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Vivo में कृन्तकों में डिस्टेंशन-इवोकेटेड यूरोथेलियल एटीपी रिलीज का ल्यूमिनल माप

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64227
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल एक एनेस्थेटाइज्ड कृंतक में मूत्राशय के लुमेन में एटीपी सांद्रता को मापने की प्रक्रिया का वर्णन करता है।

Abstract

मूत्राशय के विघटन के जवाब में यूरोथेलियम से जारी एटीपी को माइक्रोट्यूरियन के नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण संवेदी भूमिका निभाने के लिए माना जाता है। इसलिए, एक शारीरिक सेटिंग में यूरोथेलियल एटीपी रिलीज का सटीक माप मूत्राशय में प्यूरीनर्जिक सिग्नलिंग को नियंत्रित करने वाले तंत्र का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है। यांत्रिक रूप से उत्पन्न यूरोथेलियल एटीपी रिलीज का अध्ययन करने के लिए मौजूदा तकनीकें लचीले समर्थन या मूत्राशय के ऊतकों पर चढ़ाई गई सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग करती हैं; हालांकि, इनमें से प्रत्येक तकनीक बरकरार मूत्राशय में स्थितियों का पूरी तरह से अनुकरण नहीं करती है। इसलिए, कृंतक मूत्राशय के लुमेन में एटीपी सांद्रता को सीधे मापने के लिए एक प्रयोगात्मक सेटअप विकसित किया गया था।

इस सेटअप में, एनेस्थेटाइज्ड कृन्तकों के मूत्राशय को मूत्राशय के गुंबद और बाहरी मूत्रमार्ग छिद्र दोनों में कैथेटर के माध्यम से संक्रमित किया जाता है। गुंबद के माध्यम से मूत्राशय में बाँझ तरल पदार्थ डालने के दौरान मूत्रमार्ग कैथेटर को कैप करके मूत्राशय में दबाव बढ़ जाता है। इंट्रावेसिक दबाव का माप मूत्राशय गुंबद कैथेटर से जुड़े दबाव ट्रांसड्यूसर का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है, जो सिस्टोमेट्री के लिए उपयोग किए जाने वाले सेटअप के समान है। एक बार वांछित दबाव तक पहुंचने के बाद, मूत्रमार्ग कैथेटर की टोपी को हटा दिया जाता है, और ल्यूसिफेरिन-लूसिफेरस परख द्वारा एटीपी परिमाणीकरण के लिए तरल पदार्थ एकत्र किया जाता है। इस प्रयोगात्मक सेटअप के माध्यम से, यूरोथेलियल एटीपी रिलीज के यांत्रिक और रासायनिक उत्तेजना दोनों को नियंत्रित करने वाले तंत्र को विभिन्न एगोनिस्ट या विरोधी को पर्फ्यूसेट में शामिल करके या वाइल्डटाइप और आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों के बीच परिणामों की तुलना करके पूछताछ की जा सकती है।

Introduction

मूत्र एटीपी को माइक्रोट्यूरियन1 के नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण संवेदी भूमिका निभाने के लिए माना जाता है। उदाहरण के लिए, यह माना जाता है कि एटीपी को डिस्टेंशन के जवाब में यूरोथेलियम से जारी किया जाता है जहां यह मूत्राशय अभिवाही नसों पर रिसेप्टर्स पर उनकी उत्तेजना बढ़ाने के लिए कार्य कर सकता है, जिससे परिपूर्णता की संवेदनाएंहोती हैं। इस प्रकार, यह भी सोचा जाता है कि मूत्राशय की विकृति के विकास में मूत्र एटीपी एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी हो सकता है। इस परिकल्पना के समर्थन में, अतिसक्रिय मूत्राशय (ओएबी) 3, मूत्राशय दर्द सिंड्रोम / अंतरालीय सिस्टिटिस (बीपीएस / आईसी) 4, या मूत्र पथ के संक्रमण (यूटीआई) 5,6 से पीड़ित रोगियों में मूत्र एटीपी सांद्रता में काफी वृद्धि हुई है, सभी स्थितियां बढ़ी हुई तात्कालिकता, आवृत्ति और, कभी-कभी, दर्द की विशेषता है। इसके विपरीत, अंडरएक्टिव मूत्राशय (यूएबी) से पीड़ित रोगियों, जो किसी के मूत्राशय को खाली करने में असमर्थता की विशेषता है और कभी-कभी मूत्राशय की परिपूर्णता को समझने की क्षमता में कमी आ सकती है, को मूत्र एटीपी सांद्रता में कमी देखी गईहै। प्रयोगात्मक रूप से, मूत्र एटीपी सांद्रता का हेरफेर चूहे में मूत्राशय की सजगता को बदल सकता है; मूत्राशय लुमेन में अंतर्जात एटीपीस को अवरुद्ध करके एटीपी सांद्रता में वृद्धि शून्य आवृत्ति को बढ़ा सकती है, जबकि मूत्राशय में बहिर्जात एटीपीस डालकर एटीपी सांद्रता को कम करने से शून्य आवृत्तिकम हो जाती है। इस प्रकार, मूत्राशय समारोह के लिए मूत्र एटीपी का महत्व स्पष्ट है।

मूत्राशय विकृति के लिए मूत्र एटीपी के स्पष्ट महत्व को देखते हुए, यूरोथेलियल एटीपी रिलीज का सटीक माप रिलीज को नियंत्रित करने वाले तंत्र को समझने में एक महत्वपूर्ण कदम है। यूरोथेलियल एटीपी रिलीज को मापने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग करके कई अध्ययन पूरे किए गए हैं। इनमें से सबसे महत्वपूर्ण सेल संस्कृतियां हैं, या तो प्राथमिक संस्कृतियां या सेल लाइनें। हालांकि, सुसंस्कृत यूरोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग इस तथ्य से जटिल है कि यूरोथेलियल कोशिकाएं अपने शारीरिक ध्रुवीकृत आकृति विज्ञान को तब तक नहीं लेती हैं जब तक कि वे विशेष पारगम्य झिल्ली (जैसे ट्रांसवेल तकनीक [अच्छी तरह से सम्मिलित]) पर नहीं उगाई जाती हैं। इस प्रकार, शरीर विज्ञान से मापा गया किसी भी एटीपी रिलीज से संबंधित होना मुश्किल है। अच्छी तरह से डालने पर उगाई गई यूरोथेलियल कोशिकाएं ध्रुवीकरण कर सकती हैं और विवो में देखी जाने वाली बाधा बना सकती हैं; हालांकि, पूरी तरह से विभेदित यूरोथेलियम के विकास में दिन या सप्ताह लग सकते हैं। इसके अतिरिक्त, जबकि एक यूसिंग कक्ष में अच्छी तरह से सम्मिलित करना और खिंचाव पैदा करने के लिए एपिकल साइड पर दबाव लागू करना संभव है, पैथोलॉजी के दौरान मूत्राशय के अंदर स्थितियों की नकल करने के लिए पर्याप्त दबाव लागू करना मुश्किल है (यानी, 30 सेमी एच2ओ या उससे ऊपर का दबाव)। खिंचाव प्रयोगों के लिए पूरे मूत्राशय के ऊतकों को एक यूसिंग कक्ष में भी रखा जा सकता है, लेकिन यह मूत्राशय को मूत्राशय को यूरोथेलियल सेल स्वास्थ्य को बनाए रखने वाले ट्रॉफिक कारकों के साथ-साथ जीव से हटा देता है और इसलिए, यूरोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन। इसलिए, खिंचाव या दबाव के जवाब में यूरोथेलियम से एटीपी की रिहाई का अध्ययन करने का सबसे शारीरिक रूप से प्रासंगिक तरीका विवो में है। प्रयोग को स्थापित करने के लिए आवश्यक सर्जिकल तकनीक आमतौर पर पशु सिस्टोमेट्री में उपयोग की जाने वाली तकनीकों के समान हैं और इसलिए, उस तकनीक से परिचित किसी भी व्यक्ति द्वारा आसानी से किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल में, हम लगभग 200-250 ग्राम वजन वाले मादा स्प्राग डॉवले चूहों में ल्यूमिनल एटीपी की जांच करने के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीक का वर्णन करेंगे, क्योंकि नीचे वर्णित ट्रांसयूरेथ्रल कैथीटेराइजेशन महिलाओं में बहुत आसान है; हालांकि, ट्रांसयूरेथ्रल कैथीटेराइजेशन नर कृन्तकों में भी किया जा सकता है। चूंकि ट्रांसयूरेथ्रल कैथीटेराइजेशन अब दोनों लिंगों के चूहों के साथ-साथ11 में भी किया गया है, इन प्रयोगों को अनुसंधान टीम की जरूरतों के आधार पर आसानी से चूहों या या तो लिंग या अलग-अलग आकार के चूहों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

कृन्तकों में की गई सभी प्रक्रियाओं को लागू दिशानिर्देशों का पालन करना चाहिए और स्थानीय संस्थागत नैतिकता समीक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए। इस पांडुलिपि के लिए किए गए प्रयोगों को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद की मार्गदर्शिका के अनुसार किया गया था और पिट्सबर्ग स्कूल ऑफ मेडिसिन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले मानक कृंतक सिस्टोमेट्री सेटअप के संशोधित संस्करण के लिए चित्रा 1 देखें।

1. प्रयोगशाला जानवर

  1. 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र और पानी और भोजन छर्रों तक पहुंच के साथ सामाजिक आवास (एक पिंजरे में कई कृन्तक) में चूहों को बनाए रखें।

2. एनेस्थीसिया और गैंग्लियनिक ब्लॉक

  1. जानवर को ओ2 (1 एल / मिनट) में 4% -5% आइसोफ्लुरेन के साथ गैस वाले एक बंद बॉक्स में रखकर प्रारंभिक संज्ञाहरण को प्रेरित करें।
  2. यूरेथेन का उपयोग करके जानवर को एनेस्थेटाइज करें।
    1. 1.2 ग्राम / किग्रा की खुराक पर द्विपक्षीय रूप से (जानवर के प्रत्येक तरफ 1/2 खुराक) यूरेथेन को इंजेक्ट करें। यूरेथेन को प्रभावी होने की अनुमति देने के लिए जानवर को पिंजरे में रखें, जिसमें आम तौर पर 2 घंटे लगते हैं।
    2. वैकल्पिक रूप से, दो अलग-अलग खुराक ~ 10 मिनट में पूरी खुराक इंजेक्ट करके यूरेथेन इंट्रापेरिटोनियल (यानी) प्रशासित करें।
  3. यूरेथेन के प्रभावी होने के लिए उपयुक्त समय की प्रतीक्षा करने के बाद (एस.सी.: 2 घंटे, यानी: 30 मिनट), बल का उपयोग करके जानवर के पैर को चुटकी लेकर संज्ञाहरण के उचित विमान के लिए परीक्षण करें। यदि रिफ्लेक्स देखा जाता है, तो यूरेथेन की एक अतिरिक्त खुराक (0.05-0.1 एमएल यानी) का प्रशासन करें, 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और फिर से परीक्षण करें। पूरी प्रक्रिया में संज्ञाहरण के उचित विमान के लिए जानवर की निगरानी जारी रखें।
  4. डिस्टेंशन के दौरान मूत्राशय के संकुचन को रोकने के लिए, जानवर को एक गैंग्लियन ब्लॉकिंग एजेंट के साथ इंजेक्ट करें, जैसे कि हेक्सामेथोनियम (20 मिलीग्राम /
  5. प्रयोग के दौरान सूखने से रोकने के लिए जानवर की आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें।

3. सर्जिकल प्रक्रिया-सुप्राप्यूबिक मूत्राशय कैथीटेराइजेशन

  1. जानवर के पेट को शेव करें और मूत्राशय को उजागर करने के लिए एक मध्य रेखा लैप्रोटॉमी करें।
  2. एक लौ का उपयोग करके पीई 50 इंट्रामेडिक टयूबिंग की छोटी (~ 10-15 सेमी) लंबाई के एक छोर को घुमाकर एक कैथेटर तैयार करें। ट्यूबिंग के दूसरे छोर में एक 22 जी सुई रखें और क्रेब्स समाधान से भरें (संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
  3. मूत्राशय के गुंबद के ऊपर 3-0 रेशम सीवन का एक छोटा लूप रखें और ऊपर बने कैथेटर के भड़के हुए छोर को डालने के लिए पर्याप्त बड़ा एक छोटा सिस्टोस्टोमी (बारीक कैंची या 18 ग्राम सुई का उपयोग करके) करें। कैथेटर को एक हाथ से पकड़े हुए, कैथेटर को सुरक्षित करने के लिए सीवन के लूप को कसने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करें। सीवन में दो समुद्री मील बांधकर कैथेटर को सुरक्षित करना समाप्त करें और कैथेटर को वापस खींचें जब तक कि भड़के हुए सिर मूत्राशय की दीवार के संपर्क में न हो।
    1. वैकल्पिक रूप से, क्लासिक पर्स-स्ट्रिंग सीवन तकनीक का उपयोग करके कैथेटर को सुरक्षित करें, जैसा कि पहले सिस्टोमेट्री12 के लिए वर्णित किया गया था।
      नोट: इस प्रक्रिया के दौरान मूत्राशय में हवा के बुलबुले पेश नहीं करना अनिवार्य है।
  4. कैथेटर के माध्यम से क्रेब्स समाधान की थोड़ी मात्रा को शामिल करके लीक के लिए सेटअप का परीक्षण करें। यदि तरल पदार्थ सिस्टोस्टोमी से बाहर निकलता है, तो सिस्टोस्टोमी के चारों ओर अतिरिक्त सीवन के साथ कैथेटर को फिर से सुरक्षित करें।

4. ट्रांसयूरेथ्रल कैथीटेराइजेशन

  1. सर्जिकल स्नेहक में 20 जी एक्स 1 "आईवी कैथेटर (सुई हटाने के साथ) के अंत को डुबोएं।
  2. बाहरी मूत्रमार्ग के मांस को बल की एक जोड़ी के साथ धीरे से पकड़ें और कैथेटर की नोक को पूंछ की दिशा में मूत्रमार्ग छिद्र में डालें जब तक कि नोक आसन्न योनि की दीवार को विकृत न कर दे। कैथेटर को 90 ° घुमाएं (कैथेटर के लुएर-लॉक छोर को पूंछ की ओर लाएं) और धीरे से आगे बढ़ें। कैथेटर को पूरी तरह से डालें जब तक कि लुएर-लॉक हब बाहरी मूत्रमार्ग खोलने से लगभग 5 मिमी दूर न हो।
    नोट: कैथेटर को बहुत दूर न डालें, जिससे मूत्राशय की अंदर की दीवार को छेदने के लिए टिप हो सकती है। यदि कैथेटर को आगे बढ़ाते समय प्रतिरोध महसूस किया जाता है, तो रुकें और फिर से शुरू करें या मूत्रमार्ग को पंक्चर करने का जोखिम उठाएं। सफल कैथीटेराइजेशन को बढ़ाने के लिए युक्तियों पर चर्चा अनुभाग देखें।
  3. कैथेटर को सुरक्षित करें और बाहरी मूत्रमार्ग मीटस के चारों ओर 3-0 रेशम सीवन की छोटी लंबाई को लूप करके कैथेटर के चारों ओर रिसाव को रोकें और इसे कसकर बांध दें। कैथेटर को टेप के साथ पूंछ में सुरक्षित करें ताकि इसे गलती से बाहर खींचने से रोका जा सके।
  4. एक बार कैथेटरीकृत होने के बाद, धीरे से सुप्राप्यूबिक मूत्राशय कैथेटर के माध्यम से मूत्राशय में क्रेब्स समाधान डालें और पुष्टि करें कि द्रव मूत्रमार्ग कैथेटर से बाहर निकलता है और इसके आसपास नहीं। यदि आवश्यक हो, तो बाहरी मूत्रमार्ग छिद्र के चारों ओर सीवन को फिर से तैयार करें।
  5. 3-0 रेशम सीवन का उपयोग करके मूत्राशय पर पेट के चीरे को बंद करें।

5. प्रायोगिक सेटअप

  1. मूत्रमार्ग कैथेटर के माध्यम से इंट्रावेसिक द्रव की निकासी में सहायता करने में सक्षम एक बोर्ड पर जानवर को सुरक्षित करें। शरीर की गर्मी को बनाए रखने और मूत्रमार्ग कैथेटर से निकलने वाले तरल पदार्थ को अवशोषित करने के लिए जानवर और बोर्ड के बीच एक हीटिंग पैड और शोषक अंडरपैड रखें।
  2. सुप्राप्यूबिक कैथेटर को तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक से कनेक्ट करें, जो कैथेटर को सिरिंज पंप और प्रेशर ट्रांसड्यूसर से जोड़ता है। एक एम्पलीफायर और एक डेटा अधिग्रहण प्रणाली के माध्यम से दबाव ट्रांसड्यूसर को कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
    नोट: सिरिंज पंप, ट्रांसड्यूसर और मूत्राशय कैथेटर को जोड़ने वाली ट्यूबिंग में हवा के बुलबुले को बनने से रोकने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
  3. दबाव ट्रांसड्यूसर और / या डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के निर्माता द्वारा सुझाई गई प्रक्रिया का उपयोग करके मूत्राशय के दबाव रिकॉर्डिंग को कैलिब्रेट करें।
  4. 0.1 एमएल / मिनट की दर से सुप्राप्यूबिक कैथेटर के माध्यम से क्रेब्स समाधान को इंजेक्ट करें और कैथेटर प्रत्यारोपण के दौरान जारी किसी भी अवशिष्ट एटीपी को धोने के लिए 1 घंटे के लिए मूत्रमार्ग कैथेटर से तरल पदार्थ निकालने की अनुमति दें।
  5. इस वॉशआउट अवधि के बाद, लुएर-लॉक प्लग का उपयोग करके मूत्रमार्ग कैथेटर को कैप करें और मूत्राशय में दबाव को मापें। दबाव में तेज वृद्धि के बिना 30 सेमी एच2ओ के दबाव में इंट्रावेसिकल दबाव में धीमी वृद्धि की तलाश करें, जो मूत्राशय के संकुचन का संकेत देगा (चित्र 2 देखें)। मूत्राशय को नुकसान को रोकने के लिए दबाव 30 सेमी एच2ओ तक पहुंचने पर मूत्रमार्ग कैथेटर से प्लग को हटा दें।
    नोट: यदि मूत्राशय के संकुचन 1 घंटे के बाद भी होते रहते हैं, तो हेक्सामेथोनियम (5 मिलीग्राम / किग्रा खुराक यानी) की एक अतिरिक्त खुराक दें।

6. नमूने का संग्रह

  1. मूत्राशय को 0.1 एमएल / मिनट पर डालें और मूत्रमार्ग कैथेटर से एलुएट एकत्र करें। एटीपी के लिए तुरंत एलुएट के 100 μL एलिकोट का परीक्षण करें (नीचे देखें) या बाद के बैच परिमाणीकरण के लिए फ्रीज करें।
  2. ल्यूमिनल एटीपी सांद्रता पर मूत्राशय के विघटन के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, प्लग के साथ मूत्रमार्ग कैथेटर को कैप करें और मूत्राशय के दबाव की निगरानी करें जब तक कि यह वांछित स्तर तक न पहुंच जाए। फिर, मूत्रमार्ग कैथेटर को अनकैप करें और एटीपी माप या ठंड के लिए एलुएट एकत्र करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है।
  3. प्रत्येक डिस्टेंशन के बाद, मूत्राशय को आराम करने दें और अतिरिक्त नमूने लेने से पहले 10-15 मिनट के लिए धो लें। पुनरावृत्ति प्रदर्शित करने के लिए प्रत्येक वांछित विचलन दबाव पर कुल 3-5 प्रीडिस्टेंशन नमूने और 3-5 नमूने लें।
  4. एटीपी की रिहाई पर दवाओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, मूत्राशय को क्रेब्स में शामिल करने वाले क्रेब्स समाधान को स्विच करें जिसमें पसंद की दवा होती है। दवा के प्रभाव के लिए 10-15 मिनट के लिए 0.1 एमएल / मिनट पर टैप करें, और फिर चरण 6.1 और 6.2 में वर्णित गैर-अव्यवस्थित और अव्यवस्थित मूत्राशय से नमूने एकत्र करें।

7. एकत्र किए गए नमूनों से एटीपी की मात्रा निर्धारित करना

  1. निर्माता के निर्देशों और एक लुमिनोमीटर के बाद व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ल्यूसिफेरिन / लूसिफेरस परख किट का उपयोग करके एकत्र किए गए 100 μL नमूनों में एटीपी की मात्रा निर्धारित करें।
    1. एटीपी की मात्रा निर्धारित करने के लिए, परख मिश्रण के 50 μL के साथ परफ्यूसेट के 100 μL नमूनों को मिलाएं और उन्हें पढ़ने के लिए ल्यूमिनोमीटर में रखें। लुमिनोमीटर द्वारा रिपोर्ट की गई रिलेटिव लाइट यूनिट्स (आरएलयू) को एटीपी की एकाग्रता में परिवर्तित करने के लिए, क्रेब्स समाधान में एटीपी के सीरियल कमजोर पड़ने को 10 गुना कमजोर करने में 10 गुना कमजोर करने के लिए 1 0 गुना कमजोर करने और उन्हें ल्यूमिनोमीटर में पढ़ने के लिए बनाया जाता है। एक ग्राफ पर परिणामी रीडिंग को प्लॉट करें और जानवर से लिए गए नमूनों से सांद्रता को विस्तारित करने के लिए एक गैर-रैखिक (द्विघात) प्रतिगमन करें।
      नोट: प्रयोग में परीक्षण किए गए किसी भी दवा समाधान के लिए एटीपी मानक बनाना महत्वपूर्ण है, क्योंकि कई दवाएं लूसिफेरिन / लूसिफेरस प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप करती हैं, जिसे ठीक किया जाना चाहिए।

8. जानवरों की इच्छामृत्यु

  1. जब प्रयोग पूरा हो जाता है और सभी नमूने एकत्र किए जाते हैं, तो यूएसडीए दिशानिर्देशों और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद की मार्गदर्शिका के अनुसार जानवर को मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दी जाती है।
    1. प्रयोगात्मक सेटअप से एनेस्थेटाइज्ड जानवर को हटा दें, इसे एक बंद बॉक्स में रखें, और इसे 100% सीओ2 के साथ गैस दें। सुनिश्चित करें कि भरने की दर प्रति मिनट कक्ष मात्रा के 30% -70% के बराबर है (उदाहरण के लिए, 10 एल वॉल्यूम वाले बॉक्स के लिए 3-7 एल / मिनट)। श्वसन बंद होने के बाद कम से कम 1 मिनट के लिए सीओ2 प्रवाह जारी रखें।
  2. मृत्यु सुनिश्चित करने के लिए इच्छामृत्यु के द्वितीयक रूप का उपयोग करें।
    1. इच्छामृत्यु के द्वितीयक रूप के रूप में थोराकोटॉमी करें, उरोस्थि के पुच्छल छोर पर त्वचा के छोटे फ्लैप को पकड़कर और कैंची की एक तेज जोड़ी के साथ डायाफ्राम में त्वचा और मांसलता में एक छोटा छेद काटकर। कैंची को खोलने में डालकर और पसली के पिंजरे के माध्यम से रोस्टरैली काटकर थोरैकोटॉमी को पूरा करें और वक्ष गुहा को उजागर करें।
      नोट: इच्छामृत्यु पशु को संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार निपटाया जाना चाहिए।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल मानक कृंतक सिस्टोमेट्री सेटअप के एक संशोधित संस्करण का उपयोग करके मूत्राशय के लुमेन से विवो में यूरोथेलियल एटीपी रिलीज के सटीक माप की अनुमति देता है ( चित्रा 1 देखें)। यह शोधकर्ता को एक शारीरिक सेटिंग में खिंचाव-मध्यस्थता एटीपी रिलीज पर दवाओं के प्रभावों की जांच करने की अनुमति देता है।

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक सेटअप. (A) विभिन्न उपकरणों के लेबल के साथ प्रयोगात्मक सेटअप दिखाने वाली छवि. लाल आयत में उल्लिखित जानवर का क्षेत्रफल B में दिखाया गया है । (बी) सर्जरी के बाद चूहे के पेट को दर्शाती तस्वीर। मूत्राशय के गुंबद में डाले गए और बंधे सुप्राप्यूबिक कैथेटर के साथ-साथ बाहरी छिद्र के माध्यम से डाले गए मूत्रमार्ग कैथेटर पर ध्यान दें। मूत्रमार्ग कैथेटर को फोटो में प्लग किया गया है ताकि यह दिखाया जा सके कि मूत्राशय कैथेटर के माध्यम से छिड़काव के दौरान मूत्राशय का दबाव बढ़ जाता है। प्रयोग के दौरान, पेट के उद्घाटन को बंद कर दिया जाएगा, लेकिन मूत्राशय के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए यहां खुला छोड़ दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कृंतक मूत्राशय में खिंचाव-मध्यस्थता एटीपी रिलीज के सफल माप के लिए प्राथमिक महत्व यह सुनिश्चित करना है कि माइक्रोट्यूरियन रिफ्लेक्स अवरुद्ध है, जिससे मूत्राशय को सामान्य रूप से माइक्रोट्यूरियन रिफ्लेक्स को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त दहलीज दबाव से परे विकृत किया जा सकता है। जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है, जब मूत्रमार्ग कैथेटर को प्लग किया जाता है, तो मूत्राशय में घोल का जलसेक मूत्राशय के सिकुड़ने के साथ इंट्रावेसिक दबाव तेजी से बढ़ने का कारण बनता है। जैसा कि हम यूरोथेलियल एटीपी रिलीज पर निष्क्रिय खिंचाव के प्रभावों में रुचि रखते हैं, संकुचन नहीं, जानवर को एक गैंग्लियन ब्लॉकर, हेक्सामेथोनियम के साथ इलाज किया जाता है, ताकि माइक्रोट्यूरियन रिफ्लेक्स को रोका जा सके। जैसा कि चित्र 2 बी में दिखाया गया है, जब हेक्सामेथोनियम प्रशासित किया जाता है, तो मूत्रमार्ग कैथेटर अवरुद्ध के साथ मूत्राशय में घोल के इंजेक्शन के परिणामस्वरूप इंट्रावेसिक दबाव में बहुत अधिक क्रमिक वृद्धि होती है, जिससे संकुचन के बिना दबाव 30 सेमी एच2ओ तक बढ़ जाता है। यह पैथोलॉजी के लिए प्रासंगिक होने के लिए पर्याप्त दबाव पर ल्यूमिनल एटीपी रिलीज के माप की अनुमति देता है, जैसे कि एक अंडरएक्टिव मूत्राशय, आंशिक मूत्राशय आउटलेट रुकावट, या रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद डेट्रूसर-स्फिंक्टर डिस्सिनर्जिया के दौरान देखा जाता है। हालांकि इसे माइक्रोट्यूरियन रिफ्लेक्स को पूरी तरह से अवरुद्ध करने के लिए हेक्सामेथोनियम की पूरक खुराक की आवश्यकता हो सकती है, लेकिन ओवरडोज के परिणामस्वरूप पर्याप्त प्रशासन नहीं करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इससे कार्डियक आउटपुट में काफी कमी आ सकती है और प्रयोग की गुणवत्ता से समझौता हो सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि मूत्राशय रिफ्लेक्स पर एक ही निरोधात्मक प्रभाव या तो पेल्विक नसों को द्विपक्षीय रूप से काटकर या स्तर एल 4 या उससे ऊपर की रीढ़ की हड्डी को अलग करके प्राप्त किया जा सकता है। यह, ज़ाहिर है, प्रयोगात्मक सेटअप की कठिनाई और प्रयोग को पूरा करने के लिए आवश्यक समय को काफी बढ़ाता है।

Figure 2
चित्रा 2: चूहों से दबाव रिकॉर्डिंग। पहले (ए) और बाद में (बी) गैंग्लियनिक ब्लॉक। तीर इंगित करते हैं कि मूत्रमार्ग कैथेटर कब प्लग किया गया था। ध्यान दें कि शीर्ष ट्रेस में दबाव तेजी से बढ़ता है जब दबाव माइक्रोट्यूरियन को प्रेरित करने के लिए दहलीज तक पहुंचता है, जबकि नीचे के निशान में दबाव धीरे-धीरे बढ़ता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इन प्रयोगों के लिए एक और बहुत ही महत्वपूर्ण विचार मानक वक्रों का उपयोग करके एटीपी की एकाग्रता के लिए लुमिनोमीटर रीडिंग (आमतौर पर आरएलयू में व्यक्त) के उचित रूपांतरण को सुनिश्चित करना है। लूसिफेरिन / लूसिफेरस प्रतिक्रिया हस्तक्षेप एजेंटों के लिए अतिसंवेदनशील होती है। यह हस्तक्षेप लूसिफेरिन / लूसिफेरस के साथ सीधी बातचीत से आ सकता है। उदाहरण के लिए, कई यौगिक लूसिफेरस के प्रतिस्पर्धी या गैर-प्रतिस्पर्धी अवरोधकों के रूप में कार्य कर सकते हैं; एक अध्ययन ने सुझाव दिया कि आणविक पुस्तकालयों में ~ 3% यौगिक छोटे अणु रिपॉजिटरी 11 μM14 से नीचे सांद्रता पर जुगनू लूसिफेरस को रोक सकते हैं। इसके अलावा, लूसिफेरिन ऑक्सीकरण एजेंटों के लिए अतिसंवेदनशील है, जिससे ल्यूमिनेसेंस-उत्पादक प्रतिक्रिया 15 के लिए उपलब्ध सब्सट्रेट की मात्रा कम होजाती है। प्रतिक्रिया के सह-कारक, मैग्नीशियम की उपलब्धता को बदलकर लूसिफेरिन / लूसिफेरस प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप करना भी संभव है। उदाहरण के लिए, इन विट्रो एटीपी प्रयोगों में यांत्रिक खिंचाव की नकल करने के लिए एक सामान्य तकनीक परफ्यूजिंग समाधान की परासरणता को कम करके सेल सूजन को प्रेरित करना है। हालांकि, कई शोधकर्ता पानी के साथ समाधान को पतला करके इस कमी को पूरा करते हैं, ल्यूसिफेरिन / लूसिफेरस प्रतिक्रिया में सह-कारक के रूप में कार्य करने के लिए उपलब्ध मैग्नीशियम की एकाग्रता को कम करते हैं। इसके अतिरिक्त, कुछ दवाओं को मैग्नीशियम लवण के रूप में बेचा जाता है, जो समाधान में मैग्नीशियम की मात्रा को बहुत बढ़ा सकता है, जिससे ल्यूमिनेसेंस रीडिंग में मापनीय अंतर भी हो सकता है। अंत में, एक दवा समाधान के लिए ल्यूसिफेरिन / लूसिफेरस प्रतिक्रिया द्वारा उत्पादित प्रकाश को सही ढंग से मापने की क्षमता में हस्तक्षेप करना संभव है। ब्रिलियंट ब्लू एफसीएफ (बीबी-एफसीएफ, जिसे एरियोग्लासीन या एफडी एंड सी ब्लू डाई # 1 के रूप में भी जाना जाता है) पेनेक्सिन-मध्यस्थता एटीपी रिलीज16 का एक विशिष्ट अवरोधक है। प्रभावी खुराक पर, ब्रिलियंट ब्लू एफसीएफ समाधान में एक अलग नीला रंग होता है, जो लगभग 600 एनएम17 के शिखर पर प्रकाश को अवशोषित करता है। यह प्रकाश के तरंग दैर्ध्य की सीमा के भीतर है जो जुगनू लूसिफेरस द्वारा उत्सर्जित होता है; इसलिए, बीबी-एफसीएफ के साथ प्रयोगों में प्रकाश उत्सर्जन बहुत कम हो जाता है। इस प्रकार, यह जरूरी है कि प्रयोग के दौरान एटीपी रिलीज को मापने के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक दवा वाले समाधानों में घुलित एटीपी की ज्ञात मात्रा का उपयोग करके मानक वक्रों का उपयोग किया जाए। जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, बीबी-एफसीएफ (100 μM) मानक वक्र के ढलान को काफी कम कर देता है, जो नमूने में एटीपी की एकाग्रता के लिए गणना किए गए मूल्यों को महत्वपूर्ण रूप से बदलने के लिए पर्याप्त है। जैसा कि चित्र 3 के निचले भाग में दिखाया गया है, बीबी-एफसीएफ युक्त नमूने में एटीपी की एकाग्रता की गणना करने के लिए क्रेब्स मानक का उपयोग करने से एटीपी एकाग्रता का ~ 50% तक कम आकलन हो सकता है। कुछ उदाहरणों में, गलत मानक वक्र का उपयोग एटीपी रिलीज में दवा-मध्यस्थता परिवर्तन को अस्पष्ट कर सकता है, या इसे गलती से प्रकट कर सकता है जैसे कि कोई परिवर्तन हुआ है। चित्र 3 में दर्शाए गए प्रयोग में, उदाहरण के लिए, सभी नमूनों के लिए क्रेब्स मानक का उपयोग करने से ऐसा प्रतीत होता है कि ब्रिलियंट ब्लू एफसीएफ ने एटीपी रिलीज को ~ 67% (16.6 से 5.5 एनएम) तक कम कर दिया था, जबकि वास्तविकता में, यह केवल ~ 42% (16.6 से 9.6 एनएम) कम हो गया था।

Figure 3
चित्रा 3: एटीपी मानक वक्र पर प्रयोगात्मक दवाओं का प्रभाव। ध्यान दें कि पैनेक्सिन चैनल विरोधी, ब्रिलियंट ब्लू, एटीपी की किसी भी एकाग्रता के लिए मापा गया आरएलयू को काफी बदल देता है, जिसके परिणामस्वरूप एटीपी मापा गया कम आंका जाएगा, अगर इसके लिए सही नहीं किया जाता है। संक्षिप्त नाम: आरएलयू = सापेक्ष प्रकाश इकाइयाँ; बीबी-एफसीएफ = ब्रिलियंट ब्लू एफसीएफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ध्यान रखने के लिए एक अन्य विचार यह है कि एटीपी आमतौर पर क्षति के परिणामस्वरूप ऊतकों से जारी किया जाता है, और इन सर्जिकल प्रक्रियाओं और मूत्रमार्ग कैथेटर सम्मिलन के परिणामस्वरूप असामान्य रूप से उच्च एटीपी रीडिंग होगी यदि सेटअप के तुरंत बाद लिया जाता है। यह प्रक्रिया प्रयोग स्थापित होने के बाद 1 घंटे की वॉशआउट अवधि का वर्णन करती है, जिसे छोड़ा नहीं जाना चाहिए। हमने पाया है कि 1 घंटे के बाद, मूत्राशय के अव्यवस्थित नहीं होने पर लिए गए नमूनों में मापा गया एटीपी सांद्रता अपेक्षाकृत कम (~ 10-30 एनएम) होती है, जबकि वॉशआउट अवधि से पहले लिए गए नमूने अधिक परिमाण के क्रम को पढ़ सकते हैं। संक्षेप में, 5 मिनट के वॉशआउट भी डिस्टेंशन के बीच किए जाने चाहिए क्योंकि एटीपी का स्तर थोड़े समय के लिए ऊंचा रह सकता है। अंगूठे का एक अच्छा नियम प्रयोग की शुरुआत में और प्रत्येक विचलन के बाद कई नमूनों में एटीपी को मापना होगा और केवल एटीपी रीडिंग स्तर पर आगे बढ़ेगा। चित्रा 4 में, हम विभिन्न समय बिंदुओं पर लिए गए माप के साथ एक विशिष्ट प्रयोग का प्रतिनिधित्व दिखाते हैं। वॉशआउट के बाद लिए गए (नमूने # 2 और # 6) बनाम प्री-वॉशआउट (नमूने # 1 और # 5) की तुलना में ली गई उच्च रीडिंग पर ध्यान दें।

Figure 4
चित्रा 4: एक विशिष्ट प्रयोग का प्रतिनिधित्व। एक विशिष्ट दबाव रिकॉर्डिंग का एक शैलीबद्ध प्रतिनिधित्व। प्रत्येक संख्या एक समय बिंदु का प्रतिनिधित्व करती है जब एक नमूना लिया गया था और एटीपी के लिए मापा गया था: 1) सेटअप पूरा होने के तुरंत बाद, वॉशआउट अवधि से पहले, 2) 1 घंटे की वॉशआउट अवधि के बाद, 3) डिस्टेंशन से ठीक पहले, 4) डिस्टेंशन के तुरंत बाद, 5) डिस्टेंशन के तुरंत बाद, और 6) डिस्टेंशन के बाद एक छोटी वॉशआउट अवधि के बाद। इनसेट तालिका प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिनिधि आरएलयू मान और एटीपी सांद्रता दिखाती है। संक्षिप्त नाम: आरएलयू = सापेक्ष प्रकाश इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5 यूरोथेलियम से एटीपी रिलीज के तंत्र की जांच करने वाले प्रयोगात्मक परिणामों के प्रतिनिधि ग्राफ दिखाता है। जैसा कि चित्रा 5 ए में दिखाया गया है, बढ़ते दबाव से मूत्राशय के लुमेन में एटीपी की एकाग्रता में उल्लेखनीय वृद्धि होती है, जिसमें 30 सेमी पानी के दबाव से लगभग 2.5 गुना गैर-अव्यवस्थित नियंत्रण की सांद्रता बढ़ जाती है। 2 यू / एमएल एपिरेस का इंट्रावेसिकल छिड़काव, एक एंजाइम जो एटीपी के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित करता है, मूत्राशय लुमेन में एटीपी की मापा एकाग्रता को काफी कम कर देता है। इसके विपरीत, यूरोथेलियम पर मौजूद एनटीपीडेस के अवरोधक एआरएल 67156 का इंट्रावेसिकल छिड़काव, ल्यूमिनल एटीपी सांद्रता में काफी वृद्धि करता है। चित्रा 5 बी यूरोथेलियम से खिंचाव-प्रेरित एटीपी रिलीज के तंत्र में प्रयोगों को दर्शाता है। पैनेक्सिन चैनल विरोधी ब्रिलिएंट ब्लू एफसीएफ (बीबी-एफसीएफ, 100 μM) या कार्बेनोक्सोलोन (CBX, 100 μM) के साथ छिड़काव सभी दबावों में मूत्राशय के लुमेन में एटीपी की रिहाई को काफी कम कर देता है। ल्यूमिनल एटीपी सांद्रता कम नहीं होती है जब कॉनेक्सिन ब्लॉकर 18- ग्लाइसीरेटिनिक एसिड का संक्रमण होता है, यह दर्शाता है कि डिस्टेंशन-इवोकेटेड एटीपी रिलीज को पेनेक्सिन चैनलों द्वारा मध्यस्थ किया जाता है, न कि कोनेक्सिन चैनलों द्वारा।

Figure 5
चित्रा 5: मूत्राशय के लुमेन में डिस्टेंशन-इवोकेटेड एटीपी रिलीज के प्रतिनिधि माप। (ए) मूत्राशय के विघटन से ल्यूमिनल एटीपी सांद्रता बढ़ जाती है, जिसे एनटीपीडेस एपायरेस (2 यू / एमएल) की उपस्थिति में कम किया जा सकता है या तब बढ़ाया जा सकता है जब अंतर्जात एनटीपीडेस को एआरएल 67156 (10 μM) के साथ बाधित किया जाता है। (बी) डिस्टेंशन-इवोकेटेड एटीपी रिलीज को पेनेक्सिन चैनल विरोधी ब्रिलिएंट ब्लू एफसीएफ (बीबी-एफसीएफ, 100 μM) और कार्बेनोक्सोलोन (CBX, 100 μM) द्वारा अवरुद्ध किया जाता है, लेकिन कॉनेक्सिन चैनल विरोधी 18-ग्लिसाइरेटिनिक एसिड (18-GA, 50 μM) द्वारा अवरुद्ध नहीं किया जाता है। डेटा को मानक त्रुटि पट्टियों के साथ माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। ** रेखा द्वारा इंगित दो सलाखों के बीच पी < 0.05, ## पी < 0.05 की तुलना में क्रेब्स नियंत्रण एक ही विचलन पर। यह आंकड़ा बेकेल एट अल.8 की अनुमति से पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यूरोथेलियल एटीपी रिलीज में अधिकांश शोध सुसंस्कृत कोशिकाओं में आयोजित किया जाता है, या तो अमर सेल लाइनों या कृंतक यूरोथेलियल कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग करके। जबकि इन मॉडलों में अपेक्षाकृत उच्च थ्रूपुट होने का लाभ होता है (यानी, एक संस्कृति / मार्ग कोशिकाओं की कई प्लेटें / व्यंजन बना सकता है), उनकी शारीरिक प्रासंगिकता निम्न के कारण कम हो जाती है: 1) यूरोथेलियल कोशिकाओं की ध्रुवीकृत होने में असमर्थता जब तक कि वे विशेष समर्थन पर नहीं उगाए जाते हैं और 2) सुसंस्कृत कोशिकाओं को खिंचाव / दबाव के शारीरिक स्तरों पर उजागर करने में कठिनाई। इन सीमाओं से निपटने का एक तरीका एक कृंतक से मूत्राशय को हटाना, इसे खोलना, और इसे एक उसिंग कक्ष में रखना, मूत्राशय के ऊतकों को शारीरिक समाधान से भरे दो आधे कक्षों के बीच डालना है। यह शोधकर्ता को अपनी मूल ध्रुवीकृत स्थिति में यूरोथेलियम को कक्ष के यूरोथेलियल पक्ष में मात्रा जोड़कर विघटन के अधीन करने की अनुमति देता है, जिससे कक्ष में मूत्राशय के ऊतकों का खिंचाव होता है। हालांकि, इस खिंचाव को विवो में यूरोथेलियम द्वारा देखे गए विचलन से संबंधित करना मुश्किल है। इसके अलावा, उसिंग कक्ष में डिस्टेंशन-इवोकेटेड एटीपी को कक्ष में निहित शारीरिक तरल पदार्थ की बड़ी मात्रा में जारी किया जाता है, जिससे एटीपी की एकाग्रता कई गुना कम हो जाती है। इस प्रक्रिया का उपयोग करके, मूत्राशय के दबाव को सीधे मापा जाता है, ताकि डिस्टेंशन को शरीर विज्ञान या पैथोफिज़ियोलॉजी के लिए प्रासंगिक सीमा में रखा जा सके। इसके अलावा, चूंकि हम एटीपी एकाग्रता को सीधे ल्यूमिनल द्रव से माप रहे हैं, न कि विट्रो में ऊतक को बनाए रखने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरल पदार्थ की मनमानी और अत्यधिक मात्रा से, मापी गई एकाग्रता को ठीक करने की आवश्यकता नहीं है। इस प्रकार, इस पेपर में वर्णित प्रक्रिया शोधकर्ता को मूत्राशय के लुमेन में एटीपी रिलीज की जांच करने की अनुमति देती है जो मूत्राशय की शारीरिक या पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों से अधिक निकटता से मिलती-जुलती है।

वर्णित तकनीक रिफ्लेक्स मूत्राशय गतिविधि पर दवाओं के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली मानक सिस्टोमेट्री तकनीकों के समान है और उन प्रयोगों को नियमित रूप से करने वाले किसी भी व्यक्ति द्वारा आसानी से किया जाना चाहिए। मूत्राशय कैथीटेराइजेशन के लिए नए शोधकर्ताओं के लिए, हालांकि, कुछ चेतावनियां हैं जिनके बारे में पता होना चाहिए। सबसे पहले, कृंतक मूत्रमार्ग की वक्रता के कारण अनुभवहीन लोगों के लिए ट्रांसयूरेथ्रल कैथीटेराइजेशन मुश्किल हो सकता है। यह बाहरी मूत्रमार्ग स्फिंक्टर की जकड़न से भी अधिक कठिन हो सकता है, यहां तक कि यूरेथेन संज्ञाहरण के तहत भी। यह जरूरी है कि शोधकर्ता कैथेटर को मूत्रमार्ग में मजबूर करने की कोशिश न करें, क्योंकि यह सबसे अधिक सूजन और सूजन का कारण होगा, जो बदले में मूत्रमार्ग को सफलतापूर्वक कैथेटर करने के लिए और भी कठिन बना देगा। इसके अतिरिक्त, मूत्रमार्ग की दीवार के माध्यम से कैथेटर को पोक करना संभव है, जिससे पूरे प्रयोग को बर्बाद कर दिया जाता है।

हमने सफलता की दर बढ़ाने के लिए कुछ टिप्स और ट्रिक्स विकसित किए हैं। उदाहरण के लिए, मूत्रमार्ग स्फिंक्टर को आराम देने के लिए जानवर को कभी-कभी साँस के आइसोफ्लुरेन (0.5% -1.0%) की एक और छोटी खुराक देना आवश्यक होता है। यह संयम से और देखभाल के साथ किया जाना चाहिए, क्योंकि यूरेथेन और आइसोफ्लुरेन के संयोजन के परिणामस्वरूप श्वसन अवसाद हो सकता है। एक और चाल कैथेटर की नोक को बाहरी मूत्रमार्ग छिद्र में डालने से पहले 2% लिडोकेन समाधान में डुबोना है; यह अक्सर स्फिंक्टर को कुछ मिनटों के बाद आराम करने का कारण बनता है। जानवर के पेट पर धीरे से दबाकर मूत्राशय को खाली करने से मूत्रमार्ग स्फिंक्टर को आराम करने में भी मदद मिल सकती है। अंत में, एक छोटे गेज कैथेटर का उपयोग करना आवश्यक हो सकता है; हम कभी-कभी 24 जी कैथेटर का उपयोग करते हैं, खासकर छोटे जानवरों के साथ। हालांकि, ध्यान रखें कि मूत्रमार्ग कैथेटर से धीमी जल निकासी से मेल खाने के लिए, एक छोटे गेज ट्रांसयूरेथ्रल कैथेटर का उपयोग करते समय मूत्राशय में जलसेक दर को कम करना आवश्यक हो सकता है। ऐसा करने में विफलता मूत्राशय के दबाव को बढ़ाने का कारण बनती है, मूत्रमार्ग कैथेटर को कैप नहीं किए जाने के बावजूद।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यूरेथेन का उपयोग इस प्रोटोकॉल में एनेस्थेटिक के रूप में किया जाता है। यूरेथेन का उपयोग आमतौर पर निचले मूत्र पथ का अध्ययन करने वाली प्रयोगशालाओं में किया जाता है, क्योंकि यह माइक्रोट्यूरियन रिफ्लेक्स को बचाता है जबकि अन्य एनेस्थेटिक्स नहीं करते हैं। इस वजह से, यूरेथेन एनेस्थीसिया के तहत ~ 7-10 सेमी एच2ओ के दबाव से ऊपर मूत्राशय का विघटन एक माइक्रोट्यूरियन रिफ्लेक्स को ट्रिगर करेगा। चूंकि हम निष्क्रिय विघटन के जवाब में एटीपी रिलीज में रुचि रखते हैं, इसलिए यह प्रोटोकॉल गैंग्लियन ब्लॉकर हेक्सामेथोनियम का उपयोग करके मूत्राशय के संकुचन को अवरुद्ध करने का आह्वान करता है। यह आमतौर पर मूत्राशय विकृति में देखे जाने वाले उच्च इंट्रावेसिक दबाव (यानी, 30 सेमी एच2ओ) के जवाब में एटीपी रिलीज के माप की अनुमति देता है जिसमें आउटलेट रुकावट शामिल होती है। हेक्सामेथोनियम का उपयोग लंबे समय तक डिस्टेंशन-इवोकेटेड ल्यूमिनल एटीपी रिलीज के माप की अनुमति देता है (दोनों दवाओं की कार्रवाई की अवधि घंटों में मापी जाती है)। हालांकि, कुछ प्रयोगशालाएं एक एनेस्थेटिक का उपयोग करना पसंद कर सकती हैं जो केटामाइन जैसे माइक्रोट्यूरियन रिफ्लेक्स को नहीं छोड़ता है, और गैंग्लियन ब्लॉकर की आवश्यकता को समाप्त करता है। यह इस प्रक्रिया के लिए भी अच्छी तरह से काम करेगा, हालांकि एनेस्थेटिक की कार्रवाई की कम अवधि के कारण इसे अधिक लगातार (या निरंतर) प्रशासन की आवश्यकता होगी।

एटीपी को मापने के लिए इस तकनीक और सामान्य सिस्टोमेट्री सेटअप यूरोलॉजी शोधकर्ताओं के बीच एक उल्लेखनीय अंतर मानक आइसोटोनिक खारा समाधान के बजाय एक पर्फ्यूसेट के रूप में बफर क्रेब्स समाधान का उपयोग है। एटीपी एक लेबिल अणु है और इसे कुछ हद तक एक बफर समाधान में स्थिर किया जाता है। इसके अतिरिक्त, क्रेब्स समाधान की संरचना खारा की तुलना में मूत्र के बहुत करीब है, जो इन प्रयोगों के लिए नैदानिक प्रासंगिकता को जोड़ती है। यह एक महत्वपूर्ण विचार है, क्योंकि यूरोथेलियल एटीपी रिलीज के नियंत्रण को कैल्शियम पारगम्य चैनलों द्वारा संशोधित किया गया है, और सामान्य खारा में कैल्शियम की कमी एटीपी रिलीज को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है। समाधान में एटीपी की अस्थिरता भी यही कारण है कि हम सुझाव देते हैं कि नमूनों को ल्यूसिफेरिन-लूसिफेरस प्रतिक्रिया का उपयोग करके तुरंत परिमाणित किया जाए। हालांकि, यदि शोधकर्ता तुरंत नमूने पढ़ने में असमर्थ है, तो एटीपी के क्षरण को सीमित करने के लिए नमूनों को जितनी जल्दी हो सके फ्रीज किया जाना चाहिए।

इस तकनीक की एक सीमा यह है कि यह केवल ल्यूमिनल एटीपी रिलीज को मापता है और यूरोथेलियम के सेरसल पक्ष से एटीपी रिलीज को माप नहीं सकता है। यह माना जाता है कि एटीपी को सीधे अभिवाही उत्तेजना को प्रभावित करने के लिए सेरसल पक्ष से जारी किया जाता है; हालांकि, इस रिलीज का प्रत्यक्ष माप मुश्किल है। इस मामले में, पारगम्य झिल्ली समर्थन जैसे ट्रांसवेल प्लेटों पर उगाई गई कोशिकाओं का उपयोग करना या शल्य चिकित्सा द्वारा यूसिंग चैंबर प्रयोगों के लिए यूरोथेलियम को हटाना पसंदीदा तकनीक है। हालांकि, मूत्राशय विकृति में ल्यूमिनल एटीपी के स्पष्ट महत्व को देखते हुए, यह प्रयोगात्मक मॉडल पैथोलॉजी के दौरान यूरोथेलियल एटीपी रिलीज को नियंत्रित करने वाले सेलुलर तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (एनआईडीडीके) से जेएमबी (डीके 117884) को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
amplifier World Precision Instruments (WPI) SYS-TBM4M
ATP assay kit Sigma-Aldrich, Inc. FLAA-1KT
data acquisition system/ software DataQ Instruments DI-1100 Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide Sigma-Aldrich, Inc. H0879 20 mg/kg dose
Isoflurane Covetrus North America 29404
lidocaine Covetrus North America 2468
Luer Lock plugs Fisher Scientific NC0455253
luminometer (GloMax 20/20) Promega E5311
Polyethylene (PE50) tubing Fisher Scientific 14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump Harvard Apparatus 703333
pressure transducers World Precision Instruments (WPI) BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) Fine Science Tools multiple numbers
surgical lubricant Fisher Scientific 10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter  Covetrus North America 50603 20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs) Fisher Scientific 01-288-30A
Tubing connectors Fisher Scientific 14-826-19E allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane Sigma-Aldrich, Inc. U2500 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose

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References

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चिकित्सा अंक 187
<em>Vivo में</em> कृन्तकों में डिस्टेंशन-इवोकेटेड यूरोथेलियल एटीपी रिलीज का ल्यूमिनल माप
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Daugherty, S. L., Healy, K. M.,… More

Daugherty, S. L., Healy, K. M., Beckel, J. M. In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents. J. Vis. Exp. (187), e64227, doi:10.3791/64227 (2022).

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