der indtastes 50 50 50. Prøvelisten i massespektrometersoftwaren (MassLynx bruges her, se Materialetabel) skal matche disse tidspunkter nøjagtigt.
      BEMÆRK: Massespektrometerets eksempellistefilnavne og/eller eksempeltekst skal bruges til at sikre en permanent registrering af HDX-mærkningstiderne svarende til dem, der er indtastet i FastHDX-softwarens GUI. Mærkningstider for hver prøvekørsel gemmes ikke andre steder.
    8. Indstil fældetid (minutter) til at være længden af fangsttiden. Her er klokken 3.00.
    9. Indstil Vent på HPLC (min.) = (diffuseringstid + kørselstid + 1,5 min).
      BEMÆRK: For eksempel for et eksperiment med 3 min fangst og 17 min gradient, vil dette være 21.50 min.
    10. Klik kun på feltet Kør tom, hvis du kører tomme eksperimenter mellem prøvekørsler. Hvis ja, skal du sikre dig en post (dvs. en gyldig række på eksempellisten) i softwaren for den tomme kørsel efter hver prøvekørsel.
    11. Når eksempellisten er klar på softwaren, skal du fremhæve de relevante poster og starte kørslen i softwaren ved at klikke på knappen Afspil og FastHDX i softwaren.
      BEMÆRK: På grund af hydrogen / deuterium scrambling kan MS-only metoder eller soft-fragmenteringsteknikker (elektronoverførselsdissociation, elektronindfangningsdissociation og ultraviolet fotodissociation) kun anvendes29. For aSyn ved en fysiologisk pH-værdi på 7,40 er tidspunkter fra 50 ms til 300 s mest anvendelige, da disse dækker hele deuteriumoptagelseskurven8.

5. Databehandling

  1. Indlæs filen med spektralt tildelte peptider fra peptidkortlægningseksperimenterne. Åbn menuen Filer, og klik på Åbn i DynamX-softwaren (se Materialetabel).
  2. Importer råfiler til den foretrukne massemålingssoftware (f.eks. DynamX, HDExaminer osv.). Åbn menuen "Data", og klik på MS-filer. Klik på Ny tilstand for at oprette tilstande for hver undersøgt proteintilstand.
    1. Klik på Ny eksponering for at tilføje hvert HDX-tidspunkt. Klik på Ny RAW for at importere .raw filerne. Træk hver .raw fil til den korrekte position. Klik på OK , når du er færdig.
  3. Tildel automatisk isotoper først (dette er automatisk efter trin 5.2 ovenfor), og kurater derefter isotoptildelingen manuelt for at sikre høj datakvalitet.
  4. Eksporter klyngedataene til en .csv fil med kolonner i følgende rækkefølge: proteinnavn, sekvensstartnummer, sekvensendenummer, sekvens, modifikation, fragment, maksimal mulig optagelse, masse af monoisotopiske arter, tilstandsnavn, eksponeringstid, filnavn, ladning, retentionstid, intensitet og centroid.
  5. Åbn menuen Data i massemålingssoftware, og klik på Eksporter klyngedata.

6. Analyse af data

  1. Indlæs de eksporterede klyngedata i den foretrukne HDX-analysesoftware. Her bruges HDfleX30 (se Materialetabel).
  2. Tilpas de eksperimentelle data for alle peptider og tilstande, og vælg de passende tilbageudvekslingskorrektionsmetoder for at få observerede hastighedskonstanter for HDX-reaktionen.
  3. Beregn en global signifikanstærskel ved hjælp af den foretrukne metode (HDfleX understøtter flere muligheder for dette) og udfør hybrid signifikanstest for at bestemme de signifikante forskelle på tværs af staterne sammenlignet med31,32.
    BEMÆRK: Hvis den observerede forskel er større end den globale tærskel, og p-værdien er mindre end det valgte konfidensniveau (f.eks. 95 %), betragtes forskellen som signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På grund af sin iboende uordnede natur er det vanskeligt at fange de indviklede strukturelle ændringer i aSyn ved fysiologisk pH. HDX-MS overvåger isotopudveksling ved rygradsamidhydrogener og undersøger proteinkonformationsdynamikken og interaktionerne. Det er en af de få teknikker til at erhverve disse oplysninger ved høje strukturelle og tidsmæssige opløsninger. Denne protokol er bredt anvendelig på en lang række proteiner og bufferbetingelser, og dette eksemplificeres ved måling af aSyns udvekslingskinetik i to forskellige opløsningsbetingelser: stat A og tilstand B8, som defineret i trin 2.1.-2.2.

Først blev der udført et kortlægningseksperiment på aSyn, og der blev opnået et peptiddækningskort, som vist i figur 1. Kortet dækker 100% af proteinsekvensen og har en gennemsnitlig redundans på 3,79. Dækningsværdien på 100% indikerer, at alle aminosyrerne i proteinet blev fundet i proteinfordøjelserne og vil muliggøre en omfattende analyse af aSyns udvekslingsadfærd. Redundansværdien angiver antallet af overlappende peptider. En højere redundansværdi øger den strukturelle opløsning af det endelige kort, givet subtraktiv udfladning af dataene for overlappende peptider32.

Ved hjælp af prototypen af det hurtigtblandende slukningsflowinstrument (se Materialetabel) blev der indsamlet HDX-MS-data af høj kvalitet på millisekunders tidsskala på aSyn ved pH 7,4 i tilstand A og tilstand B (figur 2). Efter en isotopisk tildeling i DynamX blev der opnået "rå" deuteriumoptagelseskurver, som vist i figur 3A. Det viser optagelseskurver for tre peptider valgt på tværs af hvert proteindomæne. Deuterium-inkorporeringen over tid vises. X-aksen er på millisekundets tidsskala, hvilket stemmer overens med den meget hurtige kinetik af aSyn ved fysiologiske forhold. Det røde skraverede område viser de data, der typisk opnås fra konventionelle HDX-instrumenter, med startmålinger fra 30 s. Det er vigtigt, at dette ikke kan reduceres yderligere ved pH-manipulation for såkaldt "tidsvinduesudvidelse"; denne tilgang er ugyldig for studiet af iboende uordnede proteiner/regioner, da pH-skiftet vil forstyrre det konformationsensemble af det svagt stabile polypeptid. Som det kan ses her, udveksles det meste af aSyn fuldt ud med 1 s (figur 3C). Dette viser betydningen af millisekunder HDX-målinger for monomere aSyn, da den fulde kinetiske optagelseskurve for udvekslingsreaktionen registreres, hvilket giver den mest nøjagtige måling af monomerkonformationerne.

HDfleX udførte back-exchange korrektion ved hjælp af plateau deuterium inkorporering. Datapunkterne blev efterfølgende tilpasset i henhold til ligning 1, hvilket gav en observeret hastighedskonstant, kobs, der indikerer opløsningsmiddeltilgængelighed og hydrogenbindingsinddragelse af det pågældende peptid (figur 3B).

Equation 1Ligning 1

hvor Dt er deuteriuminkorporeringen på tidspunktet t, nExp er antallet af eksponentielle faser, N er det maksimale antal labile hydrogener, kobs er den observerede valutakurskonstant, og β er en strækningsfaktor30,33.

Efter kurvetilpasning kan optagelsesarealet under den monterede kurve beregnes ved at integrere den monterede funktion, der beskriver optagelseskurven, i forsøgstidsvinduet. Der blev udført statistisk signifikansanalyser mellem optagelsesområdet for de to stater. For det første blev der beregnet en global signifikanstærskel for optagelsesområdet i HDfleX med et konfidensniveau på 95 %. Optagelsesområdeforskelplotter blev derefter genereret, der viser forskellen mellem tilstand A og tilstand B ved to niveauer af strukturel opløsning: peptidopløsning (figur 4A) og aminosyreopløsning (figur 4B). Peptidopløsningsforskelplottet viser forskellen i optagelsesområde mellem tilstand A og tilstand B for hvert enkelt peptid, mens aminosyreopløsningsforskelplottet viser forskellen i optagelsesområde mellem tilstand A og tilstand B fladt over hele aminosyresekvensen af aSyn30,34. Begge områder indikerer en samlet større deuteriumoptagelse i hele aSyn-monomeren i stat B sammenlignet med stat A. Dette resultat kan begrundes ved at undersøge deuteriumoptagelsesområderne i figur 3, hvor stats B-optagelseskurven altid ligger over stats-A-optagelseskurven. Desuden kan det ses, at størrelsen af forskellen i optagelsesområdet er meget højere ved C-terminalen. Endnu en gang kan dette retfærdiggøres ved at spore tilbage til de oprindelige optagelseskurver, hvor de C-terminale peptider (peptider 124-140 vist i figur 3) viser et meget større mellemrum mellem optagelseskurverne end resten af proteinet. Afslutningsvis forårsager opløsningsbetingelserne i tilstand B en stigning i eksponering for opløsningsmidler eller fald i hydrogenbindingsnetværksdeltagelse i hele proteinet, men mere ved C-terminalen.

Figure 1
Figur 1: Peptiddækningskort over vildtype aSyn med i alt 30 peptider og 100% sekvensdækning. De tre domæner i aSyn er fremhævet som følger: N-terminus (blå), ikke-amyloid beta-komponentregion (gul) og C-endestation (rød). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Arbejdsgang for et millisekund HDX-MS eksperiment på aSyn. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Eksempler på optagelsesdiagrammer fra tre peptider udvalgt på tværs af de tre domæner i aSyn for stat A (gul) og tilstand B (blå). (A) Ubenyttede og ikke-tilbagebørskorrigerede optagelsesplot. B) Tilpassede og tilbagebyttekorrigerede optagelsesintervaller. Det røde skraverede område repræsenterer data, der kan opnås af konventionelle HDX-MS-systemer, typisk startende fra 30 s. Fejllinjer svarer til standardafvigelsen for de tre replikater. (C) Heatmap-plot af den procentvise deuteriumoptagelse over aminosyresekvensen pr. tidspunkt. Farvelinjen repræsenterer procentdelen af deuteriumoptagelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Observationsdiagrammer for optagelsesarealforskelle ved maksimal kurveplateautid (14.084 ms). (A) Peptidrestopløsningsdiagrammer viser hvert peptids optagelsesområdeforskel mellem tilstand A og tilstand B. (B) Aminosyreopløsningsdiagram, der viser forskellen i optagelsesområdet mellem tilstand A og tilstand B fladt over aminosyresekvensen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Kortlægning af energiniveau Rampespænding (V)
Lav 20-40
Medium 25-45
Høj 30-50
Meget høj 35-55

Tabel 1: Kortlægning af energiniveauer og tilsvarende overføringsrampespændinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel beskrives følgende procedurer: (1) udførelse af peptidkortlægningseksperimenter på monomer aSyn for at opnå den højeste sekvensdækning, (2) erhvervelse af millisekunder HDX-MS-data på monomere aSyn under fysiologiske forhold og (3) udførelse af dataanalyse og fortolkning af de resulterende HDX-MS-data. De medfølgende procedurer er generelt enkle at udføre, hvert mærkningseksperiment varer typisk kun omkring 8 timer i tre replikater og otte tidspunkter, og kortlægningseksperimentet varer kun ca. 2 timer. I betragtning af den fuldautomatiske instrumentering, der bruges her, kan et komplet datasæt erhverves på 1 dag. Ved håndtering af prøver og klargøring af buffere skal det dog sikres, at målingerne stammer fra svagt stabile proteinområder (eller proteinområder) i den ønskede tilstand. Det er vigtigt, at en tidligere undersøgelse viste, at forskellige opbevaringsforhold, såsom frysning og frysetørring, resulterede i forskellige aSyn monomerkonformer, og at det er vigtigt at karakterisere den potentielle indvirkning af prøvehåndtering på aSyn monomer konformationsensemble10. FAKTISK er HDX-MS et meget følsomt mål for sådanne konformationsforstyrrelser med et dynamisk område fra mikrosekunder til mindst måneder. Derudover anbefales filtrering, hvis man strengt studerer aSyn-monomeren, kraftigt at fjerne uønskede oligomerer og fibriller, der kan have dannet sig i prøven ved opbevaring eller håndtering. Desuden skal HDX-MS-bufferne kontrolleres nøje inden for 0,05 af den ønskede pH- eller pD-værdi, da eventuelle uoverensstemmelser vil påvirke den indre valutakurs betydeligt og føre til uønskede fejl. Det er også vigtigt at bemærke, at sammenligninger mellem opløsningsbetingelser for ethvert protein, der adskiller sig i pH, temperatur eller saltsammensætning, vil ændre den iboende hastighed. Disse data vil derfor kræve yderligere korrektioner, f.eks. anvendelse af en pH-justeringsfaktor35 eller en empirisk korrektionsfaktor 8,30.

Med hensyn til instrumentering er der ingen kommercielt tilgængelige systemer, der tillader erhvervelse af MILLISEKUNDER HDX-MS-data. Flere forskergrupper har udviklet deres egne systemer, fra slukningsflowsystemer 13,15,36 til mikrofluidiske chips 37,38,39 for at fange den hurtige udvekslingskinetik af visse proteiner. En anden metode, der er blevet brugt til at opnå millisekundtidsskala HDX-MS-data, er kendt som tidsudvidelsesmetoden 40,41, hvorved buffernes pH reduceres for at bremse udvekslingskinetikken. Denne metode gælder imidlertid ikke for aSyn (eller for svagt stabile proteinegenskaber), da (1) sænkningen af pH drastisk ændrer proteinets ladningstæthed og øger aggregeringshastigheden 8,42, og (2) aSyn-konformatorerne kun er metastabile og sandsynligvis vil blive forstyrret af disse pH-ændringer. Af disse grunde anbefales det at opretholde en konsistent pH i HDX-MS-bufferne, når man studerer monomere aSyn-konformationer, medmindre det er fysiologisk relevant, og anvende et millisekund mærkningsinstrument.

Det meste af aSyn-monomeren udveksles fuldt ud inden for 1 s, og det tager højst ca. 15 s at udveksle fuldt ud med deuterium (figur 3) ved en fysiologisk relevant pH på 7,4 (reflekterende af intracellulære cytosoliske tilstande ved presynapsen). Brug af konventionelle HDX-MS-systemer, der starter ved 30 s, er ikke hensigtsmæssigt, da HDX-MS-dataene ville svare til udvekslingsreaktionens plateau, hvilket ikke giver nogen nyttig konformationsinformation. Den nedre målegrænse for DET EUROPÆISKE HDX-instrument (svarende til en "dødtid" på 50 ms muliggør imidlertid overvågning af udvekslingsreaktionen fra ~25 % færdiggørelse for aSyn-monomeren ved pH 7,4. Dette gjorde det muligt for os at fange størstedelen af den kinetiske optagelseskurve. Tilpasning af deuteriumoptagelseskurven til ligning 1 giver vigtige kinetiske oplysninger; det svarer til et skøn over den observerede hastighedskonstant, kobs. Selvom det ikke er dækket her, er det muligt at udføre aggregeringskinetikeksperimenter og undersøge fibrilmorfologier af aSyn under de samme opløsningsbetingelser som HDX-MS-eksperimenterne, da HDX-MS er meget tolerant over for en lang række buffere8. Således kan for eksempel kobs fra HDX-MS-eksperimentet korreleres med resultaterne fra aggregeringseksperimenterne for at få indsigt i, hvilke konformationer der er mest tilbøjelige til visse aggregeringsadfærd og fibrilmorfologier.

I det enkle tilfælde med differentielle HDX-MS-forsøg, hvor to eller flere betingelser eller proteinvarianter skal sammenlignes, kan området under den monterede optagelseskurve integreres for hver tilstand og sammenlignes med hinanden. I denne undersøgelse blev optagelsesområderne for stat A og stat B sammenlignet på to forskellige niveauer af strukturel opløsning: peptidopløsning og aminosyreopløsning, som begge har forskellige styrker og udfordringer. For eksempel afspejler peptidopløsningsdataene de rå spektraldata tættere og har gennemgået mindst behandling. Imidlertid tillader de "fladede" aminosyreopløsningsdata, at både peptid- og blødfragmenteringsinformation kombineres til et enkelt output snarere end separate ikke-fletningsbare output og i sidste ende præsenterer dataene i den højeste strukturelle opløsning. En begrænsning af massespektrometridetektionen af HDX-mærkning er udfordringen med at opnå aminosyreopløsning. Mens "soft-fragmentation" teknikker, såsom elektronoverførselsdissociation (ETD), elektronindfangningsdissociation (ECD) og ultraviolet fotodissociation (UVPD), har vist sig at være effektive til at generere højere opløsninger, forbliver de udfordrende, uforudsigelige og ineffektive 30,43,44,45,46,47,48.

Sammenlignet med andre strukturelle teknikker har millisekund HDX-MS den unikke fordel at fange konformationsdynamikken i monomer aSyn ved høje strukturelle og tidsmæssige opløsninger. Da monomerens hurtige udvekslingskinetik ikke længere er en begrænsende faktor, kan yderligere undersøgelser udføres på monomer aSyn med forskellige mutationer, posttranslationelle modifikationer, saltkomponenter og koncentrationer og bindingspartnere ved fysiologisk pH. Korrelering af HDX-MS-resultaterne med funktionelle undersøgelser, såsom aggregeringskinetik og fibrilmorfologier, kan give indsigt i konforme, der enten fremmer normal cellulær funktion eller er sygdomsudsatte. I sidste ende forventes det, at et sådant millisekund HDX-MS kan være afgørende for at opdage målrettede lægemidler, der stabiliserer specifikke fysiologisk tolererede konforme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

NS er finansieret af University Council Diamond Jubilee Scholarship. JJP støttes af et UKRI Future Leaders Fellowship [Tilskudsnummer: MR / T02223X / 1].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column  Waters Corporation 186002346 Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv VWR 20060.420 For LC mobile phases
CaCl2 Sigma Aldrich C5670 Salt for HDX buffers
Chronos Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) 667006090 Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell
Deuterium chloride Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-2-50 For HDX labelling buffers
Deuterium oxide (99.9% D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-4 Deuterated water
DynamX 3.0 Waters Corporation 176016027 Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation
Enzymate BEH Pepsin Column Waters Corporation 186007233 Pepsin digestion column
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade Fisher Scientific 10596814 For LC mobile phases
Guanidinium hydrochloride Sigma Aldrich RDD001-500G Chaotrope/Denaturant
HDfleX University of Exeter N/A https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KCl Sigma Aldrich P3911 Salt for HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot Waters Corporation 725000637 Autosampler robot
Leucine enkephalin Waters Corporation 186006013 For mass spectrometry lockspray calibration.
MassLynx Waters Corporation 667004007 Software controlling inlet methods and mass spectrometer
Maximum recovery vials Waters Corporation 600000670CV 100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Salt for HDX buffers
Millipore 0.22 µm syringe filters Millipore N9CA7069B Syringe filters
ms2min Applied Photophysics Ltd N/A fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaCl Sigma Aldrich S9888 Salt for HDX buffers
Peltier temperature controller LEAP Technologies Inc. HP115-COOL/D Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.
ProteinLynx Global Server 3.0 Waters Corporation 715001030 Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.
Reagent pot caps Waters Corporation 186004632 100 pack
Reagent pots for LEAP HDX-2 Waters Corporation 186001420 100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-57 For HDX labelling buffers
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) Amicon (Merck Sigma Aldrich) UFC5003 Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.
Synapt G2-Si mass spectrometer Waters Corporation 176850035 Mass spectrometer
Total recovery vials Waters Corporation 600000671CV 100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253-250G Buffer
Trizma base Sigma Aldrich T60040-B2005 Buffer
Urea Sigma Aldrich U5378-1KG Chaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column  Waters Corporation 186004623 Trap desalting column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N. α-Synuclein misfolding and Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Molecular Basis of Disease. 1822 (2), 261-285 (2012).
  3. Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
  4. Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
  5. McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
  6. Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
  7. Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 1 240-255 (2015).
  8. Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
  9. Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820 (2020).
  10. Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
  11. Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712 (2018).
  12. Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
  13. Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
  14. Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. Biochemistry. 56 (31), 4064-4072 (2017).
  15. Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
  16. El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
  17. Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
  18. Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424 (2022).
  19. Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
  20. Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
  21. Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
  22. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
  23. Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
  24. Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  25. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
  26. Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer. New York. 571-607 (2005).
  27. Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
  28. Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
  29. Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
  30. Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
  31. Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
  32. Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
  33. Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
  34. Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
  35. Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. Biochemistry. 53 (43), 6849-6856 (2014).
  36. Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
  37. Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
  38. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
  39. Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
  40. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  41. Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
  42. Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
  43. Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
  44. Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
  45. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
  46. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  47. Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
  48. Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).

Tags

Neurovidenskab udgave 184 alfa-synuclein iboende lidelse millisekundhydrogen/deuteriumudvekslingsmassespektrometri dynamisk strukturbiologi
Millisekund hydrogen / deuterium-udveksling massespektrometri til undersøgelse af alfa-synuclein strukturel dynamik under fysiologiske forhold
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seetaloo, N., Phillips, J. J.… More

Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (184), e64050, doi:10.3791/64050 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter