Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg en stromale nichecellen

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64248
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

Summary

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de isolatie en kleuring van muriene beenmergcellen tot fenotype hemopoietische stam- en voorlopercellen, samen met de ondersteunende niche endotheel- en mesenchymale stamcellen. Een methode om cellen in endosteale en centrale beenmerggebieden te verrijken, is ook inbegrepen.

Abstract

Het beenmerg (BM) is het zachte weefsel in botten waar voornamelijk hematopoiese, het proces waarbij nieuwe bloedcellen worden gegenereerd, optreedt. Als zodanig bevat het hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's), evenals ondersteunende stromale cellen die bijdragen aan het onderhoud en de regulatie van HSPC's. Hematologische en andere BM-aandoeningen verstoren de hematopoëse door hematopoietische cellen rechtstreeks en / of door de verandering van de BM-niche te beïnvloeden. Hier beschrijven we een methode om hematopoiese in gezondheid en maligniteit te bestuderen door middel van de fenotypische analyse van murine BM HSPCs en stromale nichepopulaties door flowcytometrie. Onze methode beschrijft de vereiste stappen om BM-cellen te verrijken in endosteale en centrale BM-fracties, evenals de juiste gatingstrategieën om de twee belangrijkste nicheceltypen te identificeren die betrokken zijn bij HSPC-regulatie, endotheelcellen en mesenchymale stamcellen. De fenotypische analyse die hier wordt voorgesteld, kan worden gecombineerd met muismutanten, ziektemodellen en functionele testen om het HSPC-compartiment en zijn niche te karakteriseren.

Introduction

Flowcytometrie is een methode van onschatbare waarde om immuun- en hematopoëtische cellen te karakteriseren en prospectief te isoleren. Het wordt ook steeds vaker gebruikt om stromale en epitheliale populaties van verschillende weefsels te analyseren. De hematopoëtische stamcel (HSC) heeft unieke eigenschappen van zelfvernieuwing en multipotentie. Bij volwassen zoogdieren bevinden HSC's zich voornamelijk in het beenmerg (BM), waar ze rust- en overlevingssignalen ontvangen van de omringende micro-omgeving of niche1. HSC's worden formeel gedefinieerd volgens functionele assays2. Niettemin hebben verschillende baanbrekende artikelen het nut van flowcytometrie aangetoond om HSC's te identificeren. Door het gebruik van markers met een beperkt celoppervlak is het mogelijk om hematopoëtische populaties te onderscheiden die sterk verrijkt zijn in HSC's3. Flowcytometrie is daarom een centrale methode in het stamcelveld. Het is uitgebreid gebruikt om de impact van vermeende nicheceltypen en nichefactoren op HSC's te evalueren. Door flowcytometrie te combineren met beeldvorming en functionele assays, is aangetoond dat HSC's kritisch worden ondersteund door perivasculaire mesenchymale stamcellen (MSC's) en endotheelcellen (EC's). BM MSC's zijn een heterogene groep en hebben verschillende cytokinebijdragen4, maar het is algemeen bekend dat leptinereceptor (LepR)+ MSC's belangrijke nichecellen zijn1. BM EC's zijn ook zeer heterogeen en kunnen deel uitmaken van sinusoïden, arteriolen en type H / overgangsvaten5. Verschillende studies hebben de genuanceerde bijdrage van deze verschillende EC's aangetoond. Endosteale sinusoïdale EC's liggen bijvoorbeeld ruimtelijk dichter bij rustige HSC's6, terwijl niet-migrerende HSC's met lagere niveaus van reactieve zuurstofsoorten zich in de buurt van arteriolar ECs7 bevinden. De endosteal versus centrale locatie van niches is ook erg belangrijk. Endosteale type H-vaten worden geassocieerd met perivasculaire stromale cellen die verloren gaan met veroudering, wat leidt tot het verlies van HSC's8. Bij acute myeloïde leukemie worden centrale EC's uitgebreid, terwijl endosteale vaten en endosteale HSC's verloren gaan9.

De meeste studies in het veld hebben zich gericht op hematopoëse zelf en op de extrinsieke regulatie van HSC's door de cel. Het is echter steeds meer erkend dat er behoefte is aan een betere karakterisering van de niches die andere voorlopers reguleren, namelijk multipotente voorlopers (MPP's), vooral gezien het feit dat zij de belangrijkste aanjagers zijn van hematopoiese in steady state10. In tegenstelling tot een vaste hiërarchische structuur, hebben recente studies aangetoond dat hematopoiese een continuüm is waarin HSC's in een vroeg stadium differentiëren in bevooroordeelde MPP's11. MPP's zijn vernoemd naar verschillende classificatieschema's12, maar een recent consensusdocument van de International Society for Experimental Hematology (ISEH) stelde voor dat MPP's worden gediscrimineerd als vroege MPP's en volgens hun lymfoïde (MPP-Ly), megakaryocytische en erytroïde (MPP-Mk / E) en myeloïde (MPP-G / M) bias13. Het gebruik van flowcytometrie zal van cruciaal belang zijn bij het verder bestuderen van het belang van BM-niches in de regulatie van deze populaties. Huidige flowcytometriemethoden gebruiken variabele gatingstrategieën om HSPC's te onderscheiden en stromale cellen, namelijk EC's, te identificeren met behulp van inconsistente markers. Het doel van de huidige methode is om een eenvoudige en reproduceerbare workflow van BM-kleuring te presenteren om HSPC-subpopulaties, heterogene groepen EC's en LepR + MSC's te identificeren. Wij geloven dat deze techniek, hoewel vergelijkbaar met eerder gerapporteerde methoden (zie bijvoorbeeld referentie 14), een bijgewerkt en eenvoudig te implementeren protocol biedt voor de fenotypische analyse van hematopoietische cellen in de twee functionele merggebieden, endosteal en centraal BM 8,15, evenals BM stromale nichecellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De dieren die in dit protocol werden gebruikt, werden gehuisvest in de i3S-dierenfaciliteit onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden in een licht-donkercyclus van 12 uur en een temperatuurgecontroleerde omgeving. Gratis toegang tot standaard knaagdier chow en water werd verstrekt. Alle dieren kregen humane zorg volgens de criteria van de Federation of European Laboratory Animal Science Associations voor de verzorging en behandeling van proefdieren (EU-richtlijn 2010/63/EU). De experimentele procedure uitgevoerd op de dieren (euthanasie) werd goedgekeurd door de i3S Animal Ethics Committee (ref. DD_2019_15) en de Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Details van de materialen die in dit protocol worden gebruikt, zijn te vinden in de Materiaaltabel.

1. Bereiding van oplossingen en kleuringscocktails

  1. Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS): Los vijf PBS-tabletten op in 1 l gedestilleerd water. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).
  2. PBS 2% foetaal runderserum (FBS): Voeg 10 ml FBS toe aan 500 ml PBS. Bewaren bij 4 °C.
  3. Rode bloedcel (RBC) lysisbuffer (1x): Voeg 50 ml 10x RBC lysisbuffer toe aan 450 ml gedeïoniseerd water. Bewaren bij 4 °C.
  4. Collagenase IV en dispase II-oplossing: Los 30 mg collagenase IV en 60 mg dispase II op in 30 ml HBSS voor een collagenase IV-oplossing van 1 mg/ml en 2 mg/ml dispase II. Vers bereiden voor gebruik.
  5. Fc receptoren blokkerende oplossing: Voeg 10 μL gezuiverd anti-muis CD16/32 antilichaam toe aan 490 μL PBS 2% FBS. Bereid vers of op de vorige dag. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
  6. Fluorescerende cel levensvatbaarheid kleurstof kleuringsoplossing: Voeg 2 μL fluorescerende cel levensvatbaarheid kleurstof toe aan 1 ml PBS. Vers bereiden voor gebruik.
  7. Biotine afstammingscocktail: Meng 100 μL van elk van de volgende antilichamen: biotine anti-muis CD3ε, biotine anti-muis CD4, biotine anti-muis CD8a, biotine anti-muis/humaan CD11b, biotine anti-muis/humaan CD45R/B220, biotine anti-muis Ly-6G/Ly-6C (Gr-1), en biotine anti-muis TER-119/erytroïde cellen. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
  8. HSC's primaire kleuringscocktail: Voeg 10 μL biotinelijncocktail, 10 μL immunofluorescent gelabeld 510 antimuis CD150 (SLAM), 10 μL fycoerythrin (PE) antimuis Flk2 (CD135), 10 μL peridinine-chlorofyl-eiwit (PerCP) anti-muis Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL PE/Cyanine7 antimuis CD48 en 10 μL allophycocyanine (APC)/Cyanine7 antimuis CD117 (c-kit) toe aan 940 μL PBS 2% FBS. Bereid vers of op de vorige dag. Bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht tot gebruik.
  9. Stromale primaire kleuringscocktail: Voeg 5 μl muis leptine R gebiotinyleerd antilichaam, 6,7 μl PE antimuis endomucine antilichaam, 10 μl PerCP anti-muis Ly-6A/E (Sca-1), 4 μL PE/Cyanine7 antimuis CD31, 10 μL APC/Cyanine7 anti-muis CD45 en 10 μL APC/Cyanine7 anti-muis TER-119/erytroïde cellen toe aan 954 μL PBS 2% FBS. Bereid vers of op de vorige dag. Bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht tot gebruik.
  10. HSC's/stromale secundaire kleuringsoplossing: Voeg 1 μL APC streptavidin toe aan 1 ml PBS 2% FBS. Bereid vers of op de vorige dag. Bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht tot gebruik.
  11. ECs-kleuringscocktail: Voeg 10 μL PE antimuis-endomucine-antilichaam, 10 μL PerCP-antimuis Ly-6A / E (Sca-1), 10 μL PE / Cyanine7 antimuis CD31, 10 μL Alexa Fluor 647 antimuis CD54 / ICAM-1, 10 μL APC / Cyanine7 antimuis CD45 en 10 μL APC / Cyanine7 anti-muis TER-119 / erytroïde cellen toe aan 940 μL PBS 2% FBS. Bereid vers of op de vorige dag. Bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht tot gebruik.
  12. DAPI-kleuringsoplossing: Voeg 1 druppel DAPI-reagens toe aan 500 μL PBS. Vers bereiden voor gebruik.

2. Monsterextractie

  1. Euthanaseer het dier door cervicale dislocatie (details van de dieren die zijn gebruikt om de in dit onderzoek gepresenteerde gegevens te produceren, zijn te vinden in aanvullende tabel 1). Leg het dier met de buik omhoog op een petrischaaltje en spuit met 70% ethanol. Maak een snee boven de buik met een schaar en trek de huid helemaal weg tot aan de enkels.
  2. Pak een poot en knip met een schaar aan de onderkant (waar het gewricht tussen het been en de heup is) om het van het dier te scheiden. Deze stap zal ook dienen als secundaire bevestigingsmethode van euthanasie. Verwijder de voet van het been door bij de enkel te snijden. Plaats het been in ijskoude PBS 2% FBS. Herhaal indien nodig de stap met het andere been.
  3. Pak het heupbeen vast en knip er met een schaar achter om het van het dier te scheiden. Plaats het heupbeen in ijskoude PBS 2% FBS. Herhaal indien nodig de stap met het andere heupbeen.
  4. Plaats de poot(en) en heupbot(en) in een petrischaaltje en reinig met een steriel scalpel de botten. Scheid het scheenbeen en het dijbeen door met het scalpel bij de knie te snijden. Leg de schone botten in ijskoud PBS 2% FBS.

3. Monsterverwerking voor analyse van hematopoëtische celpopulaties in totaal beenmerg

  1. Plaats een dijbeen of scheenbeen in een vijzel met ijskoude PBS 2% FBS en plet het bot door het zachtjes tegen de wand van de mortel te drukken met behulp van de stamper. BM-cellen worden vrijgegeven in de oplossing in de mortel.
  2. Pipetteer de resulterende celsuspensie op en neer met behulp van een pipet van 10 ml om te homogeniseren en over te brengen in een buis van 50 ml via een celzeef van 40 μm die bovenop de buis is geplaatst.
  3. Als de verbrijzelde botten er op dit punt niet wit uitzien, voeg dan meer PBS 2% FBS toe aan de mortel en herhaal het verpletteren, en pipetteer vervolgens op en neer en breng de oplossing over in dezelfde buis van 50 ml door dezelfde 40 μm celzeef.
  4. Spoel de mortel af met wat meer PBS 2% FBS en breng de oplossing over in dezelfde buis van 50 ml door dezelfde 40 μm celzeef. Centrifugeer de buis van 50 ml bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  5. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celkorrel in 5 ml RBC-lysisbuffer (1x) bij RT door meerdere keren op en neer te pipetteren. Voeg na een incubatie van 2 minuten bij RT 15 ml PBS 2% FBS toe.
  6. Centrifugeer de buis van 50 ml bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Als de celkorrel er nog steeds roodachtig uitziet, gaat u terug naar stap 3.5. Zo niet, gooi het supernatant dan weg, resuspensie van de pellet in 200 μL PBS en breng de celsuspensie over in een put van een 96-well V-bodemplaat voor kleuring.
  7. Centrifugeer de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 200 μL fluorescerende kleurstofkleuringsoplossing. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  8. Centrifugeplaat bij 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 200 μL PBS 2% FBS om te wassen.
  9. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C op 500 x g , gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspendien de pellet in 100 μL Fc-receptoren blokkerende oplossing. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
  10. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C op 500 x g , gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 100 μL primaire kleuringscocktail van HSC's. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  11. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C bij 500 x g , gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 100 μL secundaire kleuringsoplossing HSC's. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  12. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C op 500 x g en gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien.
  13. Resuspensie van de pellet in 250 μL PBS 2% FBS en breng de celsuspensie over in een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem door een 40 μm celzeef. Blijf op ijs beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse.
    OPMERKING: Als u geïnteresseerd bent in het bepalen van de absolute aantallen hematopoëtische celpopulaties, voeg dan Calibrite Beads toe aan de polystyreenbuizen vóór analyse in de cytometer16.

4. Monsterverwerking voor de analyse van stromale celpopulaties in totaal beenmerg

  1. Plaats een dijbeen of scheenbeen in een vijzel met ijskoude PBS 2% FBS en plet het bot door het zachtjes tegen de wand van de mortel te drukken met behulp van de stamper. Knip de punt van een P1000-punt met een schaar en gebruik deze om alle inhoud van de mortel over te brengen in een buis van 50 ml (ga niet door een celzeef).
  2. Centrifugeer de buis van 50 ml bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 3 ml collagenase IV en dispase II-oplossing. Incubeer de buis bij 37 °C gedurende 40 min.
  3. Vul de buis aan tot 25 ml met PBS 2% FBS en vortex om te mengen. Breng de inhoud van de buis van 50 ml over naar een nieuwe buis van 50 ml door een celzeef van 100 μm. Voeg 15 ml PBS 2% FBS toe aan de oude buis van 50 ml en breng de oplossing over in dezelfde nieuwe buis van 50 ml door dezelfde celzeef. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  4. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celkorrel in 5 ml RBC-lysisbuffer (1x) bij RT door meerdere keren op en neer te pipetteren. Voeg na een incubatie van 2 minuten bij RT 15 ml PBS 2% FBS toe.
  5. Centrifugeer de buis van 50 ml bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Als de celkorrel er nog steeds roodachtig uitziet, gaat u terug naar stap 4.4. Zo niet, gooi het supernatant dan weg, resuspensie van de pellet in 200 μL PBS 2% FBS en breng de celsuspensie over in een put van een 96-well V-bodemplaat voor kleuring. Centrifugeer de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
  6. Als u stromale kleuring uitvoert, gaat u verder met stap 4.7. Als u EC-kleuring uitvoert, gaat u verder met stap 4.12.
  7. Gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 100 μL stromale primaire kleuringscocktail. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  8. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C op 500 x g , gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 100 μL stromale secundaire kleuringsoplossing. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  9. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door de plaat om te draaien op absorberend papier.
  10. Resuspensie van de pellet in 250 μL PBS 2% FBS en breng de celsuspensie over in een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem door een 40 μm celzeef. Blijf op ijs beschermd tegen licht.
  11. Voeg vlak voordat u naar de cytometer gaat 35 μL DAPI-kleuringsoplossing toe aan de buis met de celsuspensie voor flowcytometrie-analyse en incuber de buis bij RT gedurende 5 minuten in het donker. Na deze incubatie op ijs houden beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse.
  12. Gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 100 μL ECs-kleuringscocktail. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  13. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
  14. Gooi het supernatant weg door de plaat om te draaien op absorberend papier. Resuspensie van de pellet in 250 μL PBS 2% FBS en breng de celsuspensie over in een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem door een 40 μm celzeef. Blijf op ijs beschermd tegen licht.
  15. Voeg vlak voordat u naar de cytometer gaat 35 μL DAPI-kleuringsoplossing toe aan de buis met de celsuspensie voor flowcytometrie-analyse en incuber de buis bij RT gedurende 5 minuten in het donker. Na deze incubatie op ijs houden beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse.
    OPMERKING: Als u geïnteresseerd bent in het bepalen van de absolute aantallen stromale en endotheelcelpopulaties, voeg dan Calibrite Beads toe aan de polystyreenbuizen vóór analyse in de cytometer16.

5. Monsterverwerking voor de analyse van hematopoëtische celpopulaties in gemalen en gespoelde BM

  1. Plaats een dijbeen op een petrischaaltje en snijd de uiteinden van het bot af met een steriel scalpel.
  2. Spoel het centrale deel van het bot (diafyse) door 100 μL PBS 2% FBS eenmaal van elke kant door de binnenkant van het bot te laten lopen met behulp van een insulinespuit zonder dood volume 0,5 ml en de oplossing te verzamelen in een microcentrifugebuis met 1 ml PBS 2% FBS. Breng vervolgens de celsuspensie over in een buis van 50 ml met het label gespoelde BM met 4 ml PBS 2% FBS. Blijf op ijs.
  3. Plaats de uiteinden van het bot in een vijzel met ijskoude PBS 2% FBS en plet door het zachtjes tegen de mortelwand te drukken met behulp van de stamper. Pipetteer de resulterende celsuspensie op en neer met behulp van een pipet van 10 ml om te homogeniseren en over te brengen in een buis van 50 ml met het label geplet BM door een celzeef van 40 μm.
  4. Als het verbrijzelde bot er op dit punt niet wit uitziet, voeg dan meer PBS 2% FBS toe aan de mortel en herhaal het verpletteren. Pipet vervolgens op en neer en breng de oplossing over in dezelfde buis van 50 ml (gemalen BM) door dezelfde 40 μm celzeef.
  5. Spoel de mortel af met wat meer PBS 2% FBS en breng de oplossing over in dezelfde buis van 50 ml (gemalen BM) door dezelfde 40 μm celzeef.
  6. Centrifugeer de buizen van 50 ml die overeenkomen met de gespoelde en gemalen monsters bij 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
  7. Volg stap 3.5 tot en met 3.13 (rubriek 3) met de gespoelde en gemalen BM-monsters.

6. Voorbereiding van single-color controls (SCC's) voor flowcytometrie-analyse

  1. Volg de stappen 3.1 tot en met 3.6 (rubriek 3) met een extra bot van een van de dieren die niet voor de hoofdanalyse zijn gebruikt, waarbij de uiteindelijke celsuspensie wordt overgebracht in een microcentrifugebuis met 1 ml PBS 2% FBS in plaats van een put van een 96-well V-bodemplaat.
  2. Breng 100 μL van de celsuspensie over in 8 putjes van een 96-well V-bodemplaat, 100 μL in een 5 ml polystyreen rondbodembuis met 100 μL PBS 2% FBS gelabeld als DAPI SCC, en de resterende celsuspensie in een 5 ml polystyreen rondbodembuis met 100 μL PBS 2% FBS gelabeld als onbevlekt. Houd de buizen op ijs beschermd tegen licht.
  3. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C op 500 x g en gooi de supernatanten weg door de plaat op absorberend papier te draaien.
  4. Resuspendeer één pellet in 100 μL fluorescerende kleurstofkleuringsoplossing en de resterende in 100 μL PBS 2% FBS.
  5. Voeg 0,5 μl van de volgende antilichamen toe, afgezien van de afstammingscocktail van antilichamen waarvoor 2 μl en het PECy7 CD31-antilichaam waarvoor 0,3 μl wordt toegevoegd, aan elk van de putjes met celsuspensie in PBS 2% FBS (één antilichaam per put, dezelfde antilichamen die worden gebruikt in de hoofdanalysepanelen of dezelfde fluorofoorantilichamen met vergelijkbare fluorescentie-intensiteit en epitoop-abundantie): biotine afstammingscocktail, immunofluorescent gelabeld 510 anti-muis CD150 (SLAM), PE anti-muis Flk2 (CD135), PerCP anti-muis Ly-6A/E (Sca-1), immunofluorescent gelabeld 647 anti-muis CD54/ICAM-1, PE/Cyanine7 anti-muis CD48, en APC/Cyanine7 anti-muis CD117 (c-kit). Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  6. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe aan elke put en pipet een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C op 500 x g en gooi de supernatanten weg door de plaat op absorberend papier te draaien.
  7. Resuspendeer alle pellets, behalve die welke overeenkomt met de cellen die zijn geïncubeerd met de afstammingscocktail van antilichamen in 180 μL PBS 2% FBS en breng de celsuspensies over in 5 ml polystyreen buisjes met ronde bodem door 40 μm celzeven. Blijf op ijs beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse.
  8. Resuspendeer de cellen geïncubeerd met de afstammingscocktail van antilichamen in 100 μL HSC's / stromale secundaire kleuringsoplossing. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  9. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
  10. Resuspendeer de pellet in 180 μL PBS 2% FBS en breng de celsuspensie over in een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem door een 40 μm celzeef. Blijf op ijs beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse.
  11. Voeg vlak voordat u naar de cytometer gaat 35 μL DAPI-kleuringsoplossing toe aan de DAPI SCC-buis en incuber de buis bij RT gedurende 5 minuten in het donker. Na deze incubatie op ijs houden beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representatieve plots van flowcytometrie-analyse van HSC's en MPP's in een gezonde jongvolwassen C57Bl/6-muis zijn weergegeven in figuur 1. De gating-strategie volgt de meest recente harmonisatienomenclatuur die door de ISEH13 is voorgesteld. Bij het analyseren van de impact van een verstoring, zoals infectie of kanker, is het belangrijk om een controlemuis te gebruiken als referentie voor normale poorten. Fluorescentie-minus-één (FMO) controles kunnen bijzonder nuttig zijn om de grenzen van de poorten af te bakenen, maar opgemerkt moet worden dat het blindelings instellen van gate-limieten op basis van FMO's doelcellen kan weglaten of niet-doelcellen kan bevatten. Bijvoorbeeld, hoe lager de intensiteit van de CD48-set, hoe hoger de verrijking voor rustige HSC's op lange termijn17. Bovendien zijn verschillende eigenschappen van bepaalde populaties afhankelijk van de intensiteit van specifieke markers. HSC's die hogere CD150-niveaus uitdrukken, zijn bijvoorbeeld meer myeloïde-bevooroordeeld18.

De frequenties en absolute aantallen verkregen bij de analyse van hematopoëtische celpopulaties toegepast op in totaal vier dieren zijn weergegeven in tabel 1.

Figuur 2 toont representatieve plots van flowcytometrie-analyse van EC's en MSC's. De meerderheid van de hematopoëtische cellen wordt uitgesloten na een Ter119/CD45 negatieve selectie. LepR+ MSC's kunnen dan gemakkelijk worden geïdentificeerd, terwijl echte EC's een volgende selectie van Sca-1+ cellen vereisen. Hoewel Sca-1 vaak wordt gebruikt in immunofluorescentiestudies om specifiek arteriolen te markeren, is dit niet het geval in flowcytometrie, omdat deze techniek zeer gevoelig is en EC's altijd een bepaalde (zelfs als ze laag zijn) mate van Sca-1 aan het celoppervlak uitdrukken. Door niet alleen Sca-1+ cellen te selecteren, zouden andere niet-endotheelcellen in de analyse worden opgenomen, zoals CD31-tot expressie brengende myeloïde cellen, wat een aanzienlijke invloed kan hebben op de kwantificering van EC's in de BM. EC's kunnen worden geanalyseerd als een hele populatie of op basis van specifieke markers die hun heterogeniteit gedeeltelijk onthullen. Endomucine in combinatie met CD31 is zeer nuttig om het functioneel onderscheiden type H endotheel15 te identificeren (figuur 2). Bovendien is eerder aangetoond dat ICAM-1-expressie de discriminatie tussen arteriolar (aBMECs) en sinusoïdale EC's (sBMECs) mogelijk maakt (figuur 3)20.

De frequenties en absolute aantallen verkregen bij de analyse van MSC's en endotheelcelpopulaties toegepast op in totaal vier dieren zijn weergegeven in tabel 2 en tabel 3.

Hoewel BM-functionele gebieden niet duidelijk zijn afgebakend in duidelijke histologische regio's, is het goed vastgesteld dat botbekleding endosteale gebieden en centrale BM-gebieden zijn verrijkt in bepaalde celtypen en gebeurtenissen (bijvoorbeeld de afgifte van bloedplaatjes / pro-bloedplaatjes uit megakaryocyten in de sinusoïden van centrale BM-gebieden). Het is daarom nuttig om celtypen in centrale en endosteale gebieden te verrijken om deze twee compartimenten afzonderlijk te analyseren. We pasten een methode toe om de diafyse te spoelen om te verrijken voor centrale celtypen en de metafyse te verpletteren om te verrijken voor endosteale celtypen (figuur 4A). De kwantificering van aBMECs en sBMECs in gespoeld (centraal) en gemalen (endosteaal) BM-weefsel (figuur 4B) valideert de toepasbaarheid van deze mechanische isolatiemethode, aangezien aBMECs notoir overvloediger voorkomen in endosteale regio's en sinusoïden vaker voorkomen in centrale BM-gebieden.

Figure 1
Figuur 1: Analyse van hematopoëtische celpopulaties. Representatieve plots met de gatingstrategie voor de flowcytometrie-analyse van hematopoëtische celpopulaties in totale BM met behulp van de meegeleverde software. Afkortingen: FSC-H = forward scatter - height, FSC-A = forward scatter - area, Lin = lineage, LKS = Lin- Sca-1+ c-Kit+ hematopoietic progenitor cells, MPPsLy = multipotente voorlopercellen - lymfoïde, MPPsG/M = multipotente voorlopers - granulocyt/macrofaag, MPPsMk/E = multipotente voorlopers - megakaryocyt/erytrocyt, MPPs = multipotente voorlopercellen, HSCs = hematopoietische stamcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Analyse van stromale celpopulaties. Representatieve plots met de gatingstrategie voor de flowcytometrie-analyse van stromale cellen in totale BM met behulp van de meegeleverde software. Afkortingen: FSC-H = forward scatter - height, FSC-A = forward scatter - area, MSCs = mesenchymale stamcellen, LepR = leptinereceptor, ECs = endotheelcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Analyse van endotheelcellen. Representatieve plots met de gatingstrategie voor de flowcytometrie-analyse van EC's in totale BM met behulp van de meegeleverde software. Afkortingen: FSC-H = forward scatter - height, FSC-A = forward scatter - area, ECs = endotheliale cellen, aBMECs = arteriële beenmerg endotheelcellen, sBMECs = sinusoïdale beenmerg endotheelcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Analyse van eg-populaties in centrale en endosteale gebieden . (A) Weergave van de verschillende delen van een troebel lang bot. (B) Plots met de statistisch significante verschillen in de frequenties van CD31+ endotheelcellen in aBMECs (verrijkt in het gemalen monster) en sBMECs (verrijkt in het gespoelde monster). Elke stip vertegenwoordigt een muis (n = 9) en monsters worden gekoppeld. De gebruikte statistische test was de gepaarde T-test. geeft de tweezijdige P-waarde < 0,0001 aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Celpopulatie Gemiddelde van de frequentie van bm-levende cellen ± SD (n=4) in totaal BM Gemiddelde celtelling ± SD (n=4) per dijbeen in totaal BM Gemiddelde van de frequentie van bm-levende cellen ± SD (n=4) in endosteale bm Gemiddelde van de frequentie van bm-levende cellen ± SD (n=4) in centrale BM
Lin- 3,05 ± 0,13 337610 ± 59414 3,56 ± 0,21 3,53 ± 0,19
LKS 0,096 ± 0,026 10206 ± 1794 0,102 ± 0,025 0,133 ± 0,022
MPP'sLy 0,058 ± 0,011 6141 ± 716 0,058 ± 0,011 0,085 ± 0,007
MPP'sG/M 0,011 ± 0,004 1233 ± 326 0,013 ± 0,003 0,014 ± 0,003
MPP'sMk/E 0,0010 ± 0,0002 113 ± 21 0,0014 ± 0,0004 0,0012 ± 0,0005
MPP's 0,0092 ± 0,0045 940 ± 374 0,0105 ± 0,0048 0,0118 ± 0,0061
HSC's 0,0054 ± 0,0023 572 ± 191 0,0055 ± 0,0023 0,0059 ± 0,0016

Tabel 1: Kwantitatieve gegevens voor hematopoëtische celpopulaties. Gemiddelde frequentie in BM levende cellen van de verschillende hematopoietische celpopulaties geanalyseerd in totaal, endosteale en centrale BM en celtellingen per dijbeen in totale BM. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), n = 4.

Celpopulatie Gemiddelde van de frequentie van bm-levende cellen ± SD (n=4) Gemiddelde celtelling ± SD (n=4) per scheenbeen
Ecs 0,080 ± 0,011 4523 ± 1521
Type H EC's 0,041 ± 0,006 2299 ± 752
Type L EC's 0,038 ± 0,005 2103 ± 736
MSC's 0,180 ± 0,048 10270 ± 4282

Tabel 2: Kwantitatieve gegevens voor stromale celpopulaties. Gemiddelde frequentie in BM levende cellen en celtellingen per scheenbeen voor de verschillende stromale celpopulaties geanalyseerd in totale BM. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), n = 4.

Celpopulatie Gemiddelde van de frequentie van bm-levende cellen ± SD (n=4) Gemiddelde celtelling ± SD (n=4) per scheenbeen
Ecs 0,064 ± 0,006 2255 ± 150
aBMECs 0,041 ± 0,010 1419 ± 286
sBMECs 0,023 ± 0,006 819 ± 250

Tabel 3: Kwantitatieve gegevens voor endotheelcelpopulaties. Gemiddelde frequentie in BM levende cellen en celtellingen per scheenbeen voor de verschillende endotheelcelpopulaties geanalyseerd in totaal BM. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), n = 4.

Aanvullende tabel 1: Bijzonderheden over de bij het onderzoek gebruikte dieren. Stam, geslacht, leeftijd en gewicht van de dieren die zijn gebruikt om de gegevens te produceren die zijn weergegeven in figuur 1, figuur 2, en figuur 3 en tabel 1, tabel 2 en tabel 3. Afkorting: g = gram. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel het beschreven protocol eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren is, moet speciale aandacht worden besteed aan specifieke stappen. Bij het verkrijgen van gespoelde BM (stap 5.2) mag bijvoorbeeld het volume of het aantal keren dat is aangegeven om PBS 2% FBS door de binnenkant van het centrale deel van het bot te passeren, niet worden overschreden, omdat dit kan leiden tot aanzienlijke verontreiniging van het gespoelde monster door endosteale celpopulaties.

Wijzigingen in het protocol kunnen worden aangebracht om de uitvoering ervan door de onderzoeker te vergemakkelijken. Bij monsterextractie (sectie 2) kunnen poten en/of botten maximaal 24 uur in PBS 2% FBS bij 4 °C worden bewaard voordat tot monsterverwerking en -analyse wordt overgegaan. Deze tijd moet echter waar mogelijk worden geminimaliseerd. Tijdens incubatie met HSC's primaire kleuringscocktail (stap 3.10) en secundaire kleuringscocktail (stap 3.11), terwijl een incubatie van 15 minuten bij RT is aangegeven, kan dit worden vervangen door een incubatie van 30 minuten bij 4 °C.

Hetzelfde geldt voor incubatie met stromale primaire kleuringscocktail (stap 4.7), stromale secundaire kleuringsoplossing (stap 4.8), EC-kleuringscocktail (stap 4.12) en incubatie met antilichamen voor SCC's (stap 6.5); terwijl een incubatie van 15 minuten bij RT is aangegeven, kan dit worden ingeruild voor een incubatie van 30 minuten bij 4 °C.

Een ander protocol voor BM-isolatie door centrifugatie van muriene lange botten werd onlangs beschreven21. Hoewel dit protocol het voordeel biedt van snellere isolatie van de BM-cellen, maakt het hier beschreven protocol de analyse mogelijk van celpopulaties die zich in verschillende delen van de botten bevinden.

Een bijzondere beperking van de huidige methode is dat deze uitsluitend gebaseerd is op fenotypische analyse door flowcytometrie. Dit is met name relevant in het geval van HSC's, waarvoor verdere functionele validatie nodig zou zijn. Deze methode kan echter worden gecombineerd met het sorteren van verrijkte populaties en de studie van deze cellen in langdurige reconstitutietests en in vitro kolonietests.

Met betrekking tot stromale celanalyse, in het bijzonder MSC's en EC's, is eerder aangetoond dat, ondanks de optimalisatie van BM-verwerking voor flowcytometrie-analyse, een aanzienlijk aantal cellen niet uit het weefsel wordt geïsoleerd en dat er een suboptimale kwantificering van deze cellen is in vergelijking met andere methoden zoals whole-mount imaging19. Niettemin is flowcytometrie uiterst nuttig om de kwantitatieve en kwalitatieve analyse van BM EC's en MSC's uit te voeren en deze prospectief te isoleren voor functionele en expressietests.

Een andere beperking van de huidige methode is het gebruik van een mechanische techniek om de endosteale en centrale fracties te scheiden, die tot op zekere hoogte onvermijdelijk worden besmet door cellen uit het andere compartiment. Niettemin laat de kwantificering van aBMECs en sBMECs zoals uitgelegd in de sectie representatieve resultaten zien dat de mechanische isolatie een robuuste methode is om celpopulaties in deze gebieden te verrijken.

De beschreven methode maakt het mogelijk om hematopoiese in verschillende omgevingen en stromale niches van HSPC's te bestuderen. De hier gepresenteerde fenotypische analyse kan nuttig zijn om HSPC-niches te bestuderen in combinatie met specifieke muismutanten, namelijk EC- en MSC Cre-lijnen die de selectieve manipulatie van genexpressie in deze populaties mogelijk maken. De Cdh5(PAC)-CreERT222 - en de LepR-Cre23-lijnen kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om de expressie van bepaalde genen selectief in respectievelijk EC's en MSC's te induceren. De methode is nuttig om hun impact op het stromale compartiment en op HSPC's te bestuderen. Beschikbare Cre-lijnen om de vasculaire BM-niche te bestuderen zijn onlangs besproken in Mosteo et al.5. De prospectieve studie van LT-HSC's zonder transplantatie is beperkt door het gebrek aan robuuste reporterlijnen. Van de onlangs beschreven Mds1GFP/+Flt3Cre 6 is echter aangetoond dat het een hoge verrijking van LT-HSC's en een goede discriminatie van downstream-voorlopers met Flt324 tot expressie brengt. De combinatie van deze muislijn en andere hematopoëtische stammen, zoals Vav-iCre25, met flowcytometrie zal de studie van HSPC's en hun relatie met de niche mogelijk maken. Hematologische maligniteiten worden vaak geassocieerd met de verstoring van hematopoiese vanaf de vroegste stadia, wat wordt weerspiegeld in de verandering van de frequenties van hematopoëtische stam- en voorlopercellen en van stromale populaties9 die we hier hebben gepresenteerd voor gezonde C57Bl / 6. Toekomstige studies moeten de toepassing onderzoeken van vergelijkbare methoden als die hier worden beschreven met behulp van nieuwe apparatuur op basis van spectrale flowcytometrie die een uitgebreidere fenotypische karakterisering mogelijk maakt door de analyse van meer markers (meer dan 30 tegelijkertijd).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Acknowledgments

LM werd ondersteund door een subsidie van de Lady Tata Memorial Trust. JR werd ondersteund door een PhD fellowship van Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT fellowship UI/BD/150833/2021). ML werd ondersteund door een PhD fellowship van FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD werd ondersteund door subsidies van de American Society of Hematology, de Pablove Foundation, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) en de Portugese Vereniging voor Hematologie. We danken de steun van Dr. Catarina Meireles en Emilia Cardoso van TRACY faciliteit op i3s.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody BioLegend 116114
APC Streptavidin BioLegend 405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody BioLegend 105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody BioLegend 103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibody BioLegend 100304
Biotin anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100404
Biotin anti-mouse CD8a antibody BioLegend 100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody BioLegend 108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibody BioLegend 101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody BioLegend 103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody BioLegend 115929
Calibrite 2 Color Beads BD Biosciences 349502
Collagenase IV Merck Life Science C1889
Dispase II Merck Life Science D4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin ThermoFisher Scientific 10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175095
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody R&D systems BAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) ThermoFisher Scientific R37606 DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibody ThermoFisher Scientific 12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135) ThermoFisher Scientific 12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody BioLegend 102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody BioLegend 103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody BioLegend 108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tablets Merck Life Science P4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibody BioLegend 101302
RBC lysis buffer 10x BioLegend 420302
Zombie Violet Fixable Viability Dye BioLegend 423114 fluorescent dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).

Tags

Intrekking Nummer 187
Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg en stromale nichecellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L.,… More

Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L., Lopes, M., Duarte, D. Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells. J. Vis. Exp. (187), e64248, doi:10.3791/64248 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter