Summary
يصف هذا البروتوكول الإجراء الخاص بقياس تركيزات ATP في تجويف المثانة في القوارض المخدرة.
Abstract
يعتقد أن ATP ، الذي يتم إطلاقه من الظهارة البولية استجابة لانتفاخ المثانة ، يلعب دورا حسيا مهما في التحكم في التبول. لذلك ، يعد القياس الدقيق لإطلاق ATP في الظهارة البولية في بيئة فسيولوجية خطوة أولى مهمة في دراسة الآليات التي تتحكم في الإشارات البيورينية في المثانة البولية. تستخدم التقنيات الحالية لدراسة إطلاق ATP البولية المستثارة ميكانيكيا الخلايا المستزرعة المطلية على دعامات مرنة أو أنسجة المثانة المثبتة في غرف Ussing ؛ ومع ذلك ، فإن كل من هذه التقنيات لا تحاكي تماما الظروف في المثانة السليمة. لذلك ، تم تطوير إعداد تجريبي لقياس تركيزات ATP مباشرة في تجويف المثانة البولية للقوارض.
في هذا الإعداد ، يتم ثقب مثانات القوارض المخدرة من خلال القسطرة في كل من قبة المثانة وعبر فتحة مجرى البول الخارجية. يتم زيادة الضغط في المثانة عن طريق تغطية قسطرة مجرى البول أثناء إدخال السائل المعقم في المثانة عبر القبة. يتم قياس الضغط داخل المثانة باستخدام محول ضغط متصل بقسطرة قبة المثانة ، على غرار الإعداد المستخدم لقياس المثانة. بمجرد الوصول إلى الضغط المطلوب ، تتم إزالة غطاء قسطرة مجرى البول ، ويتم جمع السوائل لقياس كمية ATP عن طريق مقايسة لوسيفيرين-لوسيفيراز. من خلال هذا الإعداد التجريبي ، يمكن استجواب الآليات التي تتحكم في كل من التحفيز الميكانيكي والكيميائي لإطلاق ATP الظهاري البولي عن طريق تضمين العديد من الناهضات أو الخصوم في perfusate أو عن طريق مقارنة النتائج بين الحيوانات البرية والمعدلة وراثيا.
Introduction
يعتقد أن الأدينوسين الثلاثي الفوسفات البولي يلعب دورا حسيا مهما في السيطرة على التبول1. على سبيل المثال ، يعتقد أن ATP يتم إطلاقه من الظهارة البولية استجابة للانتفاخ حيث يمكن أن يعمل على مستقبلات الأعصاب الواردة في المثانة لزيادة استثارتها ، مما يؤدي إلى الإحساس بالامتلاء2. وبالتالي ، يعتقد أيضا أن ATP البولي يمكن أن يكون لاعبا مهما في تطوير أمراض المثانة. لدعم هذه الفرضية ، تزداد تركيزات ATP البولية بشكل ملحوظ في المرضى الذين يعانون من فرط نشاط المثانة (OAB) 3 ، أو متلازمة آلام المثانة / التهاب المثانة الخلالي (BPS / IC) 4 ، أو عدوى المسالك البولية (UTI) 5,6 ، وجميع الحالات تتميز بزيادة الإلحاح والتكرار وأحيانا الألم. على العكس من ذلك ، فإن المرضى الذين يعانون من خمول المثانة (UAB) ، والذي يتميز بعدم القدرة على إفراغ المثانة ويمكن أن يشمل في بعض الأحيان انخفاض القدرة على الشعور بامتلاء المثانة ، قد ثبت أن لديهم تركيزات ATP البولية7. من الناحية التجريبية ، يمكن أن يؤدي التلاعب بتركيزات ATP البولية إلى تغيير ردود فعل المثانة في الفئران. يمكن أن تؤدي زيادة تركيزات ATP عن طريق منع ATPases الذاتية في تجويف المثانة إلى زيادة تكرار الإفراغ ، بينما يقلل تقليل تركيزات ATP عن طريق غرس ATPases الخارجية في المثانة من تردد الإفراغ8. وبالتالي ، فإن أهمية ATP البولية لوظيفة المثانة واضحة.
نظرا للأهمية الواضحة ل ATP البولي لأمراض المثانة ، فإن القياس الدقيق لإطلاق ATP الظهاري البولي هو خطوة مهمة في فهم الآليات التي تتحكم في الإطلاق. تم الانتهاء من العديد من الدراسات باستخدام نماذج تجريبية مختلفة لقياس إطلاق ATP الظهارة البولية. ومن أهم هذه الثقافات هي مزارع الخلايا ، إما الثقافات الأولية أو خطوط الخلايا. ومع ذلك ، فإن استخدام خلايا الظهارة البولية المستزرعة معقد بسبب حقيقة أن خلايا الظهارة البولية لا تأخذ مورفولوجيتها الفسيولوجية المستقطبة ما لم تزرع على أغشية نفاذة خاصة (مثل تقنية Transwell [إدخالات البئر])9. وبالتالي ، من الصعب ربط أي إطلاق ATP يقاس بعلم وظائف الأعضاء. يمكن لخلايا الظهارة البولية التي تنمو على إدخالات الآبار أن تستقطب وتشكل حاجزا مشابها لما يرى في الجسم الحي. ومع ذلك ، يمكن أن يستغرق نمو الظهارة البولية المتمايزة تماما أياما أو أسابيع. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أنه من الممكن تركيب إدخالات جيدة في غرفة Ussing والضغط على الجانب القمي لإحداث تمدد ، فمن الصعب تطبيق ضغط كاف لتقليد الظروف داخل المثانة أثناء علم الأمراض (أي ضغوط 30 سم H2O أو أعلى). يمكن أيضا تركيب أنسجة المثانة الكاملة في غرفة Ussing لإجراء تجارب التمدد ، ولكن هذا يزيل المثانة من الكائن الحي جنبا إلى جنب مع العوامل الغذائية التي تحافظ على صحة خلايا الظهارة البولية ، وبالتالي وظيفة حاجز الظهارة البولية. لذلك ، فإن الطريقة الأكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لدراسة إطلاق ATP من الظهارة البولية استجابة للتمدد أو الضغط هي في الجسم الحي. التقنيات الجراحية اللازمة لإعداد التجربة مماثلة لتلك المستخدمة عادة في قياس المثانة الحيوانية ، وبالتالي ، يجب أن يتم إجراؤها بسهولة من قبل أي شخص على دراية بهذه التقنية.
في هذا البروتوكول ، سنصف التقنية المستخدمة لفحص ATP اللمعي في إناث فئران Sprague Dawley التي تزن حوالي 200-250 جم ، حيث أن القسطرة عبر الإحليل الموضحة أدناه أسهل بكثير عند الإناث. ومع ذلك ، يمكن أيضا إجراء قسطرة عبر الإحليل في ذكور القوارض10. نظرا لأن القسطرة عبر الإحليل قد أجريت الآن في الفئران من كلا الجنسين أيضا11 ، يمكن بسهولة تكييف هذه التجارب مع الفئران أو الجرذان من أي من الجنسين أو بأحجام مختلفة ، اعتمادا على احتياجات فريق البحث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب أن تلتزم جميع الإجراءات التي يتم تنفيذها في القوارض بالإرشادات المعمول بها وأن تتم الموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة الأخلاقيات المؤسسية المحلية. أجريت التجارب التي أجريت لهذه المخطوطة وفقا لدليل المجلس الوطني للبحوث لرعاية واستخدام المختبر ووافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لكلية الطب بجامعة بيتسبرغ. انظر الشكل 1 للحصول على نسخة معدلة من إعداد قياس المثانة القياسي للقوارض المستخدم في هذا البروتوكول.
1. المختبر
- الحفاظ على الفئران في الإسكان الاجتماعي (القوارض المتعددة في قفص واحد) مع دورة الضوء / الظلام 12 ساعة والوصول إلى الماء وكريات الطعام.
2. التخدير والكتلة العقدية
- حث التخدير الأولي عن طريق وضع الحيوان في صندوق مغلق بالغاز مع 4٪ -5٪ إيزوفلوران في O2 (1 لتر / دقيقة).
- تخدير الحيوان باستخدام يوريتان.
- حقن يوريتان تحت الجلد بشكل ثنائي (1/2 جرعة على كل جانب من الحيوان) بجرعة 1.2 جم / كجم. ضع الحيوان في قفص للسماح لليوريتان بالتأثير ، والذي يستغرق عموما 2 ساعة.
- بدلا من ذلك ، يتم تطبيق يوريتان داخل الصفاق (i.p.) عن طريق حقن الجرعة الكاملة في جرعتين منفصلتين ~ 10 دقائق على حدة.
- بعد انتظار الوقت المناسب لتفعيل اليوريتان (s.c.: 2 ساعة ، أي ب: 30 دقيقة) ، اختبر مستوى التخدير المناسب عن طريق قرص قدم الحيوان باستخدام الملقط. في حال ملاحظة رد فعلي، يتم تطبيق جرعة إضافية من اليوريتان (0.05-0.1 مل i.p.)، وانتظر لمدة 15 دقيقة، ثم اختبر مرة أخرى. استمر في مراقبة الحيوان بحثا عن المستوى المناسب للتخدير طوال العملية.
- لمنع تقلص المثانة أثناء الانتفاخ ، قم بحقن الحيوان بعامل مانع عقدي ، مثل سداسي ميثانيوم (20 مجم / كجم ، أي ب).
- ضع مرهم العيون على عيون الحيوان لمنع الجفاف أثناء التجربة.
3. الإجراء الجراحي - قسطرة المثانة فوق العانة
- حلق بطن الحيوان وإجراء بضع البطن خط الوسط لفضح المثانة البولية.
- قم بإعداد قسطرة عن طريق إشعال أحد طرفي أنبوب PE50 الطبي بطول قصير (~ 10-15 سم) باستخدام اللهب. ضع إبرة 22 جم في الطرف الآخر من الأنبوب واملأها بمحلول كريبس (انظر جدول المواد للتكوين).
- ضع حلقة صغيرة من خياطة الحرير 3-0 فوق قبة المثانة وقم بإجراء فغر المثانة الصغير (باستخدام مقص دقيق أو إبرة 18 جرام) كبيرة بما يكفي لإدخال الطرف المتوهج للقسطرة المذكورة أعلاه. بيد واحدة تمسك القسطرة في مكانها ، استخدم اليد الأخرى لشد حلقة الخيط لتثبيت القسطرة في مكانها. قم بإنهاء تأمين القسطرة عن طريق ربط عقدتين في الخيط وسحب القسطرة للخلف حتى يتلامس الرأس المتوهج مع جدار المثانة.
- بدلا من ذلك ، قم بتأمين القسطرة باستخدام تقنية خياطة سلسلة المحفظة الكلاسيكية ، كما هو موضح سابقا لقياس المثانة12.
ملاحظة: من الضروري عدم إدخال فقاعات الهواء في المثانة أثناء هذا الإجراء.
- بدلا من ذلك ، قم بتأمين القسطرة باستخدام تقنية خياطة سلسلة المحفظة الكلاسيكية ، كما هو موضح سابقا لقياس المثانة12.
- اختبر الإعداد بحثا عن التسريبات عن طريق غرس كمية صغيرة من محلول كريبس من خلال القسطرة. إذا تسرب السائل من فغر المثانة، فأعد تأمين القسطرة بخياطة إضافية حول فغر المثانة.
4. قسطرة عبر الإحليل
- اغمس نهاية قسطرة IV مقاس 20 جم × 1 بوصة (مع إزالة الإبرة) في مادة تشحيم جراحية.
- أمسك صماخ مجرى البول الخارجي برفق باستخدام ملقط وأدخل طرف القسطرة في فتحة مجرى البول في اتجاه الذيل حتى يتسبب الطرف في تشوه جدار فتحة المهبل المجاورة. قم بتدوير القسطرة 90 درجة (مع تحريك طرف Luer-Lock للقسطرة نحو الذيل) وتقدم برفق. أدخل القسطرة بالكامل حتى يصبح محور Luer-Lock على بعد 5 مم تقريبا من فتحة مجرى البول الخارجية.
ملاحظة: لا تقم بإدخال القسطرة بعيدا جدا ، مما قد يتسبب في وخز الطرف للجدار الداخلي للمثانة. إذا شعرت بالمقاومة أثناء تقدم القسطرة ، فتوقف وابدأ من جديد أو خاطر بثقب مجرى البول. راجع قسم المناقشة حول نصائح لزيادة القسطرة الناجحة. - قم بتأمين القسطرة ومنع التسرب حول القسطرة عن طريق لف خياطة حريرية قصيرة الطول 3-0 حول صماخ مجرى البول الخارجي وربطها بإحكام. ثبت القسطرة على الذيل بشريط لاصق لمنع سحبها عن طريق الخطأ.
- بمجرد القسطرة ، قم بضخ محلول كريبس برفق في المثانة من خلال قسطرة المثانة فوق العانة وتأكد من أن السائل يتدفق من قسطرة مجرى البول وليس حوله. إذا لزم الأمر ، أعد خياطة حول فتحة مجرى البول الخارجية.
- أغلق شق البطن فوق المثانة باستخدام خياطة حريرية 3-0.
5. الإعداد التجريبي
- تأمين الحيوان على لوحة قادرة على أن تميل للمساعدة في تصريف السائل داخل المثانة من خلال قسطرة مجرى البول. ضع وسادة تدفئة ووسادة سفلية ماصة بين الحيوان واللوح للحفاظ على حرارة الجسم وامتصاص تصريف السوائل من قسطرة مجرى البول.
- قم بتوصيل القسطرة فوق العانة بمحبس ثلاثي الاتجاهات ، والذي يربط القسطرة بمضخة حقنة ومحول ضغط. قم بتوصيل محول الضغط بجهاز كمبيوتر عن طريق مكبر للصوت ونظام الحصول على البيانات.
ملاحظة: يجب توخي الحذر لمنع تكون فقاعات الهواء في الأنبوب الذي يربط مضخة المحقنة ومحول الطاقة وقسطرة المثانة. - قم بمعايرة تسجيل ضغط المثانة باستخدام الإجراء الذي اقترحته الشركة المصنعة لمحول الضغط و / أو برنامج الحصول على البيانات.
- قم ببث محلول كريبس من خلال القسطرة فوق العانة بمعدل 0.1 مل / دقيقة واترك السائل يستنزف من قسطرة مجرى البول لمدة ساعة واحدة لغسل أي ATP متبقي تم إطلاقه أثناء زرع القسطرة.
- بعد فترة الغسيل هذه ، قم بتغطية قسطرة مجرى البول باستخدام قابس Luer-Lock وقم بقياس الضغط في المثانة. ابحث عن ارتفاع بطيء في الضغط داخل المثانة إلى ضغط 30 سم H 2 O دون زيادة حادة فيالضغط ، مما يشير إلى تقلص المثانة (انظر الشكل 2). قم بإزالة القابس من قسطرة مجرى البول عندما يصل الضغط إلى 30 سم H2O لمنع تلف المثانة.
ملاحظة: في حال استمرار حدوث تقلصات المثانة بعد 1 ساعة، يتم إعطاء جرعة إضافية من سداسي ميثانيوم (جرعة 5 ملغ/كغ i.p.).
6. جمع العينات
- اغرس المثانة بمعدل 0.1 مل / دقيقة واجمع الشطف من قسطرة مجرى البول. اختبر 100 ميكرولتر من القسمة من الشطف على الفور ل ATP (انظر أدناه) أو قم بالتجميد لتحديد كمية الدفعة اللاحقة.
- لاختبار تأثير انتفاخ المثانة على تركيزات ATP اللمعية ، قم بتغطية قسطرة مجرى البول بالسدادة ومراقبة ضغط المثانة حتى تصل إلى المستوى المطلوب. بعد ذلك ، قم بفك غطاء قسطرة مجرى البول وجمع الشطف لقياس ATP أو تجميده ، كما هو موضح أعلاه.
- بعد كل انتفاخ ، اترك المثانة ترتاح وتغسل لمدة 10-15 دقيقة قبل أخذ عينات إضافية. خذ ما مجموعه 3-5 عينات predistension و 3-5 عينات في كل ضغط انتفاخ المطلوب لإثبات التكرار.
- لاختبار تأثير الأدوية على إطلاق ATP ، قم بتبديل محلول كريبس الذي يغرس المثانة إلى كريبس الذي يحتوي على الدواء المفضل. استخدم 0.1 مل / دقيقة لمدة 10-15 دقيقة حتى يكون للدواء تأثير ، ثم اجمع العينات من المثانة غير المنتفخة والمنتفخة كما هو موضح في الخطوتين 6.1 و 6.2.
7. قياس ATP من العينات التي تم جمعها
- حدد كمية ATP في عينات 100 ميكرولتر التي تم جمعها باستخدام مجموعة مقايسة لوسيفيرين / لوسيفيراز المتاحة تجاريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة ومقياس الإنارة.
- لتحديد كمية ATP ، اجمع عينات 100 ميكرولتر من البيرفوسات مع 50 ميكرولتر من مزيج الفحص وضعها في مقياس الإنارة للقراءة. لتحويل وحدات الضوء النسبي (RLUs) التي أبلغ عنها مقياس الإنارة إلى تركيز ATP ، قم بعمل تخفيفات تسلسلية ل ATP في محلول كريبس تتراوح من 1 ميكرومتر إلى 10 pM في تخفيفات 10 أضعاف لإنشاء منحنى قياسي وقراءتها في مقياس الإنارة. ارسم القراءات الناتجة على رسم بياني وقم بإجراء انحدار غير خطي (تربيعي) لاستقراء التركيزات من العينات المأخوذة من الحيوان.
ملاحظة: من المهم وضع معايير ATP لأي محلول دوائي تم اختباره في التجربة ، حيث تتداخل العديد من الأدوية مع تفاعل لوسيفيرين / لوسيفيراز ، والذي يجب تصحيحه.
- لتحديد كمية ATP ، اجمع عينات 100 ميكرولتر من البيرفوسات مع 50 ميكرولتر من مزيج الفحص وضعها في مقياس الإنارة للقراءة. لتحويل وحدات الضوء النسبي (RLUs) التي أبلغ عنها مقياس الإنارة إلى تركيز ATP ، قم بعمل تخفيفات تسلسلية ل ATP في محلول كريبس تتراوح من 1 ميكرومتر إلى 10 pM في تخفيفات 10 أضعاف لإنشاء منحنى قياسي وقراءتها في مقياس الإنارة. ارسم القراءات الناتجة على رسم بياني وقم بإجراء انحدار غير خطي (تربيعي) لاستقراء التركيزات من العينات المأخوذة من الحيوان.
8. القتل الرحيم للحيوانات
- عند اكتمال التجربة وجمع جميع العينات ، قم بالقتل الرحيم للحيوان وفقا لإرشادات وزارة الزراعة الأمريكية ودليل المجلس الوطني للبحوث لرعاية واستخدام المختبر.
- قم بإزالة الحيوان المخدر من الإعداد التجريبي ، وضعه في صندوق مغلق ، وقم بالغاز بغاز 100٪ CO2. تأكد من أن معدل التعبئة يساوي 30٪ -70٪ من حجم الحجرة في الدقيقة (على سبيل المثال ، 3-7 لتر / دقيقة لصندوق بحجم 10 لتر). استمر في تدفق CO2 لمدة 1 دقيقة على الأقل بعد توقف التنفس.
- استخدم شكلا ثانويا من القتل الرحيم لضمان الموت.
- إجراء بضع الصدر كشكل ثانوي من القتل الرحيم عن طريق الإمساك بالسديلة الصغيرة من الجلد في الطرف الذيلي من القص وقطع ثقب صغير في الجلد والعضلات في الحجاب الحاجز مع زوج حاد من المقص. أكمل بضع الصدر عن طريق إدخال المقص في الفتحة والقطع بشكل دائري من خلال القفص الصدري وكشف التجويف الصدري.
ملاحظة: يجب التخلص من الحيوان الرحيم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
- إجراء بضع الصدر كشكل ثانوي من القتل الرحيم عن طريق الإمساك بالسديلة الصغيرة من الجلد في الطرف الذيلي من القص وقطع ثقب صغير في الجلد والعضلات في الحجاب الحاجز مع زوج حاد من المقص. أكمل بضع الصدر عن طريق إدخال المقص في الفتحة والقطع بشكل دائري من خلال القفص الصدري وكشف التجويف الصدري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح البروتوكول الموصوف بالقياس الدقيق لإطلاق ATP في الجسم الحي من تجويف المثانة ، باستخدام نسخة معدلة من إعداد قياس المثانة القياسي للقوارض (انظر الشكل 1). هذا يسمح للباحث بفحص آثار الأدوية على إطلاق ATP بوساطة التمدد في بيئة فسيولوجية.
الشكل 1: الإعداد التجريبي. (أ) صورة توضح الإعداد التجريبي، مع تسمية المعدات المختلفة. مساحة الحيوان الموضحة في مستطيل أحمر موضحة بالحرف (ب). (ب) صورة فوتوغرافية تصور بطن الجرذ بعد الجراحة. لاحظ القسطرة فوق العانة التي يتم إدخالها وربطها في قبة المثانة ، وكذلك قسطرة مجرى البول التي يتم إدخالها من خلال الفتحة الخارجية. يتم توصيل قسطرة مجرى البول في الصورة لإظهار أن ضغط المثانة يزداد أثناء التروية من خلال قسطرة المثانة. أثناء التجربة ، سيتم خياطة فتحة البطن مغلقة ، ولكن تم تركها مفتوحة هنا للسماح بتصور المثانة البولية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
من الأهمية بمكان للقياس الناجح لإطلاق ATP بوساطة التمدد في مثانة القوارض التأكد من انسداد منعكس التبول ، مما يسمح بانتفاخ المثانة إلى ما بعد ضغط العتبة الكافي عادة لتنشيط منعكس التبول. كما هو موضح في الشكل 2 أ، عند توصيل قسطرة مجرى البول، يؤدي تسريب المحلول إلى المثانة إلى ارتفاع الضغط داخل المثانة بشكل حاد مع انقباض المثانة. نظرا لأننا مهتمون بتأثيرات التمدد السلبي ، وليس الانكماش ، على إطلاق ATP الظهاري البولي، يتم التعامل مع الحيوان باستخدام مانع عقدي، سداسي ميثانيوم، لمنع منعكس التبول. كما يتضح من الشكل 2 ب ، عند إعطاء سداسي الميثونيوم ، يؤدي تقطير المحلول في المثانة مع انسداد قسطرة مجرى البول إلى ارتفاع تدريجي أكثر بكثير في الضغط داخل المثانة ، مما يسمح للضغوط بالارتفاع حتى 30 سم H2O دون انكماش. يسمح ذلك بقياس إطلاق ATP اللمعي عند ضغوط عالية بما يكفي لتكون ذات صلة بعلم الأمراض ، مثل تلك التي لوحظت في المثانة غير النشطة ، أو انسداد مخرج المثانة الجزئي ، أو أثناء خلل التآزر بين النافصة والعضلة العاصرة بعد إصابة الحبل الشوكي. في حين أنه قد يتطلب جرعة تكميلية من سداسي ميثانيوم لمنع منعكس التبول تماما ، يجب توخي الحذر لعدم إعطاء ما يكفي لينتج عنه جرعة زائدة. هذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض كبير في النتاج القلبي ويضر بجودة التجربة. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن الحصول على نفس التأثير المثبط على منعكس المثانة إما عن طريق قطع أعصاب الحوض بشكل ثنائي أو قطع الحبل الشوكي عند المستوى L4 أو أعلى. هذا ، بالطبع ، يزيد من صعوبة الإعداد التجريبي والوقت اللازم لإكمال التجربة ، بشكل كبير.
الشكل 2: تسجيلات الضغط من الفئران. قبل (أ) وبعد (ب) الإحصار العقدي. تشير الأسهم إلى وقت توصيل قسطرة مجرى البول. لاحظ أن الضغط في التتبع العلوي يزداد بسرعة عندما يصل الضغط إلى العتبة للحث على التبول ، بينما يرتفع الضغط في التتبع السفلي تدريجيا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
هناك اعتبار آخر مهم جدا لهذه التجارب وهو ضمان التحويل الصحيح لقراءات مقياس الإنارة (التي يتم التعبير عنها عادة في RLUs) إلى تركيز ATP باستخدام منحنيات قياسية. تفاعل لوسيفيرين / لوسيفيراز عرضة جدا لعوامل التدخل13. يمكن أن يأتي هذا التداخل من التفاعل المباشر مع لوسيفيرين / لوسيفيراز. على سبيل المثال ، يمكن أن يعمل عدد من المركبات كمثبطات تنافسية أو غير تنافسية للوسيفيراز. اقترحت إحدى الدراسات أن ~ 3٪ من المركبات في مستودع الجزيئات الصغيرة للمكتبات الجزيئية يمكن أن تمنع لوسيفيراز اليراع بتركيزات أقل من 11 ميكرومتر14. علاوة على ذلك ، فإن لوسيفيرين عرضة للعوامل المؤكسدة ، مما يقلل من كمية الركيزة المتاحة للتفاعل المنتج للتلألؤ15. من الممكن أيضا التدخل في تفاعل لوسيفيرين / لوسيفيراز عن طريق تغيير توافر العامل المساعد للتفاعل ، المغنيسيوم. على سبيل المثال ، تتمثل إحدى التقنيات الشائعة لمحاكاة التمدد الميكانيكي في تجارب ATP في المختبر في إحداث تورم الخلايا عن طريق تقليل الأسمولية للمحلول المزايد. ومع ذلك ، فإن العديد من الباحثين ينجزون هذا التخفيض عن طريق تخفيف المحلول بالماء ، مما يقلل من تركيز المغنيسيوم المتاح للعمل كعامل مساعد في تفاعل لوسيفيرين / لوسيفيراز. بالإضافة إلى ذلك ، تباع بعض الأدوية كأملاح المغنيسيوم ، والتي يمكن أن تزيد بشكل كبير من كمية المغنيسيوم في المحلول ، مما يؤدي أيضا إلى اختلافات قابلة للقياس في قراءات التلألؤ. أخيرا ، من الممكن أن يتداخل محلول الدواء مع القدرة على قياس الضوء الناتج عن تفاعل لوسيفيرين / لوسيفيراز بدقة. Brilliant Blue FCF (BB-FCF ، المعروف أيضا باسم erioglaucine أو FD&C Blue dye # 1) هو مثبط محدد لإطلاق ATP بوساطة pannexin16. عند الجرعات الفعالة ، يحتوي محلول Brilliant Blue FCF على لون أزرق مميز ، يمتص الضوء عند ذروة تبلغ حوالي 600 نانومتر17. هذا ضمن نطاق الأطوال الموجية للضوء المنبعث من اليراع لوسيفيراز. لذلك ، يتم تقليل انبعاث الضوء في التجارب مع BB-FCF بشكل كبير. وبالتالي ، من الضروري استخدام المنحنيات القياسية باستخدام كميات معروفة من ATP المذابة في المحاليل التي تحتوي على كل دواء تجريبي لتحديد كمية إطلاق ATP أثناء التجربة. كما هو موضح في الشكل 3 ، يقلل BB-FCF (100 ميكرومتر) بشكل كبير من ميل المنحنى القياسي ، وهو ما يكفي لتغيير القيم المحسوبة بشكل كبير لتركيز ATP في العينة. كما هو موضح في الجزء السفلي من الشكل 3 ، يمكن أن يؤدي استخدام معيار كريبس لحساب تركيز ATP في عينة تحتوي على BB-FCF إلى تقليل تقدير تركيز ATP بنسبة ~ 50٪. في بعض الحالات ، قد يؤدي استخدام منحنى قياسي خاطئ إلى حجب التغيير بوساطة الدواء في إطلاق ATP ، أو جعله يبدو بشكل خاطئ كما لو حدث تغيير. في التجربة الموضحة في الشكل 3 ، على سبيل المثال ، كان من شأن استخدام معيار كريبس لجميع العينات أن يجعل الأمر يبدو أن Brilliant Blue FCF قلل من إطلاق ATP بنسبة ~ 67٪ (16.6 إلى 5.5 نانومتر) عندما ، في الواقع ، انخفض فقط ~ 42٪ (16.6 إلى 9.6 نانومتر).
الشكل 3: تأثيرات الأدوية التجريبية على منحنى ATP القياسي. لاحظ أن مضاد قناة pannexin ، Brilliant Blue ، يغير بشكل كبير RLUs المقاسة لأي تركيز معين من ATP ، مما قد يؤدي إلى التقليل من تقدير ATP المقاس ، إذا لم يتم تصحيحه. اختصار: RLUs = وحدات الضوء النسبي ؛ BB-FCF = FCF الأزرق اللامع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
أحد الاعتبارات الأخرى التي يجب وضعها في الاعتبار هو أن ATP يتم إطلاقه عادة من الأنسجة نتيجة للتلف ، وأن هذه الإجراءات الجراحية وإدخال قسطرة مجرى البول ستؤدي إلى قراءات ATP عالية بشكل غير طبيعي إذا تم تناولها بعد وقت قصير جدا من الإعداد. يصف هذا الإجراء فترة غسل 1 ساعة بعد إعداد التجربة ، والتي لا ينبغي تخطيها. لقد وجدنا أنه بعد 1 ساعة ، تكون تركيزات ATP المقاسة في العينات المأخوذة عندما لا تكون المثانة منتفخة منخفضة نسبيا (~ 10-30 نانومتر) بينما يمكن للعينات المأخوذة قبل فترة الغسيل قراءة ترتيب أعلى من حيث الحجم. يجب أيضا إجراء عمليات غسل قصيرة لمدة 5 دقائق بين الانتفاخات حيث يمكن أن تظل مستويات ATP مرتفعة لفترة قصيرة. من القواعد الأساسية الجيدة قياس جزيء ATP في عينات متعددة في بداية التجربة وبعد كل انتفاخ والمضي قدما فقط عند تسوية قراءات ATP. في الشكل 4، نوضح تمثيلا لتجربة نموذجية مع قياسات مأخوذة في نقاط زمنية مختلفة. لاحظ القراءات العالية المأخوذة قبل الغسيل (العينات #1 و #5) مقابل تلك المأخوذة بعد الغسيل (العينات #2 و #6).
الشكل 4: تمثيل تجربة نموذجية. تمثيل منمق لتسجيل ضغط نموذجي. يمثل كل رقم نقطة زمنية تم فيها أخذ عينة وقياسها ل ATP: 1) مباشرة بعد اكتمال الإعداد ، قبل فترة الغسيل ، 2) بعد فترة غسل لمدة ساعة واحدة ، 3) قبل الانتفاخ مباشرة ، 4) أثناء الانتفاخ ، 5) مباشرة بعد الانتفاخ ، و 6) بعد فترة غسل قصيرة بعد الانتفاخ. يوضح الجدول الداخلي قيم RLU التمثيلية وتركيزات ATP لكل عينة. اختصار: RLUs = وحدات الضوء النسبية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
يوضح الشكل 5 تمثيلات بيانية تمثيلية للنتائج التجريبية التي تفحص آلية إطلاق ATP من الظهارة البولية. كما هو موضح في الشكل 5 أ ، تؤدي زيادة الضغط إلى زيادة كبيرة في تركيز ATP في تجويف المثانة ، مع ضغوط 30 سم من الماء تزيد من تركيزات ما يقرب من 2.5x من الضوابط غير المنتفخة. التروية داخل المثانة من 2 وحدة / مل من أبيراز ، وهو إنزيم يحفز التحلل المائي ل ATP ، يقلل بشكل كبير من التركيز المقاس ل ATP في تجويف المثانة. على العكس من ذلك ، فإن التروية داخل المثانة ل ARL67156 ، وهي مثبطة ل NTPDases الموجودة على الظهارة البولية ، تزيد بشكل كبير من تركيزات ATP اللمعية. يوضح الشكل 5B التجارب التي أجريت على آلية إطلاق ATP المستحث بالتمدد من الظهارة البولية. التروية مع مضادات قناة pannexin Brilliant Blue FCF (BB-FCF ، 100 ميكرومتر) أو كاربينوكسولون (CBX ، 100 ميكرومتر) يقلل بشكل كبير من إطلاق ATP في تجويف المثانة في جميع الضغوط. لا تتضاءل تركيزات ATP اللمعية عندما يتم استخدام مانع connexin 18α-glycyrrhetinic acid ، مما يشير إلى أن إطلاق ATP المستحث بالانتفاخ يتم بوساطة قنوات pannexin وليس قنوات connexin.
الشكل 5: قياسات تمثيلية لإطلاق الأدينوسين الثلاثي الفوسفات المستحث بالانتفاخ في تجويف المثانة البولية. (أ) يزيد انتفاخ المثانة من تركيزات ATP اللمعية ، والتي يمكن أن تتضاءل في وجود NTPDase apyrase (2 وحدة / مل) أو تزداد عند تثبيط NTPDasesare الداخلي مع ARL67156 (10 μM). (B) يتم حظر إطلاق ATP الناجم عن الانتفاخ بواسطة مضادات قناة pannexin Brilliant Blue FCF (BB-FCF ، 100 ميكرومتر) وكاربينوكسولون (CBX ، 100 ميكرومتر) ولكن ليس مضاد قناة connexin 18α-glycyrrhetinic acid (18α-GA ، 50 ميكرومتر). يتم تقديم البيانات كمتوسط مع أشرطة الخطأ القياسية. ** p < 0.05 بين الشريطين المشار إليهما بالخط ، ## p < 0.05 مقارنة بضوابط كريبس عند نفس الانتفاخ. أعيد طبع هذا الرقم بإذن من Beckel et al.8. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم إجراء غالبية الأبحاث حول إطلاق ATP في الخلايا المستزرعة ، باستخدام إما خطوط الخلايا الخالدة أو الثقافات الأولية لخلايا الظهارة البولية القوارض. في حين أن هذه النماذج لها ميزة كونها إنتاجية عالية نسبيا (أي أن مزرعة / ممر واحد يمكن أن يصنع العديد من الأطباق / أطباق الخلايا) ، فإن أهميتها الفسيولوجية تتضاءل بسبب: 1) عدم قدرة خلايا الظهارة البولية على النمو مستقطبة ما لم تزرع على دعامات خاصة و 2) صعوبة تعريض الخلايا المستزرعة لمستويات فسيولوجية من التمدد / الضغط. تتمثل إحدى طرق التعامل مع هذه القيود في إزالة المثانة من القوارض ، وفتحها ، ووضعها في غرفة Ussing ، وإدخال أنسجة المثانة بين غرفتين نصفيتين مملوءتين بمحلول فسيولوجي. هذا يسمح للباحث بإخضاع الظهارة البولية ، في حالتها المستقطبة الأصلية ، للانتفاخ عن طريق إضافة حجم إلى الجانب البولي من الغرفة ، مما يتسبب في تمدد أنسجة المثانة في الغرفة. ومع ذلك ، من الصعب ربط هذا الامتداد بالانتفاخ الذي تراه الظهارة البولية في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، يتم إطلاق ATP المستحث بالانتفاخ في غرفة Ussing في الحجم الكبير من السائل الفسيولوجي الموجود في الغرفة ، مما يخفف من تركيز ATP عدة أضعاف. باستخدام هذا الإجراء ، يتم قياس ضغط المثانة مباشرة ، بحيث يمكن الحفاظ على الانتفاخ في نطاق ذي صلة بعلم وظائف الأعضاء أو الفيزيولوجيا المرضية. علاوة على ذلك ، نظرا لأننا نقيس تركيز ATP مباشرة من السائل اللمعي وليس من كمية عشوائية ومفرطة من السوائل المستخدمة للحفاظ على الأنسجة في المختبر ، فلا يلزم تصحيح التركيز المقاس. وبالتالي ، فإن الإجراء الموصوف في هذه الورقة يسمح للباحث بفحص إطلاق ATP في تجويف المثانة في ظل ظروف تشبه إلى حد كبير الظروف الفسيولوجية أو الفيزيولوجية المرضية للمثانة.
تشبه التقنية الموصوفة إلى حد كبير تقنيات قياس المثانة القياسية المستخدمة لدراسة آثار الأدوية على نشاط المثانة المنعكسة ويجب تنفيذها بسهولة من قبل أي شخص يقوم بإجراء هذه التجارب بشكل روتيني. بالنسبة لأولئك الباحثين الجدد في قسطرة المثانة ، هناك بعض المحاذير التي يجب أن تكون على دراية بها. أولا ، قد تكون القسطرة عبر الإحليل صعبة على عديمي الخبرة بسبب انحناء مجرى البول القوارض. يمكن أيضا أن يصبح هذا أكثر صعوبة بسبب ضيق العضلة العاصرة للإحليل الخارجية ، حتى تحت تخدير اليوريتان. من الضروري ألا يحاول الباحث إجبار القسطرة على دخول مجرى البول ، لأنه من المرجح أن يسبب زيادة الالتهاب والتورم ، مما سيجعل مجرى البول أكثر صعوبة في القسطرة بنجاح. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن كزة القسطرة من خلال جدار مجرى البول ، مما يؤدي إلى تدمير التجربة بأكملها.
لقد طورنا بعض النصائح والحيل لزيادة معدل النجاح. على سبيل المثال ، من الضروري في بعض الأحيان إعطاء الحيوان جرعة قصيرة أخرى من إيزوفلوران المستنشق (0.5٪ -1.0٪) لإرخاء العضلة العاصرة للإحليل. يجب أن يتم ذلك باعتدال وبحذر ، لأن الجمع بين اليوريتان والإيزوفلوران يمكن أن يؤدي إلى اكتئاب الجهاز التنفسي. خدعة أخرى هي غمس طرف القسطرة في محلول يدوكائين 2٪ قبل إدخاله في فتحة مجرى البول الخارجية. سيؤدي هذا غالبا إلى استرخاء العضلة العاصرة بعد بضع دقائق. إفراغ المثانة عن طريق الضغط بلطف على بطن الحيوان يمكن أن يساعد أيضا على استرخاء العضلة العاصرة مجرى البول. أخيرا ، قد يكون من الضروري استخدام قسطرة قياس أصغر. نستخدم أحيانا قسطرة 24 G ، خاصة مع الحيوانات الصغيرة. ومع ذلك، ضع في اعتبارك أنه قد يكون من الضروري تقليل معدل التسريب في المثانة عند استخدام قسطرة عبر الإحليل ذات مقياس أصغر، لتتناسب مع التصريف البطيء من قسطرة مجرى البول. قد يؤدي عدم القيام بذلك إلى ارتفاع ضغط المثانة ، على الرغم من عدم تغطية قسطرة مجرى البول.
تجدر الإشارة إلى أن يوريتان يستخدم كمخدر في هذا البروتوكول. يستخدم اليوريتان بشكل شائع في المختبرات التي تدرس المسالك البولية السفلية ، لأنه يجنب منعكس التبول بينما لا يفعل التخدير الآخر. وبسبب هذا ، فإن انتفاخ المثانة فوق ضغط ~ 7-10 سم H2O تحت تخدير اليوريتان سيؤدي إلى رد فعل التبول. نظرا لأننا مهتمون بإطلاق ATP استجابة للانتفاخ السلبي ، فإن هذا البروتوكول يدعو إلى منع تقلصات المثانة باستخدام حاصرات عقدية hexamethonium. يسمح ذلك بقياس إطلاق ATP استجابة للضغوط داخل المثانة الأعلى (أي 30 سم H2O) الشائعة في أمراض المثانة التي تنطوي على انسداد المخرج. لذلك ، فإن استخدام يوريتان / سداسي ميثانيوم يسمح بقياس إطلاق ATP اللمعي الناجم عن الانتفاخ لفترات طويلة من الزمن (يتم قياس مدة عمل كلا العقارين بالساعات). ومع ذلك ، قد تفضل بعض المختبرات استخدام مخدر لا يدخر منعكس التبول ، مثل الكيتامين ، ويزيل الحاجة إلى حاصرات العقدة. سيعمل هذا أيضا بشكل جيد لهذا الإجراء ، على الرغم من أنه سيتطلب إدارة أكثر تكرارا (أو مستمرة) بسبب قصر مدة عمل المخدر.
أحد الاختلافات الجديرة بالملاحظة بين هذه التقنية لقياس ATP وإعداد قياس المثانة الشائع الذي قد يكون باحثو المسالك البولية على دراية به هو استخدام محلول كريبس المخزن كمحلول ملحي متساوي التوتر قياسي. ATP هو جزيء قابل للذوبان إلى حد ما ويستقر إلى حد ما في محلول مخزن. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تكوين محلول كريبس أقرب بكثير إلى تكوين البول منه إلى محلول ملحي ، مما يضيف أهمية سريرية لهذه التجارب. هذا اعتبار مهم ، حيث ثبت أن التحكم في إطلاق ATP في الظهارة البولية يتم تعديله بواسطة قنوات نفاذية الكالسيوم ، وقد يؤثر نقص الكالسيوم في المحلول الملحي الطبيعي سلبا على إطلاق ATP. عدم استقرار ATP في المحلول هو أيضا السبب في أننا نقترح أن يتم قياس العينات على الفور باستخدام تفاعل لوسيفيرين-لوسيفيراز. ومع ذلك ، إذا كان الباحث غير قادر على قراءة العينات على الفور ، فيجب تجميد العينات في أسرع وقت ممكن للحد من تدهور ATP.
أحد قيود هذه التقنية هو أنها تقيس فقط إطلاق ATP اللمعي ولا يمكنها قياس إطلاق ATP من الجانب المصلي من الظهارة البولية. ويعتقد أن ATP يتم تحريره من الجانب المصلي للتأثير بشكل مباشر على استثارة الواردة. ومع ذلك ، فإن القياس المباشر لهذا الإصدار صعب. في هذه الحالة ، فإن استخدام الخلايا المزروعة على دعامات غشائية قابلة للاختراق مثل ألواح Transwell أو إزالة الظهارة البولية جراحيا لتجارب غرفة Ussing هي التقنية المفضلة. ومع ذلك ، نظرا للأهمية الواضحة ل ATP اللمعي في أمراض المثانة ، فإن هذا النموذج التجريبي هو أداة مفيدة لتوضيح الآليات الخلوية التي تتحكم في إطلاق ATP في الظهارة البولية أثناء علم الأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) إلى JMB (DK117884).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
References
- Burnstock, G. Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease. Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).
- Birder, L. A.
- Silva-Ramos, M., et al. Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome. PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).
- Sun, Y., Chai, T. C. Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).
- Gill, K., et al. Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms. BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).
- Säve, S., Persson, K. Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract. Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).
- Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release. Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).
- Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).
- Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. Transurethral instillation procedure in adult male mouse. Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).
- Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).
- Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C.
- Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays. ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).
- Harvey, E. N. Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence. Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).
- Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection. Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).
