In vivo Medição Luminal da Liberação de ATP Urotelial Evocado por Distensão em Roedores

Summary

Este protocolo descreve o procedimento para medir as concentrações de ATP no lúmen da bexiga em um roedor anestesiado.

Abstract

Acredita-se que o ATP, liberado do urotélio em resposta à distensão da bexiga, desempenhe um papel sensorial significativo no controle da micção. Portanto, a medição precisa da liberação de ATP urotelial em um ambiente fisiológico é um primeiro passo importante no estudo dos mecanismos que controlam a sinalização purinérgica na bexiga urinária. As técnicas existentes para estudar a liberação de ATP urotelial evocado mecanicamente utilizam células cultivadas banhadas em suportes flexíveis ou tecido vesical fixado em câmaras de Ussing; no entanto, cada uma dessas técnicas não emula totalmente as condições na bexiga intacta. Portanto, uma configuração experimental foi desenvolvida para medir diretamente as concentrações de ATP no lúmen da bexiga urinária de roedores.

Nesta configuração, as bexigas de roedores anestesiados são perfundidas através de cateteres tanto na cúpula da bexiga quanto através do orifício uretral externo. A pressão na bexiga é aumentada tampando o cateter uretral enquanto perfunde fluido estéril na bexiga através da cúpula. A medição da pressão intravesical é obtida usando um transdutor de pressão ligado ao cateter da cúpula da bexiga, semelhante à configuração usada para cistometria. Uma vez atingida a pressão desejada, a tampa do cateter uretral é removida e o líquido coletado para quantificação de ATP pelo ensaio de luciferina-luciferase. Através desta configuração experimental, os mecanismos que controlam a estimulação mecânica e química da liberação de ATP urotelial podem ser interrogados pela inclusão de vários agonistas ou antagonistas no perfusato ou comparando os resultados entre animais selvagens e geneticamente modificados.

Introduction

Acredita-se que o ATP urinário desempenhe um papel sensorial significativo no controle da micção¹. Por exemplo, pensa-se que o ATP é liberado do urotélio em resposta à distensão, onde pode atuar sobre os receptores nos nervos aferentes da bexiga para aumentar sua excitabilidade, levando a sensações de plenitude². Assim, pensa-se também que o ATP urinário poderia ser um ator importante no desenvolvimento de patologias da bexiga. Em apoio a essa hipótese, as concentrações urinárias de ATP estão significativamente aumentadas em pacientes que sofrem de bexiga hiperativa (OAB)³, síndrome da dor vesical/cistite intersticial (BPS/IC)⁴ ou infecção do trato urinário (ITU)^5,6, todas as condições caracterizadas pelo aumento da urgência, frequência e, às vezes^, dor. Por outro lado, pacientes que sofrem de bexiga hipoativa (BAU), que é caracterizada por uma incapacidade de esvaziar a bexiga e às vezes pode incluir uma diminuição da capacidade de sentir a plenitude da bexiga, demonstraram ter diminuído as concentrações urinárias de ATP⁷. Experimentalmente, a manipulação das concentrações urinárias de ATP pode alterar os reflexos da bexiga no rato; o aumento das concentrações de ATP pelo bloqueio de ATPases endógenas no lúmen vesical pode aumentar a frequência miccional, enquanto a diminuição das concentrações de ATP pela instilação de ATPases exógenas na bexiga reduz a frequência de micção⁸. Assim, a importância do ATP urinário para a função da bexiga é clara.

Dada a aparente importância do ATP urinário para a patologia da bexiga, a medição precisa da liberação de ATP urotelial é um passo importante na compreensão dos mecanismos que controlam a liberação. Muitos estudos foram concluídos usando diferentes modelos experimentais para medir a liberação de ATP urotelial. A principal delas são as culturas celulares, sejam culturas primárias ou linhagens celulares. No entanto, o uso de células uroteliais cultivadas é complicado pelo fato de que as células uroteliais não assumem sua morfologia polarizada fisiológica, a menos que sejam cultivadas em membranas permeáveis especiais (como a tecnologia Transwell [inserções de poço])⁹. Assim, é difícil relacionar qualquer liberação de ATP medida com a fisiologia. As células uroteliais cultivadas em inserções de poços podem polarizar e formar uma barreira semelhante ao que é visto in vivo; no entanto, o crescimento de um urotélio totalmente diferenciado pode levar dias ou semanas. Além disso, embora seja possível montar inserções de poço em uma câmara de Ussing e aplicar pressão no lado apical para causar estiramento, é difícil aplicar pressão suficiente para imitar condições dentro da bexiga durante a patologia (ou seja, pressões de 30 cm H₂O ou acima). O tecido da bexiga inteira também pode ser montado em uma câmara de Ussing para experimentos de alongamento, mas isso remove a bexiga do organismo, juntamente com os fatores tróficos que mantêm a saúde das células uroteliais e, portanto, a função de barreira urotelial. Portanto, a maneira fisiologicamente mais relevante de estudar a liberação de ATP do urotélio em resposta ao estiramento ou pressão é in vivo. As técnicas cirúrgicas necessárias para a montagem do experimento são idênticas às comumente utilizadas na cistometria animal e, portanto, devem ser facilmente realizadas por qualquer pessoa familiarizada com essa técnica.

Neste protocolo, descreveremos a técnica utilizada para examinar o ATP luminal em ratas Sprague Dawley com peso aproximado de 200-250 g, pois o cateterismo transuretral descrito a seguir é muito mais fácil em fêmeas; no entanto, o cateterismo transuretral também pode ser realizado em roedores machos¹⁰. Como o cateterismo transuretral já foi realizado em camundongos de ambos os sexos também¹¹, esses experimentos podem ser facilmente adaptados para camundongos ou ratos de ambos os sexos ou de tamanhos variados, dependendo das necessidades da equipe de pesquisa.

Protocol

Todos os procedimentos realizados em roedores devem seguir as diretrizes aplicáveis e ser aprovados pelo comitê de revisão de ética institucional local. Os experimentos realizados para este manuscrito foram realizados de acordo com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Escola de Medicina da Universidade de Pittsburgh. Consulte a Figura 1 para obter uma versão modificada da configuração padrão de cistometria de roedores usada neste protocolo.

1. Animais de laboratório

1. Manter os ratos em habitação social (vários roedores em uma gaiola) com um ciclo claro/escuro de 12 horas e acesso ad libitum a pellets de água e alimentos.

2. Anestesia e bloqueio ganglionar

1. Induzir a anestesia inicial colocando o animal em uma caixa fechada gaseificada com isoflurano a 4%-5% em O₂ (1 L/min).
2. Anestesiar o animal usando uretano.
   1. Injetar uretano por via subcutânea bilateral (dose de 1/2 em cada lado do animal) na dose de 1,2 g/kg. Coloque o animal em uma gaiola para permitir que o uretano faça efeito, o que geralmente leva 2 h.
   2. Alternativamente, administrar uretano por via intraperitoneal (i.p.) injetando a dose completa em duas doses separadas ~ 10 min de intervalo.
3. Depois de aguardar o tempo apropriado para que o uretano entre em vigor (s.c.: 2 h, i.p.: 30 min), teste um plano adequado de anestesia apertando o pé do animal usando fórceps. Se um reflexo for observado, administrar uma dose adicional de uretano (0,05-0,1 mL i.p.), aguarde 15 minutos e teste novamente. Continue a monitorar o animal quanto ao plano adequado de anestesia durante todo o procedimento.
4. Para evitar uma contração da bexiga durante a distensão, injete no animal um agente bloqueador ganglionar, como o hexametônio (20 mg/kg, i.p.).
5. Aplique pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar a secagem durante o experimento.

3. Procedimento cirúrgico-cateterismo vesical suprapúbico

1. Raspe o abdômen do animal e realize uma laparotomia na linha média para expor a bexiga urinária.
2. Prepare um cateter queimando uma extremidade de um comprimento curto (~ 10-15 cm) de tubo intramédico PE50 usando uma chama. Coloque uma agulha de 22 G na outra extremidade da tubulação e encha com solução de Krebs (consulte a Tabela de Materiais para a composição).
3. Coloque uma pequena alça de sutura de seda 3-0 sobre a cúpula da bexiga e realize uma pequena cistostomia (usando uma tesoura fina ou uma agulha de 18 G) grande o suficiente para inserir a extremidade inflamada do cateter feito acima. Com uma mão segurando o cateter no lugar, use a outra mão para apertar a alça da sutura para prender o cateter no lugar. Termine de prender o cateter amarrando dois nós na sutura e puxando o cateter para trás até que a cabeça inflamada esteja em contato com a parede da bexiga.
   1. Alternativamente, prenda o cateter usando uma técnica clássica de sutura com corda de bolsa, conforme descrito anteriormente para cistometria¹².
      NOTA: É imperativo não introduzir bolhas de ar na bexiga durante este procedimento.
4. Teste a configuração para vazamentos infundindo uma pequena quantidade de solução de Krebs através do cateter. Se o fluido vazar para fora da cistostomia, proteja novamente o cateter com sutura adicional ao redor da cistostomia.

4. Cateterismo transuretral

1. Mergulhe a extremidade de um cateter IV de 20 G x 1" (com a agulha removida) no lubrificante cirúrgico.
2. Segure o meato uretral externo suavemente com um par de pinças e insira a ponta do cateter no orifício uretral na direção da cauda até que a ponta faça com que a parede da abertura vaginal adjacente se deforme. Gire o cateter 90° (trazendo a extremidade Luer-Lock do cateter em direção à cauda) e avance suavemente. Insira totalmente o cateter até que o cubo Luer-Lock esteja aproximadamente 5 mm distal da abertura uretral externa.
   NOTA: Não insira o cateter muito longe, o que pode fazer com que a ponta cutuque a parede interna da bexiga. Se a resistência for sentida durante o avanço do cateter, pare e comece novamente ou corra o risco de perfurar a uretra. Veja a seção de discussão sobre dicas para aumentar o cateterismo bem-sucedido.
3. Prenda o cateter e evite o vazamento ao redor do cateter enrolando um curto comprimento de sutura de seda 3-0 ao redor do meato uretral externo e amarre-o com força. Prenda o cateter à cauda com fita adesiva para evitar que ele seja acidentalmente retirado.
4. Uma vez cateterizado, infundir suavemente a solução de Krebs na bexiga através do cateter da bexiga suprapúbica e confirmar que o fluido flui para fora do cateter uretral e não em torno dele. Se necessário, retire a sutura ao redor do orifício uretral externo.
5. Feche a incisão abdominal sobre a bexiga usando uma sutura de seda 3-0.

5. Configuração experimental

1. Prenda o animal em uma prancha capaz de ser inclinado para auxiliar na drenagem do líquido intravesical através do cateter uretral. Coloque uma almofada de aquecimento e uma almofada absorvente entre o animal e a placa para manter o calor do corpo e absorver o fluido que drena do cateter uretral.
2. Conecte o cateter suprapúbico a uma torneira de três vias, que conecta o cateter a uma bomba de seringa e a um transdutor de pressão. Conecte o transdutor de pressão a um computador por meio de um amplificador e um sistema de aquisição de dados.
   NOTA: Deve-se tomar cuidado para evitar que bolhas de ar se formem na tubulação que conecta a bomba da seringa, o transdutor e o cateter vesical.
3. Calibre o registro da pressão da bexiga usando o procedimento sugerido pelo fabricante do transdutor de pressão e/ou software de aquisição de dados.
4. Infundir a solução de Krebs através do cateter suprapúbico a uma taxa de 0,1 mL/min e permitir que o fluido escorra do cateter uretral por 1 h para lavar qualquer ATP residual liberado durante o implante do cateter.
5. Após este período de lavagem, tampe o cateter uretral usando um plugue Luer-Lock e meça a pressão na bexiga. Procure um aumento lento da pressão intravesical para uma pressão de 30 cm H 2 O sem umaumento acentuado da pressão, o que indicaria uma contração da bexiga (ver Figura 2). Remova o tampão do cateter uretral quando a pressão atingir 30 cm H₂O para evitar danos à bexiga.
   NOTA: Se as contrações da bexiga continuarem a ocorrer após 1 h, administrar uma dose adicional de hexametónio (dose i.p. de 5 mg/kg).

6. Recolha de amostras

1. Infundir a bexiga a 0,1 mL/min e recolher o eluato do cateter uretral. Testar imediatamente as alíquotas de 100 μL do eluato para o ATP (ver infra) ou congelar para posterior quantificação do lote.
2. Para testar o efeito da distensão da bexiga nas concentrações luminais de ATP, tampe o cateter uretral com o plugue e monitore a pressão da bexiga até atingir o nível desejado. Em seguida, destampe o cateter uretral e colete o eluato para medição ou congelamento do ATP, conforme descrito acima.
3. Após cada distensão, deixe a bexiga descansar e lavar por 10-15 minutos antes de colher amostras adicionais. Tome um total de 3-5 amostras de predistensão e 3-5 amostras a cada pressão de distensão desejada para demonstrar repetibilidade.
4. Para testar o efeito das drogas na liberação de ATP, mude a solução de Krebs que infunde a bexiga para Krebs contendo a droga de escolha. Perfundir a 0,1 mL/min por 10-15 min para que a droga tenha um efeito e, em seguida, coletar as amostras de bexigas não distendidas e distendidas, conforme descrito nas etapas 6.1 e 6.2.

7. Quantificação do ATP a partir de amostras colhidas

1. Quantificar o ATP nas amostras de 100 μL recolhidas utilizando um kit de ensaio de luciferina/luciferase comercialmente disponível, seguindo as instruções do fabricante e um luminómetro.
   1. Para quantificar o ATP, combinar amostras de 100 μL de perfusato com 50 μL da mistura de ensaio e colocá-las no luminômetro para leitura. Para converter as Unidades de Luz Relativa (RLUs) relatadas pelo luminômetro em uma concentração de ATP, faça diluições seriais de ATP em solução de Krebs variando de 1 μM a 10 pM em diluições de 10 vezes para criar uma curva padrão e lê-las no luminômetro. Plotar as leituras resultantes em um gráfico e realizar uma regressão não linear (quadrática) para extrapolar as concentrações das amostras retiradas do animal.
      NOTA: É importante fazer padrões de ATP para qualquer solução medicamentosa testada no experimento, pois muitos medicamentos interferem na reação luciferina/luciferase, que deve ser corrigida.

8. Eutanásia de animais

1. Quando o experimento estiver concluído e todas as amostras forem coletadas, eutanasie humanamente o animal de acordo com as diretrizes do USDA e o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
   1. Retire o animal anestesiado da instalação experimental, coloque-o em uma caixa fechada e gaseifique-o com 100% de CO₂. Certifique-se de que a taxa de enchimento seja igual a 30%-70% do volume da câmara por minuto (por exemplo, 3-7 L/min para uma caixa com um volume de 10 L). Continue o fluxo de CO₂ por pelo menos 1 minuto após a respiração cessar.
2. Use uma forma secundária de eutanásia para garantir a morte.
   1. Realizar uma toracotomia como uma forma secundária de eutanásia, agarrando o pequeno retalho de pele na extremidade caudal do esterno e cortando um pequeno orifício na pele e musculatura no diafragma com um par afiado de tesouras. Complete a toracotomia inserindo a tesoura na abertura e cortando rostralmente através da caixa torácica e expondo a cavidade torácica.
      NOTA: O animal eutanasiado deve ser descartado de acordo com as diretrizes institucionais.

Representative Results

O protocolo descrito permite a medição precisa da liberação de ATP urotelial in vivo do lúmen da bexiga, usando uma versão modificada da configuração padrão de cistometria de roedores (ver Figura 1). Isso permite que o pesquisador examine os efeitos das drogas na liberação de ATP mediada por estiramento em um ambiente fisiológico.

Figura 1: Configuração experimental. (A) Imagem mostrando a configuração experimental, com os vários equipamentos rotulados. A área do animal delineada em um retângulo vermelho é mostrada em B. (B) Fotografia que retrata o abdómen do rato após a cirurgia. Observe o cateter suprapúbico inserido e amarrado na cúpula da bexiga, bem como o cateter uretral inserido através do orifício externo. O cateter uretral é plugado na foto para mostrar que a pressão da bexiga é aumentada durante a perfusão através do cateter vesical. Durante o experimento, a abertura abdominal seria suturada fechada, mas foi deixada aberta aqui para permitir a visualização da bexiga urinária. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

De primordial importância para a medição bem-sucedida da liberação de ATP mediada por estiramento na bexiga de roedores é garantir que o reflexo de micção seja bloqueado, permitindo que a bexiga seja distendida além da pressão limiar normalmente suficiente para ativar o reflexo de micção. Como mostrado na Figura 2A, quando o cateter uretral é entupido, a infusão da solução na bexiga faz com que a pressão intravesical aumente acentuadamente à medida que a bexiga se contrai. Como estamos interessados nos efeitos do estiramento passivo, não da contração, na liberação de ATP urotelial, o animal é tratado com um bloqueador ganglionar, o hexametônio, para prevenir o reflexo miccional. Como evidenciado na Figura 2B, quando o hexametônio é administrado, a instilação da solução na bexiga com o cateter uretral bloqueado resulta em um aumento muito mais gradual da pressão intravesical, permitindo que as pressões subam até 30 cm H₂O sem contração. Isso permite a medição da liberação de ATP luminal a pressões altas o suficiente para ser relevante para a patologia, como as observadas em uma bexiga hipoativa, obstrução parcial da saída da bexiga ou durante a dissinergia detrusor-esfíncter após lesão medular. Embora possa exigir uma dose suplementar de hexametônio para bloquear completamente o reflexo da micção, deve-se tomar cuidado para não administrar o suficiente para resultar em uma overdose. Isso pode levar a uma diminuição significativa do débito cardíaco e comprometer a qualidade do experimento. Deve-se notar que o mesmo efeito inibitório sobre o reflexo da bexiga pode ser obtido cortando os nervos pélvicos bilateralmente ou cortando a medula espinhal no nível L4 ou superior. Isso, é claro, aumenta significativamente a dificuldade da configuração experimental e o tempo necessário para concluir o experimento.

Figura 2: Registros de pressão de ratos. Antes (A) e depois (B) do bloqueio ganglionar. As setas indicam quando o cateter uretral foi entupido. Observe que a pressão no traço superior aumenta rapidamente quando a pressão atinge o limiar para induzir a micção, enquanto a pressão no traço inferior aumenta gradualmente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Outra consideração muito importante para esses experimentos é garantir a conversão adequada das leituras do luminômetro (normalmente expressas em RLUs) para uma concentração de ATP usando curvas padrão. A reação luciferina/luciferase é muito suscetível a agentes interferentes¹³. Essa interferência pode vir de uma interação direta com luciferina/luciferase. Por exemplo, uma série de compostos pode atuar como inibidores competitivos ou não competitivos da luciferase; um estudo sugeriu que ~3% dos compostos no Molecular Libraries Small Molecule Repository poderiam inibir a luciferase de vagalume em concentrações abaixo de 11 μM¹⁴. Além disso, a luciferina é suscetível a agentes oxidantes, reduzindo a quantidade de substrato disponível para a reação produtora de luminescência¹⁵. Também é possível interferir com a reação luciferina/luciferase alterando a disponibilidade do cofator da reação, o magnésio. Por exemplo, uma técnica comum para imitar o estiramento mecânico em experimentos de ATP in vitro é induzir o inchaço celular, reduzindo a osmolaridade da solução de perfusão. No entanto, muitos pesquisadores conseguem essa redução diluindo a solução com água, reduzindo a concentração de magnésio disponível para atuar como um cofator na reação luciferina / luciferase. Além disso, alguns medicamentos são vendidos como sais de magnésio, o que pode aumentar muito a quantidade de magnésio na solução, levando também a diferenças mensuráveis nas leituras de luminescência. Finalmente, é possível que uma solução medicamentosa interfira na capacidade de medir com precisão a luz produzida pela reação luciferina/luciferase. Brilliant Blue FCF (BB-FCF, também conhecido como erioglaucina ou FD&C Blue dye #1) é um inibidor específico da liberação de ATP mediada por^{panexina 16}. Em doses eficazes, a solução Brilliant Blue FCF tem uma tonalidade azul distinta, que absorve a luz a um pico de cerca de 600 nm¹⁷. Isto está dentro da faixa de comprimentos de onda da luz que é emitida pela luciferase do vagalume; portanto, a emissão de luz em experimentos com BB-FCF é bastante reduzida. Assim, é imperativo que curvas padrão usando quantidades conhecidas de ATP dissolvido em soluções contendo cada droga experimental sejam usadas para quantificar a liberação de ATP durante o experimento. Como mostra a Figura 3, o BB-FCF (100 μM) diminui significativamente a inclinação da curva padrão, o que é suficiente para alterar significativamente os valores calculados para a concentração de ATP na amostra. Como mostrado na parte inferior da Figura 3, o uso do padrão de Krebs para calcular a concentração de ATP em uma amostra contendo BB-FCF pode resultar em uma subestimação da concentração de ATP em ~50%. Em alguns casos, o uso da curva padrão errada pode obscurecer uma mudança mediada por drogas na liberação de ATP ou fazê-la parecer erroneamente como se uma mudança tivesse ocorrido. No experimento descrito na Figura 3, por exemplo, o uso do padrão de Krebs para todas as amostras teria feito parecer que o Brilliant Blue FCF reduziu a liberação de ATP em ~67% (16,6 a 5,5 nM) quando, na verdade, havia diminuído apenas ~42% (16,6 a 9,6 nM).

Figura 3: Efeitos de drogas experimentais na curva padrão de ATP. Note-se que o antagonista do canal da anexina, Azul Brilhante, altera significativamente os RLUs medidos para qualquer concentração dada de ATP, o que resultaria em uma subestimação do ATP medido, se não corrigido. Abreviação: RLUs = Unidades de Luz Relativa; BB-FCF = FCF Azul Brilhante. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma outra consideração a ter em mente é que o ATP é comumente liberado dos tecidos como resultado de danos, e que esses procedimentos cirúrgicos e a inserção do cateter uretral resultarão em leituras anormalmente altas de ATP se tomadas muito cedo após a configuração. Este procedimento descreve um período de lavagem de 1 h após a configuração do experimento, que não deve ser ignorado. Descobrimos que, após 1 h, as concentrações de ATP medidas em amostras colhidas quando a bexiga não está distendida são relativamente baixas (~ 10-30 nM), enquanto as amostras colhidas antes do período de lavagem podem ler uma ordem de magnitude maior. Washouts curtos de 5 minutos também devem ser realizados entre as distensões, pois os níveis de ATP podem permanecer elevados por um curto período. Uma boa regra seria medir o ATP em várias amostras no início do experimento e após cada distensão e só prosseguir quando as leituras de ATP se nivelarem. Na Figura 4, mostramos uma representação de um experimento típico com medições realizadas em vários momentos. Observe as altas leituras feitas antes do washout (amostras #1 e #5) versus aquelas tomadas após o washout (amostras #2 e #6).

Figura 4: Representação de um experimento típico. Uma representação estilizada de uma gravação de pressão típica. Cada número representa um ponto de tempo em que uma amostra foi coletada e medida para ATP: 1) imediatamente após a conclusão da configuração, antes do período de washout, 2) após um período de washout de 1 h, 3) imediatamente anterior a uma distensão, 4) durante a distensão, 5) imediatamente após uma distensão e 6) após um curto período de washout após a distensão. A tabela de inserção mostra valores representativos de RLU e concentrações de ATP para cada amostra. Abreviação: RLUs = Unidades de Luz Relativa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 5 mostra gráficos representativos dos resultados experimentais examinando o mecanismo de liberação de ATP do urotélio. Como mostra a Figura 5A, o aumento da pressão provoca um aumento significativo na concentração de ATP no lúmen da bexiga, com pressões de 30 cm de água aumentando as concentrações quase 2,5x dos controles não distendidos. A perfusão intravesical de 2 U/mL de apirase, uma enzima que catalisa a hidrólise de ATP, diminui significativamente a concentração medida de ATP no lúmen da bexiga. Por outro lado, a perfusão intravesical de ARL67156, um inibidor das NTPDases presentes no urotélio, aumenta significativamente as concentrações luminais de ATP. A Figura 5B mostra os experimentos no mecanismo de liberação de ATP induzido por estiramento do urotélio. A perfusão com os antagonistas do canal da anexinina Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) ou carbenoxolona (CBX, 100 μM) reduz significativamente a liberação de ATP no lúmen da bexiga em todas as pressões. As concentrações de ATP luminal não são diminuídas quando o bloqueador de conexina ácido 18α-glicirretínico é perfundido, indicando que a liberação de ATP evocada por distensão é mediada por canais de anexina e não por canais de conexina.

Figura 5: Medidas representativas da liberação de ATP evocado por distensão no lúmen da bexiga urinária. (A) A distensão da bexiga aumenta as concentrações luminais de ATP, que podem ser diminuídas na presença da NTPDase apirase (2 U/mL) ou aumentadas quando a NTPDasese endógena é inibida com ARL67156 (10 μM). (B) A liberação de ATP evocada por distensão é bloqueada pelos antagonistas do canal de anexina Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) e carbenoxolona (CBX, 100 μM), mas não pelo antagonista do canal de conexina ácido 18α-glicirretínico (18α-GA, 50 μM). Os dados são apresentados como a média com barras de erro padrão. ** p < 0,05 entre as duas barras indicadas pela linha, ## p < 0,05 em comparação com os controles de Krebs na mesma distensão. Esta figura é reimpressa com permissão de Beckel et ^al.8. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A maioria das pesquisas sobre a liberação de ATP urotelial é conduzida em células cultivadas, usando linhagens celulares imortalizadas ou culturas primárias de células uroteliais de roedores. Embora esses modelos tenham o benefício de ter um rendimento relativamente alto (ou seja, uma cultura/passagem pode produzir muitas placas/pratos de células), sua relevância fisiológica é diminuída devido: 1) à incapacidade das células uroteliais de crescer polarizadas a menos que sejam cultivadas em suportes especiais e 2) à dificuldade em expor as células cultivadas a níveis fisiológicos de estiramento/pressão. Uma maneira de lidar com essas limitações é removendo a bexiga de um roedor, cortando-a aberta e colocando-a em uma câmara de Ussing, inserindo o tecido da bexiga entre duas meias câmaras cheias de solução fisiológica. Isso permite que o pesquisador submeta o urotélio, em seu estado polarizado nativo, à distensão, adicionando volume ao lado urotelial da câmara, causando estiramento do tecido vesical na câmara. No entanto, é difícil relacionar esse trecho com a distensão observada pelo urotélio in vivo. Além disso, o ATP evocado por distensão na câmara de Ussing é liberado no grande volume de fluido fisiológico contido na câmara, diluindo a concentração de ATP várias vezes. Usando este procedimento, a pressão da bexiga é medida diretamente, de modo que a distensão pode ser mantida em uma faixa relevante para a fisiologia ou fisiopatologia. Além disso, uma vez que estamos medindo a concentração de ATP diretamente do fluido luminal e não de uma quantidade arbitrária e excessiva de fluido usado para manter o tecido in vitro, a concentração medida não precisa ser corrigida. Assim, o procedimento descrito neste artigo permite que o pesquisador examine a liberação de ATP no lúmen da bexiga em condições que se assemelham muito mais a condições fisiológicas ou fisiopatológicas da bexiga.

A técnica descrita é muito semelhante às técnicas de cistometria padrão usadas para estudar os efeitos das drogas na atividade da bexiga reflexa e deve ser facilmente realizada por qualquer pessoa que rotineiramente realize esses experimentos. Para os pesquisadores novos no cateterismo vesical, no entanto, existem algumas ressalvas a serem observadas. Primeiro, o cateterismo transuretral pode ser difícil para os inexperientes devido à curvatura da uretra do roedor. Isso também pode ser dificultado pelo aperto do esfíncter uretral externo, mesmo sob anestesia de uretano. É imperativo que o pesquisador não tente forçar o cateter para dentro da uretra, pois provavelmente causará aumento da inflamação e inchaço, o que, por sua vez, tornará a uretra ainda mais difícil de cateterizar com sucesso. Além disso, é possível cutucar o cateter através da parede da uretra, arruinando todo o experimento.

Desenvolvemos algumas dicas e truques para aumentar a taxa de sucesso. Por exemplo, às vezes é necessário dar ao animal outra dose curta de isoflurano inalado (0,5%-1,0%) para relaxar o esfíncter uretral. Isso deve ser realizado com moderação e cuidado, pois a combinação de uretano e isoflurano pode resultar em depressão respiratória. Outro truque é mergulhar a ponta do cateter em uma solução de lidocaína a 2% antes de inseri-la no orifício uretral externo; isso muitas vezes fará com que o esfíncter relaxe após alguns minutos. Esvaziar a bexiga pressionando suavemente o abdômen do animal também pode ajudar a relaxar o esfíncter uretral. Finalmente, pode ser necessário usar um cateter de calibre menor; às vezes usamos um cateter 24 G, especialmente com animais menores. Tenha em mente, no entanto, que pode ser necessário reduzir a taxa de infusão na bexiga ao usar um cateter transuretral de calibre menor, para combinar com a drenagem mais lenta do cateter uretral. Não fazer isso faria com que a pressão da bexiga aumentasse, apesar do cateter uretral não estar tampado.

Deve-se notar que o uretano é usado como anestésico neste protocolo. O uretano é comumente usado em laboratórios que estudam o trato urinário inferior, uma vez que poupa o reflexo da micção, enquanto outros anestésicos não. Devido a isso, a distensão da bexiga acima de uma pressão de ~ 7-10 cm H₂O sob anestesia uretana desencadeará um reflexo de micção. Como estamos interessados na liberação de ATP em resposta à distensão passiva, este protocolo exige o bloqueio das contrações da bexiga usando o bloqueador ganglionar hexametônio. Isso permite a medição da liberação de ATP em resposta às pressões intravesicais mais altas (ou seja, 30 cm H₂O) comumente observadas na patologia da bexiga envolvendo obstrução da saída. Portanto, o uso de um uretano/hexametônio permite a medição da liberação de ATP luminal evocado por distensão por longos períodos de tempo (a duração da ação de ambas as drogas é medida em horas). No entanto, alguns laboratórios podem preferir usar um anestésico que não poupe o reflexo da micção, como a cetamina, e elimine a necessidade de um bloqueador ganglionar. Isso também funcionará bem para este procedimento, embora exija administração mais frequente (ou contínua) devido à menor duração de ação do anestésico.

Uma diferença notável entre esta técnica para medir o ATP e a configuração comum de cistometria com a qual os pesquisadores de urologia podem estar familiarizados é o uso de solução tamponada de Krebs como um perfusato em vez da solução salina isotônica padrão. O ATP é uma molécula bastante lábil e é estabilizado um pouco em uma solução tamponada. Além disso, a composição da solução de Krebs é muito mais próxima da da urina do que a solução salina, o que acrescenta ainda mais relevância clínica a esses experimentos. Esta é uma consideração importante, pois o controle da liberação de ATP urotelial tem se mostrado modulado por canais permeáveis ao cálcio, e a falta de cálcio na solução salina normal pode influenciar negativamente a liberação de ATP. A instabilidade do ATP em solução também é o motivo pelo qual sugerimos que as amostras sejam imediatamente quantificadas usando a reação luciferina-luciferase. No entanto, se o investigador não conseguir ler as amostras imediatamente, as amostras devem ser congeladas o mais rapidamente possível para limitar a degradação do ATP.

Uma limitação desta técnica é que ela mede apenas a liberação de ATP luminal e não pode medir a liberação de ATP do lado serosal do urotélio. Acredita-se que o ATP é liberado do lado serosal para influenciar diretamente a excitabilidade aferente; no entanto, a medição direta dessa liberação é difícil. Neste caso, o uso de células cultivadas em suportes de membrana permeáveis, como placas Transwell, ou a remoção cirúrgica do urotélio para experimentos com câmara de Ussing, é a técnica preferida. No entanto, dada a aparente importância do ATP luminal na patologia da bexiga, este modelo experimental é uma ferramenta útil para elucidar os mecanismos celulares que controlam a liberação de ATP urotelial durante a patologia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose