Summary
Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'isolamento e la colorazione delle cellule del midollo osseo murino al fenotipo delle cellule staminali emopoietiche e progenitrici insieme alle cellule staminali endoteliali e mesenchimali di nicchia di supporto. È incluso anche un metodo per arricchire le cellule situate nelle aree endostali e centrali del midollo osseo.
Abstract
Il midollo osseo (BM) è il tessuto molle trovato all'interno delle ossa dove si verifica principalmente l'ematopoiesi, il processo mediante il quale vengono generate nuove cellule del sangue. Come tale, contiene cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), oltre a sostenere le cellule stromali che contribuiscono al mantenimento e alla regolazione delle HSPC. I disturbi ematologici e altri disturbi del BM interrompono l'ematopoiesi colpendo direttamente le cellule ematopoietiche e/o attraverso l'alterazione della nicchia BM. Qui, descriviamo un metodo per studiare l'ematopoiesi in salute e malignità attraverso l'analisi fenotipica di BM HSPC murini e popolazioni di nicchia stromali mediante citometria a flusso. Il nostro metodo descrive in dettaglio i passaggi necessari per arricchire le cellule BM nelle frazioni BM endostali e centrali, nonché le strategie di gating appropriate per identificare i due tipi di cellule di nicchia chiave coinvolte nella regolazione HSPC, le cellule endoteliali e le cellule staminali mesenchimali. L'analisi fenotipica qui proposta può essere combinata con mutanti murini, modelli di malattia e saggi funzionali per caratterizzare il compartimento HSPC e la sua nicchia.
Introduction
La citometria a flusso è un metodo inestimabile per caratterizzare e isolare prospetticamente le cellule immunitarie ed ematopoietiche. Viene anche sempre più utilizzato per analizzare popolazioni stromali ed epiteliali di diversi tessuti. La cellula staminale ematopoietica (HSC) ha proprietà uniche di auto-rinnovamento e multipotenza. Nei mammiferi adulti, le HSC risiedono principalmente nel midollo osseo (BM), dove ricevono segnali di quiescenza e sopravvivenza dal microambiente circostante o dalla nicchia1. Le HSC sono formalmente definite secondo i saggi funzionali2. Tuttavia, diversi documenti di riferimento hanno dimostrato l'utilità della citometria a flusso per identificare le HSC. Attraverso l'uso di marcatori di superficie cellulare limitati, è possibile discriminare popolazioni ematopoietiche che sono altamente arricchite in HSCs3. La citometria a flusso è, quindi, un metodo centrale nel campo delle cellule staminali. È stato ampiamente utilizzato per valutare l'impatto di tipi di cellule di nicchia putativi e fattori di nicchia sulle HSC. Combinando la citometria a flusso con l'imaging e i saggi funzionali, è stato dimostrato che le HSC sono supportate criticamente dalle cellule staminali mesenchimali perivascolari (MSC) e dalle cellule endoteliali (ECs). Le MSC BM sono un gruppo eterogeneo e hanno diversi contributi di citochine4, ma è ben noto che le MSC del recettore della leptina (LepR)+ sono cellule di nicchia chiave1. Le EC BM sono anche altamente eterogenee e possono far parte di sinusoidi, arteriole e vasi transizionali di tipo H/ 5. Diversi studi hanno dimostrato il contributo sfumato di queste diverse CE. Ad esempio, le EC sinusoidali endostre sono spazialmente più vicine alle HSC quiescenti6, mentre le HSC non migratorie con livelli più bassi di specie reattive dell'ossigeno si trovano vicino alle EC arteriolari7. Anche la posizione endostale rispetto alla posizione centrale delle nicchie è molto importante. I vasi endostali di tipo H sono associati alle cellule stromali perivascolari che vengono perse con l'invecchiamento, portando alla perdita di HSC8. Nella leucemia mieloide acuta, le EC centrali sono espanse, mentre i vasi endostali e le HSC endostali vengono persi9.
La maggior parte degli studi sul campo si sono concentrati sull'ematopoiesi stessa e sulla regolazione estrinseca delle HSC da parte della cellula. È stato, tuttavia, sempre più riconosciuto che vi è la necessità di caratterizzare meglio le nicchie che regolano altri progenitori, vale a dire i progenitori multipotenti (MPP), in particolare considerando che sono i principali driver dell'ematopoiesi allo stato stazionario10. In contrasto con una struttura gerarchica fissa, studi recenti hanno dimostrato che l'ematopoiesi è un continuum in cui le HSC si differenziano in MPP distorte in una fase iniziale11. Le MPP sono state nominate in base a diversi schemi di classificazione12, ma un recente documento di consenso della Società internazionale per l'ematologia sperimentale (ISEH) ha proposto che le MPP fossero discriminate come MPP precoci e in base alla loro distorsione linfoide (MPP-Ly), megacariocitica ed eritroide (MPP-Mk / E) e mieloide (MPP-G / M)13. L'uso della citometria a flusso sarà fondamentale per studiare ulteriormente l'importanza delle nicchie BM nella regolazione di queste popolazioni. Gli attuali metodi di citometria a flusso utilizzano strategie di gating variabili per differenziare le HSPC e identificare le cellule stromali, vale a dire le EC, utilizzando marcatori incoerenti. L'obiettivo del metodo attuale è quello di presentare un flusso di lavoro semplice e riproducibile di colorazione BM per identificare sottopopolazioni HSPC, gruppi eterogenei di EC e MSC LepR +. Riteniamo che questa tecnica, sebbene comparabile con i metodi precedentemente riportati (vedi, ad esempio, riferimento 14), fornisca un protocollo aggiornato e facile da implementare per l'analisi fenotipica delle cellule ematopoietiche nelle due aree funzionali del midollo, endostale e BM centrale 8,15, nonché delle cellule di nicchia stromale BM.
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Protocol
Gli animali utilizzati in questo protocollo sono stati alloggiati presso la struttura per animali i3S in specifiche condizioni prive di agenti patogeni in un ciclo luce-buio di 12 ore e in un ambiente a temperatura controllata. È stato fornito l'accesso gratuito al chow e all'acqua standard dei roditori. Tutti gli animali hanno ricevuto cure umane secondo i criteri delineati dalla Federazione delle associazioni europee di scienze degli animali da laboratorio per la cura e la manipolazione degli animali da laboratorio (Direttiva UE 2010/63 / UE). La procedura sperimentale eseguita sugli animali (eutanasia) è stata approvata dal Comitato etico animale i3S (rif. DD_2019_15) e dalla Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. I dettagli dei materiali utilizzati in questo protocollo sono disponibili nella tabella dei materiali.
1. Preparazione di soluzioni e cocktail coloranti
- Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): sciogliere cinque compresse di PBS in 1 L di acqua distillata. Conservare a temperatura ambiente (RT).
- Siero bovino fetale PBS al 2% (FBS): aggiungere 10 ml di FBS a 500 ml di PBS. Conservare a 4 °C.
- Tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) (1x): aggiungere 50 ml di tampone di lisi 10x RBC a 450 mL di acqua deionizzata. Conservare a 4 °C.
- Soluzione di collagenasi IV e dispasi II: sciogliere 30 mg di collagenasi IV e 60 mg di dispasi II in 30 ml di HBSS per una soluzione di collagenasi IV da 1 mg/mL e 2 mg/ml di dispasi II. Preparare fresco prima dell'uso.
- Soluzione di blocco dei recettori Fc: aggiungere 10 μL di anticorpo purificato CD16/32 anti-topo a 490 μL di PBS 2% FBS. Preparare fresco o il giorno precedente. Conservare a 4 °C fino all'uso.
- Soluzione colorante fluorescente per la vitalità delle cellule: aggiungere 2 μL di colorante di vitalità cellulare fluorescente a 1 mL di PBS. Preparare fresco prima dell'uso.
- Cocktail di lignaggio della biotina: mescolare 100 μL di ciascuno dei seguenti anticorpi: biotina anti-topo CD3ε, biotina anti-topo CD4, biotina anti-topo CD8a, biotina anti-topo / umano CD11b, biotina anti-topo / umano CD45R / B220, biotina anti-topo Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) e biotina anti-topo TER-119 / cellule eritroidi. Conservare a 4 °C fino all'uso.
- Cocktail di colorazione primaria HSCs: aggiungere 10 μL di cocktail di linea di biotina, 10 μL di 510 CD150 (SLAM) anti-topo etichettati con immunofluorescenza, 10 μL di ficoeritrina (PE) anti-topo Flk2 (CD135), 10 μL di peridinina-clorofilla-proteina (PerCP) anti-topo Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL di PE/Cyanine7 anti-topo CD48 e 10 μL di alloficocianina (APC)/Cyanine7 anti-topo CD117 (c-kit) a 940 μL di PBS 2% FBS. Preparare fresco o il giorno precedente. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce fino all'uso.
- Cocktail di colorazione primaria stromale: aggiungere 5 μL di anticorpo biotinilato R leptina di topo, 6,7 μL di anticorpo endomucina PE anti-topo, 10 μL di PerCP anti-topo Ly-6A/E (Sca-1), 4 μL di PE/Cyanine7 anti-topo CD31, 10 μL di APC/Cyanine7 anti-topo CD45 e 10 μL di cellule APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/eritroidi a 954 μL di PBS 2% FBS. Preparare fresco o il giorno precedente. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce fino all'uso.
- Soluzione di colorazione secondaria HSCs/stromale: aggiungere 1 μL di streptavidina APC a 1 mL di PBS 2% FBS. Preparare fresco o il giorno precedente. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce fino all'uso.
- Cocktail di colorazione CE: aggiungere 10 μL di anticorpo endomucina PE anti-topo, 10 μL di PerCP anti-topo Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL di PE/Cyanine7 anti-mouse CD31, 10 μL di Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1, 10 μL di APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 e 10 μL di cellule APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/eritroidi a 940 μL di PBS 2% FBS. Preparare fresco o il giorno precedente. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce fino all'uso.
- Soluzione colorante DAPI: aggiungere 1 goccia di reagente DAPI a 500 μL di PBS. Preparare fresco prima dell'uso.
2. Estrazione del campione
- Eutanasia dell'animale per lussazione cervicale (i dettagli degli animali utilizzati per produrre i dati presentati in questo studio sono disponibili nella tabella supplementare 1). Posizionare l'animale con la pancia in su su una piastra di Petri e spruzzare con etanolo al 70%. Fai un taglio sopra l'addome usando le forbici e tira via la pelle fino alle caviglie.
- Prendi una gamba e, usando le forbici, taglia sul fondo (dove si trova l'articolazione tra la gamba e l'anca) per separarla dall'animale. Questo passo servirà anche come metodo secondario di conferma dell'eutanasia. Rimuovere il piede dalla gamba tagliando la caviglia. Posiziona la gamba in PBS 2% FBS ghiacciato. Se necessario, ripetere il passaggio con l'altra gamba.
- Afferrare l'osso dell'anca e, usando le forbici, tagliare dietro di esso per separarlo dall'animale. Posizionare l'osso dell'anca in PBS 2% FBS ghiacciato. Se necessario, ripetere il passaggio con l'altro osso dell'anca.
- Posizionare le gambe e le ossa dell'anca in una capsula di Petri e, usando un bisturi sterile, pulire le ossa. Separare la tibia e il femore tagliando il ginocchio con il bisturi. Posizionare le ossa pulite in PBS 2% FBS ghiacciato.
3. Elaborazione di campioni per l'analisi di popolazioni cellulari ematopoietiche nel midollo osseo totale
- Metti un femore o una tibia in un mortaio con PBS 2% FBS ghiacciato e schiaccia l'osso premendolo delicatamente contro la parete del mortaio usando il pestello. Le cellule BM vengono rilasciate nella soluzione contenuta nella malta.
- Pipettare la sospensione cellulare risultante su e giù usando una pipetta da 10 mL per omogeneizzare e trasferire in una provetta da 50 mL attraverso un filtro cellulare da 40 μm posto sopra il tubo.
- Se le ossa frantumate non sembrano bianche a questo punto, aggiungere più PBS 2% FBS alla malta e ripetere la frantumazione, quindi pipettare su e giù e trasferire la soluzione nello stesso tubo da 50 ml attraverso lo stesso filtro cellulare da 40 μm.
- Risciacquare la malta con un altro PBS 2% FBS e trasferire la soluzione nello stesso tubo da 50 mL attraverso lo stesso filtro cellulare da 40 μm. Centrifugare il tubo da 50 mL a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone di lisi RBC (1x) a RT mediante pipettaggio su e giù più volte. Dopo un'incubazione di 2 minuti a RT, aggiungere 15 ml di PBS 2% FBS.
- Centrifugare il tubo da 50 mL a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Se il pellet cellulare appare ancora rossastro, tornare al punto 3.5. In caso contrario, scartare il surnatante, risospendere il pellet in 200 μL di PBS e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra inferiore a V a 96 pozzetti per la colorazione.
- Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 200 μL di soluzione colorante fluorescente. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
- Centrifugare in piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 200 μL di PBS 2% FBS per lavare.
- Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C, scartare il surnatante capovolgendo su carta assorbente e risospendere il pellet in 100 μL di soluzione bloccante dei recettori Fc. Incubare la piastra per 10 minuti a 4 °C al riparo dalla luce.
- Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C, scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 100 μL di cocktail di colorazione primaria HSC. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
- Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C, scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 100 μL di soluzione colorante secondaria HSC. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
- Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante capovolgendo su carta assorbente.
- Risospendere il pellet in 250 μL di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Conservare sul ghiaccio al riparo dalla luce fino all'analisi citometrica a flusso.
NOTA: Se interessati a determinare il numero assoluto di popolazioni di cellule ematopoietiche, aggiungere Perle di Calibrite ai tubi di polistirene prima dell'analisi nel citometro16.
4. Elaborazione di campioni per l'analisi di popolazioni di cellule stromali nel midollo osseo totale
- Metti un femore o una tibia in un mortaio con PBS 2% FBS ghiacciato e schiaccia l'osso premendolo delicatamente contro la parete del mortaio usando il pestello. Tagliare la punta di una punta P1000 usando le forbici e usarla per trasferire tutto il contenuto della malta in un tubo da 50 ml (non passare attraverso un colino cellulare).
- Centrifugare il tubo da 50 mL a 500 x g per 5 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 3 mL di soluzione di collagenasi IV e dispasi II. Incubare il tubo a 37 °C per 40 min.
- Riempire il tubo a 25 ml con PBS 2% FBS e vortice da miscelare. Trasferire il contenuto del tubo da 50 mL in un nuovo tubo da 50 mL attraverso un filtro cellulare da 100 μm. Aggiungere 15 mL di PBS 2% FBS al vecchio tubo da 50 mL e trasferire la soluzione nello stesso nuovo tubo da 50 mL attraverso lo stesso filtro cellulare. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone di lisi RBC (1x) a RT mediante pipettaggio su e giù più volte. Dopo un'incubazione di 2 minuti a RT, aggiungere 15 ml di PBS 2% FBS.
- Centrifugare il tubo da 50 mL a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Se il pellet cellulare appare ancora rossastro, tornare al punto 4.4. In caso contrario, scartare il surnatante, risospendere il pellet in 200 μL di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra inferiore a V a 96 pozzetti per la colorazione. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C.
- Se si esegue la colorazione stromale, procedere al passaggio 4.7. Se si esegue la colorazione EC, procedere al punto 4.12.
- Scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 100 μL di cocktail di colorazione primaria stromale. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
- Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 100 μL di soluzione di colorazione secondaria stromale. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
- Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente.
- Risospendere il pellet in 250 μL di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Conservare sul ghiaccio al riparo dalla luce.
- Poco prima di andare al citometro, aggiungere 35 μL di soluzione colorante DAPI alla provetta contenente la sospensione cellulare per l'analisi della citometria a flusso e incubare la provetta a RT per 5 minuti al buio. Dopo questa incubazione, tenere il ghiaccio al riparo dalla luce fino all'analisi citometrica a flusso.
- Scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente e risospendere il pellet in 100 μL di cocktail colorante CE. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
- Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C.
- Scartare il surnatante capovolgendo la piastra su carta assorbente. Risospendere il pellet in 250 μL di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Conservare sul ghiaccio al riparo dalla luce.
- Poco prima di andare al citometro, aggiungere 35 μL di soluzione colorante DAPI alla provetta contenente la sospensione cellulare per l'analisi della citometria a flusso e incubare la provetta a RT per 5 minuti al buio. Dopo questa incubazione, tenere il ghiaccio al riparo dalla luce fino all'analisi citometrica a flusso.
NOTA: Se interessati a determinare il numero assoluto di popolazioni di cellule stromali ed endoteliali, aggiungere Perle di Calibrite ai tubi di polistirene prima dell'analisi nel citometro16.
5. Elaborazione di campioni per l'analisi di popolazioni cellulari ematopoietiche in BM frantumato e lavato
- Metti un femore su una piastra di Petri e taglia le estremità dell'osso usando un bisturi sterile.
- Lavare la parte centrale dell'osso (diafisi) facendo passare 100 μL di PBS 2% FBS attraverso l'interno dell'osso una volta da ciascun lato utilizzando una siringa da insulina da 0,5 mL senza volume morto e raccogliendo la soluzione in una provetta da microcentrifuga contenente 1 mL di PBS 2% FBS. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL etichettato come BM lavato contenente 4 mL di PBS 2% FBS. Mantenere il ghiaccio.
- Posizionare le estremità dell'osso in un mortaio con PBS 2% FBS ghiacciato e schiacciarlo premendo delicatamente contro la parete del mortaio usando il pestello. Pipettare la sospensione cellulare risultante su e giù usando una pipetta da 10 mL per omogeneizzare e trasferire in un tubo da 50 mL etichettato come BM frantumato attraverso un filtro cellulare da 40 μm.
- Se l'osso schiacciato non sembra bianco a questo punto, aggiungere più PBS 2% FBS al mortaio e ripetere la frantumazione. Quindi pipettare su e giù e trasferire la soluzione nello stesso tubo da 50 mL (BM frantumato) attraverso lo stesso filtro cellulare da 40 μm.
- Risciacquare la malta con un altro PBS 2% FBS e trasferire la soluzione nello stesso tubo da 50 mL (BM frantumato) attraverso lo stesso filtro cellulare da 40 μm.
- Centrifugare le provette da 50 mL corrispondenti ai campioni lavati e frantumati a 500 x g per 3 minuti a 4 °C.
- Seguire i punti da 3.5 a 3.13 (sezione 3) con i campioni di BM lavati e frantumati.
6. Preparazione di controlli monocromatici (SCC) per l'analisi citometrica a flusso
- Seguire i punti da 3.1 a 3.6 (sezione 3) con un osso supplementare di uno degli animali non utilizzati per l'analisi principale, trasferendo la sospensione cellulare finale in una provetta da microcentrifuga contenente 1 mL di PBS 2% FBS invece di un pozzetto di una piastra con fondo a V a 96 pozzetti.
- Trasferire 100 μL della sospensione cellulare in 8 pozzetti di una piastra inferiore a V da 96 pozzetti, 100 μL in un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL contenente 100 μL di PBS 2% FBS etichettato come DAPI SCC e la restante sospensione cellulare in un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL contenente 100 μL di PBS 2% FBS etichettato come non colorato. Tenere i tubi sul ghiaccio al riparo dalla luce.
- Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C ed eliminare i surnatanti capovolgendo la piastra su carta assorbente.
- Risospendere un pellet in 100 μL di soluzione colorante fluorescente e i restanti in 100 μL di PBS 2% FBS.
- Aggiungere 0,5 μL dei seguenti anticorpi, oltre al cocktail di anticorpi di linea per i quali aggiungere 2 μL e l'anticorpo PECy7 CD31 per il quale aggiungere 0,3 μL, a ciascuno dei pozzetti con sospensione cellulare in PBS 2% FBS (un anticorpo per pozzetto, stessi anticorpi utilizzati nei pannelli di analisi principali o stessi anticorpi fluorofori con intensità di fluorescenza e abbondanza di epitopi simili): cocktail di lignaggio di biotina, immunofluorescente marcato 510 anti-topo CD150 (SLAM), PE anti-topo Flk2 (CD135), PerCP anti-topo Ly-6A/E (Sca-1), immunofluorescente marcato 647 anti-topo CD54/ICAM-1, PE/Cyanine7 anti-topo CD48 e APC/Cyanine7 anti-topo CD117 (c-kit). Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
- Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS a ciascun pozzetto e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C ed eliminare i surnatanti capovolgendo la piastra su carta assorbente.
- Risospendere tutti i pellet tranne quello corrispondente alle cellule incubate con il cocktail di anticorpi di lignaggio in 180 μL di PBS 2% FBS e trasferire le sospensioni cellulari in tubi di polistirene a fondo tondo da 5 mL attraverso filtri cellulari da 40 μm. Conservare sul ghiaccio al riparo dalla luce fino all'analisi citometrica a flusso.
- Risospendere le cellule incubate con il cocktail di anticorpi della linea in 100 μL di soluzione di colorazione secondaria HSCs/stromale. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
- Aggiungere 100 μL di PBS 2% FBS e pipettare su e giù alcune volte per lavare. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a 4 °C.
- Risospendere il pellet in 180 μL di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un tubo di polistirene a fondo tondo da 5 mL attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Conservare sul ghiaccio al riparo dalla luce fino all'analisi citometrica a flusso.
- Poco prima di andare al citometro, aggiungere 35 μL di soluzione colorante DAPI al tubo DAPI SCC e incubare il tubo a RT per 5 minuti al buio. Dopo questa incubazione, tenere il ghiaccio al riparo dalla luce fino all'analisi citometrica a flusso.
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Representative Results
I grafici rappresentativi dell'analisi citometrica a flusso di HSC e MPP in un topo C57Bl/6 adulto sano sono mostrati nella Figura 1. La strategia di gating segue l'ultima nomenclatura armonizzante proposta dall'ISEH13. Quando si analizza l'impatto di una perturbazione, come un'infezione o un cancro, è importante utilizzare un mouse di controllo come riferimento per le porte normali. I controlli a fluorescenza meno uno (FMO) possono essere particolarmente utili per delineare i confini delle porte, ma va notato che l'impostazione cieca dei limiti di gate basati su FMO può omettere cellule bersaglio o includere celle non bersaglio. Ad esempio, minore è l'intensità del set CD48, maggiore è l'arricchimento per le HSC quiescenti a lungo termine17. Inoltre, diverse proprietà di alcune popolazioni dipendono dall'intensità di marcatori specifici. Ad esempio, le HSC che esprimono livelli più elevati di CD150 sono più mieloidi-biased18.
Le frequenze e i numeri assoluti ottenuti nell'analisi delle popolazioni cellulari ematopoietiche applicate a un totale di quattro animali sono presentati nella Tabella 1.
La Figura 2 mostra grafici rappresentativi dell'analisi citometrica a flusso di EC e MSC. La maggior parte delle cellule ematopoietiche sono escluse a seguito di una selezione Ter119/CD45 negativa. Le MSC LepR+ possono quindi essere facilmente identificate, mentre le EC vere richiedono una successiva selezione di cellule Sca-1+. Mentre Sca-1 è spesso usato negli studi di immunofluorescenza per marcare specificamente le arteriole, questo non è il caso della citometria a flusso, poiché questa tecnica è altamente sensibile e le EC esprimono sempre un certo (anche se basso) grado di Sca-1 sulla superficie cellulare. Non selezionando solo le cellule Sca-1+, altre cellule non endoteliali sarebbero incluse nell'analisi, come le cellule mieloidi che esprimono CD31, che potrebbero avere un impatto significativo sulla quantificazione delle EC nel BM. Le EC possono essere analizzate come popolazione intera o sulla base di marcatori specifici che rivelano parzialmente la loro eterogeneità. L'endomucina in combinazione con CD31 è molto utile per identificare l'endotelio15 di tipo H funzionalmente distinto (Figura 2). Inoltre, è stato precedentemente dimostrato che l'espressione di ICAM-1 consente la discriminazione tra EC arteriolari (aBMEC) e sinusoidali (sBMEC) (Figura 3)20.
Le frequenze e i numeri assoluti ottenuti nell'analisi delle MSC e delle popolazioni di cellule endoteliali applicate a un totale di quattro animali sono presentati nella Tabella 2 e nella Tabella 3.
Sebbene le aree funzionali del BM non siano chiaramente delineate nelle regioni istologiche evidenti, è ben noto che le aree endostali del rivestimento osseo e le aree centrali del BM sono arricchite in alcuni tipi ed eventi cellulari (ad esempio, il rilascio di piastrine / pro-piastrine dai megacariociti nelle sinusoidi delle aree centrali del BM). È quindi utile arricchire per i tipi di cellule nelle aree centrali ed endostre analizzare separatamente questi due compartimenti. Abbiamo applicato un metodo di lavaggio della diafisi per arricchire per i tipi di cellule centrali e schiacciare la metafisi per arricchire per i tipi di cellule endostali (Figura 4A). La quantificazione di aBMECs e sBMECs in tessuto BM arrossato (centrale) e schiacciato (endosteale) (Figura 4B) convalida l'applicabilità di questo metodo di isolamento meccanico, poiché gli aBMEC sono notoriamente più abbondanti nelle regioni endostramali e le sinusoidi sono più frequenti nelle aree BM centrali.
Figura 1: Analisi delle popolazioni di cellule ematopoietiche. Grafici rappresentativi che mostrano la strategia di gating per l'analisi citometrica a flusso di popolazioni cellulari ematopoietiche in BM totale utilizzando il software fornito. Abbreviazioni: FSC-H = forward scatter - height, FSC-A = forward scatter - area, Lin = lineage, LKS = Lin- Sca-1+ c-Kit+ cellule progenitrici ematopoietiche, MPPsLy = progenitori multipotenti - linfoidi, MPPsG/M = progenitori multipotenti - granulociti/macrofagi, MPPMk/E = progenitori multipotenti - megacariociti/eritrociti, MPPs = progenitori multipotenti, HSCs = cellule staminali ematopoietiche. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Analisi delle popolazioni di cellule stromali. Grafici rappresentativi che mostrano la strategia di gating per l'analisi citometrica a flusso delle cellule stromali in BM totale utilizzando il software fornito. Abbreviazioni: FSC-H = forward scatter - height, FSC-A = forward scatter - area, MSCs = cellule staminali mesenchimali, LepR = recettore della leptina, ECs = cellule endoteliali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Analisi delle cellule endoteliali. Grafici rappresentativi che mostrano la strategia di gating per l'analisi citometrica a flusso di EC in BM totale utilizzando il software fornito. Abbreviazioni: FSC-H = forward scatter - height, FSC-A = forward scatter - area, ECs = cellule endoteliali, aBMECs = cellule endoteliali del midollo osseo arterioso, sBMECs = cellule endoteliali del midollo osseo sinusoidale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi delle popolazioni EC nelle aree centrali ed endosteali . (A) Rappresentazione delle diverse parti di un osso lungo murino. (B) Grafici che mostrano le differenze statisticamente significative nelle frequenze delle cellule endoteliali CD31+ negli aBMEC (arricchiti nel campione frantumato) e negli sBMEC (arricchiti nel campione lavato). Ogni punto rappresenta un mouse (n = 9) e i campioni sono accoppiati. Il test statistico utilizzato era il test T accoppiato. indica il valore P a due code < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Popolazione cellulare | Media di frequenza delle cellule vive di BM ± SD (n=4) nella BM totale | Media della conta cellulare ± DS (n=4) per femore nella BM totale | Media di frequenza delle cellule vive di BM ± SD (n=4) nella BM endostale | Media di frequenza delle cellule vive BM ± SD (n=4) nel BM centrale |
| Lin- | 3,05 ± 0,13 | 337610 ± 59414 | 3,56 ± 0,21 | 3,53 ± 0,19 |
| LKS | 0,096 ± 0,026 | 10206 ± 1794 | 0,102 ± 0,025 | 0,133 ± 0,022 |
| MPPLy | 0,058 ± 0,011 | 6141 ± 716 | 0,058 ± 0,011 | 0,085 ± 0,007 |
| MPPG/M | 0,011 ± 0,004 | 1233 ± 326 | 0,013 ± 0,003 | 0,014 ± 0,003 |
| MPPMk/E | 0,0010 ± 0,0002 | 113 ± 21 | 0,0014 ± 0,0004 | 0,0012 ± 0,0005 |
| MPP | 0,0092 ± 0,0045 | 940 ± 374 | 0,0105 ± 0,0048 | 0,0118 ± 0,0061 |
| HSC | 0,0054 ± 0,0023 | 572 ± 191 | 0,0055 ± 0,0023 | 0,0059 ± 0,0016 |
Tabella 1: Dati quantitativi per popolazioni di cellule ematopoietiche. Media di frequenza nelle cellule vive di BM delle diverse popolazioni di cellule ematopoietiche analizzate in BM totale, endostale, centrale e conta cellulare per femore nel BM totale. Dati mostrati come media ± deviazione standard (SD), n = 4.
| Popolazione cellulare | Media di frequenza delle cellule vive BM ± SD (n=4) | Media della conta cellulare ± SD (n=4) per tibia |
| Ecs | 0,080 ± 0,011 | 4523 ± 1521 |
| EC di tipo H | 0,041 ± 0,006 | 2299 ± 752 |
| EC di tipo L | 0,038 ± 0,005 | 2103 ± 736 |
| MSC | 0,180 ± 0,048 | 10270 ± 4282 |
Tabella 2: Dati quantitativi per le popolazioni di cellule stromali. Media di frequenza nelle cellule vive di BM e conta cellulare per tibia per le diverse popolazioni di cellule stromali analizzate nella BM totale. Dati mostrati come deviazione standard media ± (SD), n = 4.
| Popolazione cellulare | Media di frequenza delle cellule vive BM ± SD (n=4) | Media della conta cellulare ± SD (n=4) per tibia |
| Ecs | 0,064 ± 0,006 | 2255 ± 150 |
| aBMEC | 0,041 ± 0,010 | 1419 ± 286 |
| sBMEC | 0,023 ± 0,006 | 819 ± 250 |
Tabella 3: Dati quantitativi per popolazioni di cellule endoteliali. Media di frequenza nelle cellule vive di BM e conta cellulare per tibia per le diverse popolazioni di cellule endoteliali analizzate nella BM totale. Dati mostrati come media ± deviazione standard (SD), n = 4.
Tabella supplementare 1: Dettagli degli animali utilizzati nello studio. Ceppo, sesso, età e peso degli animali utilizzati per produrre i dati mostrati nelle figure 1, figure 2 e figure 3 e tabelle 1, tabelle 2 e 3. Abbreviazione: g = grammi. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Mentre il protocollo descritto è semplice e facile da eseguire, è necessario prestare particolare attenzione a passaggi specifici. Ad esempio, quando si ottiene BM lavato (fase 5.2), il volume o il numero di volte indicato per passare PBS 2% FBS attraverso l'interno della parte centrale dell'osso non deve essere superato, in quanto ciò potrebbe comportare una contaminazione significativa del campione lavato da popolazioni di cellule endosteali.
È possibile apportare modifiche al protocollo per facilitarne l'esecuzione da parte dello sperimentatore. Nell'estrazione del campione (sezione 2), le gambe e/o le ossa possono essere conservate in PBS 2% FBS a 4 °C per un massimo di 24 ore prima di procedere all'elaborazione e all'analisi del campione. Tuttavia, questo tempo dovrebbe essere ridotto al minimo quando possibile. Durante l'incubazione con cocktail di colorazione primaria HSC (fase 3.10) e cocktail di colorazione secondaria (fase 3.11), mentre è indicata un'incubazione di 15 minuti a RT, questa può essere sostituita con un'incubazione di 30 minuti a 4 °C.
Lo stesso vale per l'incubazione con cocktail di colorazione primaria stromale (fase 4.7), soluzione di colorazione secondaria stromale (fase 4.8), cocktail di colorazione EC (fase 4.12) e incubazione con anticorpi per SCC (fase 6.5); mentre è indicata un'incubazione di 15 minuti a RT, questa può essere scambiata con un'incubazione di 30 minuti a 4 °C.
Un altro protocollo per l'isolamento della BM mediante centrifugazione di ossa lunghe murine è stato recentemente descritto21. Mentre questo protocollo presenta il vantaggio di un isolamento più rapido delle cellule BM, il protocollo qui descritto consente l'analisi delle popolazioni cellulari che risiedono in diverse aree delle ossa.
Un limite particolare del metodo attuale è che si basa esclusivamente sull'analisi fenotipica mediante citometria a flusso. Ciò è particolarmente rilevante nel caso delle HSC, che richiederebbero un'ulteriore convalida funzionale. Questo metodo può, tuttavia, essere combinato con la selezione di popolazioni arricchite e lo studio di queste cellule in saggi di ricostituzione a lungo termine e saggi di colonie in vitro .
Per quanto riguarda l'analisi delle cellule stromali, in particolare MSC e EC, è stato precedentemente dimostrato che, nonostante l'ottimizzazione del trattamento BM per l'analisi della citometria a flusso, un numero significativo di cellule non è isolato dal tessuto e vi è una quantificazione subottimale di queste cellule rispetto ad altri metodi come l'imaging a montaggio intero19. Tuttavia, la citometria a flusso è estremamente utile per eseguire l'analisi quantitativa e qualitativa di BM EC e MSCs e per isolarle prospetticamente per saggi funzionali ed espressivi.
Un'altra limitazione del metodo attuale è l'uso di una tecnica meccanica per separare le frazioni endostali e centrali, che sono in qualche misura inevitabilmente contaminate dalle cellule dell'altro compartimento. Tuttavia, la quantificazione di aBMEC e sBMEC come spiegato nella sezione dei risultati rappresentativi mostra che l'isolamento meccanico è un metodo robusto per arricchire le popolazioni cellulari in queste aree.
Il metodo descritto consente lo studio dell'ematopoiesi in diversi contesti e nicchie stromali di HSPC. L'analisi fenotipica qui presentata può essere utile per studiare nicchie HSPC quando combinate con specifici mutanti murini, vale a dire le linee EC e MSC Cre che consentono la manipolazione selettiva dell'espressione genica in queste popolazioni. Ad esempio, le linee Cdh5(PAC)-CreERT222 e LepR-Cre23 possono essere utilizzate per indurre l'espressione di alcuni geni selettivamente nelle EC e nelle MSC, rispettivamente. Il metodo è utile per studiare il loro impatto sul compartimento stromale e sulle HSPC. Le linee Cre disponibili per studiare la nicchia vascolare del BM sono state recentemente riviste in Mosteo et al.5. Lo studio prospettico delle LT-HSC senza trapianto è stato limitato dalla mancanza di solide linee di reporter. Il Mds1GFP/+Flt3Cre 6 recentemente descritto ha tuttavia dimostrato di ottenere un elevato arricchimento delle LT-HSC e una buona discriminazione da parte dei progenitori a valle che esprimono Flt324. La combinazione di questa linea murina e di altri ceppi ematopoietici, come Vav-iCre25, con citometria a flusso consentirà lo studio delle HSPC e della loro relazione con la nicchia. Le neoplasie ematologiche sono frequentemente associate all'interruzione dell'ematopoiesi fin dalle prime fasi, che si riflette nell'alterazione delle frequenze delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche e delle popolazioni stromali9 che abbiamo qui presentato per C57Bl/6 sano. Studi futuri dovrebbero esplorare l'applicazione di metodi simili a quello qui descritto utilizzando nuove apparecchiature basate sulla citometria a flusso spettrale che consentono una caratterizzazione fenotipica più ampia attraverso l'analisi di più marcatori (superiori a 30 contemporaneamente).
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
LM è stato sostenuto da una sovvenzione del Lady Tata Memorial Trust. JR è stato supportato da una borsa di dottorato della Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT fellowship UI/BD/150833/2021). ML è stato supportato da una borsa di dottorato di dottorato da FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). La DD è stata sostenuta da sovvenzioni dell'American Society of Hematology, della Pablove Foundation, della FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) e della Società portoghese di ematologia. Ringraziamo il supporto della Dott.ssa Catarina Meireles ed Emilia Cardoso della struttura TRACY di i3s.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
References
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