Summary
このプロトコルは、麻酔をかけたげっ歯類の膀胱の内腔におけるATP濃度を測定するための手順を説明しています。
Abstract
膀胱膨満に応答して尿路上皮から放出されるATPは、排尿の制御において重要な感覚的役割を果たすと考えられている。したがって、生理学的設定での尿路上皮ATP放出の正確な測定は、膀胱内のプリン作動性シグナル伝達を制御するメカニズムを研究する上で重要な最初のステップです。機械的に誘発される尿路上皮ATP放出を研究するための既存の技術は、柔軟な支持体またはUssingチャンバーに固定された膀胱組織に播種された培養細胞を利用します。ただし、これらの各手法は、無傷の膀胱の状態を完全にはエミュレートしません。したがって、げっ歯類の膀胱の内腔におけるATP濃度を直接測定するための実験装置が開発された。
この設定では、麻酔をかけたげっ歯類の膀胱は、膀胱の ドームと外 尿道開口部の両方のカテーテルを介して灌流されます。膀胱内の圧力は、尿道カテーテルをキャップしながら、ドームを介して滅菌液を膀胱に灌流することによって増加します。膀胱内圧の測定は、膀胱測定に使用されるセットアップと同様に、膀胱ドームカテーテルに取り付けられた圧力トランスデューサを使用して行われます。所望の圧力に達すると、尿道カテーテルのキャップが取り外され、ルシフェリン-ルシフェラーゼアッセイによるATP定量のために液体が収集されます。この実験セットアップを通じて、尿路上皮ATP放出の機械的および化学的刺激の両方を制御するメカニズムは、灌流液にさまざまなアゴニストまたはアンタゴニストを含めることによって、または野生型動物と遺伝子組み換え動物の結果を比較することによって調べることができます。
Introduction
尿中ATPは、排尿の制御において重要な感覚的役割を果たすと考えられています1。例えば、ATPは膨満に応答して尿路上皮から放出され、膀胱求心性神経の受容体に作用して興奮性を高め、満腹感をもたらすと考えられています2。したがって、尿中ATPは膀胱病変の発症において重要なプレーヤーである可能性があるとも考えられています。この仮説を支持するために、尿中ATP濃度は、過活動膀胱(OAB)3、膀胱痛症候群/間質性膀胱炎(BPS / IC)4、または尿路感染症(UTI)5,6に苦しむ患者で有意に増加します。逆に、膀胱を空にすることができないことを特徴とし、時には膀胱の満腹感を感知する能力の低下を含むことがある低活動膀胱(UAB)に苦しむ患者は、尿中ATP濃度が低下していることが示されています7。実験的には、尿中ATP濃度の操作はラットの膀胱反射を変化させる可能性があります。膀胱内腔の内因性ATPアーゼを遮断することによってATP濃度を増加させると排尿頻度を増加させることができ、一方、外因性ATPアーゼを膀胱に注入することによってATP濃度を低下させると排尿頻度が低下する8。したがって、膀胱機能に対する尿中ATPの重要性は明らかである。
膀胱病理に対する尿中ATPの明らかな重要性を考えると、尿路上皮ATP放出の正確な測定は、放出を制御するメカニズムを理解する上で重要なステップです。尿路上皮ATP放出を測定するために、異なる実験モデルを用いて多くの研究が完了している。これらの中で最も重要なのは、初代培養または細胞株のいずれかの細胞培養です。しかし、培養尿路上皮細胞の使用は、特殊な透過性膜(Transwell技術[ウェルインサート]など)で増殖させない限り、尿路上皮細胞が生理学的分極形態をとらないという事実によって複雑になります9。したがって、測定された任意のATP放出を生理学に関連付けることは困難である。ウェルインサート上で増殖した尿路上皮細胞は分極し、 in vivoで見られるものと同様の障壁を形成する可能性があります。ただし、完全に分化した尿路上皮の成長には数日から数週間かかる場合があります。さらに、ウッシングチャンバーにウェルインサートを取り付け、頂端側に圧力を加えて伸張させることは可能ですが、病理学中に膀胱内の状態を模倣するのに十分な圧力(すなわち、30 cm H2O以上の圧力)を適用することは困難です。膀胱組織全体をストレッチ実験のためにUssingチャンバーに取り付けることもできますが、これにより、尿路上皮細胞の健康、したがって尿路上皮バリア機能を維持する栄養因子とともに、膀胱が生物から除去されます。したがって、伸張または圧力に応答した尿路上皮からのATPの放出を研究するための最も生理学的に関連性のある方法は in vivoである。実験のセットアップに必要な外科的技術は、動物の膀胱測定で一般的に使用されるものと同じであるため、その技術に精通している人なら誰でも簡単に実行できるはずです。
このプロトコルでは、以下で説明する経尿道的カテーテル法は女性の方がはるかに簡単であるため、体重約200〜250 gの雌Sprague Dawleyラットの管腔ATPを調べるために使用される技術について説明します。しかしながら、経尿道的カテーテル法は、雄のげっ歯類10においても行うことができる。経尿道的カテーテル法は現在、男女両方のマウスでも行われているため11、これらの実験は、研究チームのニーズに応じて、性別またはさまざまなサイズのマウスまたはラットに簡単に適応させることができます。
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Protocol
げっ歯類で行われるすべての手順は、該当するガイドラインに準拠し、地元の施設倫理審査委員会によって承認されなければなりません。この原稿のために行われた実験は、実験動物の世話と使用のための全米研究評議会のガイドに従って実施され、ピッツバーグ大学医学部の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されました。このプロトコルで使用される標準的なげっ歯類の膀胱測定セットアップの修正バージョンについては 、図1 を参照してください。
1.実験動物
- ラットを公営住宅(1つのケージに複数のげっ歯類)で維持し、12時間の明暗サイクルと水と食物ペレットへの 自由 アクセスを維持します。
2.麻酔と神経節ブロック
- 動物をO2 (1 L / min)の4%-5%イソフルランでガスを飲んだ密閉ボックスに入れることにより、初期麻酔を誘発します。.
- ウレタンを使用して動物を麻酔します。
- ウレタンを両側に皮下注射します(動物の両側に1/2用量)1.2 g / kgの用量で。動物をケージに入れてウレタンを有効にし、通常2時間かかります。
- あるいは、ウレタンを腹腔内(i.p.)に投与し、全用量を2回~10分間隔で注射します。
- ウレタンが効くのに適切な時間(s.c.:2時間、i.p.:30分)を待った後、鉗子を使用して動物の足をつまんで適切な麻酔面をテストします。反射が観察された場合は、追加用量のウレタン(0.05〜0.1 mL i.p.)を投与し、15分間待ってから再度テストします。.手順全体を通して、適切な麻酔面について動物を監視し続けます。
- 膨張中の膀胱の収縮を防ぐために、ヘキサメトニウム(20 mg / kg、i.p.)などの神経節遮断剤を動物に注射します。.
- 実験中の乾燥を防ぐために、動物の目に眼科用軟膏を塗布します。
3.外科的処置-恥骨上膀胱カテーテル法
- 動物の腹部を剃り、正中線開腹術を行って膀胱を露出させます。
- 炎を使用して、短い長さ(~10-15 cm)のPE50イントラメディックチューブの一端をフレアすることにより、カテーテルを準備します。チューブのもう一方の端に22Gの針を置き、クレブス溶液で満たします(組成については 材料表 を参照)。
- 膀胱のドームの上に3-0シルク縫合糸の小さなループを置き、上記のカテーテルのフレアエンドを挿入するのに十分な大きさの小さな膀胱瘻造設術(細かいはさみまたは18 G針を使用)を実行します。片手でカテーテルを所定の位置に保持し、もう一方の手で縫合糸のループを締め、カテーテルを所定の位置に固定します。縫合糸に2つの結び目を結び、フレアヘッドが膀胱壁に接触するまでカテーテルを引き戻して、カテーテルの固定を終了します。
- あるいは、膀胱測定12について前述したように、古典的な巾着縫合技術を使用してカテーテルを固定します。
注意: この手順では、膀胱に気泡を入れないことが不可欠です。
- あるいは、膀胱測定12について前述したように、古典的な巾着縫合技術を使用してカテーテルを固定します。
- カテーテルを通して少量のクレブス溶液を注入することにより、漏れのセットアップをテストします。膀胱瘻から液体が漏れた場合は、膀胱瘻の周りに追加の縫合糸でカテーテルを再固定します。
4.経尿道的カテーテル法
- 20 G x 1インチの点滴カテーテルの端を(針を外した状態)外科用潤滑剤に浸します。
- 一対の鉗子で外尿道口をそっと持ち、先端が隣接する膣口の壁を変形させるまで、カテーテルの先端を尾の方向に尿道開口部に挿入します。カテーテルを90°回転させ(カテーテルのルアーロック端を尾に近づけます)、ゆっくりと前進させます。ルアーロックハブが外尿道開口部から約5mm離れるまで、カテーテルを完全に挿入します。
注意: カテーテルを深く挿入しすぎると、先端が膀胱の内壁を突く可能性があります。カテーテルの前進中に抵抗が感じられた場合は、停止して再開するか、尿道に穴を開ける危険があります。カテーテル挿入を成功させるためのヒントについては、ディスカッションセクションを参照してください。 - カテーテルを固定し、外尿道口の周りに短い長さの3-0シルク縫合糸をループさせ、しっかりと結ぶことにより、カテーテルの周りの漏れを防ぎます。誤って引き抜かれないように、カテーテルをテープで尾に固定します。
- カテーテル挿入したら、恥骨上膀胱カテーテルを介してクレブス溶液を膀胱に静かに注入し、液体が尿道カテーテルの周囲ではなく尿道カテーテルから流出することを確認します。必要に応じて、外尿道開口部の周りの縫合糸を再調整します。
- 3-0シルク縫合糸を使用して膀胱の腹部切開を閉じます。
5. 実験のセットアップ
- 尿道カテーテルからの膀胱内液の排出を助けるように傾けることができるボードに動物を固定します。動物とボードの間に加熱パッドと吸収性アンダーパッドを配置して、体温を維持し、尿道カテーテルから排出される液体を吸収します。
- 恥骨上カテーテルを三方活栓に接続し、カテーテルをシリンジポンプと圧力トランスデューサーに接続します。圧力トランスデューサをアンプとデータ収集システムを介してコンピュータに接続します。
注意: シリンジポンプ、トランスデューサー、および膀胱カテーテルを接続するチューブに気泡が形成されないように注意する必要があります。 - 圧力トランスデューサおよび/またはデータ収集ソフトウェアの製造元が提案する手順を使用して、膀胱圧力記録を校正します。
- 恥骨上カテーテルにクレブス溶液を0.1 mL / minの速度で注入し、尿道カテーテルから液体を1時間排出して、カテーテル移植中に放出された残留ATPを洗い流します。
- このウォッシュアウト期間の後、ルアーロックプラグを使用して尿道カテーテルにキャップをし、膀胱内の圧力を測定します。膀胱内圧が急激に上昇することなく、膀胱内圧が30 cm H 2 Oの圧力までゆっくりと上昇し、膀胱収縮を示すことを探します(図2を参照)。膀胱の損傷を防ぐために、圧力が30 cm H2Oに達したら尿道カテーテルからプラグを取り外します。
注:膀胱収縮が1時間後も引き続き発生する場合は、ヘキサメトニウムを追加投与してください(5 mg / kg用量i.p.)。.
6.サンプルの収集
- 0.1 mL/minで膀胱を注入し、尿道カテーテルから溶出液を採取します。100 μLの溶出液アリコートをATPについて直ちにテストするか(下記参照)、後でバッチ定量するために凍結します。
- 管腔ATP濃度に対する膀胱膨満の影響をテストするには、尿道カテーテルをプラグで覆い、膀胱圧が所望のレベルに達するまで監視します。次に、尿道カテーテルのキャップを外し、上記のようにATP測定または凍結のために溶出液を採取します。
- 膨満するたびに、追加のサンプルを採取する前に、膀胱を休ませて10〜15分間洗い流します。再現性を実証するために、各所望の膨張圧力で合計3〜5個の前濃縮サンプルと3〜5個のサンプルを採取します。
- ATPの放出に対する薬物の効果をテストするには、膀胱を注入するクレブス溶液を、選択した薬物を含むクレブスに切り替えます。薬が効果を発揮するために0.1 mL / minで10〜15分間灌流し、手順6.1および6.2で説明されているように、非膨張および膨張した膀胱からサンプルを収集します。.
7. 採取したサンプルからのATPの定量
- 市販のルシフェリン/ルシフェラーゼアッセイキットを使用して、製造元の指示に従って、収集した100 μLサンプル中のATPを定量します。
- ATPを定量するには、灌流液100 μLのサンプルとアッセイミックス50 μLを組み合わせ、ルミノメーターに入れて読み取ります。ルミノメーターによって報告された相対光単位(RRU)をATPの濃度に変換するには、クレブス溶液中のATPを10倍希釈で1μMから10pMの範囲で連続希釈して標準曲線を作成し、ルミノメーターで読み取ります。結果の読み取り値をグラフにプロットし、非線形(二次)回帰を実行して、動物から採取したサンプルから濃度を推定します。
注:多くの薬物がルシフェリン/ルシフェラーゼ反応を妨害するため、実験でテストされた薬物溶液のATP標準を作成することが重要です。
- ATPを定量するには、灌流液100 μLのサンプルとアッセイミックス50 μLを組み合わせ、ルミノメーターに入れて読み取ります。ルミノメーターによって報告された相対光単位(RRU)をATPの濃度に変換するには、クレブス溶液中のATPを10倍希釈で1μMから10pMの範囲で連続希釈して標準曲線を作成し、ルミノメーターで読み取ります。結果の読み取り値をグラフにプロットし、非線形(二次)回帰を実行して、動物から採取したサンプルから濃度を推定します。
8.動物の安楽死
- 実験が完了し、すべてのサンプルが収集されたら、USDAガイドラインと実験動物の世話と使用に関する国立研究評議会のガイドに従って、動物を人道的に安楽死させます。
- 麻酔をかけた動物を実験装置から取り出し、密閉箱に入れ、100%CO2でガスを採取します。充填率がチャンバー容積の30%〜70%/分に等しいことを確認してください(たとえば、3 L容量のボックスの場合は7〜10 L / min)。呼吸が停止した後、少なくとも1分間CO2 フローを継続します。
- 死を確実にするために安楽死の二次的な形態を使用してください。
- 胸骨の尾端にある皮膚の小さな皮弁をつかみ、鋭いハサミで横隔膜の皮膚と筋肉組織に小さな穴を開けることにより、安楽死の二次形態として開胸術を行います。はさみを開口部に挿入し、胸郭を通して吻側を切断し、胸腔を露出させることにより、開胸を完了します。
注:安楽死させた動物は、施設のガイドラインに従って処分する必要があります。
- 胸骨の尾端にある皮膚の小さな皮弁をつかみ、鋭いハサミで横隔膜の皮膚と筋肉組織に小さな穴を開けることにより、安楽死の二次形態として開胸術を行います。はさみを開口部に挿入し、胸郭を通して吻側を切断し、胸腔を露出させることにより、開胸を完了します。
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Representative Results
記載されたプロトコルは、標準的なげっ歯類の膀胱測定セットアップの修正バージョンを使用して、膀胱の内腔からのin vivo での尿路上皮ATP放出の正確な測定を可能にする( 図1を参照)。これにより、研究者は生理学的設定でのストレッチ媒介ATP放出に対する薬物の効果を調べることができます。
図1:実験のセットアップ 。 (A)さまざまな機器にラベルを付けた実験セットアップを示す画像。赤い長方形で輪郭を描かれた動物の面積を Bに示します。 (B)手術後のラットの腹部を描いた写真。恥骨上カテーテルが膀胱ドームに挿入されて結ばれていること、および尿道カテーテルが外部開口部から挿入されていることに注意してください。尿道カテーテルは写真に差し込まれており、膀胱カテーテルを介した灌流中に膀胱圧が上昇することを示しています。実験中、腹部の開口部は縫合して閉じますが、膀胱を視覚化できるようにここに開いたままにしました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
げっ歯類の膀胱における伸張媒介ATP放出の測定を成功させるために最も重要なことは、排尿反射が確実にブロックされ、排尿反射を活性化するのに通常十分な閾値圧力を超えて膀胱を膨張させることです。. 図2Aに示すように、尿道カテーテルを塞ぐと、膀胱内に溶液を注入すると、膀胱が収縮するにつれて膀胱内圧が急激に上昇します。尿路上皮ATP放出に対する収縮ではなく受動的なストレッチの影響に関心があるため、動物は排尿反射を防ぐために神経節遮断薬であるヘキサメトニウムで治療されます。 図2Bで証明されているように、ヘキサメトニウムを投与すると、尿道カテーテルを塞いだ状態で膀胱に溶液を点滴すると、膀胱内圧がはるかに緩やかに上昇し、収縮することなく圧力が30 cm H2Oまで上昇します。これにより、活動不足の膀胱、部分的な膀胱出口閉塞、または脊髄損傷後の排尿筋括約筋の異相乗障害中に観察されるような、病理学に関連するのに十分な高さの圧力での管腔ATP放出の測定が可能になります。排尿反射を完全に遮断するには、ヘキサメトニウムの補足用量が必要になる場合がありますが、過剰摂取につながるほど十分に投与しないように注意する必要があります。.これは、心拍出量を大幅に減少させ、実験の質を損なう可能性があります。膀胱反射に対する同じ抑制効果は、骨盤神経を両側に切断するか、レベルL4以上で脊髄を切断することによって得ることができることに注意すべきである。もちろん、これにより、実験のセットアップの難易度と実験を完了するために必要な時間が大幅に増加します。
図2:ラットからの圧力記録。 (A)および(B)神経節ブロックの前および後。矢印は、尿道カテーテルがいつ詰まったかを示します。上部のトレースの圧力は、圧力が排尿を誘発するしきい値に達すると急速に増加し、下部のトレースの圧力は徐々に上昇することに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
これらの実験のもう一つの非常に重要な考慮事項は、ルミノメーターの読み取り値(通常はRLUで表される)を標準曲線を使用してATPの濃度に適切に変換することです。ルシフェリン/ルシフェラーゼ反応は、干渉剤13の影響を非常に受けやすい。この干渉は、ルシフェリン/ルシフェラーゼとの直接的な相互作用から生じる可能性があります。例えば、多くの化合物は、ルシフェラーゼの競合的または非競合的阻害剤として作用し得る。ある研究では、分子ライブラリ低分子リポジトリの化合物の~3%が、11 μM未満の濃度でホタルルシフェラーゼを阻害できることが示唆されました14。さらに、ルシフェリンは酸化剤の影響を受けやすく、発光生成反応に利用可能な基質の量を減らす15。反応の補因子であるマグネシウムの利用可能性を変えることによって、ルシフェリン/ルシフェラーゼ反応を妨害することも可能です。例えば、 in vitro ATP実験において機械的伸張を模倣するための1つの一般的な技術は、灌流溶液の浸透圧を低下させることによって細胞膨潤を誘導することである。しかし、多くの研究者は、溶液を水で希釈し、ルシフェリン/ルシフェラーゼ反応の補因子として作用するために利用可能なマグネシウムの濃度を下げることによって、この減少を達成しています。さらに、一部の薬物はマグネシウム塩として販売されており、溶液中のマグネシウムの量を大幅に増加させる可能性があり、発光測定値の測定可能な違いにもつながります。最後に、薬液がルシフェリン/ルシフェラーゼ反応によって生成された光を正確に測定する能力を妨げる可能性があります。ブリリアントブルーFCF(BB-FCF、エリオグラウシンまたはFD&Cブルー色素#1としても知られる)は、パンネキシン媒介ATP放出の特異的阻害剤である16。有効線量では、ブリリアントブルーFCF溶液は明瞭な青色色相を有し、約600nmのピークで光を吸収する17。これは、ホタルルシフェラーゼによって放出される光の波長の範囲内です。したがって、BB-FCFを用いた実験における発光は大幅に減少する。したがって、各実験薬物を含む溶液に溶解した既知量のATPを用いた標準曲線を用いて、実験中のATP放出を定量することが不可欠である。 図3に示すように、BB-FCF(100μM)は検量線の傾きを有意に減少させ、これはサンプル中のATP濃度の計算値を大幅に変更するのに十分です。 図3の下部に示すように、クレブス標準を使用してBB-FCFを含むサンプル中のATP濃度を計算すると、ATP濃度が~50%過小評価される可能性があります。場合によっては、間違った検量線を使用すると、薬物を介したATP放出の変化が不明瞭になったり、変化が起こったかのように誤って見えたりする可能性があります。たとえば、 図3に示す実験では、すべてのサンプルにクレブス標準を使用すると、ブリリアントブルーFCFはATP放出を~67%(16.6〜5.5 nM)減少させたように見えますが、実際には~42%(16.6〜9.6 nM)しか減少していません。
図3:ATP標準曲線に対する実験薬の効果。 パンネキシンチャネル拮抗薬であるブリリアントブルーは、任意の濃度のATPについて測定されるRLUを有意に変化させ、補正しないと測定されたATPを過小評価することになることに注意してください。略語: RLU = 相対光単位;BB-FCF = ブリリアントブルーFCF。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
覚えておくべきもう1つの考慮事項は、ATPは損傷の結果として組織から放出されることが多く、これらの外科的処置と尿道カテーテルの挿入は、セットアップ後すぐに服用すると異常に高いATP測定値をもたらすことです。この手順では、実験が設定されてから1時間のウォッシュアウト期間について説明しますが、これはスキップしないでください。1時間後、膀胱が膨張していないときに採取されたサンプルで測定されたATP濃度は比較的低い(~10-30nM)のに対し、ウォッシュアウト期間前に採取されたサンプルは桁違いに高い値を読み取ることができることがわかりました。ATPレベルは短期間上昇したままになる可能性があるため、膨張の間に5分間のウォッシュアウトも実行する必要があります。.経験則として、実験の開始時と各膨張後に複数のサンプルでATPを測定し、ATPの読み取り値が横ばいになったときにのみ進行します。 図4に、様々な時点で行われた測定値を用いた典型的な実験の表現を示す。ウォッシュアウト前に取られた高い測定値(サンプル#1および#5)とウォッシュアウト後に取られた測定値(サンプル#2および#6)に注意してください。
図4:典型的な実験の表現。 典型的な圧力記録の定型化された表現。各数値は、サンプルを採取してATPを測定した時点を表します:1)セットアップが完了した直後、ウォッシュアウト期間の前、2)1時間のウォッシュアウト期間の後、3)膨張の直前、4)膨張中、5)膨張直後、および6)膨張後の短いウォッシュアウト期間の後。挿入表は、各サンプルの代表的なRLU値とATP濃度を示しています。省略形: RLU = 相対光の単位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5 は、尿路上皮からのATP放出のメカニズムを調べた実験結果の代表的なグラフを示す。 図5Aに示すように、圧力が上昇すると、膀胱の内腔におけるATPの濃度が有意に増加し、30cmの水の圧力は、非膨張対照のほぼ2.5倍の濃度を増加させる。ATPの加水分解を触媒する酵素であるアピラーゼ2 U/mLの膀胱内灌流は、膀胱内腔におけるATPの測定濃度を有意に低下させる。逆に、尿路上皮に存在するNTPDaseの阻害剤であるARL67156の膀胱内灌流は、管腔ATP濃度を有意に増加させる。 図5B は、尿路上皮からの伸張誘導性ATP放出のメカニズムに関する実験を示す。パネキシンチャネルアンタゴニストであるブリリアントブルーFCF(BB-FCF、100μM)またはカルベノキソロン(CBX、100μM)との灌流は、すべての圧力で膀胱内腔へのATPの放出を有意に減少させる。コネキシン遮断薬18α-グリチルレチン酸が灌流されても管腔ATP濃度は減少せず、膨張誘発ATP放出がコネキシンチャネルではなくパネキシンチャネルによって媒介されることを示しています。.
図5:膀胱の内腔における膨満誘発性ATP放出の代表的な測定値。 (A)膀胱の膨張は管腔ATP濃度を増加させ、NTPDaseアピラーゼ(2 U / mL)の存在下で減少するか、内因性NTPDaseaseがARL67156(10 μM)で阻害された場合に増加する可能性があります。(B)膨張誘発ATP放出は、パネキシンチャネル拮抗薬ブリリアントブルーFCF(BB-FCF、100μM)およびカルベノキソロン(CBX、100μM)によってブロックされますが、コネキシンチャネル拮抗薬18α-グリチルレチン酸(18α-GA、50μM)によってブロックされません。データは、標準誤差バー付きの平均値として表示されます。** p<線で示された2つのバーの間で0.05、##pは同じ膨張でクレブス対照と比較して0.05<。この図は、Beckelらの許可を得て転載しています8。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
尿路上皮ATP放出に関する研究の大部分は、不死化細胞株またはげっ歯類の尿路上皮細胞の初代培養のいずれかを使用して、培養細胞で行われます。これらのモデルには、スループットが比較的高いという利点がありますが(つまり、1回の培養/継代で細胞のプレート/皿を多数作成できます)、生理学的関連性は、1)尿路上皮細胞が特別な支持体上で増殖しない限り分極的に増殖できないこと、および2)培養細胞を生理学的レベルの伸張/圧力にさらすことの難しさのために低下します。これらの制限に対処する1つの方法は、げっ歯類から膀胱を取り外し、それを切断して開き、それをUssingチャンバーに配置し、生理学的溶液で満たされた2つの半チャンバーの間に膀胱組織を挿入することです。これにより、研究者は、本来の分極状態の尿路上皮を、チャンバーの尿路上皮側に体積を追加することによって膨張させ、チャンバー内の膀胱組織の伸張を引き起こすことができます。しかしながら、この伸張を in vivoで 尿路上皮によって見られる膨張と関連付けることは困難である。さらに、Ussingチャンバー内の膨張誘発ATPは、チャンバー内に収容された大量の生理液中に放出され、ATPの濃度を数倍に希釈する。この手順を使用して、膀胱圧が直接測定されるため、膨張を生理学または病態生理学に関連する範囲に保つことができます。さらに、ATP濃度は、 組織をin vitroで維持するために使用される任意で過剰な量の流体からではなく、管腔液から直接測定しているため、測定された濃度を補正する必要はありません。したがって、この論文に記載されている手順により、研究者は、膀胱の生理学的または病態生理学的条件にはるかに近い条件下で、膀胱内腔におけるATP放出を調べることができます。
記載されている技術は、反射膀胱活動に対する薬物の効果を研究するために使用される標準的な膀胱測定技術と非常によく似ており、これらの実験を日常的に実行する人なら誰でも簡単に実行する必要があります。ただし、膀胱カテーテル法に不慣れな研究者にとっては、注意すべき点がいくつかあります。第一に、経尿道的カテーテル法は、げっ歯類の尿道の湾曲のために経験の浅い人にとっては困難であり得る。これはまた、ウレタン麻酔下であっても、外尿道括約筋の締まり具合によってより困難になる可能性があります。研究者は、カテーテルを尿道に押し込もうとしないことが不可欠です、それは炎症と腫れの増加を引き起こす可能性が最も高いので、それは次に尿道をうまくカテーテル挿入することをさらに困難にします。さらに、カテーテルを尿道の壁に突き刺して、実験全体を台無しにする可能性があります。
成功率を高めるためのヒントとコツをいくつか開発しました。例えば、尿道括約筋を弛緩させるために、動物に別の短時間の吸入イソフルラン(0.5%〜1.0%)を与えることが時々必要である。ウレタンとイソフルランの組み合わせは呼吸抑制を引き起こす可能性があるため、これは控えめに注意して行う必要があります。.別のトリックは、カテーテルの先端を2%リドカイン溶液に浸してから、外尿道開口部に挿入することです。これにより、数分後に括約筋が弛緩することがよくあります。動物の腹部をそっと押して膀胱を空にすることも、尿道括約筋を弛緩させるのに役立ちます。最後に、より小さなゲージカテーテルを使用する必要があるかもしれません。特に小動物では、24Gのカテーテルを使用することがあります。ただし、より小さなゲージの経尿道的カテーテルを使用する場合は、尿道カテーテルからのより遅いドレナージに合わせて、膀胱への注入速度を下げる必要がある場合があることに注意してください。そうしないと、尿道カテーテルに蓋がされていないにもかかわらず、膀胱圧が上昇します。
このプロトコルではウレタンが麻酔薬として使用されていることに注意してください。ウレタンは、他の麻酔薬がそうではないのに対し、排尿反射を免れるため、下部尿路を研究する研究室で一般的に使用されます。このため、ウレタン麻酔下で~7-10 cm H2Oの圧力を超える膀胱の膨張は、排尿反射を引き起こします。受動膨張に応答したATP放出に関心があるため、このプロトコルでは、神経節遮断薬ヘキサメトニウムを使用して膀胱収縮をブロックする必要があります。これにより、出口閉塞を伴う膀胱病理において一般的に見られるより高い膀胱内圧(すなわち、30cmH2O)に応答したATP放出の測定が可能になる。したがって、ウレタン/ヘキサメトニウムを使用すると、膨満誘発管腔ATP放出を長期間測定できます(両方の薬物の作用時間は時間単位で測定されます)。.ただし、一部のラボでは、ケタミンなどの排尿反射を惜しまない麻酔薬を使用し、神経節遮断薬の必要性を排除することを好む場合があります。これはこの手順にもうまく機能しますが、麻酔薬の作用時間が短いため、より頻繁な(または継続的な)投与が必要になります。
ATPを測定するこの技術と、泌尿器科の研究者がよく知っている一般的な膀胱測定セットアップとの注目すべき違いの1つは、標準的な等張生理食塩水の代わりに緩衝クレブス溶液を灌流液として使用することです。ATPはかなり不安定な分子であり、緩衝溶液中でいくらか安定化される。さらに、クレブス溶液の組成は生理食塩水よりも尿の組成にはるかに近いため、これらの実験に臨床的関連性がさらに追加されます。尿路上皮のATP放出の制御はカルシウム透過性チャネルによって調節されることが示されており、通常の生理食塩水中のカルシウムの不足はATP放出に悪影響を与える可能性があるため、これは重要な考慮事項です。溶液中のATPの不安定性は、ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応を使用してサンプルを直ちに定量することを提案する理由でもあります。ただし、研究者がサンプルをすぐに読み取ることができない場合は、ATPの分解を制限するために、サンプルをできるだけ早く凍結する必要があります。
この手法の1つの制限は、管腔のATP放出のみを測定し、尿路上皮の漿膜側からのATP放出を測定できないことです。ATPは漿膜側から放出され、求心性興奮性に直接影響すると考えられている。ただし、このリリースを直接測定することは困難です。この場合、トランスウェルプレートなどの透過性膜支持体上で増殖した細胞を使用するか、またはウッシングチャンバー実験のために尿路上皮を外科的に除去することが好ましい技術である。しかし、膀胱病理における管腔ATPの明らかな重要性を考えると、この実験モデルは、病理学中の尿路上皮ATP放出を制御する細胞メカニズムを解明するための有用なツールです。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
本研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)からJMBへの助成(DK117884)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
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