In vivo Misurazione luminale del rilascio uroteliale di ATP evocato dalla distensione nei roditori

Summary

Questo protocollo descrive la procedura per misurare le concentrazioni di ATP nel lume della vescica in un roditore anestetizzato.

Abstract

Si ritiene che l'ATP, rilasciato dall'urotelio in risposta alla distensione della vescica, svolga un ruolo sensoriale significativo nel controllo della minzione. Pertanto, una misurazione accurata del rilascio uroteliale di ATP in un contesto fisiologico è un primo passo importante nello studio dei meccanismi che controllano la segnalazione purinergica nella vescica urinaria. Le tecniche esistenti per studiare il rilascio uroteliale di ATP evocato meccanicamente utilizzano cellule in coltura placcate su supporti flessibili o tessuto vescicale appuntato nelle camere di Ussing; Tuttavia, ognuna di queste tecniche non emula completamente le condizioni nella vescica intatta. Pertanto, è stata sviluppata una configurazione sperimentale per misurare direttamente le concentrazioni di ATP nel lume della vescica urinaria del roditore.

In questa configurazione, le vesciche dei roditori anestetizzati vengono perfuse attraverso cateteri sia nella cupola della vescica che attraverso l'orifizio uretrale esterno. La pressione nella vescica viene aumentata tappando il catetere uretrale mentre perfonde il fluido sterile nella vescica attraverso la cupola. La misurazione della pressione intravescicale viene ottenuta utilizzando un trasduttore di pressione collegato al catetere a cupola della vescica, simile alla configurazione utilizzata per la cistometria. Una volta raggiunta la pressione desiderata, il cappuccio del catetere uretrale viene rimosso e il fluido raccolto per la quantificazione dell'ATP mediante saggio luciferina-luciferasi. Attraverso questa configurazione sperimentale, i meccanismi che controllano la stimolazione meccanica e chimica del rilascio uroteliale di ATP possono essere interrogati includendo vari agonisti o antagonisti nel perfusato o confrontando i risultati tra animali wildtype e geneticamente modificati.

Introduction

Si ritiene che l'ATP urinario svolga un ruolo sensoriale significativo nel controllo della minzione¹. Ad esempio, si pensa che l'ATP venga rilasciato dall'urotelio in risposta alla distensione dove può agire sui recettori sui nervi afferenti della vescica per aumentare la loro eccitabilità, portando a sensazioni di pienezza². Pertanto, si pensa anche che l'ATP urinario potrebbe essere un attore importante nello sviluppo delle patologie della vescica. A sostegno di questa ipotesi, le concentrazioni urinarie di ATP sono significativamente aumentate nei pazienti affetti da vescica iperattiva (OAB)³, sindrome da dolore alla vescica/cistite interstiziale (BPS/IC)⁴ o infezione del tratto urinario (UTI)^5,6, tutte condizioni caratterizzate da maggiore urgenza, frequenza e, talvolta^, dolore. Al contrario, i pazienti affetti da vescica iperattiva (UAB), che è caratterizzata da un'incapacità di svuotare la vescica e talvolta può includere una ridotta capacità di percepire la pienezza della vescica, hanno dimostrato di avere una diminuzione delle concentrazioni urinarie di ATP⁷. Sperimentalmente, la manipolazione delle concentrazioni urinarie di ATP può alterare i riflessi della vescica nel ratto; aumentare le concentrazioni di ATP bloccando le ATPasi endogene nel lume della vescica può aumentare la frequenza di minzione, mentre la diminuzione delle concentrazioni di ATP instillando ATPasi esogene nella vescica riduce la frequenza di minzione⁸. Pertanto, l'importanza dell'ATP urinario per la funzione della vescica è chiara.

Data l'apparente importanza dell'ATP urinario per la patologia della vescica, la misurazione accurata del rilascio uroteliale di ATP è un passo importante nella comprensione dei meccanismi che controllano il rilascio. Molti studi sono stati completati utilizzando diversi modelli sperimentali per misurare il rilascio uroteliale di ATP. Il primo tra questi sono le colture cellulari, sia colture primarie che linee cellulari. Tuttavia, l'uso di cellule uroteliali in coltura è complicato dal fatto che le cellule uroteliali non assumono la loro fisiologica morfologia polarizzata a meno che non siano cresciute su speciali membrane permeabili (come la tecnologia Transwell [inserti pozzo])⁹. Pertanto, è difficile correlare qualsiasi rilascio di ATP misurato alla fisiologia. Le cellule uroteliali cresciute su inserti di pozzetti possono polarizzarsi e formare una barriera simile a quella che si vede in vivo; Tuttavia, la crescita di un urotelio completamente differenziato può richiedere giorni o settimane. Inoltre, mentre è possibile montare inserti di pozzetti in una camera di Ussing e applicare pressione sul lato apicale per causare allungamento, è difficile applicare una pressione sufficiente per imitare le condizioni all'interno della vescica durante la patologia (cioè pressioni di 30 cm H₂O o superiori). L'intero tessuto vescicale può anche essere montato in una camera di Ussing per esperimenti di allungamento, ma questo rimuove la vescica dall'organismo insieme ai fattori trofici che mantengono la salute delle cellule uroteliali e, quindi, la funzione di barriera uroteliale. Pertanto, il modo fisiologicamente più rilevante per studiare il rilascio di ATP dall'urotelio in risposta allo stiramento o alla pressione è in vivo. Le tecniche chirurgiche necessarie per impostare l'esperimento sono identiche a quelle comunemente utilizzate nella cistometria animale e, pertanto, dovrebbero essere facilmente eseguite da chiunque abbia familiarità con tale tecnica.

In questo protocollo, descriveremo la tecnica utilizzata per esaminare l'ATP luminale in ratti femmina di Sprague Dawley del peso di circa 200-250 g, poiché il cateterismo transuretrale descritto di seguito è molto più facile nelle femmine; Tuttavia, il cateterismo transuretrale può essere eseguito anche nei roditori maschi¹⁰. Poiché il cateterismo transuretrale è stato eseguito in topi di entrambi i sessi e¹¹, questi esperimenti possono essere facilmente adattati per topi o ratti di entrambi i sessi o di dimensioni variabili, a seconda delle esigenze del team di ricerca.

Protocol

Tutte le procedure eseguite nei roditori devono aderire alle linee guida applicabili ed essere approvate dal comitato di revisione etica istituzionale locale. Gli esperimenti eseguiti per questo manoscritto sono stati condotti in conformità con la Guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della School of Medicine dell'Università di Pittsburgh. Vedere la Figura 1 per una versione modificata della configurazione standard della cistometria dei roditori utilizzata in questo protocollo.

1. Animali da laboratorio

1. Mantenere i ratti in alloggi sociali (più roditori in una gabbia) con un ciclo luce/buio di 12 ore e accesso ad libitum ad acqua e pellet di cibo.

2. Anestesia e blocco gangliare

1. Indurre l'anestesia iniziale ponendo l'animale in una scatola chiusa gassata con isoflurano al 4%-5% in O₂ (1 L/min).
2. Anestetizzare l'animale usando l'uretano.
   1. Iniettare uretano per via sottocutanea bilateralmente (1/2 dose su ciascun lato dell'animale) alla dose di 1,2 g/kg. Metti l'animale in una gabbia per consentire all'uretano di fare effetto, che generalmente richiede 2 ore.
   2. In alternativa, somministrare uretano per via intraperitoneale (i.p.) iniettando la dose completa in due dosi separate a ~ 10 minuti di distanza.
3. Dopo aver atteso il tempo opportuno affinché l'uretano faccia effetto (c.s.: 2 h, i.p.: 30 min), testare un adeguato piano di anestesia pizzicando il piede dell'animale usando una pinza. Se si osserva un riflesso, somministrare una dose aggiuntiva di uretano (0,05-0,1 mL i.p.), attendere 15 minuti e ripetere il test. Continuare a monitorare l'animale per il corretto piano di anestesia durante la procedura.
4. Per prevenire una contrazione della vescica durante la distensione, iniettare nell'animale un agente bloccante gangliare, come l'esametonio (20 mg/kg, i.p.).
5. Applicare un unguento oftalmico agli occhi dell'animale per prevenire l'essiccazione durante l'esperimento.

3. Procedura chirurgica-cateterismo vescicale sovrapubico

1. Rasare l'addome dell'animale ed eseguire una laparotomia della linea mediana per esporre la vescica urinaria.
2. Preparare un catetere bruciando un'estremità di una lunghezza corta (~ 10-15 cm) di tubo intramedico PE50 usando una fiamma. Inserire un ago da 22 G nell'altra estremità del tubo e riempire con la soluzione di Krebs (vedere la tabella dei materiali per la composizione).
3. Posizionare un piccolo anello di sutura di seta 3-0 sulla cupola della vescica ed eseguire una piccola cistostomia (usando forbici sottili o un ago da 18 G) abbastanza grande da inserire l'estremità svasata del catetere fatto sopra. Con una mano che tiene il catetere in posizione, utilizzare l'altra mano per stringere l'anello della sutura per fissare il catetere in posizione. Completare il fissaggio del catetere legando due nodi nella sutura e tirando indietro il catetere fino a quando la testa svasata è a contatto con la parete della vescica.
   1. In alternativa, fissare il catetere utilizzando una classica tecnica di sutura a corda di borsa, come precedentemente descritto per la cistometria¹².
      NOTA: È imperativo non introdurre bolle d'aria nella vescica durante questa procedura.
4. Testare la configurazione per le perdite infondendo una piccola quantità di soluzione di Krebs attraverso il catetere. Se il liquido fuoriesce dalla cistostomia, rifissare il catetere con una sutura aggiuntiva attorno alla cistostomia.

4. Cateterismo transuretrale

1. Immergere l'estremità di un catetere endovenoso da 20 G x 1" (con l'ago rimosso) nel lubrificante chirurgico.
2. Tenere delicatamente il meato uretrale esterno con un paio di pinze e inserire la punta del catetere nell'orifizio uretrale in direzione della coda fino a quando la punta provoca la deformazione della parete dell'apertura vaginale adiacente. Ruotare il catetere di 90° (portando l'estremità Luer-Lock del catetere verso la coda) e avanzare delicatamente. Inserire completamente il catetere fino a quando il mozzo Luer-Lock si trova a circa 5 mm distale dall'apertura uretrale esterna.
   NOTA: Non inserire il catetere troppo lontano, che potrebbe causare la punta a colpire la parete interna della vescica. Se si avverte resistenza durante l'avanzamento del catetere, fermarsi e ricominciare o rischiare di perforare l'uretra. Vedere la sezione di discussione sui suggerimenti per aumentare il successo del cateterismo.
3. Fissare il catetere e prevenire perdite intorno al catetere avvolgendo una sutura di seta 3-0 di breve lunghezza attorno al meato uretrale esterno e legarlo strettamente. Fissare il catetere alla coda con del nastro adesivo per evitare che venga estratto accidentalmente.
4. Una volta cateterizzata, infondere delicatamente la soluzione di Krebs nella vescica attraverso il catetere vescica sovrapubica e confermare che il fluido fuoriesce dal catetere uretrale e non intorno ad esso. Se necessario, ritirare la sutura attorno all'orifizio uretrale esterno.
5. Chiudere l'incisione addominale sopra la vescica usando una sutura di seta 3-0.

5. Configurazione sperimentale

1. Fissare l'animale su una tavola in grado di essere inclinata per aiutare nel drenaggio del liquido intravescicale attraverso il catetere uretrale. Posizionare una piastra riscaldante e un sottocuscinetto assorbente tra l'animale e la tavola per mantenere il calore corporeo e assorbire il liquido che drena dal catetere uretrale.
2. Collegare il catetere sovrapubico a un rubinetto a tre vie, che collega il catetere a una pompa a siringa e un trasduttore di pressione. Collegare il trasduttore di pressione a un computer tramite un amplificatore e un sistema di acquisizione dati.
   NOTA: prestare attenzione per evitare la formazione di bolle d'aria nel tubo che collega la pompa della siringa, il trasduttore e il catetere vescicale della siringa.
3. Calibrare la registrazione della pressione della vescica utilizzando la procedura suggerita dal produttore del trasduttore di pressione e/o del software di acquisizione dati.
4. Infondere la soluzione di Krebs attraverso il catetere sovrapubico ad una velocità di 0,1 ml / min e lasciare che il fluido defluisca dal catetere uretrale per 1 ora per lavare qualsiasi ATP residuo rilasciato durante gli impianti del catetere.
5. Dopo questo periodo di washout, tappare il catetere uretrale utilizzando un tappo Luer-Lock e misurare la pressione nella vescica. Cerca un lento aumento della pressione intravescicale a una pressione di 30 cm H 2O senza un forte aumento della pressione, che indicherebbe una contrazione della vescica (vedi Figura 2). Rimuovere il tappo dal catetere uretrale quando la pressione raggiunge i 30 cm H₂O per evitare danni alla vescica.
   NOTA: Se le contrazioni della vescica continuano a verificarsi dopo 1 ora, somministrare una dose aggiuntiva di esametonio (5 mg/kg dose i.p.).

6. Raccolta dei campioni

1. Infondere la vescica a 0,1 ml/min e raccogliere l'eluato dal catetere uretrale. Testare immediatamente 100 μL di aliquote dell'eluato per l'ATP (vedere sotto) o congelare per una successiva quantificazione del lotto.
2. Per testare l'effetto della distensione della vescica sulle concentrazioni luminali di ATP, tappare il catetere uretrale con il tappo e monitorare la pressione della vescica fino a raggiungere il livello desiderato. Quindi, aprire il catetere uretrale e raccogliere l'eluato per la misurazione o il congelamento dell'ATP, come descritto sopra.
3. Dopo ogni distensione, lasciare riposare la vescica e lavarsi per 10-15 minuti prima di prelevare ulteriori campioni. Prelevare un totale di 3-5 campioni di pretensione e 3-5 campioni ad ogni pressione di distensione desiderata per dimostrare la ripetibilità.
4. Per testare l'effetto dei farmaci sul rilascio di ATP, cambiare la soluzione di Krebs che infonde la vescica a Krebs contenente il farmaco di scelta. Perfondere a 0,1 ml / min per 10-15 minuti affinché il farmaco abbia un effetto, quindi raccogliere i campioni dalle vesciche non distese e distese come descritto nei passaggi 6.1 e 6.2.

7. Quantificazione dell'ATP dai campioni raccolti

1. Quantificare l'ATP nei campioni raccolti da 100 μL utilizzando un kit di analisi luciferina/luciferasi disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore e un luminometro.
   1. Per quantificare l'ATP, combinare 100 μL di campioni di perfusato con 50 μL della miscela di analisi e posizionarli nel luminometro per la lettura. Per convertire le unità di luce relativa (RLU) riportate dal luminometro in una concentrazione di ATP, effettuare diluizioni seriali di ATP in soluzione di Krebs che vanno da 1 μM a 10 pM in diluizioni 10 volte per creare una curva standard e leggerle nel luminometro. Tracciare le letture risultanti su un grafico ed eseguire una regressione non lineare (quadratica) per estrapolare le concentrazioni dai campioni prelevati dall'animale.
      NOTA: È importante stabilire standard ATP per qualsiasi soluzione farmacologica testata nell'esperimento, poiché molti farmaci interferiscono con la reazione luciferina/luciferasi, che deve essere corretta.

8. Eutanasia degli animali

1. Quando l'esperimento è completato e tutti i campioni sono raccolti, eutanasia umana l'animale secondo le linee guida USDA e la Guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
   1. Rimuovere l'animale anestetizzato dalla configurazione sperimentale, metterlo in una scatola chiusa e gasarlo con CO₂ al 100%. Assicurarsi che la velocità di riempimento sia pari al 30%-70% del volume della camera al minuto (ad esempio, 3-7 L/min per una scatola con un volume di 10 L). Continuare il flusso di CO₂ per almeno 1 minuto dopo la cessazione della respirazione.
2. Usa una forma secondaria di eutanasia per garantire la morte.
   1. Eseguire una toracotomia come forma secondaria di eutanasia afferrando il piccolo lembo di pelle all'estremità caudale dello sterno e tagliando un piccolo foro nella pelle e nella muscolatura al diaframma con un paio di forbici affilate. Completare la toracotomia inserendo le forbici nell'apertura e tagliando rostralmente attraverso la gabbia toracica ed esponendo la cavità toracica.
      NOTA: L'animale sottoposto a eutanasia deve essere smaltito secondo le linee guida istituzionali.

Representative Results

Il protocollo descritto consente la misurazione accurata del rilascio uroteliale di ATP in vivo dal lume della vescica, utilizzando una versione modificata della configurazione standard della cistometria dei roditori (vedere Figura 1). Ciò consente al ricercatore di esaminare gli effetti dei farmaci sul rilascio di ATP mediato dallo stiramento in un ambiente fisiologico.

Figura 1: Configurazione sperimentale. (A) Immagine che mostra la configurazione sperimentale, con le varie apparecchiature etichettate. L'area dell'animale delineata in un rettangolo rosso è mostrata in B. (B) Fotografia raffigurante l'addome del ratto dopo l'intervento chirurgico. Si noti il catetere sovrapubico inserito e legato nella cupola della vescica, così come il catetere uretrale inserito attraverso l'orifizio esterno. Il catetere uretrale è inserito nella foto per mostrare che la pressione della vescica aumenta durante la perfusione attraverso il catetere vescicale . Durante l'esperimento, l'apertura addominale sarebbe stata suturata chiusa, ma è stata lasciata aperta qui per consentire la visualizzazione della vescica urinaria. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Di primaria importanza per la misurazione di successo del rilascio di ATP mediato dallo stiramento nella vescica dei roditori è garantire che il riflesso della minzione sia bloccato, consentendo alla vescica di essere distesa oltre la pressione di soglia normalmente sufficiente per attivare il riflesso di minzione. Come mostrato nella Figura 2A, quando il catetere uretrale è tappato, l'infusione della soluzione nella vescica provoca un brusco aumento della pressione intravescicale mentre la vescica si contrae. Poiché siamo interessati agli effetti dell'allungamento passivo, non della contrazione, sul rilascio uroteliale di ATP, l'animale viene trattato con un bloccante gangliare, l'esametonio, per prevenire il riflesso della minzione. Come evidenziato nella Figura 2B, quando viene somministrato esametonio, l'instillazione della soluzione nella vescica con il catetere uretrale bloccato provoca un aumento molto più graduale della pressione intravescicale, consentendo alle pressioni di salire fino a 30 cm H₂O senza contrazione. Ciò consente di misurare il rilascio di ATP luminale a pressioni abbastanza elevate da essere rilevanti per la patologia, come quelle osservate in una vescica iperattiva, nell'ostruzione parziale dello sbocco della vescica o durante la dissinergia del detrusore-sfintere dopo lesione del midollo spinale. Mentre può richiedere una dose supplementare di esametonio per bloccare completamente il riflesso della minzione, si deve prestare attenzione a non somministrare abbastanza per provocare un sovradosaggio. Ciò potrebbe portare a una significativa diminuzione della gittata cardiaca e compromettere la qualità dell'esperimento. Va notato che lo stesso effetto inibitorio sul riflesso della vescica può essere ottenuto tagliando i nervi pelvici bilateralmente o recidendo il midollo spinale a livello L4 o superiore. Questo, ovviamente, aumenta significativamente la difficoltà della configurazione sperimentale e il tempo necessario per completare l'esperimento.

Figura 2: Registrazioni della pressione dai ratti. Prima (A) e dopo (B) blocco gangliare. Le frecce indicano quando il catetere uretrale è stato tappato. Si noti che la pressione nella traccia superiore aumenta rapidamente quando la pressione raggiunge la soglia per indurre la minzione, mentre la pressione nella traccia inferiore aumenta gradualmente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Un'altra considerazione molto importante per questi esperimenti è quella di garantire una corretta conversione delle letture del luminometro (normalmente espresse in RLU) in una concentrazione di ATP utilizzando curve standard. La reazione luciferina/luciferasi è molto suscettibile agli agenti interferenti¹³. Questa interferenza può derivare da un'interazione diretta con luciferina/luciferasi. Ad esempio, un certo numero di composti può agire come inibitori competitivi o non competitivi della luciferasi; uno studio ha suggerito che ~ 3% dei composti nel Molecular Libraries Small Molecule Repository potrebbe inibire la luciferasi della lucciola a concentrazioni inferiori a 11 μM¹⁴. Inoltre, la luciferina è suscettibile agli agenti ossidanti, riducendo la quantità di substrato disponibile per la reazione che produce luminescenza¹⁵. È anche possibile interferire con la reazione luciferina/luciferasi alterando la disponibilità del cofattore della reazione, il magnesio. Ad esempio, una tecnica comune per imitare l'allungamento meccanico negli esperimenti ATP in vitro è quella di indurre il gonfiore cellulare riducendo l'osmolarità della soluzione perfusa. Tuttavia, molti ricercatori ottengono questa riduzione diluendo la soluzione con acqua, riducendo la concentrazione di magnesio disponibile per agire come cofattore nella reazione luciferina / luciferasi. Inoltre, alcuni farmaci sono venduti come sali di magnesio, che possono aumentare notevolmente la quantità di magnesio nella soluzione, portando anche a differenze misurabili nelle letture della luminescenza. Infine, è possibile che una soluzione farmacologica interferisca con la capacità di misurare con precisione la luce prodotta dalla reazione luciferina/luciferasi. Brilliant Blue FCF (BB-FCF, noto anche come erioglaucina o FD&C Blue dye #1) è un inibitore specifico del rilascio¹⁶ di ATP mediato dalla pannexina. A dosi efficaci, la soluzione Brilliant Blue FCF ha una distinta tonalità blu, che assorbe la luce ad un picco di circa 600 nm¹⁷. Questo è all'interno della gamma di lunghezze d'onda della luce che viene emessa dalla luciferasi; pertanto, l'emissione luminosa negli esperimenti con BB-FCF è notevolmente ridotta. Pertanto, è imperativo che le curve standard che utilizzano quantità note di ATP disciolte in soluzioni contenenti ciascun farmaco sperimentale siano utilizzate per quantificare il rilascio di ATP durante l'esperimento. Come mostrato nella Figura 3, BB-FCF (100 μM) diminuisce significativamente la pendenza della curva standard, che è sufficiente per alterare significativamente i valori calcolati per la concentrazione di ATP nel campione. Come mostrato nella parte inferiore della Figura 3, l'utilizzo dello standard Krebs per calcolare la concentrazione di ATP in un campione contenente BB-FCF può comportare una sottostima della concentrazione di ATP di ~ 50%. In alcuni casi, l'uso della curva standard sbagliata potrebbe oscurare un cambiamento mediato da farmaci nel rilascio di ATP o far apparire erroneamente come se si fosse verificato un cambiamento. Nell'esperimento illustrato nella Figura 3, ad esempio, l'utilizzo dello standard Krebs per tutti i campioni avrebbe fatto sembrare che Brilliant Blue FCF riducesse il rilascio di ATP di ~ 67% (da 16,6 a 5,5 nM) quando, in realtà, era diminuito solo ~ 42% (da 16,6 a 9,6 nM).

Figura 3: Effetti dei farmaci sperimentali sulla curva standard dell'ATP. Si noti che l'antagonista del canale della pannexina, Brilliant Blue, altera significativamente le RLU misurate per ogni data concentrazione di ATP, il che comporterebbe una sottostima dell'ATP misurato, se non corretto. Abbreviazione: RLUs = Relative Light Units; BB-FCF = Blu brillante FCF. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Un'altra considerazione da tenere a mente è che l'ATP viene comunemente rilasciato dai tessuti a causa di danni e che queste procedure chirurgiche e l'inserimento del catetere uretrale si tradurranno in letture di ATP anormalmente elevate se assunto troppo presto dopo la configurazione. Questa procedura descrive un periodo di washout di 1 ora dopo l'impostazione dell'esperimento, che non deve essere saltato. Abbiamo scoperto che dopo 1 ora, le concentrazioni di ATP misurate nei campioni prelevati quando la vescica non è distesa sono relativamente basse (~ 10-30 nM) mentre i campioni prelevati prima del periodo di washout possono leggere un ordine di grandezza superiore. Brevi washout di 5 minuti dovrebbero essere eseguiti anche tra le distensioni, poiché i livelli di ATP possono rimanere elevati per un breve periodo. Una buona regola empirica sarebbe quella di misurare l'ATP in più campioni all'inizio dell'esperimento e dopo ogni distensione e procedere solo quando le letture dell'ATP si stabilizzano. Nella Figura 4, mostriamo una rappresentazione di un tipico esperimento con misurazioni effettuate in vari punti temporali. Si noti le letture elevate prese prima del washout (campioni #1 e #5) rispetto a quelle prese dopo il washout (campioni #2 e #6).

Figura 4: Rappresentazione di un esperimento tipico. Una rappresentazione stilizzata di una tipica registrazione di pressione. Ogni numero rappresenta un punto temporale in cui un campione è stato prelevato e misurato per ATP: 1) immediatamente dopo il completamento dell'installazione, prima del periodo di washout, 2) dopo un periodo di washout di 1 ora, 3) immediatamente prima di una distensione, 4) durante la distensione, 5) immediatamente dopo una distensione e 6) dopo un breve periodo di washout dopo la distensione. La tabella dei riquadri mostra i valori rappresentativi di RLU e le concentrazioni di ATP per ciascun campione. Abbreviazione: RLUs = Relative Light Units. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La Figura 5 mostra grafici rappresentativi dei risultati sperimentali che esaminano il meccanismo di rilascio di ATP dall'urotelio. Come mostrato nella Figura 5A, l'aumento della pressione provoca un aumento significativo della concentrazione di ATP nel lume della vescica, con pressioni di 30 cm di acqua che aumentano le concentrazioni di quasi 2,5 volte rispetto ai controlli non distesi. La perfusione intravescicale di 2 U/mL di apirasi, un enzima che catalizza l'idrolisi dell'ATP, diminuisce significativamente la concentrazione misurata di ATP nel lume della vescica. Al contrario, la perfusione intravescicale di ARL67156, un inibitore delle NTPDasi presente sull'urotelio, aumenta significativamente le concentrazioni luminali di ATP. La figura 5B illustra gli esperimenti sul meccanismo di rilascio di ATP indotto dallo stiramento dall'urotelio. La perfusione con gli antagonisti dei canali pannexina Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) o carbenoxolone (CBX, 100 μM) riduce significativamente il rilascio di ATP nel lume della vescica a tutte le pressioni. Le concentrazioni luminali di ATP non diminuiscono quando l'acido 18α-glicirretico bloccante della connessina viene perfuso, indicando che il rilascio di ATP evocato dalla distensione è mediato dai canali della pannexina e non dai canali della connessina.

Figura 5: Misurazioni rappresentative del rilascio di ATP evocato dalla distensione nel lume della vescica urinaria. (A) La distensione della vescica aumenta le concentrazioni luminali di ATP, che possono essere diminuite in presenza della NTPDasi apirasi (2 U/mL) o aumentate quando le NTPDasi endogene sono inibite con ARL67156 (10 μM). (B) Il rilascio di ATP evocato dalla distensione è bloccato dagli antagonisti del canale della pannexina Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) e carbenoxolone (CBX, 100 μM) ma non dall'antagonista del canale della connessina acido 18α-glicirretico (18α-GA, 50 μM). I dati sono presentati come media con barre di errore standard. ** p < 0,05 tra le due barre indicate dalla linea, ## p < 0,05 rispetto ai controlli di Krebs alla stessa distensione. Questa figura è ristampata con il permesso di Beckel et ^al.8. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

La maggior parte della ricerca sul rilascio di ATP uroteliale è condotta in cellule in coltura, utilizzando linee cellulari immortalizzate o colture primarie di cellule uroteliali di roditori. Mentre questi modelli hanno il vantaggio di essere relativamente alti (cioè, una coltura / passaggio può fare molti piatti / piatti di cellule), la loro rilevanza fisiologica è diminuita a causa di: 1) l'incapacità delle cellule uroteliali di crescere polarizzate a meno che non siano coltivate su supporti speciali e 2) la difficoltà di esporre le cellule coltivate a livelli fisiologici di allungamento / pressione. Un modo per affrontare queste limitazioni è rimuovere la vescica da un roditore, tagliarla e metterla in una camera di Ussing, inserendo il tessuto vescicale tra due mezze camere piene di soluzione fisiologica. Ciò consente al ricercatore di sottoporre l'urotelio, nel suo stato polarizzato nativo, alla distensione aggiungendo volume al lato uroteliale della camera, causando l'allungamento del tessuto vescicale nella camera. Tuttavia, è difficile mettere in relazione questo tratto con la distensione osservata dall'urotelio in vivo. Inoltre, l'ATP evocato dalla distensione nella camera di Ussing viene rilasciato nel grande volume di fluido fisiologico contenuto nella camera, diluendo la concentrazione di ATP diverse volte. Utilizzando questa procedura, la pressione della vescica viene misurata direttamente, in modo che la distensione possa essere mantenuta in un intervallo rilevante per la fisiologia o la fisiopatologia. Inoltre, poiché stiamo misurando la concentrazione di ATP direttamente dal fluido luminale e non da una quantità arbitraria ed eccessiva di fluido utilizzato per mantenere il tessuto in vitro, la concentrazione misurata non deve essere corretta. Pertanto, la procedura descritta in questo documento consente al ricercatore di esaminare il rilascio di ATP nel lume della vescica in condizioni che assomigliano molto più da vicino alle condizioni fisiologiche o fisiopatologiche della vescica.

La tecnica descritta è molto simile alle tecniche di cistometria standard utilizzate per studiare gli effetti dei farmaci sull'attività riflessa della vescica e dovrebbe essere facilmente eseguita da chiunque esegua abitualmente tali esperimenti. Per quei ricercatori nuovi al cateterismo vescicale, tuttavia, ci sono alcuni avvertimenti di cui essere consapevoli. Innanzitutto, il cateterismo transuretrale può essere difficile per gli inesperti a causa della curvatura dell'uretra dei roditori. Questo può anche essere reso più difficile dalla tenuta dello sfintere uretrale esterno, anche in anestesia uretanica. È imperativo che il ricercatore non cerchi di forzare il catetere nell'uretra, poiché molto probabilmente causerà un aumento dell'infiammazione e del gonfiore, che a sua volta renderà l'uretra ancora più difficile da cateterizzare con successo. Inoltre, è possibile colpire il catetere attraverso la parete dell'uretra, rovinando l'intero esperimento.

Abbiamo sviluppato alcuni suggerimenti e trucchi per aumentare il tasso di successo. Ad esempio, a volte è necessario somministrare all'animale un'altra breve dose di isoflurano inalato (0,5% -1,0%) per rilassare lo sfintere uretrale. Questo deve essere eseguito con parsimonia e con cura, poiché la combinazione di uretano e isoflurano può causare depressione respiratoria. Un altro trucco è quello di immergere la punta del catetere in una soluzione di lidocaina al 2% prima di inserirla nell'orifizio uretrale esterno; Questo spesso farà sì che lo sfintere si rilassi dopo pochi minuti. Svuotare la vescica premendo delicatamente sull'addome dell'animale può anche aiutare a rilassare lo sfintere uretrale. Infine, potrebbe essere necessario utilizzare un catetere di calibro più piccolo; a volte usiamo un catetere da 24 G, specialmente con animali più piccoli. Tenere presente, tuttavia, che potrebbe essere necessario ridurre la velocità di infusione nella vescica quando si utilizza un catetere transuretrale di calibro più piccolo, per abbinare il drenaggio più lento dal catetere uretrale. In caso contrario, la pressione della vescica aumenterebbe, nonostante il catetere uretrale non sia tappato.

Va notato che l'uretano è usato come anestetico in questo protocollo. L'uretano è comunemente usato nei laboratori che studiano il tratto urinario inferiore, poiché risparmia il riflesso della minzione mentre altri anestetici non lo fanno. Per questo motivo, la distensione della vescica al di sopra di una pressione di ~ 7-10 cm H₂O sotto anestesia uretanica innescherà un riflesso di minzione. Poiché siamo interessati al rilascio di ATP in risposta alla distensione passiva, questo protocollo richiede di bloccare le contrazioni della vescica utilizzando il bloccante gangliare esametonio. Ciò consente la misurazione del rilascio di ATP in risposta alle pressioni intravescicali più elevate (cioè 30 cm H₂O) comunemente osservate nella patologia vescicale che coinvolge l'ostruzione dello sbocco. Pertanto, l'uso di un uretano/esametonio consente di misurare il rilascio di ATP luminale evocato dalla distensione per lunghi periodi di tempo (la durata d'azione di entrambi i farmaci è misurata in ore). Tuttavia, alcuni laboratori potrebbero preferire l'uso di un anestetico che non risparmi il riflesso della minzione, come la ketamina, ed elimini la necessità di un bloccante gangliare. Questo funzionerà bene anche per questa procedura, anche se richiederà una somministrazione più frequente (o continua) a causa della durata più breve dell'azione dell'anestetico.

Una differenza degna di nota tra questa tecnica per misurare l'ATP e la comune configurazione cistometrica con cui i ricercatori di urologia possono avere familiarità è l'uso della soluzione tamponata di Krebs come perfusato invece della soluzione salina isotonica standard. L'ATP è una molecola piuttosto labile ed è un po' stabilizzata in una soluzione tamponata. Inoltre, la composizione della soluzione di Krebs è molto più vicina a quella dell'urina rispetto alla soluzione salina, il che aggiunge ulteriore rilevanza clinica a questi esperimenti. Questa è una considerazione importante, poiché il controllo del rilascio uroteliale di ATP ha dimostrato di essere modulato dai canali permeabili al calcio e la mancanza di calcio nella soluzione salina normale può influenzare negativamente il rilascio di ATP. L'instabilità dell'ATP in soluzione è anche il motivo per cui suggeriamo che i campioni siano immediatamente quantificati utilizzando la reazione luciferina-luciferasi. Tuttavia, se il ricercatore non è in grado di leggere immediatamente i campioni, i campioni devono essere congelati il più rapidamente possibile per limitare la degradazione dell'ATP.

Una limitazione di questa tecnica è che misura solo il rilascio di ATP luminale e non può misurare il rilascio di ATP dal lato sieroso dell'urotelio. Si ritiene che l'ATP venga rilasciato dal lato sieroso per influenzare direttamente l'eccitabilità afferente; Tuttavia, la misurazione diretta di questo rilascio è difficile. In questo caso, l'uso di cellule coltivate su supporti di membrana permeabili come le piastre di Transwell o la rimozione chirurgica dell'urotelio per gli esperimenti della camera di Ussing è la tecnica preferita. Tuttavia, data l'apparente importanza dell'ATP luminale nella patologia vescicale, questo modello sperimentale è uno strumento utile per chiarire i meccanismi cellulari che controllano il rilascio uroteliale di ATP durante la patologia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose