In vivo Luminal måling av distensjon-fremkalt urotelial ATP-frigjøring hos gnagere

Summary

Denne protokollen beskriver prosedyren for å måle ATP-konsentrasjoner i blærens lumen i en bedøvet gnager.

Abstract

ATP, frigjort fra urotelet som respons på blæredistensjon, antas å spille en betydelig sensorisk rolle i kontrollen av vannlating. Derfor er nøyaktig måling av urotelial ATP-frigjøring i en fysiologisk setting et viktig første skritt i å studere mekanismene som styrer purinerg signalering i urinblæren. Eksisterende teknikker for å studere mekanisk fremkalt urotelial ATP-frigjøring benytter dyrkede celler belagt på fleksible støtter eller blærevev festet i Ussing-kamre; Imidlertid etterligner hver av disse teknikkene ikke fullt ut forholdene i den intakte blæren. Derfor ble det utviklet et eksperimentelt oppsett for direkte å måle ATP-konsentrasjoner i lumen i urinblæren hos gnagere.

I dette oppsettet blir blærene til bedøvede gnagere perfusert gjennom katetre i både blærekuppelen og via den eksterne urinrøråpningen. Trykket i blæren økes ved å kappe urinrørskateteret mens du perfuserer steril væske inn i blæren gjennom kuppelen. Måling av intravesikalt trykk oppnås ved hjelp av en trykktransduser festet til blærekuppelkateteret, beslektet med oppsettet som brukes til cystometri. Når ønsket trykk er nådd, fjernes urinkateterets hette, og væske oppsamles for ATP-kvantifisering ved luciferin-luciferase-analyse. Gjennom dette eksperimentelle oppsettet kan mekanismene som styrer både mekanisk og kjemisk stimulering av urotelial ATP-frigjøring undersøkes ved å inkludere forskjellige agonister eller antagonister i perfusatet eller ved å sammenligne resultater mellom villtype og genetisk modifiserte dyr.

Introduction

ATP i urin antas å spille en betydelig sensorisk rolle i kontrollen av vannlating¹. For eksempel antas det at ATP frigjøres fra urotelet som respons på distensjon der det kan virke på reseptorer på blæreafferente nerver for å øke spenningen, noe som fører til følelser av fylde². Dermed er det også antatt at urin ATP kan være en viktig aktør i utviklingen av blærepatologier. Til støtte for denne hypotesen er ATP-konsentrasjonene i urin signifikant økt hos pasienter som lider av overaktiv blære (OAB)³, blæresmertesyndrom/interstitiell cystitt (BPS/IC)⁴ eller urinveisinfeksjon (UVI)^5,6, alle tilstander karakterisert ved økt haster^, frekvens og noen ganger smerter. Omvendt, pasienter som lider av underaktiv blære (UAB), som er preget av en manglende evne til å tømme ens blære og kan noen ganger inkludere en redusert evne til å føle blæren fylde, har vist seg å ha redusert urin ATP konsentrasjoner⁷. Eksperimentelt kan manipulering av ATP-konsentrasjoner i urin endre blærereflekser hos rotter; økende ATP-konsentrasjoner ved å blokkere endogene ATPaser i blærelumen kan øke tømmingsfrekvensen, mens reduksjon av ATP-konsentrasjoner ved å sette inn eksogene ATPaser i blæren reduserer tømmingsfrekvensen⁸. Dermed er viktigheten av urin ATP til blærefunksjon klar.

Gitt den tilsynelatende betydningen av urin ATP til blærepatologi, er nøyaktig måling av urotelial ATP-frigjøring et viktig skritt i å forstå mekanismene som kontrollerer frigjøring. Mange studier har blitt gjennomført ved hjelp av forskjellige eksperimentelle modeller for å måle urotelial ATP-frigjøring. Fremst blant disse er cellekulturer, enten primære kulturer eller cellelinjer. Imidlertid kompliseres bruken av dyrkede urotelceller av det faktum at urotelceller ikke tar på seg sin fysiologiske polariserte morfologi med mindre de dyrkes på spesielle permeable membraner (som Transwell-teknologi [brønninnsatser])⁹. Dermed er det vanskelig å relatere noen ATP-frigjøring målt til fysiologi. Urotelceller dyrket på brønninnsatser kan polarisere og danne en barriere som ligner på det som ses in vivo; Imidlertid kan veksten av et fullt differensiert urotel ta dager eller uker. I tillegg, mens det er mulig å montere brønninnlegg i et Ussing-kammer og legge trykk på den apikale siden for å forårsake strekk, er det vanskelig å påføre nok trykk for å etterligne forholdene i blæren under patologi (dvs. trykk på 30 cm H₂O eller høyere). Hele blærevevet kan også monteres i et Ussing-kammer for strekkeksperimenter, men dette fjerner blæren fra organismen sammen med de trofiske faktorene som opprettholder urotelcellehelsen og dermed urotelbarrierefunksjonen. Derfor er den mest fysiologisk relevante måten å studere frigjøring av ATP fra urotelet som respons på strekk eller trykk, in vivo. De kirurgiske teknikkene som trengs for å sette opp eksperimentet, er identiske med de som vanligvis brukes i cystometri hos dyr, og bør derfor enkelt utføres av alle som er kjent med den teknikken.

I denne protokollen vil vi beskrive teknikken som brukes til å undersøke luminal ATP hos kvinnelige Sprague Dawley-rotter som veier ca. 200-250 g, da transuretral kateterisering beskrevet nedenfor er mye lettere hos kvinner; Imidlertid kan transuretral kateterisering også utføres hos mannlige gnagere¹⁰. Siden transuretral kateterisering nå er utført hos mus av begge kjønn også¹¹, kan disse forsøkene enkelt tilpasses mus eller rotter av begge kjønn eller av varierende størrelse, avhengig av forskerteamets behov.

Protocol

Alle prosedyrer som utføres hos gnagere må følge gjeldende retningslinjer og godkjennes av den lokale institusjonelle etiske vurderingskomiteen. Forsøkene som ble utført for dette manuskriptet ble utført i samsvar med National Research Council's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh School of Medicine. Se figur 1 for en modifisert versjon av standard cystometrioppsett for gnagere som brukes i denne protokollen.

1. Forsøksdyr

1. Hold rottene i sosiale boliger (flere gnagere i ett bur) med en 12 timers lys / mørk syklus og ad libitum tilgang til vann og matpellets.

2. Anestesi og ganglionisk blokk

1. Indusere initial anestesi ved å plassere dyret i en lukket boks gasset med 4%-5% isofluran i_O2 (1 l / min).
2. Bedøv dyret ved hjelp av uretan.
   1. Injiser uretan subkutant bilateralt (1/2 dose på hver side av dyret) i en dose på 1,2 g/kg. Plasser dyret i et bur for å la uretanen tre i kraft, som vanligvis tar 2 timer.
   2. Alternativt kan du administrere uretan intraperitonealt (i.p.) ved å injisere hele dosen i to separate doser ~10 minutter fra hverandre.
3. Etter å ha ventet på riktig tidspunkt for at uretan skal tre i kraft (SC: 2 timer, i.p.: 30 min), test for et riktig anestesiplan ved å klemme foten av dyret ved hjelp av tang. Hvis en refleks observeres, administrer en ekstra dose uretan (0,05-0,1 ml i.p.), vent i 15 minutter og test igjen. Fortsett å overvåke dyret for riktig anestesiplan gjennom hele prosedyren.
4. For å forhindre sammentrekning av blæren under distensjon, injiser dyret med et ganglionisk blokkeringsmiddel, slik som heksametanium (20 mg/kg, i.p.).
5. Påfør oftalmisk salve på dyrets øyne for å forhindre tørking under forsøket.

3. Kirurgisk prosedyre-suprapubisk blærekateterisering

1. Barbere dyrets underliv og utfør en midtre laparotomi for å eksponere urinblæren.
2. Forbered et kateter ved å fakle den ene enden av en kort (~ 10-15 cm) lengde av PE50 intramedisk slange ved hjelp av en flamme. Plasser en 22 G nål i den andre enden av slangen og fyll med Krebs oppløsning (se materialfortegnelse for sammensetningen).
3. Plasser en liten sløyfe med 3-0 silkesutur over blærekuppelen og utfør en liten cystostomi (med fin saks eller en 18 G nål) som er stor nok til å sette inn den blussede enden av kateteret som er laget ovenfor. Med den ene hånden som holder kateteret på plass, bruk den andre hånden til å stramme sutursløyfen for å feste kateteret på plass. Avslutt sikringen av kateteret ved å binde to knuter i suturen og trekke kateteret tilbake til det blussede hodet er i kontakt med blæreveggen.
   1. Alternativt kan du sikre kateteret med klassisk pursestrengsuturteknikk, som tidligere beskrevet for cystometri¹².
      MERK: Det er viktig å ikke introdusere luftbobler i blæren under denne prosedyren.
4. Test oppsettet for lekkasjer ved å infusere en liten mengde Krebs-løsning gjennom kateteret. Hvis væsken lekker ut av cystostomien, fest kateteret på nytt med ytterligere sutur rundt cystostomien.

4. Transuretral kateterisering

1. Dypp enden av et 20 G x 1" intravenøst kateter (med nålen fjernet) i kirurgisk smøremiddel.
2. Hold den eksterne urinrøret meatus forsiktig med et par tang og sett spissen av kateteret inn i urinrøråpningen i retning av halen til spissen fører til at veggen i den tilstøtende vaginalåpningen deformeres. Drei kateteret 90° (før Luer-Lock-enden av kateteret mot halen) og gå forsiktig videre. Sett kateteret helt inn til Luer-Lock-navet er ca. 5 mm distalt fra den eksterne urinrørsåpningen.
   MERK: Ikke sett kateteret for langt, noe som kan føre til at spissen stikker inn i blærens innervegg. Hvis motstanden føles mens du fremmer kateteret, stopp og start igjen eller risikere å punktere urinrøret. Se diskusjonsdelen om tips for å øke vellykket kateterisering.
3. Fest kateteret og forhindre lekkasje rundt kateteret ved å sløyfe en kort lengde på 3-0 silkesutur rundt den eksterne urinrørsåpningen og binde den tett. Fest kateteret til halen med tape for å forhindre at det ved et uhell blir trukket ut.
4. Når kateterisert, fyll forsiktig Krebs-løsningen inn i blæren gjennom det suprapubiske blærekateteret og bekreft at væsken strømmer ut av urinrørskateteret og ikke rundt det. Om nødvendig, behold suturen rundt den eksterne urinrøråpningen.
5. Lukk magesnittet over blæren ved hjelp av en 3-0 silke sutur.

5. Eksperimentelt oppsett

1. Fest dyret på et brett som kan være tilbøyelig til å hjelpe til med drenering av intravesikal væske gjennom urinrørskateteret. Plasser en varmepute og absorberende underpute mellom dyret og brettet for å opprettholde kroppsvarmen og absorbere væskedrenering fra urinrørskateteret.
2. Koble det suprapubiske kateteret til en treveis stoppekran, som forbinder kateteret til en sprøytepumpe og en trykktransduser. Koble trykktransduseren til en datamaskin ved hjelp av en forsterker og et datainnsamlingssystem.
   MERK: Det må utvises forsiktighet for å forhindre at det dannes luftbobler i slangen som forbinder sprøytepumpen, svingeren og blærekateteret.
3. Kalibrer blæretrykkregistreringen ved hjelp av prosedyren foreslått av produsenten av trykktransduseren og/eller datainnsamlingsprogramvaren.
4. Infiser Krebs-løsningen gjennom det suprapubiske kateteret med en hastighet på 0,1 ml / min og la væsken renne fra urinrørskateteret i 1 time for å vaske ut eventuell gjenværende ATP frigjort under kateterimplantasjonene.
5. Etter denne utvaskingsperioden setter du lokk på urinrørskateteret med en Luer-Lock-plugg og måler trykket i blæren. Se etter en langsom økning i det intravesikale trykket til et trykk på 30 cm H 2O uten en kraftig økning i trykk, noe som vil indikere en blærekontraksjon (se figur 2). Fjern pluggen fra urinrørskateteret når trykket når 30 cm_H2O for å forhindre skade på blæren.
   MERK: Hvis blærekontraksjoner fortsetter etter 1 time, gi en ekstra dose heksametanium (5 mg/kg dose i.p.).

6. Innsamling av prøver

1. Infundere blæren ved 0,1 ml / min og samle eluatet fra urinrørskateteret. Test 100 μL alikoter av eluatet umiddelbart for ATP (se nedenfor) eller frys for senere batchkvantifisering.
2. For å teste effekten av blæredistensjon på luminale ATP-konsentrasjoner, kapp urinrørskateteret med pluggen og overvåk blæretrykket til det når ønsket nivå. Fjern deretter hetten på urinrørskateteret og samle eluatet for ATP-måling eller frysing, som beskrevet ovenfor.
3. Etter hver distensjon, la blæren hvile og vaske ut i 10-15 min før du tar ytterligere prøver. Ta totalt 3-5 predistensjonsprøver og 3-5 prøver ved hvert ønsket distensjonstrykk for å demonstrere repeterbarhet.
4. For å teste effekten av legemidler på frigjøring av ATP, bytt Krebs-løsningen infusjon blæren til Krebs som inneholder det valgte stoffet. Perfuse ved 0,1 ml/min i 10-15 min for at medikamentet skal ha effekt, og ta deretter prøvene fra ikke-distenderte og distenderte blærer som beskrevet i trinn 6.1 og 6.2.

7. Kvantifisering av ATP fra innsamlede prøver

1. Kvantifiser ATP i de innsamlede 100 μL-prøvene ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig luciferin / luciferase-analysesett i henhold til produsentens instruksjoner og et luminometer.
   1. For å kvantifisere ATP, kombiner 100 μL prøver av perfusat med 50 μL av analyseblandingen og plasser dem i luminometeret for lesing. For å konvertere Relative Light Units (RLUs) rapportert av luminometeret til en konsentrasjon av ATP, gjør serielle fortynninger av ATP i Krebs-oppløsning fra 1 μM til 10 pM i 10 ganger fortynninger for å lage en standardkurve og lese dem i luminometeret. Plott de resulterende avlesningene på en graf og utfør en ikke-lineær (kvadratisk) regresjon for å ekstrapolere konsentrasjoner fra prøvene tatt fra dyret.
      MERK: Det er viktig å lage ATP-standarder for enhver legemiddelløsning som ble testet i forsøket, da mange stoffer forstyrrer luciferin / luciferase-reaksjonen, som må korrigeres for.

8. Avliving av dyr

1. Når forsøket er fullført og alle prøvene er samlet, avlives dyret humant i henhold til USDA-retningslinjene og National Research Council's Guide for Care and Use of Laboratory Animals.
   1. Fjern det bedøvede dyret fra forsøksoppsettet, legg det i en lukket boks og gass det med 100% CO₂. Forsikre deg om at fyllhastigheten er lik 30% -70% av kammervolumet per minutt (f.eks. 3-7 l / min for en boks med 10 l volum). Fortsett CO₂ -strømmen i minst 1 min etter at respirasjonen opphører.
2. Bruk en sekundær form for eutanasi for å sikre døden.
   1. Utfør en toraktomi som en sekundær form for eutanasi ved å ta tak i den lille hudklaffen i den kaudale enden av brystbenet og kutte et lite hull i huden og muskulaturen ved membranen med en skarp saks. Fullfør torakotomi ved å sette saksen inn i åpningen og kutte rostralt gjennom ribbeholderen og utsette brysthulen.
      MERK: Det avlivede dyret skal kastes i henhold til institusjonelle retningslinjer.

Representative Results

Den beskrevne protokollen tillater nøyaktig måling av urotelial ATP-frigjøring in vivo fra blærens lumen, ved bruk av en modifisert versjon av standard cystometrioppsett for gnagere (se figur 1). Dette gjør det mulig for forskeren å undersøke effekten av legemidler på strekkmediert ATP-frigjøring i en fysiologisk setting.

Figur 1: Eksperimentelt oppsett . (A) Bilde som viser det eksperimentelle oppsettet, med det forskjellige utstyret merket. Området av dyret som er skissert i et rødt rektangel er vist i B. (B) Fotografi som viser magen til rotta etter operasjonen. Legg merke til det suprapubiske kateteret som er satt inn og bundet inn i blærekuppelen, samt urinrørskateteret som er satt inn gjennom den eksterne åpningen. Urinrørskateteret er plugget inn på bildet for å vise at blæretrykket økes under perfusjon gjennom blærekateteret. Under forsøket ville bukåpningen bli suturert lukket, men ble stående åpen her for å tillate visualisering av urinblæren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Av primær betydning for vellykket måling av strekkmediert ATP-frigjøring i gnagerblæren er å sikre at miksjonsrefleksen blokkeres, slik at blæren kan distenderes utover terskeltrykket som normalt er tilstrekkelig til å aktivere miksjonsrefleksen. Som vist i figur 2A, når urinrørskateteret er plugget, fører infusjon av løsningen inn i blæren til at det intravesikale trykket stiger kraftig når blæren trekker seg sammen. Siden vi er interessert i effekten av passiv strekk, ikke sammentrekning, på urotelial ATP-frigjøring, behandles dyret med en ganglionisk blokkering, heksametanium, for å forhindre micturitionsrefleksen. Som vist i figur 2B, når heksametanium administreres, resulterer instillasjon av løsningen i blæren med urinrørskateterblokken i en mye mer gradvis økning i intravesikalt trykk, slik at trykket stiger så høyt som 30 cm H₂O uten sammentrekning. Dette muliggjør måling av luminal ATP-frigjøring ved trykk som er høye nok til å være relevante for patologi, slik som de som observeres i en underaktiv blære, delvis blæreutløpsobstruksjon eller under detrusor-sfinkter dyssynergi etter ryggmargsskade. Selv om det kan være nødvendig med en supplerende dose heksametanium for å blokkere miksjonsrefleksen fullstendig, bør det utvises forsiktighet for ikke å administrere nok til å resultere i en overdose. Dette kan føre til betydelig redusert hjerteutgang og kompromittere kvaliteten på eksperimentet. Det skal bemerkes at den samme hemmende effekten på blærerefleksen kan oppnås ved enten å kutte bekkennervene bilateralt eller kutte ryggmargen på nivå L4 eller høyere. Dette øker selvfølgelig vanskeligheten med det eksperimentelle oppsettet og tiden som kreves for å fullføre eksperimentet, betydelig.

Figur 2: Trykkregistreringer fra rotter. Før (A) og etter (B) ganglionisk blokk. Pilene indikerer når urinrørskateteret ble plugget. Legg merke til at trykket i det øverste sporet øker raskt når trykket når terskelen for å indusere vannlating, mens trykket i bunnsporet gradvis stiger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

En annen svært viktig faktor for disse eksperimentene er å sikre riktig konvertering av luminometeravlesningene (normalt uttrykt i RLU) til en konsentrasjon av ATP ved hjelp av standardkurver. Luciferin/luciferasereaksjonen er svært følsom for interfererende midler¹³. Denne forstyrrelsen kan komme fra en direkte interaksjon med luciferin / luciferase. For eksempel kan en rekke forbindelser fungere som konkurrerende eller ikke-konkurrerende hemmere av luciferase; en studie antydet at ~ 3% av forbindelsene i Molecular Libraries Small Molecule Repository kunne hemme firefly luciferase ved konsentrasjoner under 11 μM¹⁴. Videre er luciferin utsatt for oksidasjonsmidler, noe som reduserer mengden substrat som er tilgjengelig for den luminescensproduserende reaksjonen¹⁵. Det er også mulig å interferere med luciferin / luciferase-reaksjonen ved å endre tilgjengeligheten av reaksjonens kofaktor, magnesium. For eksempel er en vanlig teknikk for å etterligne mekanisk strekk i in vitro ATP-eksperimenter å indusere cellehevelse ved å redusere osmolariteten til perfusjonsløsningen. Imidlertid oppnår mange forskere denne reduksjonen ved å fortynne løsningen med vann, og reduserer konsentrasjonen av magnesium som er tilgjengelig for å fungere som en kofaktor i luciferin / luciferase-reaksjonen. I tillegg selges noen stoffer som magnesiumsalter, noe som i stor grad kan øke mengden magnesium i løsningen, noe som også fører til målbare forskjeller i luminescensavlesninger. Endelig er det mulig for en legemiddeloppløsning å forstyrre evnen til nøyaktig å måle lyset som produseres av luciferin / luciferase-reaksjonen. Brilliant Blue FCF (BB-FCF, også kjent som erioglaucin eller FD &C Blue dye #1) er en spesifikk hemmer av pannexin-mediert ATP-utgivelse¹⁶. Ved effektive doser har Brilliant Blue FCF-løsningen en tydelig blå nyanse, som absorberer lys på en topp på rundt 600 nm¹⁷. Dette er innenfor rekkevidden av bølgelengder av lys som sendes ut av firefly luciferase; derfor reduseres lysutslipp i eksperimenter med BB-FCF kraftig. Det er derfor viktig at standardkurver ved bruk av kjente mengder ATP oppløst i løsninger som inneholder hvert eksperimentelt legemiddel, brukes til å kvantifisere ATP-frigjøringen under forsøket. Som vist i figur 3, reduserer BB-FCF (100 μM) signifikant helningen til standardkurven, noe som er tilstrekkelig til å endre de beregnede verdiene for konsentrasjonen av ATP i prøven betydelig. Som vist nederst i figur 3, kan bruk av Krebs-standarden for å beregne konsentrasjonen av ATP i en prøve som inneholder BB-FCF resultere i en underestimering av ATP-konsentrasjonen med ~ 50%. I noen tilfeller kan bruk av feil standardkurve skjule en narkotikamediert endring i ATP-frigivelse, eller få det feilaktig til å se ut som om en endring har skjedd. I eksperimentet som er avbildet i figur 3, for eksempel, ville bruk av Krebs-standarden for alle prøver ha fått det til å se ut til at Brilliant Blue FCF reduserte ATP-utgivelsen med ~ 67% (16,6 til 5,5 nM) når den i virkeligheten bare hadde redusert ~ 42% (16,6 til 9,6 nM).

Figur 3: Effekter av eksperimentelle legemidler på ATP-standardkurven. Merk at pannexinkanalantagonisten, Brilliant Blue, signifikant endrer RLUene målt for en gitt konsentrasjon av ATP, noe som vil resultere i en underestimering av ATP målt, hvis ikke korrigert for. Forkortelse: RLUs = Relative Light Units; BB-FCF = Strålende blå FCF. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

En annen vurdering å huske på er at ATP ofte frigjøres fra vev som følge av skade, og at disse kirurgiske prosedyrene og urinrørkateterinnsetting vil resultere i unormalt høye ATP-avlesninger hvis de tas for tidlig etter oppsettet. Denne prosedyren beskriver en utvaskingsperiode på 1 time etter at eksperimentet er konfigurert, som ikke skal hoppes over. Vi har funnet at etter 1 time er ATP-konsentrasjoner målt i prøver tatt når blæren ikke er oppblåst, relativt lave (~ 10-30 nM), mens prøver tatt før utvaskingsperioden kan lese en størrelsesorden høyere. Korte, 5 min utvasking bør også utføres mellom distensjoner, da ATP-nivåene kan forbli forhøyet i en kort periode. En god tommelfingerregel ville være å måle ATP i flere prøver i begynnelsen av eksperimentet og etter hver distensjon og bare fortsette når ATP-avlesningene jevner seg ut. I figur 4 viser vi en fremstilling av et typisk eksperiment med målinger tatt på ulike tidspunkter. Legg merke til de høye avlesningene som er tatt før utvasking (prøver #1 og #5) kontra de som tas etter utvasking (prøver #2 og #6).

Figur 4: Representasjon av et typisk eksperiment. En stilisert fremstilling av et typisk trykkopptak. Hvert tall representerer et tidspunkt da en prøve ble tatt og målt for ATP: 1) umiddelbart etter at oppsettet er fullført, før utvaskingsperioden, 2) etter en utvaskingsperiode på 1 time, 3) umiddelbart før en distensjon, 4) under distensjon, 5) umiddelbart etter en distensjon og 6) etter en kort utvaskingsperiode etter distensjonen. Innfelttabellen viser representative RLU-verdier og ATP-konsentrasjoner for hver prøve. Forkortelse: RLUs = Relative Light Units. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5 viser representative grafer av eksperimentelle resultater som undersøker mekanismen for ATP-frigjøring fra urotelet. Som vist i figur 5A, forårsaker økende trykk en signifikant økning i konsentrasjonen av ATP i blærens lumen, med trykk på 30 cm vann som øker konsentrasjonene nesten 2,5x av ikke-distenderte kontroller. Intravesikal perfusjon av 2 U / ml apyrase, et enzym som katalyserer hydrolysen av ATP, reduserer signifikant den målte konsentrasjonen av ATP i blærens lumen. Omvendt øker intravesikal perfusjon av ARL67156, en inhibitor av NTPDaser tilstede på urotelet, signifikant luminale ATP-konsentrasjoner. Figur 5B viser eksperimentene i mekanismen for strekkindusert ATP-frigjøring fra urotelet. Perfusjon med pannexinkanalantagonistene Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) eller karbenoksolon (CBX, 100 μM) reduserer signifikant frigjøringen av ATP i blærens lumen ved alle trykk. Luminale ATP-konsentrasjoner reduseres ikke når connexinblokkeren 18a-glycyrrhetinsyre perfuseres, noe som indikerer at distensjonsfremkalt ATP-frigjøring medieres av pannexinkanaler og ikke connexinkanaler.

Figur 5 Representative målinger av distensjonsfremkalt ATP-frigjøring i urinblærens lumen. (A) Oppblåsthet av blæren øker luminal ATP-konsentrasjoner, som kan reduseres i nærvær av NTPDase-apyrasen (2 U / ml) eller økes når endogen NTPDaseser hemmet med ARL67156 (10 μM). (B) Distensjonsfremkalt ATP-frigjøring blokkeres av pannexinkanalantagonistene Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) og karbenoksolon (CBX, 100 μM), men ikke connexinkanalantagonisten 18a-glycyrrhetinsyre (18a-GA, 50 μM). Data presenteres som gjennomsnittet med standard feilfelt. ** p < 0,05 mellom de to stolpene angitt med linjen, ## p < 0,05 sammenlignet med Krebs-kontroller ved samme distensjon. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Beckel et ^al.8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Flertallet av forskningen på urotelial ATP-frigjøring utføres i dyrkede celler, ved bruk av enten immortaliserte cellelinjer eller primære kulturer av gnagere urotelceller. Selv om disse modellene har fordelen av å være relativt høy gjennomstrømning (dvs. en kultur / passasje kan lage mange plater / tallerkener av celler), blir deres fysiologiske relevans redusert på grunn av: 1) urotelcellers manglende evne til å vokse polarisert med mindre de dyrkes på spesielle støtter og 2) vanskeligheten med å utsette dyrkede celler for fysiologiske nivåer av strekk / trykk. En måte å håndtere disse begrensningene på er å fjerne blæren fra en gnager, kutte den åpen og plassere den i et Ussing-kammer, sette inn blærevevet mellom to halvkamre fylt med fysiologisk løsning. Dette gjør at forskeren kan utsette urotelet, i sin opprinnelige polariserte tilstand, for distensjon ved å legge volum til urotelsiden av kammeret, noe som forårsaker strekk av blærevevet i kammeret. Det er imidlertid vanskelig å relatere denne strekningen til distensjonen sett av urotelet in vivo. Videre frigjøres distensjonsfremkalt ATP i Ussing-kammeret i det store volumet av fysiologisk væske inneholdt i kammeret, og fortynner konsentrasjonen av ATP flere ganger. Ved hjelp av denne prosedyren måles blæretrykket direkte, slik at distensjon kan holdes i et område som er relevant for fysiologi eller patofysiologi. Siden vi måler ATP-konsentrasjon direkte fra luminalvæsken og ikke fra en vilkårlig og overdreven mengde væske som brukes til å opprettholde vev in vitro, trenger ikke den målte konsentrasjonen å korrigeres. Dermed tillater prosedyren beskrevet i dette papiret forskeren å undersøke ATP-frigjøring i blæren lumen under forhold som ligner mye mer på fysiologiske eller patofysiologiske forhold i blæren.

Den beskrevne teknikken er svært lik standard cystometri teknikker som brukes til å studere effekten av legemidler på refleks blære aktivitet og bør lett utføres av alle som rutinemessig utfører disse forsøkene. For de forskerne som er nye for blærekateterisering, er det imidlertid noen advarsler å være klar over. For det første kan transuretral kateterisering være vanskelig for uerfarne på grunn av krumningen i gnagerurinrøret. Dette kan også gjøres vanskeligere ved tetthet av den eksterne uretrale sfinkteren, selv under uretanbedøvelse. Det er viktig at forskeren ikke prøver å tvinge kateteret inn i urinrøret, da det mest sannsynlig vil føre til økt betennelse og hevelse, noe som igjen vil gjøre urinrøret enda vanskeligere å kateterisere. I tillegg er det mulig å peke kateteret gjennom urinrørets vegg, ødelegge hele forsøket.

Vi har utviklet noen tips og triks for å øke suksessraten. For eksempel er det noen ganger nødvendig å gi dyret en annen kort dose inhalert isofluran (0,5%-1,0%) for å slappe av urinrøret sphincter. Dette bør utføres sparsomt og med forsiktighet, da kombinasjonen av uretan og isofluran kan føre til respirasjonsdepresjon. Et annet triks er å dyppe spissen av kateteret i en 2% lidokainoppløsning før du setter den inn i den eksterne urinrøråpningen; Dette vil ofte føre til at lukkemuskelen slapper av etter noen minutter. Tømming av blæren ved forsiktig å trykke på dyrets underliv kan også bidra til å slappe av urinrøret sphincter. Endelig kan det være nødvendig å bruke et mindre kateter; Vi bruker noen ganger et 24 G kateter, spesielt med mindre dyr. Vær imidlertid oppmerksom på at det kan være nødvendig å redusere infusjonshastigheten i blæren når du bruker et transuretralt kateter med mindre målebånd, for å matche den langsommere drenasje fra urinrørskateteret. Unnlatelse av å gjøre dette vil føre til at blæretrykket stiger, til tross for at urinrørskateteret ikke er avkortet.

Det skal bemerkes at uretan brukes som bedøvelsesmiddel i denne protokollen. Uretan brukes ofte i laboratorier som studerer nedre urinveiene, siden det sparer miksjonsrefleksen, mens andre anestetika ikke gjør det. På grunn av dette vil distensjon av blæren over et trykk på ~ 7-10 cm H₂O under uretanbedøvelse utløse en miksjonsrefleks. Siden vi er interessert i ATP-frigjøring som svar på passiv distensjon, krever denne protokollen blokkering av blærekontraksjoner ved bruk av ganglionisk blokkering av heksametanium. Dette gjør det mulig å måle ATP-frigjøring som respons på høyere intravesikalt trykk (dvs. 30 cm_H2O) som ofte ses i blærepatologi som involverer utløpsobstruksjon. Derfor tillater bruk av uretan / heksametanium måling av distensjonsfremkalt luminal ATP-frigjøring i lange perioder (virkningsvarigheten av begge legemidlene måles i timer). Noen laboratorier kan imidlertid foretrekke å bruke et bedøvelsesmiddel som ikke sparer mikturjonsrefleksen, for eksempel ketamin, og eliminerer behovet for en ganglionisk blokkering. Dette vil også fungere godt for denne prosedyren, selv om det vil kreve hyppigere (eller kontinuerlig) administrasjon på grunn av den kortere virkningstiden av bedøvelsen.

En bemerkelsesverdig forskjell mellom denne teknikken for å måle ATP og det vanlige cystometrioppsettet urologiforskere kan være kjent med, er bruken av bufret Krebs-løsning som perfusat i stedet for standard isotonisk saltoppløsning. ATP er et ganske labilt molekyl og stabiliseres noe i en bufret løsning. I tillegg er sammensetningen av Krebs-løsningen mye nærmere den av urin enn saltvann, noe som ytterligere legger til klinisk relevans for disse forsøkene. Dette er en viktig faktor, da kontrollen av urotelial ATP-frigjøring har vist seg å være modulert av kalsiumpermeable kanaler, og mangelen på kalsium i normal saltoppløsning kan påvirke ATP-frigivelsen negativt. Ustabiliteten til ATP i oppløsning er også grunnen til at vi foreslår at prøvene umiddelbart kvantifiseres ved hjelp av luciferin-luciferase-reaksjonen. Men hvis forskeren ikke klarer å lese prøvene umiddelbart, bør prøvene fryses så raskt som mulig for å begrense nedbrytningen av ATP.

En begrensning av denne teknikken er at den bare måler luminal ATP-frigjøring og ikke kan måle ATP-frigjøring fra den serosale siden av urotelet. Det antas at ATP frigjøres fra serosalsiden for direkte å påvirke afferente spenning; Direkte måling av denne utgivelsen er imidlertid vanskelig. I dette tilfellet er bruk av celler dyrket på permeable membranstøtter som Transwell-plater eller kirurgisk fjerning av urotelet for Ussing-kammereksperimenter den foretrukne teknikken. Imidlertid, gitt den tilsynelatende betydningen av luminal ATP i blærepatologi, er denne eksperimentelle modellen et nyttig verktøy for å belyse de cellulære mekanismene som styrer urotelial ATP-frigjøring under patologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose