Summary
Bu protokol, anestezi uygulanan bir kemirgende mesanenin lümenindeki ATP konsantrasyonlarını ölçme prosedürünü açıklar.
Abstract
Mesane distansiyonuna yanıt olarak ürotelyumdan salınan ATP'nin, işitasyonun kontrolünde önemli bir duyusal rol oynadığı düşünülmektedir. Bu nedenle, ürotelyal ATP salınımının fizyolojik bir ortamda doğru ölçülmesi, idrar kesesinde pürinerjik sinyalleşmeyi kontrol eden mekanizmaların incelenmesinde önemli bir ilk adımdır. Mekanik olarak uyarılmış ürotelyal ATP salınımını incelemek için mevcut teknikler, esnek destekler üzerine kaplanmış kültürlü hücreleri veya Ussing odalarına sabitlenmiş mesane dokusunu kullanır; Bununla birlikte, bu tekniklerin her biri, sağlam mesanedeki koşulları tam olarak taklit etmez. Bu nedenle, kemirgen idrar kesesinin lümenindeki ATP konsantrasyonlarını doğrudan ölçmek için deneysel bir kurulum geliştirilmiştir.
Bu kurulumda, anestezi uygulanan kemirgenlerin mesaneleri, hem mesanenin kubbesindeki kateterlerden hem de dış üretral delikten geçirilir. Mesanedeki basınç, üretral kateterin kapatılmasıyla arttırılırken, steril sıvının kubbe yoluyla mesaneye nüfuz ettirilmesiyle arttırılır. İntravezikal basıncın ölçümü, sistometri için kullanılan kuruluma benzer şekilde, mesane kubbe kateterine bağlı bir basınç transdüseri kullanılarak gerçekleştirilir. İstenilen basınca ulaşıldıktan sonra, üretral kateter kapağı çıkarılır ve lusiferin-lusiferaz testi ile ATP nicelleştirmesi için sıvı toplanır. Bu deney düzeneği sayesinde, ürotelyal ATP salınımının hem mekanik hem de kimyasal stimülasyonunu kontrol eden mekanizmalar, perfüzyona çeşitli agonistler veya antagonistler dahil edilerek veya vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar arasındaki sonuçlar karşılaştırılarak sorgulanabilir.
Introduction
Üriner ATP'nin miksiyonkontrolünde önemli bir duyusal rol oynadığı düşünülmektedir 1. Örneğin, ATP'nin, uyarılabilirliklerini arttırmak için mesane afferent sinirleri üzerindeki reseptörler üzerinde hareket edebileceği ve dolgunluk hissine yol açabileceği distansiyona yanıt olarak ürotelyumdan salındığı düşünülmektedir2. Bu nedenle, idrar ATP'sinin mesane patolojilerinin gelişiminde önemli bir oyuncu olabileceği düşünülmektedir. Bu hipotezi desteklemek için, aşırı aktif mesane (OAB)3, mesane ağrısı sendromu/interstisyel sistit (BPS/IC)4 veya idrar yolu enfeksiyonu (İYE)5,6 şikayeti olan hastalarda, artan aciliyet, sıklık ve bazen ağrı ile karakterize tüm durumlarda, üriner ATP konsantrasyonları anlamlı olarak artmıştır. Tersine, mesanesini boşaltamamakla karakterize olan ve bazen mesane dolgunluğunu algılama yeteneğinin azalmasını içerebilen düşük aktif mesaneden (UAB) muzdarip hastaların, idrar ATP konsantrasyonlarının azaldığı gösterilmiştir7. Deneysel olarak, idrar ATP konsantrasyonlarının manipülasyonu sıçandaki mesane reflekslerini değiştirebilir; Mesane lümenindeki endojen ATPazları bloke ederek ATP konsantrasyonlarının arttırılması işeme sıklığını artırabilirken, mesaneye eksojen ATPazlar aşılayarak ATP konsantrasyonlarını azaltmak işeme sıklığını azaltır8. Bu nedenle, idrar ATP'sinin mesane fonksiyonu için önemi açıktır.
Üriner ATP'nin mesane patolojisi için belirgin önemi göz önüne alındığında, ürotelyal ATP salınımının doğru ölçülmesi, salınımı kontrol eden mekanizmaların anlaşılmasında önemli bir adımdır. Ürotelyal ATP salınımını ölçmek için farklı deneysel modeller kullanılarak birçok çalışma tamamlanmıştır. Bunların başında hücre kültürleri, birincil kültürler veya hücre hatları gelir. Bununla birlikte, kültürlenmiş ürotelyal hücrelerin kullanımı, ürotelyal hücrelerin özel geçirgen membranlarda (Transwell teknolojisi [kuyu ekleri] gibi) yetiştirilmedikçe fizyolojik polarize morfolojilerini üstlenmemeleri nedeniyle karmaşıktır9. Bu nedenle, ölçülen herhangi bir ATP salınımını fizyoloji ile ilişkilendirmek zordur. Kuyu uçlarında yetişen ürotelyal hücreler polarize olabilir ve in vivo görülene benzer bir bariyer oluşturabilir; Bununla birlikte, tamamen farklılaşmış bir ürotelyumun büyümesi günler veya haftalar sürebilir. Ek olarak, kuyu uçlarını bir Ussing odasına monte etmek ve gerilmeye neden olmak için apikal tarafa basınç uygulamak mümkün olsa da, patoloji sırasında mesanenin içindeki koşulları taklit etmek için yeterli basınç uygulamak zordur (yani, 30 cmH2O veya üzeri basınçlar). Tüm mesane dokusu, streç deneyleri için bir Ussing odasına da monte edilebilir, ancak bu, ürotelyal hücre sağlığını ve dolayısıyla ürotelyal bariyer fonksiyonunu koruyan trofik faktörlerle birlikte mesaneyi organizmadan uzaklaştırır. Bu nedenle, gerilme veya basınca yanıt olarak ürotelyumdan ATP salınımını incelemenin fizyolojik olarak en alakalı yolu in vivo'dur. Deneyi kurmak için gereken cerrahi teknikler, hayvan sistometrisinde yaygın olarak kullanılanlarla aynıdır ve bu nedenle, bu tekniğe aşina olan herkes tarafından kolayca uygulanmalıdır.
Bu protokolde, yaklaşık 200-250 g ağırlığındaki dişi Sprague Dawley sıçanlarında luminal ATP'yi incelemek için kullanılan tekniği açıklayacağız, çünkü aşağıda açıklanan transüretral kateterizasyon kadınlarda çok daha kolaydır; Bununla birlikte, transüretral kateterizasyon erkek kemirgenlerde de yapılabilir10. Transüretral kateterizasyon artık her iki cinsiyetteki farelerde de11 yapıldığından, bu deneyler araştırma ekibinin ihtiyaçlarına bağlı olarak, cinsiyetteki veya farklı boyutlardaki fareler veya sıçanlar için kolayca uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kemirgenlerde gerçekleştirilen tüm prosedürler geçerli kılavuzlara uymalı ve yerel kurumsal etik inceleme komitesi tarafından onaylanmalıdır. Bu makale için yapılan deneyler, Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Pittsburgh Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan standart kemirgen sistometri kurulumunun değiştirilmiş bir versiyonu için Şekil 1'e bakınız.
1. Laboratuvar hayvanları
- Sıçanları sosyal konutlarda (bir kafeste birden fazla kemirgen) 12 saatlik bir ışık / karanlık döngüsü ve su ve yiyecek peletlerine ad libitum erişimi ile koruyun.
2. Anestezi ve gangliyonik blok
- HayvanıO2'de (1 L / dak) % 4-5% izofluran ile gazlanmış kapalı bir kutuya yerleştirerek ilk anesteziyi indükleyin.
- Üretan kullanarak hayvanı anestezi altına alın.
- Üretanı deri altından iki taraflı olarak (hayvanın her iki tarafında 1/2 doz) 1.2 g / kg'lık bir dozda enjekte edin. Üretanın etkili olmasına izin vermek için hayvanı bir kafese yerleştirin, bu genellikle 2 saat sürer.
- Alternatif olarak, üretanı intraperitoneal olarak (i.p.) tam dozu ~ 10 dakika arayla iki ayrı dozda enjekte ederek uygulayın.
- Üretanın etkili olması için uygun zamanı bekledikten sonra (s.c.: 2 saat, yani 30 dakika), forseps kullanarak hayvanın ayağını sıkıştırarak uygun bir anestezi düzlemi için test edin. Bir refleks gözlenirse, ek bir doz üretan (0.05-0.1 mL i.p.) uygulayın, 15 dakika bekleyin ve tekrar test edin. İşlem boyunca uygun anestezi düzlemi için hayvanı izlemeye devam edin.
- Distansiyon sırasında mesanenin kasılmasını önlemek için, hayvana heksametonyum (20 mg / kg, i.p.) gibi gangliyonik bir bloke edici ajan enjekte edin.
- Deney sırasında kurumayı önlemek için hayvanın gözlerine oftalmik merhem uygulayın.
3. Cerrahi prosedür-suprapubik mesane kateterizasyonu
- Hayvanın karnını tıraş edin ve idrar kesesini ortaya çıkarmak için orta hat laparotomi yapın.
- Bir alev kullanarak PE50 intramedik tüpünün kısa (~ 10-15 cm) uzunluğunun bir ucunu alevlendirerek bir kateter hazırlayın. Borunun diğer ucuna 22 G'lik bir iğne yerleştirin ve Krebs çözeltisi ile doldurun (kompozisyon için Malzeme Tablosuna bakınız).
- Mesanenin kubbesinin üzerine 3-0 ipek sütürden küçük bir halka yerleştirin ve yukarıda yapılan kateterin alevli ucunu yerleştirecek kadar büyük küçük bir sistostomi (ince makas veya 18 G iğne kullanarak) uygulayın. Bir eliniz kateteri yerinde tutarken, kateteri yerine sabitlemek için dikişin halkasını sıkmak için diğer elinizi kullanın. Dikişe iki düğüm bağlayarak ve parlayan kafa mesane duvarıyla temas edene kadar kateteri geri çekerek kateteri sabitlemeyi bitirin.
- Alternatif olarak, daha önce sistometri 12 için tarif edildiği gibi klasik bir kese ipi sütür tekniği kullanarak kateterisabitleyin.
NOT: Bu işlem sırasında mesaneye hava kabarcıkları sokmamak zorunludur.
- Alternatif olarak, daha önce sistometri 12 için tarif edildiği gibi klasik bir kese ipi sütür tekniği kullanarak kateterisabitleyin.
- Kateterden az miktarda Krebs çözeltisi enjekte ederek sızıntı için kurulumu test edin. Sıvı sistostomiden sızarsa, kateteri sistostomi etrafında ek dikişle yeniden sabitleyin.
4. Transüretral kateterizasyon
- 20 G x 1" I.V. kateterin ucunu (iğne çıkarılmış olarak) cerrahi kayganlaştırıcıya batırın.
- Dış üretral meatusu bir çift forseps ile nazikçe tutun ve kateterin ucunu, uç bitişik vajinal açıklığın duvarının deforme olmasına neden olana kadar kuyruk yönünde üretral deliğe yerleştirin. Kateteri 90° döndürün (kateterin Luer-Lock ucunu kuyruğa doğru getirin) ve yavaşça ilerleyin. Luer-Lock göbeği eksternal üretral açıklıktan yaklaşık 5 mm distal olana kadar kateteri tamamen takın.
NOT: Kateteri çok uzağa sokmayın, bu da ucun mesanenin iç duvarını dürtmesine neden olabilir. Kateteri ilerletirken direnç hissedilirse, durun ve tekrar başlayın, aksi takdirde üretrayı delme riski vardır. Başarılı kateterizasyonu artırmak için ipuçları hakkındaki tartışma bölümüne bakın. - Kateteri sabitleyin ve dış üretral meatusun etrafına 3-0 ipek sütür uzunluğunda kısa bir süre ilmek ilmek ve sıkıca bağlayarak kateterin etrafındaki sızıntıyı önleyin. Kateteri yanlışlıkla dışarı çekilmesini önlemek için kuyruğa bantla sabitleyin.
- Kateterize edildikten sonra, Krebs çözeltisini suprapubik mesane kateteri yoluyla mesaneye nazikçe enjekte edin ve sıvının üretral kateterden dışarı aktığını ve etrafında akmadığını doğrulayın. Gerekirse, dış üretral deliğin etrafındaki dikişi emekli edin.
- Mesane üzerindeki karın kesisini 3-0 ipek dikiş kullanarak kapatın.
5. Deney düzeni
- Hayvanı, intravezikal sıvının üretral kateter yoluyla boşaltılmasına yardımcı olmak için eğimli olabilecek bir tahtaya sabitleyin. Vücut ısısını korumak ve üretral kateterden boşalan sıvıyı emmek için hayvan ve tahta arasına bir ısıtma yastığı ve emici alt ped yerleştirin.
- Suprapubik kateteri, kateteri bir şırınga pompasına ve bir basınç dönüştürücüsüne bağlayan üç yönlü bir stopcock'a bağlayın. Basınç dönüştürücüsünü bir amplifikatör ve bir veri toplama sistemi aracılığıyla bir bilgisayara bağlayın.
NOT: Şırınga pompasını, dönüştürücüyü ve mesane kateterini birbirine bağlayan boruda hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için özen gösterilmelidir. - Mesane basınç kaydını, basınç dönüştürücü ve / veya veri toplama yazılımı üreticisi tarafından önerilen prosedürü kullanarak kalibre edin.
- Krebs solüsyonunu suprapubik kateterden 0.1 mL / dak oranında infüze edin ve kateter implantasyonları sırasında salınan artık ATP'yi yıkamak için sıvının üretral kateterden 1 saat boyunca boşalmasına izin verin.
- Bu yıkama periyodundan sonra, üretral kateteri bir Luer-Lock tapası kullanarak kapatın ve mesanedeki basıncı ölçün. İntravezikal basınçta, basınçta keskin bir artış olmadan 30 cmH2O'luk bir basınca yavaş bir artış olup olmadığına bakın, bu da mesane kasılmasını gösterir (bkz. Şekil 2). Mesanenin zarar görmesini önlemek için basınç 30 cm H2O'ya ulaştığında tıkacı üretral kateterden çıkarın.
NOT: Mesane kasılmaları 1 saat sonra oluşmaya devam ederse, ek bir heksametonyum dozu (5 mg / kg doz i.p.) verin.
6. Örneklerin toplanması
- Mesaneyi 0.1 mL / dak'da infüze edin ve üretral kateterden elüatı toplayın. ATP için hemen elüatın 100 μL alikotlarını test edin (aşağıya bakınız) veya daha sonra parti miktarı için dondurun.
- Mesane distansiyonunun luminal ATP konsantrasyonları üzerindeki etkisini test etmek için, üretral kateteri tıkaç ile kapatın ve istenen seviyeye ulaşana kadar mesane basıncını izleyin. Daha sonra, üretral kateterin kapağını açın ve yukarıda açıklandığı gibi ATP ölçümü veya donma için elatı toplayın.
- Her distansiyondan sonra, ek numuneler almadan önce mesanenin dinlenmesine ve 10-15 dakika yıkanmasına izin verin. Tekrarlanabilirliği göstermek için istenen her distansiyon basıncında toplam 3-5 predistansiyon numunesi ve 3-5 numune alın.
- İlaçların ATP salınımı üzerindeki etkisini test etmek için, mesaneyi infüze eden Krebs çözeltisini, seçilen ilacı içeren Krebs'e geçirin. İlacın bir etkiye sahip olması için 10-15 dakika boyunca 0.1 mL / dak'da perfüze edin ve daha sonra 6.1 ve 6.2. adımlarda açıklandığı gibi şişkin olmayan ve şişmiş mesanelerden örnekler toplayın.
7. Toplanan örneklerden ATP'nin ölçülmesi
- Toplanan 100 μL numunelerdeki ATP'yi, üreticinin talimatlarını ve bir luminometreyi izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir lusiferin / lusiferaz tahlil kiti kullanarak sayısallaştırın.
- ATP'yi ölçmek için, 100 μL perfüzyonat numunesini 50 μL tahlil karışımı ile birleştirin ve okumak için luminometreye yerleştirin. Luminometre tarafından bildirilen Bağıl Işık Birimlerini (RLU'lar) bir ATP konsantrasyonuna dönüştürmek için, standart bir eğri oluşturmak ve bunları luminometrede okumak için Krebs çözeltisinde 1 μM ila 10 pM arasında değişen seri ATP seyreltmeleri yapın. Elde edilen okumaları bir grafik üzerinde çizin ve hayvandan alınan örneklerden konsantrasyonları tahmin etmek için doğrusal olmayan (ikinci dereceden) bir regresyon gerçekleştirin.
NOT: Deneyde test edilen herhangi bir ilaç çözeltisi için ATP standartları oluşturmak önemlidir, çünkü birçok ilaç düzeltilmesi gereken lusiferin / lusiferaz reaksiyonuna müdahale eder.
- ATP'yi ölçmek için, 100 μL perfüzyonat numunesini 50 μL tahlil karışımı ile birleştirin ve okumak için luminometreye yerleştirin. Luminometre tarafından bildirilen Bağıl Işık Birimlerini (RLU'lar) bir ATP konsantrasyonuna dönüştürmek için, standart bir eğri oluşturmak ve bunları luminometrede okumak için Krebs çözeltisinde 1 μM ila 10 pM arasında değişen seri ATP seyreltmeleri yapın. Elde edilen okumaları bir grafik üzerinde çizin ve hayvandan alınan örneklerden konsantrasyonları tahmin etmek için doğrusal olmayan (ikinci dereceden) bir regresyon gerçekleştirin.
8. Hayvanların ötenazisi
- Deney tamamlandığında ve tüm örnekler toplandığında, hayvanı USDA kılavuzlarına ve Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna göre insani olarak ötenazi yapın.
- Anestezi uygulanan hayvanı deney düzeneğinden çıkarın, kapalı bir kutuya koyun ve% 100 CO2 ile gazlayın. Doldurma hızının dakikada hazne hacminin %30-%70'ine eşit olduğundan emin olun (örneğin, 10 L hacimli bir kutu için 3-7 L/dak). Solunum durduktan sonra CO2 akışına en az 1 dakika devam edin.
- Ölümü sağlamak için ikincil bir ötenazi formu kullanın.
- Sternumun kaudal ucundaki küçük deri flebini kavrayarak ve diyaframdaki cilt ve kas yapısında küçük bir deliği keskin bir makasla keserek ikincil bir ötenazi formu olarak torakotomi yapın. Makası açıklığa sokarak ve göğüs kafesinden rostral olarak keserek ve göğüs boşluğunu açığa çıkararak torakotomiyi tamamlayın.
NOT: Ötanize edilen hayvan, kurumsal yönergelere göre bertaraf edilmelidir.
- Sternumun kaudal ucundaki küçük deri flebini kavrayarak ve diyaframdaki cilt ve kas yapısında küçük bir deliği keskin bir makasla keserek ikincil bir ötenazi formu olarak torakotomi yapın. Makası açıklığa sokarak ve göğüs kafesinden rostral olarak keserek ve göğüs boşluğunu açığa çıkararak torakotomiyi tamamlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tarif edilen protokol, standart kemirgen sistometri kurulumunun modifiye edilmiş bir versiyonunu kullanarak, mesanenin lümeninden ürotelyal ATP salınımının in vivo olarak doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar (bkz. Şekil 1). Bu, araştırmacının ilaçların fizyolojik bir ortamda streç aracılı ATP salınımı üzerindeki etkilerini incelemesini sağlar.
Şekil 1: Deney düzeneği . (A) Çeşitli ekipmanlar etiketlenmiş olarak deney düzeneğini gösteren resim. Kırmızı bir dikdörtgenle özetlenen hayvanın alanı B'de gösterilmiştir . (B) Ameliyattan sonra sıçanın karnını gösteren fotoğraf. Mesane kubbesine yerleştirilen ve bağlanan suprapubik kateterin yanı sıra dış delikten sokulan üretral kateterin de dikkat edin. Üretral kateter, mesane kateteri yoluyla perfüzyon sırasında mesane basıncının arttığını göstermek için fotoğrafa takılmıştır. Deney sırasında, karın açıklığı kapatılacak, ancak idrar kesesinin görselleştirilmesine izin vermek için burada açık bırakılacaktı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kemirgen mesanesinde gerilme aracılı ATP salınımının başarılı bir şekilde ölçülmesi için birincil önem, miktüritasyon refleksinin bloke edilmesini sağlamak ve mesanenin normalde miksiyon refleksini aktive etmek için yeterli olan eşik basıncının ötesine taşınmasına izin vermektir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, üretral kateter tıkandığında, çözeltinin mesaneye infüzyonu, mesane kasıldıkça intravezikal basıncın keskin bir şekilde yükselmesine neden olur. Kasılmanın değil, pasif gerilmenin ürotelyal ATP salınımı üzerindeki etkileriyle ilgilendiğimizden, hayvan miktüritasyon refleksini önlemek için gangliyonik bir bloker, heksametonyum ile muamele edilir. Şekil 2B'de kanıtlandığı gibi, heksametonyum uygulandığında, çözeltinin üretral kateter bloke edilmiş olarak mesaneye damlatılması, intravezikal basınçta çok daha kademeli bir artışa neden olur ve basınçların kasılma olmadan 30 cmH2O'ya kadar yükselmesine izin verir. Bu, luminal ATP salınımının, düşük aktif bir mesanede, kısmi mesane çıkış tıkanıklığında veya omurilik yaralanmasından sonra detrusor-sfinkter dissinerjisinde gözlenenler gibi patoloji ile ilgili olacak kadar yüksek basınçlarda ölçülmesine izin verir. İşitme refleksini tamamen bloke etmek için ek bir heksametonyum dozu gerektirse de, aşırı dozla sonuçlanacak kadar uygulanmamasına dikkat edilmelidir. Bu, kalp debisinin önemli ölçüde azalmasına ve deneyin kalitesini tehlikeye atmasına neden olabilir. Mesane refleksi üzerindeki aynı inhibitör etkinin, pelvik sinirlerin iki taraflı olarak kesilmesi veya omuriliğin L4 veya daha yüksek seviyede kesilmesiyle elde edilebileceği belirtilmelidir. Bu, elbette, deney düzeneğinin zorluğunu ve deneyi tamamlamak için gereken süreyi önemli ölçüde artırır.
Şekil 2: Sıçanlardan alınan basınç kayıtları. (A) öncesi ve sonrası (B) gangliyonik blok. Oklar, üretral kateterin ne zaman tıkandığını gösterir. Üst izdeki basıncın, basınç miksiyonu indüklemek için eşiğe ulaştığında hızla arttığını, alt izdeki basıncın ise kademeli olarak yükseldiğini unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu deneyler için bir diğer çok önemli husus, luminometre okumalarının (normalde RLU'larla ifade edilir) standart eğrileri kullanarak bir ATP konsantrasyonuna uygun şekilde dönüştürülmesini sağlamaktır. Lusiferin/lusiferaz reaksiyonu müdahale eden ajanlara karşı çok hassastır13. Bu girişim, lusiferin / lusiferaz ile doğrudan bir etkileşimden kaynaklanabilir. Örneğin, bir dizi bileşik, lusiferazın rekabetçi veya rekabetçi olmayan inhibitörleri olarak işlev görebilir; Bir çalışma, Moleküler Kütüphaneler Küçük Molekül Deposundaki bileşiklerin ~% 3'ünün, 11 μM14'ün altındaki konsantrasyonlarda ateşböceği lusiferazını inhibe edebileceğini öne sürdü. Dahası, lusiferin oksitleyici ajanlara karşı hassastır ve lüminesans üreten reaksiyon15 için mevcut substrat miktarını azaltır. Reaksiyonun ko-faktörü magnezyumun mevcudiyetini değiştirerek lusiferin / lusiferaz reaksiyonuna müdahale etmek de mümkündür. Örneğin, in vitro ATP deneylerinde mekanik gerilmeyi taklit etmek için yaygın bir teknik, perfüzyon çözeltisinin ozmolaritesini azaltarak hücre şişmesini indüklemektir. Bununla birlikte, birçok araştırmacı bu azalmayı, çözeltiyi suyla seyrelterek, lusiferin / lusiferaz reaksiyonunda bir ko-faktör olarak hareket etmek için mevcut magnezyum konsantrasyonunu azaltarak gerçekleştirir. Ek olarak, bazı ilaçlar magnezyum tuzları olarak satılmaktadır, bu da çözeltideki magnezyum miktarını büyük ölçüde artırabilir ve ayrıca lüminesans okumalarında ölçülebilir farklılıklara yol açabilir. Son olarak, bir ilaç çözeltisinin lusiferin / lusiferaz reaksiyonu tarafından üretilen ışığı doğru bir şekilde ölçme yeteneğine müdahale etmesi mümkündür. Parlak Mavi FCF (bb-fcf, erioglausin veya FD & C Mavi boya # 1 olarak da bilinir), pannexin aracılı ATP salınımı16'nın spesifik bir inhibitörüdür. Etkili dozlarda, Brilliant Blue FCF çözeltisi, yaklaşık 600 nm17'lik bir zirvede ışığı emen farklı bir mavi renk tonuna sahiptir. Bu, ateşböceği lusiferaz tarafından yayılan ışığın dalga boyları aralığındadır; bu nedenle, BB-FCF ile yapılan deneylerde ışık emisyonu büyük ölçüde azaltılmıştır. Bu nedenle, deney sırasında ATP salınımını ölçmek için her deneysel ilacı içeren çözeltilerde çözünmüş bilinen miktarlarda ATP kullanan standart eğrilerin kullanılması zorunludur. Şekil 3'te gösterildiği gibi, BB-FCF (100 μM), standart eğrinin eğimini önemli ölçüde azaltır, bu da numunedeki ATP konsantrasyonu için hesaplanan değerleri önemli ölçüde değiştirmek için yeterlidir. Şekil 3'ün altında gösterildiği gibi, BB-FCF içeren bir numunedeki ATP konsantrasyonunu hesaplamak için Krebs standardını kullanmak, ATP konsantrasyonunun ~% 50 oranında hafife alınmasına neden olabilir. Bazı durumlarda, yanlış standart eğrinin kullanılması, ATP salınımındaki ilaç aracılı bir değişikliği gizleyebilir veya yanlışlıkla bir değişiklik meydana gelmiş gibi görünmesini sağlayabilir. Örneğin, Şekil 3'te gösterilen deneyde, tüm örnekler için Krebs standardını kullanmak, Brilliant Blue FCF'nin ATP salınımını ~% 67 (16.6 ila 5.5 nM) azalttığını, gerçekte ise sadece% 42 (16.6 ila 9.6 nM) azaldığını ortaya koymuştur.
Şekil 3: Deneysel ilaçların ATP standart eğrisi üzerine etkileri. Pannexin kanal antagonisti Brilliant Blue'nun, herhangi bir ATP konsantrasyonu için ölçülen RLU'ları önemli ölçüde değiştirdiğini ve bunun düzeltilmediği takdirde ölçülen ATP'nin hafife alınmasına neden olacağını unutmayın. Kısaltma: RLUs = Göreceli Işık Birimleri; BB-FCF = Parlak Mavi FCF. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Akılda tutulması gereken bir diğer husus, ATP'nin genellikle hasarın bir sonucu olarak dokulardan salındığı ve bu cerrahi prosedürlerin ve üretral kateter yerleştirmesinin, kurulumdan çok kısa bir süre sonra alındığında anormal derecede yüksek ATP okumalarına neden olacağıdır. Bu prosedür, deney kurulduktan sonra atlanmaması gereken 1 saatlik bir yıkama süresini tanımlar. 1 saat sonra, mesane şişirilmediğinde alınan örneklerde ölçülen ATP konsantrasyonlarının nispeten düşük (~ 10-30 nM) olduğunu, yıkama süresinden önce alınan örneklerin ise daha yüksek bir büyüklük sırasını okuyabildiğini bulduk. ATP seviyeleri kısa bir süre için yüksek kalabileceğinden, distansiyonlar arasında kısa, 5 dakikalık yıkamalar da yapılmalıdır. İyi bir kural, deneyin başlangıcında ve her bir distansiyondan sonra birden fazla örnekte ATP'yi ölçmek ve yalnızca ATP okumaları düzleştiğinde devam etmek olacaktır. Şekil 4'te, çeşitli zaman noktalarında alınan ölçümlerle tipik bir deneyin temsilini gösteriyoruz. Yıkama öncesi alınan yüksek okumalara (numune #1 ve #5) ve sonrasında alınan yüksek okumalara (numune #2 ve #6) dikkat edin.
Şekil 4: Tipik bir deneyin gösterimi. Tipik bir basınç kaydının stilize edilmiş bir temsili. Her sayı, ATP için bir numunenin alındığı ve ölçüldüğü bir zaman noktasını temsil eder: 1) kurulum tamamlandıktan hemen sonra, yıkama periyodundan önce, 2) 1 saatlik bir yıkama periyodundan sonra, 3) bir distansiyondan hemen önce, 4) distansiyon sırasında, 5) bir distansiyonun hemen ardından ve 6) distansiyonu takip eden kısa bir yıkama periyodundan sonra. Dahili tablo, her numune için temsili RLU değerlerini ve ATP konsantrasyonlarını gösterir. Kısaltma: RLUs = Göreceli Işık Birimleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5 , ürotelyumdan ATP salınım mekanizmasını inceleyen deneysel sonuçların temsili grafiklerini göstermektedir. Şekil 5A'da gösterildiği gibi, artan basınç, mesanenin lümenindeki ATP konsantrasyonunda önemli bir artışa neden olur, 30 cm'lik su basıncı, şişirilmemiş kontrollerin neredeyse 2.5 katı konsantrasyonları arttırır. ATP'nin hidrolizini katalize eden bir enzim olan 2 U / mL apirazın intravezikal perfüzyonu, mesane lümeninde ölçülen ATP konsantrasyonunu önemli ölçüde azaltır. Tersine, ürotelyumda bulunan NTPDazların bir inhibitörü olan ARL67156'nın intravezikal perfüzyonu, luminal ATP konsantrasyonlarını önemli ölçüde arttırır. Şekil 5B , ürotelyumdan gerilmeye bağlı ATP salınım mekanizmasına yapılan deneyleri göstermektedir. Panneksin kanal antagonistleri Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) veya karbenoksolon (CBX, 100 μM) ile perfüzyon, ATP'nin tüm basınçlarda mesane lümenine salınımını önemli ölçüde azaltır. Konneksin blokeri 18α-glisiretinik asit perfüze edildiğinde Luminal ATP konsantrasyonları azalmaz, bu da distansiyonla uyarılan ATP salınımının konneksin kanalları tarafından değil, panneksin kanalları tarafından aracılık edildiğini gösterir.
Şekil 5: İdrar kesesinin lümeninde distansiyonla uyarılmış ATP salınımının temsili ölçümleri. (A) Mesanenin distansiyonu, NTPDaz apiraz (2 U / mL) varlığında azaltılabilen veya endojen NTPDazare ARL67156 (10 μM) ile inhibe edildiğinde artabilen luminal ATP konsantrasyonlarını arttırır. (B) Distansiyonla uyarılan ATP salınımı panneksin kanal antagonistleri Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) ve karbenoksolon (CBX, 100 μM) tarafından bloke edilir, ancak konneksin kanal antagonisti 18α-glisiretinik asit (18α-GA, 50 μM) tarafından bloke edilmez. Veriler standart hata çubukları ile ortalama olarak sunulur. ** p < çizgiyle gösterilen iki çubuk arasında 0,05, ## p < 0,05 aynı distansiyondaki Krebs kontrollerine kıyasla. Bu şekil Beckel ve ark.8'in izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ürotelyal ATP salınımı ile ilgili araştırmaların çoğu, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları veya kemirgen ürotelyal hücrelerinin birincil kültürleri kullanılarak kültürlenmiş hücrelerde gerçekleştirilir. Bu modeller nispeten yüksek verim avantajına sahip olsa da (yani, bir kültür / pasaj birçok tabak / hücre tabağı yapabilir), fizyolojik alaka düzeyleri şunlardan dolayı azalır: 1) ürotelyal hücrelerin özel destekler üzerinde yetiştirilmedikçe polarize büyüyememesi ve 2) kültürlenmiş hücreleri fizyolojik gerilme / basınç seviyelerine maruz bırakmadaki zorluk. Bu sınırlamalarla başa çıkmanın bir yolu, mesaneyi bir kemirgenden çıkarmak, kesmek ve bir Ussing odasına yerleştirmek, mesane dokusunu fizyolojik çözelti ile dolu iki yarım oda arasına yerleştirmektir. Bu, araştırmacının ürotelyumu, doğal polarize durumunda, odanın ürotelyal tarafına hacim ekleyerek distansiyona maruz bırakmasına ve odadaki mesane dokusunun gerilmesine neden olmasına izin verir. Bununla birlikte, bu gerilmeyi ürotelyumun in vivo olarak gördüğü distansiyonla ilişkilendirmek zordur. Dahası, Ussing odasındaki distansiyon ile uyarılan ATP, odada bulunan büyük hacimli fizyolojik sıvıya salınır ve ATP konsantrasyonunu birkaç kat seyreltir. Bu prosedür kullanılarak, mesane basıncı doğrudan ölçülür, böylece distansiyon fizyoloji veya patofizyoloji ile ilgili bir aralıkta tutulabilir. Ayrıca, ATP konsantrasyonunu in vitro dokuyu korumak için kullanılan keyfi ve aşırı miktarda sıvıdan değil, doğrudan luminal sıvıdan ölçtüğümüz için, ölçülen konsantrasyonun düzeltilmesi gerekmez. Bu nedenle, bu makalede açıklanan prosedür, araştırmacının mesanenin fizyolojik veya patofizyolojik koşullarına çok daha yakından benzeyen koşullar altında mesane lümenindeki ATP salınımını incelemesine izin verir.
Tarif edilen teknik, ilaçların refleks mesane aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılan standart sistometri tekniklerine çok benzer ve bu deneyleri rutin olarak yapan herkes tarafından kolayca gerçekleştirilmelidir. Bununla birlikte, mesane kateterizasyonunda yeni olan araştırmacılar için, farkında olunması gereken birkaç uyarı vardır. İlk olarak, kemirgen üretrasının eğriliği nedeniyle deneyimsizler için transüretral kateterizasyon zor olabilir. Bu aynı zamanda üretan anestezi altında bile eksternal üretral sfinkterin sıkılığı ile daha da zorlaştırılabilir. Araştırmacının kateteri üretraya zorlamaya çalışmaması zorunludur, çünkü büyük olasılıkla inflamasyonun ve şişliğin artmasına neden olur, bu da üretranın başarılı bir şekilde kateterize edilmesini daha da zorlaştırır. Ek olarak, kateteri üretranın duvarından geçirerek tüm deneyi mahvetmek mümkündür.
Başarı oranını artırmak için bazı ipuçları ve püf noktaları geliştirdik. Örneğin, bazen üretral sfinkteri gevşetmek için hayvana kısa dozda inhale izofluran (% 0.5 -% 1.0) vermek gerekir. Bu, az miktarda ve dikkatle yapılmalıdır, çünkü üretan ve izofluran kombinasyonu solunum depresyonuna neden olabilir. Başka bir numara, kateterin ucunu dış üretral deliğe sokmadan önce% 2'lik bir lidokain çözeltisine batırmaktır; bu genellikle sfinkterin birkaç dakika sonra rahatlamasına neden olur. Mesanenin hayvanın karnına hafifçe bastırılarak boşaltılması da üretral sfinkterin rahatlamasına yardımcı olabilir. Son olarak, daha küçük bir ölçer kateter kullanmak gerekebilir; bazen 24 G'lık bir kateter kullanıyoruz, özellikle de daha küçük hayvanlarda. Bununla birlikte, üretral kateterden daha yavaş drenajı eşleştirmek için daha küçük bir transüretral kateter kullanırken mesaneye infüzyon hızını azaltmanın gerekli olabileceğini unutmayın. Bunun yapılmaması, üretral kateterin kapatılmamasına rağmen mesane basıncının yükselmesine neden olur.
Bu protokolde üretanın anestezik olarak kullanıldığı unutulmamalıdır. Üretan, alt üriner sistemi inceleyen laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılır, çünkü diğer anestezikler bunu yapmazken, miksiyon refleksini korur. Bu nedenle, mesanenin üretan anestezisi altında ~ 7-10 cm H2O basıncın üzerinde distansiyonu bir miksiyon refleksini tetikleyecektir. Pasif distansiyona yanıt olarak ATP salınımı ile ilgilendiğimizden, bu protokol gangliyonik bloker heksametonyum kullanarak mesane kasılmalarını bloke etmeyi gerektirir. Bu, çıkış tıkanıklığını içeren mesane patolojisinde yaygın olarak görülen daha yüksek intravezikal basınçlara (yani 30 cm H2O) yanıt olarak ATP salınımının ölçülmesini sağlar. Bu nedenle, bir üretan / heksametonyum kullanımı, distansiyonla uyarılmış luminal ATP salınımının uzun süre ölçülmesine izin verir (her iki ilacın etki süresi saatlerce ölçülür). Bununla birlikte, bazı laboratuvarlar ketamin gibi miktüritasyon refleksini korumayan ve gangliyonik bir bloker ihtiyacını ortadan kaldıran bir anestezi kullanmayı tercih edebilir. Bu aynı zamanda bu prosedür için de iyi çalışacaktır, ancak anestezinin daha kısa etki süresi nedeniyle daha sık (veya sürekli) uygulama gerektirecektir.
ATP'yi ölçmek için bu teknik ile üroloji araştırmacılarının aşina olabileceği ortak sistometri kurulumu arasındaki dikkate değer bir fark, standart izotonik salin çözeltisi yerine tamponlu Krebs çözeltisinin bir perfüzyonat olarak kullanılmasıdır. ATP oldukça kararsız bir moleküldür ve tamponlu bir çözelti içinde bir miktar stabilize edilir. Ek olarak, Krebs çözeltisinin bileşimi, idrara salinden çok daha yakındır ve bu da bu deneylere klinik alaka düzeyini daha da ekler. Ürotelyal ATP salınımının kontrolünün kalsiyum geçirgen kanallar tarafından modüle edildiği gösterilmiştir ve normal salinde kalsiyum eksikliği ATP salınımını olumsuz yönde etkileyebilir. ATP'nin çözeltideki instabilitesi aynı zamanda numunelerin lusiferin-lusiferaz reaksiyonu kullanılarak derhal ölçülmesini önermemizin nedenidir. Bununla birlikte, araştırmacı örnekleri hemen okuyamıyorsa, ATP'nin bozulmasını sınırlamak için örnekler mümkün olduğunca çabuk dondurulmalıdır.
Bu tekniğin bir sınırlaması, sadece luminal ATP salınımını ölçmesi ve ürotelyumun serozal tarafından ATP salınımını ölçememesidir. ATP'nin afferent uyarılabilirliği doğrudan etkilemek için serozal taraftan salındığına inanılmaktadır; ancak, bu salınımın doğrudan ölçülmesi zordur. Bu durumda, Transwell plakaları gibi geçirgen membran destekleri üzerinde yetiştirilen hücrelerin kullanılması veya Ussing oda deneyleri için ürotelyumun cerrahi olarak çıkarılması tercih edilen tekniktir. Bununla birlikte, mesane patolojisinde luminal ATP'nin belirgin önemi göz önüne alındığında, bu deneysel model, patoloji sırasında ürotelyal ATP salınımını kontrol eden hücresel mekanizmaları aydınlatmak için yararlı bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü'nden (NIDDK) JMB'ye (DK117884) verilen bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
References
- Burnstock, G. Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease. Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).
- Birder, L. A.
- Silva-Ramos, M., et al. Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome. PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).
- Sun, Y., Chai, T. C. Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).
- Gill, K., et al. Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms. BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).
- Säve, S., Persson, K. Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract. Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).
- Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release. Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).
- Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).
- Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. Transurethral instillation procedure in adult male mouse. Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).
- Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).
- Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C.
- Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays. ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).
- Harvey, E. N. Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence. Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).
- Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection. Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).
