В городе Виво Просветное измерение высвобождения уротелиального АТФ, вызванного растяжением, у грызунов

Summary

Данный протокол описывает процедуру измерения концентраций АТФ в просвете мочевого пузыря у обезболенного грызуна.

Abstract

АТФ, высвобождаемый из уротелия в ответ на растяжение мочевого пузыря, как полагают, играет значительную сенсорную роль в контроле мочеиспускания. Поэтому точное измерение высвобождения уротелиальной АТФ в физиологических условиях является важным первым шагом в изучении механизмов, которые контролируют пуринергическую сигнализацию в мочевом пузыре. Существующие методы изучения механически вызванного высвобождения уротелиального АТФ используют культивируемые клетки, покрытые гибкими опорами или тканью мочевого пузыря, закрепленной в камерах Ussing; однако каждый из этих методов не полностью эмулирует состояния в неповрежденном мочевом пузыре. Поэтому была разработана экспериментальная установка для непосредственного измерения концентраций АТФ в просвете мочевого пузыря грызунов.

В этой установке мочевые пузыри анестезированных грызунов перфузируются через катетеры как в куполе мочевого пузыря, так и через наружное уретральное отверстие. Давление в мочевом пузыре увеличивается путем закрытия уретрального катетера при перфузии стерильной жидкости в мочевой пузырь через купол. Измерение внутрипузырного давления достигается с помощью датчика давления, прикрепленного к купольному катетеру мочевого пузыря, аналогично установке, используемой для цистометрии. Как только желаемое давление достигнуто, крышка уретрального катетера удаляется, а жидкость собирается для количественной оценки АТФ с помощью анализа люциферин-люциферазы. С помощью этой экспериментальной установки механизмы, контролирующие как механическую, так и химическую стимуляцию высвобождения уротелиального АТФ, могут быть опрошены путем включения различных агонистов или антагонистов в перфусат или путем сравнения результатов между диким типом и генетически модифицированными животными.

Introduction

Считается, что АТФ в моче играет значительную сенсорную роль в контроле мочеиспускания¹. Например, считается, что АТФ высвобождается из уротелия в ответ на растяжение, где он может воздействовать на рецепторы афферентных нервов мочевого пузыря, чтобы увеличить их возбудимость, что приводит к ощущениям полноты². Таким образом, также считается, что атФ мочи может быть важным игроком в развитии патологий мочевого пузыря. В подтверждение этой гипотезы концентрации АТФ в моче значительно повышены у пациентов, страдающих гиперактивным мочевым пузырем (ОАБ)³, синдромом боли в мочевом пузыре / интерстициальным циститом (BPS / IC) ⁴ или инфекцией мочевыводящих путей (ИМП) ^5,6, все состояния характеризуются повышенной срочностью, частотой и, иногда, болью. И наоборот, было показано, что у пациентов, страдающих недостаточной активностью мочевого пузыря (UAB), который характеризуется неспособностью опорожнить мочевой пузырь и иногда может включать снижение способности чувствовать полноту мочевого пузыря, было показано снижение концентрации АТФ^{в моче 7}. Экспериментально манипуляции с концентрациями АТФ в моче могут изменить рефлексы мочевого пузыря у крыс; увеличение концентрации АТФ путем блокирования эндогенных АТФаз в просвете мочевого пузыря может увеличить частоту мочеиспускания, в то время как снижение концентрации АТФ путем закапывания экзогенных АТФаз в мочевой пузырь снижает частоту мочеиспускания⁸. Таким образом, важность АТФ в моче для функции мочевого пузыря очевидна.

Учитывая очевидную важность АТФ в моче для патологии мочевого пузыря, точное измерение высвобождения уротелиального АТФ является важным шагом в понимании механизмов, контролирующих высвобождение. Многие исследования были завершены с использованием различных экспериментальных моделей для измерения высвобождения уротелиального АТФ. Главными среди них являются клеточные культуры, либо первичные культуры, либо клеточные линии. Однако использование культивируемых уротелиальных клеток осложняется тем фактом, что уротелиальные клетки не приобретают свою физиологическую поляризованную морфологию, если они не выращиваются на специальных проницаемых мембранах (таких как технология Transwell [вставки колодца])⁹. Таким образом, трудно связать какое-либо высвобождение АТФ, измеренное с физиологией. Уротелиальные клетки, выращенные на колодцах, могут поляризоваться и образовывать барьер, похожий на то, что видно in vivo; однако рост полностью дифференцированного уротелия может занять дни или недели. Кроме того, хотя можно хорошо установить вставки в камеру Ussing и приложить давление к апикальной стороне, чтобы вызвать растяжение, трудно применить достаточное давление, чтобы имитировать условия внутри мочевого пузыря во время патологии (т. Е. Давление 30 см H₂O или выше). Вся ткань мочевого пузыря также может быть установлена в камере Ussing для экспериментов с растяжкой, но это удаляет мочевой пузырь из организма вместе с трофическими факторами, поддерживающими здоровье уротелиальных клеток и, следовательно, функцию уротелиального барьера. Поэтому наиболее физиологически значимым способом изучения высвобождения АТФ из уротелия в ответ на растяжение или давление является in vivo. Хирургические методы, необходимые для проведения эксперимента, идентичны тем, которые обычно используются в цистометрии животных, и, следовательно, должны быть легко выполнены любым, кто знаком с этой техникой.

В этом протоколе мы опишем методику, используемую для исследования просветной АТФ у самок крыс Sprague Dawley массой примерно 200-250 г, так как трансуретральная катетеризация, описанная ниже, намного легче у самок; однако трансуретральная катетеризация также может быть выполнена у самцов грызунов¹⁰. Поскольку трансуретральная катетеризация в настоящее время проводится у мышей обоих полов, а также¹¹, эти эксперименты могут быть легко адаптированы для мышей или крыс любого пола или различных размеров, в зависимости от потребностей исследовательской группы.

Protocol

Все процедуры, проводимые на грызунах, должны соответствовать применимым руководящим принципам и быть одобрены местным институциональным комитетом по проверке этики. Эксперименты, проведенные для этой рукописи, были проведены в соответствии с Руководством Национального исследовательского совета по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинской школы Университета Питтсбурга. На рисунке 1 показана модифицированная версия стандартной установки цистометрии грызунов, используемой в этом протоколе.

1. Лабораторные животные

1. Поддерживайте крыс в социальном жилье (несколько грызунов в одной клетке) с 12-часовым циклом света / темноты и доступом ad libitum к воде и пищевым гранулам .

2. Анестезия и ганглионная блокада

1. Индуцировать начальную анестезию путем помещения животного в закрытую коробку, отравленную газом 4%-5% изофлурана в_О2 (1 л/мин).
2. Обезболить животное с помощью уретана.
   1. Вводят уретан подкожно двусторонне (по 1/2 дозы с каждой стороны животного) в дозе 1,2 г/кг. Поместите животное в клетку, чтобы позволить уретану вступить в силу, что обычно занимает 2 ч.
   2. Альтернативно, вводят уретан внутрибрюшинно (т..) путем введения полной дозы в двух отдельных дозах ~ 10 мин с интервалом.
3. После ожидания подходящего времени для вступления уретана в силу (s.c.: 2 ч, т..: 30 мин), проверьте правильную плоскость анестезии, зажав ногу животного с помощью щипцов. При соблюдении рефлекса вводят дополнительную дозу уретана (0,05-0,1 мл в..), ждут 15 мин и снова тестируют. Продолжайте следить за животным для правильной плоскости анестезии на протяжении всей процедуры.
4. Чтобы предотвратить сокращение мочевого пузыря во время растяжения, вводят животному ганглионную блокирующую агенту, такую как гексаметоний (20 мг/кг, т..).
5. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза животного, чтобы предотвратить пересыхание во время эксперимента.

3. Хирургическая процедура - надлобковая катетеризация мочевого пузыря

1. Побрить брюшко животного и выполнить лапаротомию средней линии, чтобы обнажить мочевой пузырь.
2. Подготовьте катетер, вспыхнув одним концом короткой (~10-15 см) интрамедицинской трубки PE50 с помощью пламени. Поместите иглу весом 22 г в другой конец трубки и заполните раствором Кребса (см. Таблицу материалов для состава).
3. Поместите небольшую петлю из 3-0 шелкового шва над куполом мочевого пузыря и выполните небольшую цистостомию (используя тонкие ножницы или иглу 18 G), достаточно большую, чтобы вставить расклешенный конец катетера, сделанного выше. Одной рукой удерживая катетер на месте, другой рукой затяните петлю шва, чтобы закрепить катетер на месте. Закончите закрепление катетера, завязав два узла в шве и потянув катетер обратно, пока расклешенная головка не соприкоснется со стенкой мочевого пузыря.
   1. В качестве альтернативы, закрепите катетер, используя классическую технику шва кошелька, как описано ранее для цистометрии¹².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой процедуры обязательно не вводите пузырьки воздуха в мочевой пузырь.
4. Проверьте установку на наличие утечек, вливая небольшое количество раствора Кребса через катетер. Если жидкость вытекает из цистостомии, повторно закрепите катетер дополнительным швом вокруг цистостомии.

4. Трансуретральная катетеризация

1. Окуните конец внутривенного катетера 20 G x 1" (с удаленной иглой) в хирургическую смазку.
2. Осторожно удерживайте наружный уретральный меатус парой щипцов и вставьте кончик катетера в уретральное отверстие в направлении хвоста, пока кончик не приведет к деформации стенки соседнего влагалищного отверстия. Поверните катетер на 90° (поднеся конец катетера Luer-Lock к хвосту) и осторожно двиньтесь вперед. Полностью вставьте катетер до тех пор, пока ступица Luer-Lock не окажется примерно на расстоянии 5 мм от наружного отверстия уретры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не вставляйте катетер слишком далеко, что может привести к тому, что наконечник просунет внутреннюю стенку мочевого пузыря. Если сопротивление ощущается при продвижении катетера, остановитесь и начните снова или рискуйте проколоть уретру. Смотрите раздел обсуждения о советах по увеличению успешной катетеризации.
3. Закрепите катетер и предотвратите утечку вокруг катетера, закольцовав короткий шелковый шов длиной 3-0 вокруг наружного уретрального мяса и плотно завязав его. Закрепите катетер на хвосте с помощью ленты, чтобы предотвратить его случайное вытаскивание.
4. После катетеризации осторожно вводят раствор Кребса в мочевой пузырь через надлобковый катетер мочевого пузыря и подтверждают, что жидкость вытекает из уретрального катетера, а не вокруг него. При необходимости повторите шов вокруг наружного отверстия уретры.
5. Закройте брюшной разрез над мочевым пузырем с помощью шелкового шва 3-0.

5. Экспериментальная установка

1. Закрепите животное на доске, способной быть склонным помогать в дренаже внутрипузырной жидкости через уретральный катетер. Поместите грелку и абсорбирующую подкладку между животным и доской, чтобы поддерживать тепло тела и поглощать жидкость, стекающую из уретрального катетера.
2. Подключите надлобковый катетер к трехстороннему запорному крану, который соединяет катетер со шприцевым насосом и преобразователем давления. Подключите датчик давления к компьютеру с помощью усилителя и системы сбора данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха в трубке, соединяющей шприцевой насос, датчик и катетер мочевого пузыря.
3. Откалибруйте запись давления в мочевом пузыре, используя процедуру, предложенную производителем датчика давления и/или программного обеспечения для сбора данных.
4. Вводят раствор Кребса через надлобковый катетер со скоростью 0,1 мл/мин и дают жидкости стекать из уретрального катетера в течение 1 ч, чтобы вымыть любые остаточные АТФ, высвобождаемые во время имплантации катетера.
5. После этого периода промывания закройте уретральный катетер с помощью пробки Luer-Lock и измерьте давление в мочевом пузыре. Ищите медленное повышение внутрипузырного давления до давления 30 см_H2Oбез резкого повышения давления, что будет указывать на сокращение мочевого пузыря (см. Рисунок 2). Снимите пробку из уретрального катетера, когда давление достигнет 30 см H_2O, чтобы предотвратить повреждение мочевого пузыря.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если сокращения мочевого пузыря продолжают происходить через 1 ч, вводят дополнительную дозу гексаметония (доза 5 мг/кг в.п.).

6. Сбор образцов

1. Вводят мочевой пузырь со скоростью 0,1 мл/мин и собирают элюат из уретрального катетера. Испытайте 100 мкл аликвот элюата немедленно на АТФ (см. ниже) или заморозьте для последующей количественной оценки партии.
2. Чтобы проверить влияние растяжения мочевого пузыря на концентрацию АТФ в просвете, закройте уретральный катетер пробкой и контролируйте давление в мочевом пузыре, пока оно не достигнет желаемого уровня. Затем снимите крышку уретрального катетера и соберите элюат для измерения АТФ или замораживания, как описано выше.
3. После каждого растяжения дайте мочевому пузырю отдохнуть и промыть в течение 10-15 минут, прежде чем брать дополнительные пробы. Возьмите в общей сложности 3-5 образцов предопределения и 3-5 образцов при каждом желаемом давлении растяжения, чтобы продемонстрировать повторяемость.
4. Чтобы проверить влияние препаратов на высвобождение АТФ, переключите раствор Кребса, настояющий мочевой пузырь, на Кребс, содержащий препарат выбора. Перфьюируйте при 0,1 мл/мин в течение 10-15 мин, чтобы препарат оказывал эффект, а затем соберите образцы из нерастянутых и растянутых мочевых пузырей, как описано в шагах 6.1 и 6.2.

7. Количественная оценка АТФ из собранных образцов

1. Количественное определение АТФ в собранных образцах объемом 100 мкл с использованием коммерчески доступного набора для анализа люциферина/люциферазы в соответствии с инструкциями производителя и люминометром.
   1. Для количественной оценки АТФ соедините образцы перфусата объемом 100 мкл с 50 мкл смеси для анализа и поместите их в люминометр для считывания показаний. Для преобразования относительных световых единиц (RLU), сообщаемых люминометром, в концентрацию АТФ производят последовательные разбавления АТФ в растворе Кребса в диапазоне от 1 мкМ до 10 пМ в 10-кратных разведениях для создания стандартной кривой и считывания их в люминометре. Нанесите полученные показания на график и выполните нелинейную (квадратичную) регрессию для экстраполяции концентраций из образцов, взятых у животного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно установить стандарты АТФ для любого лекарственного раствора, протестированного в эксперименте, так как многие препараты вмешиваются в реакцию люциферин/люцифераза, которая должна быть скорректирована.

8. Эвтаназия животных

1. Когда эксперимент будет завершен и все образцы собраны, гуманно усыпить животное в соответствии с руководящими принципами Министерства сельского хозяйства США и Руководством Национального исследовательского совета по уходу и использованию лабораторных животных.
   1. Извлеките обезболенное животное из экспериментальной установки, поместите его в закрытую коробку и загазуйте его 100% CO₂. Убедитесь, что скорость заполнения равна 30%-70% объема камеры в минуту (например, 3-7 л/мин для коробки с объемом 10 л). Продолжайте поток CO₂ в течение не менее 1 мин после прекращения дыхания.
2. Используйте вторичную форму эвтаназии, чтобы обеспечить смерть.
   1. Выполните торакотомию как вторичную форму эвтаназии, захватив небольшой лоскут кожи на каудальном конце грудины и разрезав небольшое отверстие в коже и мускулатуре на диафрагме острыми ножницами. Завершите торакотомию, вставив ножницы в отверстие и разрезав рострально через грудную клетку и обнажив грудную полость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Усыпленное животное должно быть утилизировано в соответствии с институциональными руководящими принципами.

Representative Results

Описанный протокол позволяет точно измерять высвобождение уротелиальной АТФ in vivo из просвета мочевого пузыря с использованием модифицированной версии стандартной установки цистометрии грызунов (см. Рисунок 1). Это позволяет исследователю изучить влияние лекарств на высвобождение АТФ, опосредованное растяжением, в физиологических условиях.

Рисунок 1: Экспериментальная установка. (A) Изображение, показывающее экспериментальную установку, с маркировкой различного оборудования. Область животного, очерченная красным прямоугольником, показана в B. (B) Фотография, изображающая живот крысы после операции. Обратите внимание на надлобковый катетер, вставленный и привязанный к куполу мочевого пузыря, а также уретральный катетер, вставленный через наружное отверстие. Уретральный катетер вставлен в фотографию, чтобы показать, что давление в мочевом пузыре увеличивается во время перфузии через катетер мочевого пузыря. Во время эксперимента брюшное отверстие закрывалось, но оставалось открытым, чтобы можно было визуализировать мочевой пузырь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Первостепенное значение для успешного измерения опосредованного растяжением высвобождения АТФ в мочевом пузыре грызунов имеет обеспечение того, чтобы рефлекс мочеиспускания блокировался, что позволяет мочевому пузырю растягиваться выше порогового давления, обычно достаточного для активации рефлекса мочеиспускания. Как показано на рисунке 2А, когда уретральный катетер закупоривается, инфузия раствора в мочевой пузырь вызывает резкое повышение внутрипузырного давления по мере сокращения мочевого пузыря. Поскольку нас интересует влияние пассивного растяжения, а не сокращения, на высвобождение уротелиального АТФ, животное лечат ганглионным блокатором, гексаметонием, чтобы предотвратить рефлекс мочеиспускания. Как показано на рисунке 2B, при введении гексаметония закапывание раствора в мочевой пузырь с заблокированным уретральным катетером приводит к гораздо более постепенному повышению внутрипузырного давления, что позволяет давлению подниматься до 30 см_H2Oбез сокращения. Это позволяет измерять высвобождение просветных АТФ при давлениях, достаточно высоких, чтобы иметь отношение к патологии, например, наблюдаемым в недостаточноактивном мочевом пузыре, частичной обструкции выхода из мочевого пузыря или во время диссинергии детрузора-сфинктера после травмы спинного мозга. Хотя может потребоваться дополнительная доза гексаметония, чтобы полностью блокировать рефлекс мочеиспускания, следует соблюдать осторожность, чтобы не вводить достаточно, чтобы привести к передозировке. Это может привести к значительному снижению сердечного выброса и поставить под угрозу качество эксперимента. Следует отметить, что такое же тормозное действие на рефлекс мочевого пузыря может быть получено либо путем двустороннего разрезания тазовых нервов, либо при разрыве спинного мозга на уровне L4 или выше. Это, конечно, значительно увеличивает сложность экспериментальной установки и время, необходимое для завершения эксперимента.

Рисунок 2: Записи давления у крыс. До (А) и после (Б) ганглионного блока. Стрелки указывают, когда уретральный катетер был закупорен. Обратите внимание, что давление в верхнем следе быстро увеличивается, когда давление достигает порога, чтобы вызвать мочеиспускание, в то время как давление в нижнем следе постепенно повышается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Другим очень важным соображением для этих экспериментов является обеспечение надлежащего преобразования показаний люминометра (обычно выраженных в RLU) в концентрацию АТФ с использованием стандартных кривых. Реакция люциферин/люцифераза очень восприимчива к интерферирующим агентам¹³. Эта интерференция может исходить от прямого взаимодействия с люциферином/люциферазой. Например, ряд соединений может выступать в качестве конкурентных или неконкурентных ингибиторов люциферазы; Одно исследование показало, что ~ 3% соединений в хранилище малых молекул молекулярных библиотек могут ингибировать люциферазу светлячка в концентрациях ниже 11 мкМ¹⁴. Кроме того, люциферин восприимчив к окислителям, уменьшая количество субстрата, доступного для люминесцентно-продуцирующей реакции¹⁵. Также возможно вмешиваться в реакцию люциферин/люцифераза, изменяя доступность кофактора реакции, магния. Например, одним из распространенных методов имитации механического растяжения в экспериментах с АТФ in vitro является индуцирование набухания клеток путем снижения осмолярности перфузионного раствора. Тем не менее, многие исследователи достигают этого сокращения, разбавляя раствор водой, уменьшая концентрацию магния, доступного для действия в качестве кофактора в реакции люциферин / люцифераза. Кроме того, некоторые препараты продаются в виде солей магния, которые могут значительно увеличить количество магния в растворе, что также приводит к измеримым различиям в показаниях люминесценции. Наконец, раствор лекарственного средства может влиять на способность точно измерять свет, производимый реакцией люциферин/люцифераза. Brilliant Blue FCF (BB-FCF, также известный как эриоглауцин или FD &C Blue dye #1) является специфическим ингибитором паннексин-опосредованного АТФ высвобождения¹⁶. В эффективных дозах раствор Brilliant Blue FCF имеет отчетливый синий оттенок, который поглощает свет на пике около 600 нм¹⁷. Это находится в диапазоне длин волн света, который излучается светлячком люциферазой; поэтому световое излучение в экспериментах с BB-FCF значительно снижается. Таким образом, крайне важно, чтобы стандартные кривые, использующие известные количества АТФ, растворенного в растворах, содержащих каждый экспериментальный препарат, использовались для количественной оценки высвобождения АТФ во время эксперимента. Как показано на рисунке 3, BB-FCF (100 мкМ) значительно уменьшает наклон стандартной кривой, что достаточно для существенного изменения расчетных значений концентрации АТФ в образце. Как показано в нижней части рисунка 3, использование стандарта Кребса для расчета концентрации АТФ в образце, содержащем BB-FCF, может привести к занижению концентрации АТФ на ~50%. В некоторых случаях использование неправильной стандартной кривой может скрыть опосредованное лекарственными средствами изменение высвобождения АТФ или заставить его ошибочно выглядеть так, как будто изменение произошло. В эксперименте, изображенном на рисунке 3, например, использование стандарта Кребса для всех образцов показало бы, что Brilliant Blue FCF уменьшил высвобождение АТФ на ~67% (от 16,6 до 5,5 нМ), когда на самом деле он уменьшился только на ~42% (от 16,6 до 9,6 нМ).

Рисунок 3: Влияние экспериментальных препаратов на стандартную кривую АТФ. Обратите внимание, что антагонист канала паннексина, Brilliant Blue, значительно изменяет RLU, измеренные для любой заданной концентрации АТФ, что приведет к недооценке измеренного АТФ, если не скорректированного. Аббревиатура: RLU = относительные световые единицы; BB-FCF = Блестящий синий FCF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Еще одно соображение, которое следует иметь в виду, заключается в том, что АТФ обычно высвобождается из тканей в результате повреждения, и что эти хирургические процедуры и введение уретрального катетера приведут к аномально высоким показаниям АТФ, если их принимать слишком рано после установки. Эта процедура описывает период вымывания 1 час после установки эксперимента, который не следует пропускать. Мы обнаружили, что через 1 ч концентрации АТФ, измеренные в образцах, взятых, когда мочевой пузырь не растянут, относительно низки (~ 10-30 нМ), в то время как образцы, взятые до периода вымывания, могут читать на порядок выше. Короткие, 5 мин промывки также должны выполняться между растяжениями, так как уровни АТФ могут оставаться повышенными в течение короткого периода. Хорошим эмпирическим правилом было бы измерение АТФ в нескольких образцах в начале эксперимента и после каждого растяжения и только тогда, когда показания АТФ выровняются. На рисунке 4 мы показываем представление типичного эксперимента с измерениями, сделанными в различные моменты времени. Обратите внимание на высокие показания, взятые до вымывания (образцы No 1 и No 5), по сравнению с показаниями, взятыми после вымывания (образцы No 2 и No 6).

Рисунок 4: Представление типичного эксперимента. Стилизованное представление типичной записи давления. Каждое число представляет собой точку времени, когда образец был взят и измерен для АТФ: 1) сразу после завершения установки, до периода вымывания, 2) после 1-часового периода вымывания, 3) непосредственно предшествующий растяжению, 4) во время растяжения, 5) сразу после растяжения и 6) после короткого периода вымывания после растяжения. В таблице вставок показаны репрезентативные значения RLU и концентрации АТФ для каждого образца. Аббревиатура: RLU = относительные световые единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 5 показаны репрезентативные графики экспериментальных результатов, изучающих механизм высвобождения АТФ из уротелия. Как показано на рисунке 5А, повышение давления вызывает значительное увеличение концентрации АТФ в просвете мочевого пузыря, при этом давление в 30 см воды увеличивает концентрации почти в 2,5 раза нерастянутых контрольных групп. Внутрипузырная перфузия 2 Ед/мл апиразы, фермента, катализирующего гидролиз АТФ, значительно снижает измеренную концентрацию АТФ в просвете мочевого пузыря. И наоборот, внутрипузырная перфузия ARL67156, ингибитора NTPDas, присутствующего на уротелии, значительно увеличивает концентрации АТФ в просвете. На рисунке 5B показаны эксперименты по механизму высвобождения АТФ из уротелия, индуцированного растяжением. Перфузия с антагонистами канала паннексина Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 мкМ) или карбеноксолоном (CBX, 100 мкМ) значительно снижает высвобождение АТФ в просвет мочевого пузыря при всех давлениях. Люминальные концентрации АТФ не уменьшаются, когда коннексин-блокатор 18α-глицирретиновой кислоты перфузируется, что указывает на то, что вызванное растяжением высвобождение АТФ опосредовано паннексиновыми каналами, а не коннексиновыми каналами.

Рисунок 5: Репрезентативные измерения высвобождения АТФ, вызванного растяжением, в просвете мочевого пузыря. (A) Растяжение мочевого пузыря увеличивает просветные концентрации АТФ, которые могут быть уменьшены в присутствии Апиразы NTPDase (2 ЕД/мл) или увеличены, когда эндогенные NTPDaseses ингибируются ARL67156 (10 мкМ). (B) Высвобождение АТФ, вызванное растяжением, блокируется антагонистами паннексинового канала Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 мкМ) и карбеноксолоном (CBX, 100 мкМ), но не антагонистом канала коннексина 18α-глицирретиновой кислотой (18α-GA, 50 мкМ). Данные представляются в виде среднего значения со стандартными полосами ошибок. ** p < 0,05 между двумя барами, обозначенными линией, ## p < 0,05 по сравнению с элементами управления Кребса при том же растяжении. Эта цифра перепечатана с разрешения Beckel et ^al.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Большинство исследований высвобождения уротелиального АТФ проводится в культивируемых клетках с использованием либо увековеченных клеточных линий, либо первичных культур уротелиальных клеток грызунов. Хотя эти модели имеют преимущество в том, что они имеют относительно высокую пропускную способность (т. Е. Одна культура / проход может сделать много пластин / тарелок из клеток), их физиологическая значимость уменьшается из-за: 1) неспособности уротелиальных клеток расти поляризованными, если они не выращиваются на специальных опорах и 2) трудности в воздействии культивируемых клеток на физиологические уровни растяжения / давления. Один из способов справиться с этими ограничениями - удалить мочевой пузырь у грызуна, разрезать его и поместить в камеру Ussing, вставив ткань мочевого пузыря между двумя полукамерами, заполненными физиологическим раствором. Это позволяет исследователю подвергнуть уротелий в его родном поляризованном состоянии растяжению, добавив объем к уротелиальной стороне камеры, вызывая растяжение ткани мочевого пузыря в камере. Однако трудно связать это растяжение с растяжением, наблюдаемым уротелием in vivo. Более того, вызванный растяжением АТФ в камере Уссинга высвобождается в большой объем физиологической жидкости, содержащейся в камере, разбавляя концентрацию АТФ в несколько раз. Используя эту процедуру, давление в мочевом пузыре измеряется напрямую, так что растяжение может поддерживаться в диапазоне, соответствующем физиологии или патофизиологии. Более того, поскольку мы измеряем концентрацию АТФ непосредственно из просветной жидкости, а не из произвольного и чрезмерного количества жидкости, используемой для поддержания тканей in vitro, измеренную концентрацию не нужно корректировать. Таким образом, процедура, описанная в данной работе, позволяет исследователю исследовать высвобождение АТФ в просвете мочевого пузыря в условиях, гораздо более близких к физиологическим или патофизиологическим условиям мочевого пузыря.

Описанный метод очень похож на стандартные методы цистометрии, используемые для изучения влияния лекарств на рефлекторную активность мочевого пузыря, и должен легко выполняться любым, кто регулярно проводит эти эксперименты. Однако для тех исследователей, которые новичок в катетеризации мочевого пузыря, есть несколько предостережений, о которых следует знать. Во-первых, трансуретральная катетеризация может быть затруднена для неопытных из-за искривления уретры грызуна. Это также может быть затруднено плотностью наружного уретрального сфинктера, даже под уретановой анестезией. Крайне важно, чтобы исследователь не пытался загнать катетер в уретру, так как это, скорее всего, вызовет повышенное воспаление и отек, что, в свою очередь, сделает уретру еще более трудной для успешной катетеризации. Дополнительно можно просунуть катетер через стенку уретры, испортив весь эксперимент.

Мы разработали несколько советов и трюков для повышения скорости успеха. Например, иногда необходимо дать животному еще одну короткую дозу ингаляционного изофлурана (0,5%-1,0%), чтобы расслабить уретральный сфинктер. Это следует выполнять экономно и с осторожностью, так как комбинация уретана и изофлунана может привести к угнетению дыхания. Еще одна хитрость заключается в том, чтобы окунуть кончик катетера в 2% раствор лидокаина перед введением его в наружное уретральное отверстие; это часто приводит к тому, что сфинктер расслабляется через несколько минут. Опорожнение мочевого пузыря путем осторожного надавливания на живот животного также может помочь расслабить уретральный сфинктер. Наконец, может потребоваться использование катетера меньшего размера; мы иногда используем катетер 24 G, особенно с мелкими животными. Имейте в виду, однако, что может потребоваться уменьшить скорость инфузии в мочевой пузырь при использовании трансуретрального катетера меньшего калибра, чтобы соответствовать более медленному дренажу из уретрального катетера. Неспособность сделать это приведет к повышению давления в мочевом пузыре, несмотря на то, что уретральный катетер не закрыт.

Следует отметить, что уретан используется в качестве анестетика в этом протоколе. Уретан обычно используется в лабораториях, изучающих нижние мочевые пути, поскольку он щадит рефлекс мочеиспускания, в то время как другие анестетики этого не делают. Из-за этого растяжение мочевого пузыря выше давления ~7-10 см H_2Oпод уретановой анестезией вызовет рефлекс мочеиспускания. Поскольку мы заинтересованы в высвобождении АТФ в ответ на пассивное растяжение, этот протокол призывает блокировать сокращения мочевого пузыря с помощью ганглионного блокатора гексаметония. Это позволяет измерять высвобождение АТФ в ответ на более высокое внутрипузырное давление (т.е. 30 см_H2O), обычно наблюдаемое при патологии мочевого пузыря, связанной с обструкцией выхода. Поэтому применение уретана/гексаметония позволяет измерять вызванное растяжением просветное высвобождение АТФ в течение длительных периодов времени (продолжительность действия обоих препаратов измеряется в часах). Тем не менее, некоторые лаборатории могут предпочесть использовать анестетик, который не щадит рефлекс мочеиспускания, такой как кетамин, и устраняет необходимость в ганглионном блокаторе. Это также будет хорошо работать для этой процедуры, хотя и потребует более частого (или непрерывного) введения из-за более короткой продолжительности действия анестетика.

Одним из примечательных различий между этим методом измерения АТФ и общей установкой цистометрии, с которой могут быть знакомы исследователи урологии, является использование буферного раствора Кребса в качестве перфусата вместо стандартного изотонического физиологического раствора. АТФ представляет собой довольно лабильную молекулу и несколько стабилизируется в буферном растворе. Кроме того, состав раствора Кребса намного ближе к составу мочи, чем физиологического раствора, что еще больше добавляет клиническую значимость этим экспериментам. Это является важным соображением, поскольку было показано, что контроль высвобождения уротелиального АТФ модулируется проницаемыми каналами кальция, а недостаток кальция в нормальном физиологическом растворе может негативно влиять на высвобождение АТФ. Нестабильность АТФ в растворе также является причиной того, что мы предлагаем немедленно количественно определить образцы с использованием люциферин-люциферазной реакции. Однако, если исследователь не может прочитать образцы немедленно, образцы должны быть заморожены как можно быстрее, чтобы ограничить деградацию АТФ.

Одним из ограничений этого метода является то, что он измеряет только просветное высвобождение АТФ и не может измерять высвобождение АТФ с серозальной стороны уротелия. Считается, что АТФ высвобождается из серозной стороны, чтобы непосредственно влиять на афферентную возбудимость; однако прямое измерение этого релиза затруднено. В этом случае использование клеток, выращенных на проницаемых мембранных опорах, таких как пластины Transwell, или хирургическое удаление уротелия для экспериментов с камерой Ussing является предпочтительным методом. Однако, учитывая очевидную важность просветной АТФ при патологии мочевого пузыря, эта экспериментальная модель является полезным инструментом для выяснения клеточных механизмов, контролирующих высвобождение уротелиального АТФ во время патологии.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose