Summary
ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。
Abstract
骨髄(BM)は、新しい血球が生成されるプロセスである造血が主に発生する骨内にある軟組織です。そのため、造血幹および前駆細胞(HSPC)と、HSPCの維持と調節に寄与する間質細胞が含まれています。 血液学的およびその他のBM障害は、造血細胞に直接および/またはBMニッチの変化を介して影響を与えることにより、造血を破壊します。ここでは、フローサイトメトリーによるマウスBM HSPCと間質ニッチ集団の表現型解析を通じて、健康と悪性腫瘍における造血を研究する方法について説明します。私たちの方法は、内膜および中枢BM画分でBM細胞を濃縮するために必要なステップ、およびHSPC調節に関与する2つの主要なニッチ細胞タイプ、内皮細胞および間葉系幹細胞を特定するための適切なゲーティング戦略を詳述しています。ここで提案される表現型解析は、マウス変異体、疾患モデル、および機能アッセイと組み合わせて、HSPCコンパートメントおよびそのニッチを特徴付けることができる。
Introduction
フローサイトメトリーは、免疫細胞および造血細胞の特性評価と前向き単離のための非常に貴重な方法です。また、さまざまな組織の間質および上皮集団の分析にもますます使用されています。造血幹細胞(HSC)は、自己複製と多能性というユニークな特性を持っています。成体哺乳類では、HSCは主に骨髄(BM)に存在し、周囲の微小環境またはニッチから静止および生存シグナルを受け取ります1。HSCは、機能アッセイ2に従って正式に定義されます。それにもかかわらず、いくつかの画期的な論文は、HSCを特定するためのフローサイトメトリーの有用性を示しています。限られた細胞表面マーカーを使用することにより、造血幹細胞が高度に濃縮されている造血集団を識別することが可能です3。したがって、フローサイトメトリーは幹細胞分野の中心的な方法です。これは、HSCに対する推定ニッチ細胞タイプおよびニッチ因子の影響を評価するために広く使用されています。フローサイトメトリーとイメージングおよび機能アッセイを組み合わせることにより、造血幹細胞が血管周囲間葉系幹細胞(MSC)および内皮細胞(EC)によって決定的にサポートされていることが示されています。BM MSCは異種グループであり、サイトカインの寄与が異なりますが4、レプチン受容体(LepR)+ MSCが重要なニッチ細胞であることは十分に確立されています1。BM ECも非常に不均一であり、正弦波、細動脈、およびH型/移行血管の一部である可能性があります5。さまざまな研究により、これらのさまざまなECの微妙な貢献が示されています。例えば、内膜正弦波ECは空間的に静止HSC6に近く、活性酸素種レベルが低い非移動性HSCは細動脈EC7の近くに位置しています。ニッチの内膜と中央の位置も非常に重要です。骨内膜H型血管は、加齢とともに失われる血管周囲間質細胞と関連しており、HSCの喪失につながります8。急性骨髄性白血病では、中枢ECが拡張し、内膜血管と内膜HSCが失われます9。
この分野のほとんどの研究は、造血自体と細胞のHSCの外因性調節に焦点を当てています。しかし、他の前駆細胞を調節するニッチ、すなわち多能性前駆細胞(MPP)をよりよく特徴付ける必要があることが、特にそれらが定常状態での造血の主な推進力であることを考慮すると、ますます認識されています10。固定された階層構造とは対照的に、最近の研究では、造血は、造血幹細胞が初期段階で偏ったMPPに分化する連続体であることが示されています11。MPPは異なる分類スキーム12にちなんで名付けられているが、国際実験血液学会(ISEH)による最近のコンセンサス論文は、MPPを初期のMPPとして、リンパ系(MPP-Ly)、巨核球および赤血球(MPP-Mk/E)、および骨髄系(MPP-G/M)バイアス13に従って識別することを提案した。フローサイトメトリーの使用は、これらの集団の調節におけるBMニッチの重要性をさらに研究する上で重要です。現在のフローサイトメトリー法では、可変ゲーティング戦略を使用してHSPCを区別し、一貫性のないマーカーを使用して間質細胞、つまりECを同定します。現在の方法の目標は、HSPC亜集団、ECの不均一なグループ、およびLepR+ MSCを同定するためのBM染色のシンプルで再現性のあるワークフローを提示することです。この手法は、以前に報告された方法(たとえば、参考文献14を参照)に匹敵するものの、2つの機能的骨髄領域、内膜および中枢BM 8,15、およびBM間質ニッチ細胞の表現型分析のための更新された実装が容易なプロトコルを提供すると考えています。
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Protocol
このプロトコルで使用された動物は、i3S動物施設で、12時間の明暗サイクルおよび温度制御された環境で、特定の病原体のない条件下で飼育されました。標準的なげっ歯類のチャウチャウと水への無料アクセスが提供されました。すべての動物は、実験動物の世話と取り扱いに関する欧州実験動物科学協会連盟(EU指令2010/63 / EU)によって概説された基準に従って人道的な世話を受けました。動物に対して行われた実験手順(安楽死)は、i3S動物倫理委員会(参照DD_2019_15)およびDireção-Geral de Alimentação e Veterináriaによって承認されました。このプロトコル全体で使用される材料の詳細は、 材料の表に記載されています。
1.溶液の調製とカクテルの染色
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS):5つのPBS錠剤を1 Lの蒸留水に溶解します。.室温(RT)で保存してください。
- PBS 2%ウシ胎児血清(FBS):500 mLのPBSに10 mLのFBSを加えます。4°Cで保存してください。
- 赤血球(RBC)溶解バッファー(1x):50 mLの10x RBC溶解バッファーを450 mLの脱イオン水に加えます。4°Cで保存してください。
- コラゲナーゼIVおよびディスパーゼII溶液:30 mgのコラゲナーゼIVおよび60 mgのディスパーゼIIを30 mLのHBSSに溶解して、1 mg/mLのコラゲナーゼIVおよび2 mg/mLのディスパーゼII溶液にします。使用前に新鮮な準備をしてください。
- Fc受容体ブロッキング溶液:精製マウスCD16/32抗体10 μLをPBS 2%FBS490 μLに加えます。新鮮な準備または前日に準備してください。使用するまで4°Cで保存してください。
- 蛍光細胞生存率色素染色液:2 μLの蛍光細胞生存率色素を1 mLのPBSに加えます。使用前に新鮮な準備をしてください。
- ビオチン系統カクテル:ビオチン抗マウスCD3ε、ビオチン抗マウスCD4、ビオチン抗マウスCD8a、ビオチン抗マウス/ヒトCD11b、ビオチン抗マウス/ヒトCD45R/B220、ビオチン抗マウスLy-6G/Ly-6C(Gr-1)、およびビオチン抗マウスTER-119/赤血球細胞の各抗体を100μL混合します。使用するまで4°Cで保存してください。
- HSCの一次染色カクテル:ビオチン系統カクテル10 μL、免疫蛍光タグ付き510抗マウスCD150(SLAM)10 μL、フィコエリスリン(PE)抗マウスFlk2(CD135)10 μL、ペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)抗マウスLy-6A/E(Sca-1)10 μL、PE/シアニン7抗マウスCD4810 μL、およびアロフィコシアニン(APC)/シアニン7抗マウスCD117(cキット)10 μLをPBS 2%FBS940 μLに加えます。新鮮な準備または前日に準備してください。使用するまで光から保護して4°Cで保管してください。
- 間質一次染色カクテル:5 μLのマウスレプチンRビオチン化抗体、6.7 μLのPE抗マウスエンドムチン抗体、10 μLのPerCP抗マウスLy-6A/E(Sca-1)、4 μLのPE /シアニン7抗マウスCD31、10 μLのAPC/シアニン7抗マウスCD45、および10 μLのAPC/シアニン7抗マウスTER-119/赤血球細胞を954 μLのPBS 2%FBSに添加します。新鮮な準備または前日に準備してください。使用するまで光から保護して4°Cで保管してください。
- HSC/間質二次染色液:1 μLのAPCストレプトアビジンを1 mLのPBS 2%FBSに加えます。新鮮な準備または前日に準備してください。使用するまで光から保護して4°Cで保管してください。
- ECs染色カクテル:10 μLのPE抗マウスエンドムチン抗体、10 μLのPerCP抗マウスLy-6A/E(Sca-1)、10 μLのPE/シアニン7抗マウスCD31、10 μLのAlexa Fluor 647抗マウスCD54/ICAM-1、10 μLのAPC/Cyanine7抗マウスCD45、および10 μLのAPC/シアニン7抗マウスTER-119/赤血球細胞を940 μLのPBS 2%FBSに加えます。新鮮な準備または前日に準備してください。使用するまで光から保護して4°Cで保管してください。
- DAPI染色液:1滴のDAPI試薬を500 μLのPBSに加えます。使用前に新鮮な準備をしてください。
2. サンプル抽出
- 頸部脱臼によって動物を安楽死させる(この研究で提示されたデータを生成するために使用された動物の詳細は、 補足表1に記載されています)。腹を上にして動物をペトリ皿に置き、70%エタノールをスプレーします。はさみを使用して腹部の上に切り込みを入れ、皮膚を足首まで引き離します。
- 片足をつかみ、はさみを使ってその底(脚と腰の間の関節がある場所)で切り、動物から分離します。このステップは、安楽死の二次確認方法としても機能します。足首を切って足から足を外します。脚を氷冷したPBS 2%FBSに入れます。必要に応じて、もう一方の脚で手順を繰り返します。
- 腰の骨をつかみ、後ろに切ったハサミを使って動物から分離します。股関節の骨を氷冷したPBS 2%FBSに入れます。必要に応じて、もう一方の股関節骨で手順を繰り返します。
- 脚と腰の骨をペトリ皿に入れ、滅菌メスを使用して骨をきれいにします。メスで膝を切って脛骨と大腿骨を分離します。きれいな骨を氷冷したPBS 2%FBSに入れます。
3. 全骨髄中の造血細胞集団解析のためのサンプル処理
- 氷冷PBS 2%FBSを入れた乳鉢に大腿骨または脛骨を置き、乳棒を使用して乳鉢の壁にそっと押し付けて骨を粉砕します。BM細胞は乳鉢に含まれる溶液中に放出される。
- 得られた細胞懸濁液を10 mLピペットを使用して上下にピペットでホモジナイズし、チューブの上部に配置された40 μmのセルストレーナーを介して50 mLチューブに移します。
- この時点で破砕された骨が白く見えない場合は、乳鉢にPBS 2%FBSを追加して破砕を繰り返してから、上下にピペットで移動し、同じ40 μmセルストレーナーを介して同じ50 mLチューブに溶液を移します。
- さらにPBS 2%FBSで乳鉢をすすぎ、同じ40 μmセルストレーナーを通して同じ50 mLチューブに溶液を移します。50 mLチューブを500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、細胞ペレットを5 mLのRBC溶解バッファー(1x)に数回上下にピペッティングしてRTで再懸濁します。RTで2分間インキュベーションした後、15 mLのPBS 2%FBSを加えます。
- 50 mLチューブを500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 それでも細胞ペレットが赤みがかっているように見える場合は、手順3.5に戻ります。そうでない場合は、上清を廃棄し、ペレットを200 μLのPBSに再懸濁し、細胞懸濁液を96ウェルV底プレートのウェルに移して染色します。
- プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。 プレートを吸収紙の上にひっくり返して上清を捨て、ペレットを200 μLの蛍光色素染色液に再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
- プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。 プレートを吸収紙の上にひっくり返して上清を捨て、ペレットを200 μLのPBS 2%FBSに再懸濁して洗浄します。
- プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上に裏返して上清を捨て、ペレットを100 μLのFc受容体遮断溶液に再懸濁します。プレートを光から保護された4°Cで10分間インキュベートします。
- 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上に裏返して上清を捨て、ペレットを100 μLのHSCs一次染色カクテルに再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
- 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上に裏返して上清を捨て、ペレットを100 μLのHSCs二次染色溶液に再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
- 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上に裏返して上清を廃棄します。
- ペレットを250 μLのPBS 2%FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を40 μmのセルストレーナーを通して5 mLポリスチレン丸底チューブに移します。フローサイトメトリー分析まで、光から保護された氷上に保管してください。
注:造血細胞集団の絶対数を決定することに関心がある場合は、サイトメーター16で分析する前に、Caliblite Beadsをポリスチレンチューブに追加します。
4. 全骨髄中の間質細胞集団分析のためのサンプル処理
- 氷冷PBS 2%FBSを入れた乳鉢に大腿骨または脛骨を置き、乳棒を使用して乳鉢の壁にそっと押し付けて骨を粉砕します。はさみを使用してP1000チップの先端を切り、それを使用して乳鉢のすべての内容物を50 mLチューブに移します(セルストレーナーを通過させないでください)。
- 50 mLチューブを500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを3 mLのコラゲナーゼIVおよびディスパーゼII溶液に再懸濁します。チューブを37°Cで40分間インキュベートします。
- チューブを25 mLに補充し、PBS、2%FBS、ボルテックスを加えて混合します。50 mLチューブの内容物を100 μmセルストレーナーを通して新しい50 mLチューブに移します。15 mLのPBS 2% FBSを古い50 mLチューブに加え、同じセルストレーナーを通して同じ新しい50 mLチューブに溶液を移します。500 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、細胞ペレットを5 mLのRBC溶解バッファー(1x)に数回上下にピペッティングしてRTで再懸濁します。RTで2分間インキュベーションした後、15 mLのPBS 2%FBSを加えます。
- 50 mLチューブを500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 それでも細胞ペレットが赤みがかっているように見える場合は、手順4.4に戻ります。そうでない場合は、上清を廃棄し、ペレットを200 μLのPBS 2% FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を染色のために96ウェルV底プレートのウェルに移します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。
- 間質染色を行う場合は、手順4.7に進みます。EC染色を行う場合は、ステップ4.12に進んでください。
- プレートを吸収紙の上にひっくり返して上清を捨て、ペレットを100 μLの間質一次染色カクテルに再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
- 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上にひっくり返して上清を捨て、ペレットを100 μLの間質二次染色溶液に再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
- 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。 プレートを吸収紙の上に裏返して上清を捨てます。
- ペレットを250 μLのPBS 2%FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を40 μmのセルストレーナーを通して5 mLポリスチレン丸底チューブに移します。光から保護された氷の上に保管してください。
- サイトメーターに行く直前に、フローサイトメトリー分析用の細胞懸濁液を含むチューブに35 μLのDAPI染色溶液を加え、チューブをRTで暗所で5分間インキュベートします。このインキュベーションの後、フローサイトメトリー分析まで光から保護された氷上で保管してください。
- プレートを吸収紙の上に裏返して上清を捨て、ペレットを100 μLのECs染色カクテルに再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
- 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。
- プレートを吸収紙の上に裏返して上清を捨てます。ペレットを250 μLのPBS 2%FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を40 μmのセルストレーナーを通して5 mLポリスチレン丸底チューブに移します。光から保護された氷の上に保管してください。
- サイトメーターに行く直前に、フローサイトメトリー分析用の細胞懸濁液を含むチューブに35 μLのDAPI染色溶液を加え、チューブをRTで暗所で5分間インキュベートします。このインキュベーションの後、フローサイトメトリー分析まで光から保護された氷上で保管してください。
注:間質細胞集団および内皮細胞集団の絶対数を決定する場合は、サイトメーター16で分析する前に、Caliblite Beadsをポリスチレンチューブに追加します。
5.破砕およびフラッシュされたBMにおける造血細胞集団の分析のためのサンプル処理
- ペトリ皿の上に大腿骨を置き、滅菌メスを使用して骨の端を切ります。
- 死体のない0.5 mLインスリンシリンジを使用して、PBS 2%FBS100 μLを両側から1回骨の内側に通し、PBS 2%FBS1 mLを含む微量遠心チューブに溶液を回収することにより、骨の中央部を洗い流します(骨幹)。続いて、細胞懸濁液を、4 mLのPBS 2% FBSを含むフラッシュBMとラベル付けした50 mLチューブに移します。氷の上に保管してください。
- 骨の端を氷冷PBS 2%FBSの入った乳鉢に入れ、乳棒を使って乳鉢の壁にそっと押し付けて押しつぶします。得られた細胞懸濁液を10 mLピペットを用いて上下にピペットでホモジナイズし、40 μmの細胞ストレーナーを通して破砕BMと標識した50 mLチューブに移します。
- この時点で押しつぶされた骨が白く見えない場合は、モルタルにPBS 2%FBSを追加し、破砕を繰り返します。次に、上下にピペットで移動し、同じ40 μmセルストレーナーを介して同じ50 mLチューブ(粉砕BM)に溶液を移します。
- さらにPBS 2%FBSで乳鉢をすすぎ、同じ40 μmセルストレーナーを通して同じ50 mLチューブ(粉砕BM)に溶液を移します。
- フラッシュおよび破砕したサンプルに対応する50 mLチューブを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。
- ステップ3.5から3.13(セクション3)に従って、洗い流して粉砕したBMサンプルを使用します。
6. フローサイトメトリー解析のための単色コントロール(SCC)の調製
- ステップ3.1から3.6(セクション3)に従い、メイン分析に使用しなかった動物の1匹から余分な骨を加え、最終的な細胞懸濁液を96ウェルV底プレートのウェルの代わりに1 mLのPBS 2%FBSを含むマイクロ遠心チューブに移します。
- 細胞懸濁液100 μLを96ウェルV底プレートの8ウェルに移し、100 μLをDAPI SCCと標識されたPBS 2%FBS100 μLを含む5 mLポリスチレン丸底チューブに移し、残りの細胞懸濁液を無染色として標識されたPBS 2%FBS100 μLを含む5 mLポリスチレン丸底チューブに移します。チューブを氷上に保ち、光から保護してください。
- プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上に裏返して上清を廃棄します。
- 1つのペレットを100 μLの蛍光色素染色溶液に再懸濁し、残りのペレットを100 μLのPBS 2%FBSに再懸濁します。
- PBS 2% FBS中の細胞懸濁液(1ウェルあたり1抗体、メイン解析パネルで使用したのと同じ抗体、または同様の蛍光強度とエピトープ存在量を持つ同じ蛍光色素抗体)をそれぞれウェルに、2 μL添加する抗体と0.3 μLを添加するPECy7 CD31抗体の系統カクテルとは別に、以下の抗体を0.5 μL添加します。 ビオチン系統カクテル、免疫蛍光タグ付き510抗マウスCD150(SLAM)、PE抗マウスFlk2(CD135)、PerCP抗マウスLy-6A/E(Sca-1)、免疫蛍光タグ付き647抗マウスCD54/ICAM-1、PE/シアニン7抗マウスCD48、およびAPC/シアニン7抗マウスCD117(cキット)。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
- 各ウェルに100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、プレートを吸収紙の上に裏返して上清を廃棄します。
- 抗体の系統カクテルとともにインキュベートした細胞に対応するペレットを除くすべてのペレットを180 μLのPBS 2%FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を40 μmのセルストレーナーを通して5 mLポリスチレン丸底チューブに移します。フローサイトメトリー分析まで、光から保護された氷上に保管してください。
- 抗体の系統カクテルとともにインキュベートした細胞を、100 μLのHSC/間質二次染色溶液に再懸濁します。プレートを暗所のRTで15分間インキュベートします。
- 100 μLのPBS 2% FBSを加え、数回上下にピペットで入れて洗浄します。プレートを500 x g で4°Cで3分間遠心分離します。
- ペレットを180 μLのPBS 2%FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を40 μmのセルストレーナーを通して5 mLポリスチレン丸底チューブに移します。フローサイトメトリー分析まで、光から保護された氷上に保管してください。
- サイトメーターに行く直前に、35 μLのDAPI染色溶液をDAPI SCCチューブに加え、チューブをRTで暗所で5分間インキュベートします。このインキュベーションの後、フローサイトメトリー分析まで光から保護された氷上で保管してください。
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Representative Results
健康な若年成人C57Bl/6マウスにおけるHSCおよびMPPのフローサイトメトリー分析の代表的なプロットを 図1に示します。ゲーティング戦略は、ISEH13によって提案された最新の調和命名法に従います。感染やがんなどの摂動の影響を解析する場合、正常ゲートの基準としてコントロールマウスを使用することが重要です。蛍光マイナス1(FMO)コントロールは、ゲートの境界を描写するのに特に有用であり得るが、FMOに基づいて盲目的にゲート制限を設定すると、標的細胞が省略されたり、非標的細胞が含まれる場合があることに留意すべきである。例えば、CD48セットの強度が低いほど、静止長期HSC17に対する濃縮度が高くなる。さらに、特定の集団の異なる特性は、特定のマーカーの強度に依存する。例えば、より高いCD150レベルを発現するHSCは、より骨髄偏り18である。
合計4匹の動物に適用した造血細胞集団の解析において得られた頻度および絶対数を 表1に示す。
図2は、ECおよびMSCのフローサイトメトリー分析の代表的なプロットを示しています。造血細胞の大部分は、Ter119 / CD45陰性選択後に除外されます。その後、LepR+ MSCを容易に同定できますが、真のECはその後のSca-1+細胞の選択を必要とします。Sca-1は免疫蛍光研究で細動脈を特異的にマークするためによく使用されますが、フローサイトメトリーでは、この手法は非常に感度が高く、ECは常に細胞表面で特定の程度のSca-1を発現するため、これは当てはまりません。Sca-1+細胞のみを選択しないことで、CD31発現骨髄系細胞など、他の非内皮細胞が解析に含まれ、BMにおけるECの定量に大きな影響を与える可能性があります。 ECは、集団全体として、またはそれらの不均一性を部分的に明らかにする特定のマーカーに基づいて分析することができます。CD31と組み合わせたエンドムシンは、機能的に異なるH型内皮15を同定するのに非常に有用である(図2)。さらに、ICAM-1の発現により、細動脈(aBMEC)と正弦波EC(sBMEC)の識別が可能になることが以前に示されています(図3)20。
合計4匹の動物に適用したMSCおよび内皮細胞集団の分析において得られた頻度および絶対数を表 2 および 表3に示す。
BM機能領域は明らかな組織学的領域では明確に描写されていませんが、骨の内側を覆う内膜領域と中央BM領域が特定の細胞型とイベント(例えば、中央BM領域の類洞部の巨核球からの血小板/血小板促進体の放出)で濃縮されていることは十分に確立されています。したがって、これら2つのコンパートメントを別々に分析するために、中枢領域と内膜領域の細胞タイプを濃縮することは有用です。骨幹を洗い流して中心細胞型を濃縮し、骨幹を破砕して骨内細胞型を濃縮する方法を適用しました(図4A)。フラッシュ(中枢)および破砕(内膜)BM組織におけるaBMECおよびsBMECの定量(図4B)は、aBMECが内膜領域でより豊富であることが有名であり、正弦波が中央BM領域でより頻繁に発生するため、この機械的分離方法の適用性を検証します。
図1:造血細胞集団の解析。提供されたソフトウェアを用いた総BMにおける造血細胞集団のフローサイトメトリー分析のためのゲーティング戦略を示す代表的なプロット。略語:FSC-H =前方散乱-高さ、FSC-A =前方散乱-面積、Lin =系統、LKS = Lin-Sca-1+ c-Kit +造血前駆細胞、MPPLy =多能性前駆細胞-リンパ球、MPPG / M =多能性前駆細胞-顆粒球/マクロファージ、MPPMk / E =多能性前駆細胞-巨核球/赤血球、MPP =多能性前駆細胞、HSC =造血幹細胞。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:間質細胞集団の解析。 提供されたソフトウェアを用いた総BMにおける間質細胞のフローサイトメトリー分析のためのゲーティング戦略を示す代表的なプロット。略語:FSC-H =前方散乱-高さ、FSC-A =前方散乱-面積、MSCs=間葉系幹細胞、LepR=レプチン受容体、ECs =内皮細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:内皮細胞の解析。 提供されたソフトウェアを用いた総BMにおけるECのフローサイトメトリー分析のためのゲーティング戦略を示す代表的なプロット。略語:FSC-H =前方散乱-高さ、FSC-A =前方散乱-面積、ECs =内皮細胞、aBMEC =動脈骨髄内皮細胞、sBMEC =類洞骨髄内皮細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:中枢および内膜領域におけるEC集団の分析 。 (A)マウス長骨のさまざまな部分の表現。(B)aBMEC(破砕サンプルで濃縮)およびsBMEC(フラッシュサンプルで濃縮)におけるCD31+内皮細胞の頻度の統計的に有意な差を示すプロット。各ドットはマウス(n = 9)を表し、サンプルはペアになっています。使用した統計的検定は対応のあるT検定でした。は両側 P値<0.0001を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 細胞集団 | 総BMにおけるBM生細胞±SDの平均周波数(n=4) | 総BMにおける大腿骨あたりの細胞数±SD(n = 4)の平均 | 内膜BMにおけるBM生細胞±SD(n=4)の平均周波数 | BM中心部におけるBM生細胞±SDの平均周波数(n=4) |
| 林- | 3.05 ± 0.13 | 337610 ± 59414 | 3.56 ± 0.21 | 3.53 ± 0.19 |
| ティッカー | 0.096 ± 0.026 | 10206 ± 1794 | 0.102 ± 0.025 | 0.133 ± 0.022 |
| MPPsLy | 0.058 ± 0.011 | 6141 ± 716 | 0.058 ± 0.011 | 0.085 ± 0.007 |
| MPPG/M | 0.011 ± 0.004 | 1233 ± 326 | 0.013 ± 0.003 | 0.014 ± 0.003 |
| MPPMk/E | 0.0010 ± 0.0002 | 113 ± 21 | 0.0014 ± 0.0004 | 0.0012 ± 0.0005 |
| ティッカー | 0.0092 ± 0.0045 | 940 ± 374 | 0.0105 ± 0.0048 | 0.0118 ± 0.0061 |
| HSC | 0.0054 ± 0.0023 | 572 ± 191 | 0.0055 ± 0.0023 | 0.0059 ± 0.0016 |
表1:造血細胞集団の定量的データ。 合計で分析した異なる造血細胞集団のBM生細胞における頻度の平均、骨内膜、および中央BMおよび総BMにおける大腿骨当たりの細胞数。 データは平均±標準偏差(SD)として示され、n=4である。
| 細胞集団 | BM生細胞±SDの平均周波数(n=4) | 脛骨あたりの細胞数±平均SD(n = 4) |
| ティッカー | 0.080 ± 0.011 | 4523 ± 1521 |
| タイプ H ECS | 0.041 ± 0.006 | 2299 ± 752 |
| タイプ L ECS | 0.038 ± 0.005 | 2103 ± 736 |
| 間葉系企業 | 0.180 ± 0.048 | 10270 ± 4282 |
表2:間質細胞集団の定量的データ。 BM生細胞における頻度の平均および総BMで分析された異なる間質細胞集団の脛骨当たりの細胞数。 データは平均±標準偏差(SD)、n = 4として示される。
| 細胞集団 | BM生細胞±SDの平均周波数(n=4) | 脛骨あたりの細胞数±平均SD(n = 4) |
| ティッカー | 0.064 ± 0.006 | 2255 ± 150 |
| aBMEC | 0.041 ± 0.010 | 1419 ± 286 |
| sBMEC | 0.023 ± 0.006 | 819 ± 250 |
表3:内皮細胞集団の定量的データ。 BM生細胞における頻度の平均および総BMで分析された異なる内皮細胞集団についての脛骨当たりの細胞数。 データは平均±標準偏差(SD)、n=4として示される。
補足表1:研究に使用された動物の詳細。データを作製するために用いた動物の系統、性別、年齢、および体重を図1、図2、および図3ならびに表1、表2、および表3に示す。略語:g =グラム。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
説明されているプロトコルはシンプルで簡単に実行できますが、特定の手順には特別な注意を払う必要があります。例えば、フラッシュされたBMを得る場合(ステップ5.2)、PBS 2%FBSを骨の中央部の内側に通すために示された量または回数は、内膜細胞集団によるフラッシュされたサンプルの重大な汚染をもたらす可能性があるため、超えてはなりません。
治験責任医師による実行を容易にするために、プロトコルを変更することができます。サンプル抽出(セクション2)では、脚や骨をPBS 2% FBSに4°Cで最大24時間保存してから、サンプルの処理と分析に進むことができます。ただし、この時間は可能な限り最小限に抑える必要があります。HSCの一次染色カクテル(ステップ3.10)および二次染色カクテル(ステップ3.11)とのインキュベーション中、RTで15分間のインキュベーションが示されますが、これを4°Cで30分間のインキュベーションと交換できます。
同じことが、間質一次染色カクテルとのインキュベーション(ステップ4.7)、間質二次染色溶液(ステップ4.8)、ECs染色カクテル(ステップ4.12)およびSCCに対する抗体とのインキュベーション(ステップ6.5)にも当てはまります。RTでの15分間のインキュベーションが示されていますが、これは4°Cでの30分間のインキュベーションと交換できます。
マウス長骨の遠心分離によるBM単離のための別のプロトコルが最近記載された21。このプロトコルはBM細胞のより速い単離の利点を提示するが、ここで説明するプロトコルは骨の異なる領域に存在する細胞集団の分析を可能にする。
現在の方法の特定の制限は、フローサイトメトリーによる表現型分析のみに基づいていることです。これは、さらなる機能検証を必要とするHSCの場合に特に関連します。ただし、この方法は、濃縮集団の選別や、長期再構成アッセイや in vitro コロニーアッセイにおけるこれらの細胞の研究と組み合わせることができます。
間質細胞解析、特にMSCおよびECに関しては、フローサイトメトリー解析のためのBM処理の最適化にもかかわらず、かなりの数の細胞が組織から単離されておらず、ホールマウントイメージングなどの他の方法と比較した場合、これらの細胞の定量が最適ではないことが以前に示されています19.それにもかかわらず、フローサイトメトリーは、BM ECおよびMSCの定量的および定性的分析を実行し、機能アッセイおよび発現アッセイのためにそれらを前向きに単離するのに非常に有用です。
現在の方法の別の制限は、他の区画からの細胞によってある程度必然的に汚染されている内膜画分および中枢画分を分離するための機械的技術の使用である。それにもかかわらず、代表的な結果のセクションで説明したaBMECおよびsBMECの定量は、機械的単離がこれらの領域の細胞集団を濃縮するための堅牢な方法であることを示しています。
記載された方法は、HSPCの異なる設定および間質ニッチにおける造血の研究を可能にする。ここで提示された表現型解析は、特定のマウス変異体、すなわちこれらの集団における遺伝子発現の選択的操作を可能にするECおよびMSC Cre株と組み合わせると、HSPCニッチを研究するのに役立つ可能性があります。例えば、Cdh5(PAC)-CreERT222 およびLepR-Cre23 株は、それぞれECおよびMSCにおいて特定の遺伝子の選択的に発現を誘導するために使用することができる。この方法は、間質コンパートメントおよびHSPCへの影響を研究するのに有用です。 血管BMニッチを研究するために利用可能なCreラインは、最近Mosteoらでレビューされています5。移植なしのLT-HSCの前向き研究は、堅牢なレポーターラインの欠如によって制限されてきました。しかしながら、最近記載された Mds1GFP/+Flt3Cre 6 は、LT-HSCの高濃縮およびFlt324を発現する下流の前駆細胞からの良好な識別を達成することが示されている。このマウス系統とVav-iCre25などの他の造血株とフローサイトメトリーを組み合わせることで、HSPCとニッチとの関係の研究が可能になります。血液悪性腫瘍は、初期段階からの造血の破綻と関連していることが多く、これは造血幹細胞と前駆細胞の頻度の変化、および健康なC57Bl/6についてここで提示した間質集団9 の変化に反映されています。今後の研究では、より多くのマーカー(同時に30を超える)の分析を通じてより広範な表現型の特徴付けを可能にするスペクトルフローサイトメトリーに基づく新しい機器を使用して、ここで説明した方法と同様の方法の適用を検討する必要があります。
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Disclosures
著者は、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
LMは、レディタタメモリアルトラストからの助成金によってサポートされました。JRは、Fundação para a Ciência e Tecnologia(FCT;FCTフェローシップUI / BD / 150833 / 2021)。MLは、FCTの博士号フェローシップ(FCTフェローシップ 2021.04773.BD)によってサポートされました。DDは、米国血液学会、パブラブ財団、FCT(EXPL/MED-ONC/0522/2021)、およびポルトガル血液学会からの助成金によって支援されました。i3sのTRACY施設のカタリーナ・メイレレス博士とエミリア・カルドーゾ博士の支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
References
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