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Biology

म्यूरिन अस्थि मज्जा हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं और स्ट्रोमल आला कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64248
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

Summary

यहां, हम सहायक आला एंडोथेलियल और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के साथ-साथ फेनोटाइप हेमोपोइटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं के लिए मुराइन अस्थि मज्जा कोशिकाओं के अलगाव और धुंधलापन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एंडोचोरी और केंद्रीय अस्थि मज्जा क्षेत्रों में स्थित कोशिकाओं को समृद्ध करने की एक विधि भी शामिल है।

Abstract

अस्थि मज्जा (बीएम) हड्डियों के भीतर पाया जाने वाला नरम ऊतक है जहां हेमटोपोइजिस, वह प्रक्रिया जिसके द्वारा नई रक्त कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं, मुख्य रूप से होती हैं। जैसे, इसमें हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं (एचएसपीसी) शामिल हैं, साथ ही सहायक स्ट्रोमल कोशिकाएं हैं जो एचएसपीसी के रखरखाव और विनियमन में योगदान करती हैं। यहां, हम फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मुराइन बीएम एचएसपीसी और स्ट्रोमल आला आबादी के फेनोटाइपिक विश्लेषण के माध्यम से स्वास्थ्य और घातकता में हेमटोपोइजिस का अध्ययन करने की एक विधि का वर्णन करते हैं। हमारी विधि एंडोस्टोल और केंद्रीय बीएम अंशों में बीएम कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए आवश्यक कदमों का विवरण देती है, साथ ही एचएसपीसी विनियमन, एंडोथेलियल कोशिकाओं और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं में शामिल दो प्रमुख आला सेल प्रकारों की पहचान करने के लिए उपयुक्त गेटिंग रणनीतियों का विवरण देती है। यहां प्रस्तावित फेनोटाइपिक विश्लेषण को एचएसपीसी डिब्बे और उसके आला को चिह्नित करने के लिए माउस उत्परिवर्ती, रोग मॉडल और कार्यात्मक परख के साथ जोड़ा जा सकता है।

Introduction

फ्लो साइटोमेट्री प्रतिरक्षा और हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को चिह्नित करने और भावी प्रभाव से अलग करने के लिए एक अमूल्य विधि है। यह विभिन्न ऊतकों के स्ट्रोमल और उपकला आबादी का विश्लेषण करने के लिए भी तेजी से उपयोग किया जा रहा है। हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) में आत्म-नवीकरण और बहुशक्ति के अद्वितीय गुण हैं। वयस्क स्तनधारियों में, एचएससी मुख्य रूप से अस्थि मज्जा (बीएम) में रहते हैं, जहां वे आसपास के माइक्रोएन्वायरमेंट या आला1 से जिज्ञासा और उत्तरजीविता संकेत प्राप्त करते हैं। एचएससी को औपचारिक रूप से कार्यात्मक परख2 के अनुसार परिभाषित किया गया है। फिर भी, कई ऐतिहासिक पत्रों ने एचएससी की पहचान करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री की उपयोगिता दिखाई है। सीमित सेल सतह मार्करों के उपयोग के माध्यम से, हेमटोपोइएटिक आबादी को भेदभाव करना संभव है जो एचएससी3 में अत्यधिक समृद्ध हैं। फ्लो साइटोमेट्री, इसलिए, स्टेम सेल क्षेत्र में एक केंद्रीय विधि है। एचएससी पर कथित आला सेल प्रकारों और आला कारकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इसका बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। इमेजिंग और कार्यात्मक परख के साथ फ्लो साइटोमेट्री के संयोजन से, यह दिखाया गया है कि एचएससी पेरिवास्कुलर मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) और एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) द्वारा गंभीर रूप से समर्थित हैं। बीएम एमएससी एक विषमसमूह हैं और इसमें अलग-अलग साइटोकिन योगदान4 हैं, लेकिन यह अच्छी तरह से स्थापित है कि लेप्टिन रिसेप्टर (एलईपीआर) + एमएससी प्रमुख आला कोशिकाएंहैं। बीएम ईसी भी अत्यधिक विषम हैं और साइनसोइड्स, धमनी और टाइप एच / संक्रमणकालीन वाहिकाओंका हिस्सा हो सकते हैं। विभिन्न अध्ययनों ने इन विभिन्न ईसी के सूक्ष्म योगदान को दिखाया है। उदाहरण के लिए, एंडोस्टेल साइनसॉइडल ईसी स्थानिक रूप से क्विसेंट एचएससी6 के करीब हैं, जबकि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के निम्न स्तर वाले गैर-प्रवासी एचएससी धमनी ईसीएस7 के पास स्थित हैं। एंडोचोरी बनाम आला का केंद्रीय स्थान भी बहुत महत्वपूर्ण है। एंडोस्टेल टाइप एच वाहिकाएं पेरिवास्कुलर स्ट्रोमल कोशिकाओं से जुड़ी होती हैं जो उम्र बढ़ने के साथ खो जाती हैं, जिससे एचएससी8 का नुकसान होता है। तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया में, केंद्रीय ईसी का विस्तार किया जाता है, जबकि एंडोचोरी वाहिकाओं और एंडोचोरी एचएससीखो जाते हैं।

क्षेत्र में अधिकांश अध्ययनों ने हेमटोपोइजिस पर और एचएससी के सेल के बाह्य विनियमन पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, यह तेजी से मान्यता प्राप्त है कि अन्य पूर्वजों, अर्थात् मल्टीपोटेंट पूर्वजों (एमपीपी) को विनियमित करने वाले niches को बेहतर ढंग से चिह्नित करने की आवश्यकता है, विशेष रूप से यह देखते हुए कि वेस्थिर अवस्था में हेमटोपोइजिस के मुख्य चालक हैं। एक निश्चित पदानुक्रमित संरचना के विपरीत, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि हेमटोपोइजिस एक निरंतरता है जिसमें एचएससी प्रारंभिक चरण11 में पक्षपाती एमपीपी में अंतर करते हैं। एमपीपी का नाम विभिन्न वर्गीकरण योजनाओं के नाम पर रखा गया है, लेकिन इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर एक्सपेरिमेंटल हेमेटोलॉजी (आईएसईएच) द्वारा हाल ही में एक आम सहमति पत्र में एमपीपी को प्रारंभिक एमपीपीके रूप में और उनके लिम्फोइड (एमपीपी-एलवाई), मेगाकैरियोसाइटिक और एरिथ्रोइड (एमपीपी-एमके / ई), और माइलॉयड (एमपीपी-जी / एम) पूर्वाग्रह13 के अनुसार भेदभाव करने का प्रस्ताव दिया गया है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग इन आबादी के नियमन में बीएम niches के महत्व का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण होगा। वर्तमान फ्लो साइटोमेट्री विधियां एचएसपीसी को अलग करने और असंगत मार्करों का उपयोग करके स्ट्रोमल कोशिकाओं, अर्थात् ईसी की पहचान करने के लिए परिवर्तनीय गेटिंग रणनीतियों का उपयोग करती हैं। वर्तमान विधि का लक्ष्य एचएसपीसी उप-आबादी, ईसी के विषम समूहों और एलईपीआर + एमएससी की पहचान करने के लिए बीएम स्टेनिंग का एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वर्कफ़्लो प्रस्तुत करना है। हमारा मानना है कि यह तकनीक, हालांकि पहले रिपोर्ट किए गए तरीकों के साथ तुलनीय है (देखें, उदाहरण के लिए, संदर्भ14), दो कार्यात्मक मज्जा क्षेत्रों, एंडोचोरी और केंद्रीय बीएम 8,15, साथ ही बीएम स्ट्रोमल आला कोशिकाओं में हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए एक अद्यतन और आसानी से लागू प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए जानवरों को 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र और तापमान-नियंत्रित वातावरण में विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों में आई 3 एस पशु सुविधा में रखा गया था। मानक कृंतक चाउ और पानी तक मुफ्त पहुंच प्रदान की गई थी। सभी जानवरों को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और हैंडलिंग के लिए यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघों के संघ द्वारा उल्लिखित मानदंडों के अनुसार मानवीय देखभाल प्राप्त हुई (यूरोपीय संघ निर्देश 2010/63 / ईयू)। जानवरों पर की गई प्रयोगात्मक प्रक्रिया (इच्छामृत्यु) को आई 3 एस पशु नैतिकता समिति (रेफरी DD_2019_15) और डीरेको-गेराल डी एलिमेंटाको ई वेटेरिनारिया द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों का विवरण सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है।

1. समाधान की तैयारी और धुंधला कॉकटेल

  1. फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस): पांच पीबीएस गोलियों को 1 लीटर आसुत जल में घोलें। कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर करें।
  2. पीबीएस 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस): पीबीएस के 500 एमएल में एफबीएस के 10 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) लाइसिस बफर (1x): 450 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 10x आरबीसी लाइसिस बफर के 50 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. कोलेजनेस IV और डिस्पेस II समाधान: 1 mg/mL कोलेजनेस IV और 2 mg/mL dispase II घोल के लिए HBSS के 30 मिलीलीटर में 30 मिलीग्राम कोलेजनेस IV और 60 मिलीग्राम डिस्पेस II घोल घोलें। उपयोग करने से पहले ताजा तैयार करें।
  5. एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉकिंग समाधान: पीबीएस 2% एफबीएस के 490 μL में शुद्ध एंटी-माउस CD16/32 एंटीबॉडी के 10 μL जोड़ें। ताजा या पिछले दिन तैयारी करें। उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. फ्लोरोसेंट सेल व्यवहार्यता डाई धुंधला समाधान: 1 एमएल पीबीएस में फ्लोरोसेंट सेल व्यवहार्यता डाई के 2 μL जोड़ें। उपयोग करने से पहले ताजा तैयार करें।
  7. बायोटिन वंश कॉकटेल: निम्नलिखित एंटीबॉडी में से प्रत्येक के 100 μL मिलाएं: बायोटिन एंटी-माउस CD3, Biotin एंटी-माउस CD4, बायोटिन एंटी-माउस CD8a, बायोटिन एंटी-माउस / मानव CD11b, बायोटिन एंटी-माउस / मानव CD45R / B220, बायोटिन एंटी-माउस Ly-6G / Ly-6C (Gr-1), और बायोटिन एंटी-माउस TER-119 / उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. एचएससी प्राथमिक धुंधला कॉकटेल: बायोटिन वंश कॉकटेल के 10 μL, इम्यूनोफ्लोरोसेंटली टैग किए गए 510 एंटी-माउस CD150 (SLAM), 10 μL फाइकोएरिथ्रिन (PE) एंटी-माउस Flk2 (CD135), 10 μL पेरिडिनिन-क्लोरोफिल-प्रोटीन (PerCP) एंटी-माउस Ly-6A/E (SCA-1), 10 μL PE/Cyanine7 एंटी-माउस CD48 जोड़ें। ताजा या पिछले दिन तैयारी करें। उपयोग तक प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. स्ट्रोमल प्राइमरी स्टेनिंग कॉकटेल: माउस लेप्टिन आर बायोटिनीलेटेड एंटीबॉडी के 5 μL, पीई एंटी-माउस एंडोम्यूसिन एंटीबॉडी के 6.7 μL, PerCP एंटी-माउस Ly-6A/E (SCA-1), PE/Cyanine7 एंटी-माउस CD31 के 4 μL, APC/Cyanine7 एंटी-माउस CD45 के 10 μL, और APC/Cyanine7 एंटी-माउस CD45 के 10 μL जोड़ें। ताजा या पिछले दिन तैयारी करें। उपयोग तक प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  10. स्ट्रोमल सेकेंडरी स्टेनिंग समाधान: पीबीएस 2% एफबीएस के 1 एमएल में एपीसी स्ट्रेप्टाविडिन के 1 μL जोड़ें। ताजा या पिछले दिन तैयारी करें। उपयोग तक प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  11. ईसीएस धुंधला कॉकटेल: पीई एंटी-माउस एंडोम्यूसिन एंटीबॉडी के 10 μL, PerCP एंटी-माउस Ly-6A/E (SCA-1) के 10 μL, PE/Cyanine7 एंटी-माउस CD31 के 10 μL, Alexa Fluor 647 एंटी-माउस CD54/ICAM-1 के 10 μL, APC/Cyanine7 एंटी-माउस CD45 के 10 μL, और APC/Cyanine7 एंटी-माउस CD45 के 10 μL जोड़ें। ताजा या पिछले दिन तैयारी करें। उपयोग तक प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  12. DAPI धुंधला समाधान: PBS के 500 μL में DAPI अभिकर्मक की 1 बूंद जोड़ें। उपयोग करने से पहले ताजा तैयार करें।

2. नमूना निष्कर्षण

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा जानवर को इच्छामृत्यु करें (इस अध्ययन में प्रस्तुत आंकड़ों का उत्पादन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों का विवरण पूरक तालिका 1 में पाया जा सकता है)। पेट के साथ जानवर को पेट्री डिश पर रखें और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। कैंची का उपयोग करके पेट के ऊपर एक कट बनाएं और त्वचा को एड़ियों तक खींचें।
  2. एक पैर पकड़ो और, कैंची का उपयोग करके, इसे जानवर से अलग करने के लिए इसके तल (जहां पैर और कूल्हे के बीच का जोड़ है) पर काट लें। यह कदम इच्छामृत्यु की द्वितीयक पुष्टि विधि के रूप में भी काम करेगा। टखने पर काटकर पैर को पैर से हटा दें। पैर को बर्फ-ठंडे पीबीएस 2% एफबीएस में रखें। यदि आवश्यक हो, तो दूसरे पैर के साथ चरण दोहराएं।
  3. कूल्हे की हड्डी को पकड़ें और, कैंची का उपयोग करके इसे जानवर से अलग करने के लिए इसके पीछे काट दें। कूल्हे की हड्डी को बर्फ-ठंडे पीबीएस 2% एफबीएस में रखें। यदि आवश्यक हो, तो दूसरे कूल्हे की हड्डी के साथ चरण दोहराएं।
  4. पैर (ओं) और कूल्हे की हड्डी (ओं) को पेट्री डिश में रखें और बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके, हड्डियों को साफ करें। स्केलपेल के साथ घुटने पर काटकर टिबिया और फीमर को अलग करें। साफ हड्डियों को बर्फ-ठंडे पीबीएस 2% एफबीएस में रखें।

3. कुल अस्थि मज्जा में हेमटोपोइएटिक सेल आबादी के विश्लेषण के लिए नमूना प्रसंस्करण

  1. बर्फ-ठंडे पीबीएस 2% एफबीएस के साथ मोर्टार में एक फीमर या टिबिया रखें और मूसल का उपयोग करके मोर्टार की दीवार पर धीरे से दबाकर हड्डी को कुचल दें। बीएम कोशिकाओं को मोर्टार में निहित समाधान में छोड़ दिया जाता है।
  2. परिणामस्वरूप सेल निलंबन को 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके ऊपर और नीचे किया जाता है ताकि ट्यूब के शीर्ष पर रखे गए 40 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से 50 mL ट्यूब में समरूप और स्थानांतरित किया जा सके।
  3. यदि कुचल हड्डियां इस बिंदु पर सफेद नहीं दिखती हैं, तो मोर्टार में अधिक पीबीएस 2% एफबीएस जोड़ें और क्रशिंग दोहराएं, और फिर ऊपर और नीचे पिपेट करें और उसी 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से समाधान को उसी 50 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. मोर्टार को कुछ और पीबीएस 2% एफबीएस के साथ कुल्ला करें और उसी 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से उसी 50 mL ट्यूब में घोल को स्थानांतरित करें। 50 एमएल ट्यूब को 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और आरटी पर आरबीसी लाइसिस बफर (1x) के 5 मिलीलीटर में सेल गोली को कई बार ऊपर और नीचे पाइप करके फिर से निलंबित करें। आरटी पर 2 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस 2% एफबीएस के 15 एमएल जोड़ें।
  6. 50 एमएल ट्यूब को 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। यदि सेल गोली अभी भी लाल दिखती है, तो चरण 3.5 पर वापस जाएं। यदि नहीं, तो सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, पीबीएस के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित करें, और सेल निलंबन को धुंधला करने के लिए 96-वेल वी-बॉटम प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें।
  7. प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। प्लेट को शोषक कागज पर फ्लिप करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें और फ्लोरोसेंट डाई स्टेनिंग समाधान के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज प्लेट। प्लेट को शोषक कागज पर फ्लिप करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें और धोने के लिए पीबीएस 2% एफबीएस के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
  9. प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, प्लेट को शोषक कागज पर पलटकर सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें, और 100 μL एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉकिंग समाधान में गोली को फिर से निलंबित करें। प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  10. 100 μL PBS 2% FBS जोड़ें और धोने के लिए कुछ बार ऊपर और नीचे पिपेट जोड़ें। प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, प्लेट को शोषक कागज पर पलटकर सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें, और एचएससी प्राथमिक धुंधला कॉकटेल के 100 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  11. 100 μL PBS 2% FBS जोड़ें और धोने के लिए कुछ बार ऊपर और नीचे पिपेट जोड़ें। प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, प्लेट को शोषक कागज पर फ्लिप करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और एचएससी सेकेंडरी स्टेनिंग घोल के 100 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  12. 100 μL PBS 2% FBS जोड़ें और धोने के लिए कुछ बार ऊपर और नीचे पिपेट जोड़ें। प्लेट को 500 x g पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और प्लेट को शोषक कागज पर पलटकर सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
  13. पीबीएस 2% एफबीएस के 250 μL में गोली को पुन: निलंबित करें और सेल निलंबन को 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से 5 mL पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण तक बर्फ को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    नोट: यदि हेमटोपोइएटिक सेल आबादी की पूर्ण संख्या निर्धारित करने में रुचि रखते हैं, तो साइटोमीटर16 में विश्लेषण से पहले पॉलीस्टाइनिन ट्यूबों में कैलिब्राइट बीड्स जोड़ें।

4. कुल अस्थि मज्जा में स्ट्रोमल सेल आबादी के विश्लेषण के लिए नमूना प्रसंस्करण

  1. बर्फ-ठंडे पीबीएस 2% एफबीएस के साथ मोर्टार में एक फीमर या टिबिया रखें और मूसल का उपयोग करके मोर्टार की दीवार पर धीरे से दबाकर हड्डी को कुचल दें। कैंची का उपयोग करके पी 1000 टिप की नोक को काटें और मोर्टार की सभी सामग्री को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए इसका उपयोग करें (सेल छन्नी से न गुजरें)।
  2. 50 एमएल ट्यूब को 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें, सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और 3 एमएल कोलेजनेस IV और डिस्पेस II घोल में गोली को फिर से निलंबित करें। 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
  3. पीबीएस 2% एफबीएस और मिश्रण करने के लिए भंवर के साथ ट्यूब को 25 एमएल तक टॉप अप करें। 50 एमएल ट्यूब की सामग्री को 100 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से एक नए 50 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें। पुराने 50 एमएल ट्यूब में पीबीएस 2% एफबीएस के 15 एमएल जोड़ें और उसी सेल स्ट्रेनर के माध्यम से उसी नए 50 एमएल ट्यूब में समाधान को स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  4. सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और आरटी पर आरबीसी लाइसिस बफर (1x) के 5 मिलीलीटर में सेल गोली को कई बार ऊपर और नीचे पाइप करके फिर से निलंबित करें। आरटी पर 2 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस 2% एफबीएस के 15 एमएल जोड़ें।
  5. 50 एमएल ट्यूब को 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। यदि सेल गोली अभी भी लाल दिखती है, तो चरण 4.4 पर वापस जाएं। यदि नहीं, तो सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, पीबीएस 2% एफबीएस के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित करें, और सेल निलंबन को धुंधला करने के लिए 96-वेल वी-बॉटम प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें। प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. यदि स्ट्रोमल धुंधला प्रदर्शन कर रहे हैं, तो चरण 4.7 पर आगे बढ़ें। यदि ईसी धुंधला प्रदर्शन कर रहे हैं, तो चरण 4.12 पर आगे बढ़ें।
  7. प्लेट को शोषक कागज पर पलटकर सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और स्ट्रोमल प्राइमरी स्टेनिंग कॉकटेल के 100 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  8. 100 μL PBS 2% FBS जोड़ें और धोने के लिए कुछ बार ऊपर और नीचे पिपेट जोड़ें। प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, प्लेट को शोषक कागज पर पलटकर सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें, और 100 μL स्ट्रोमल सेकेंडरी स्टेनिंग घोल में गोली को फिर से निलंबित करें। अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  9. 100 μL PBS 2% FBS जोड़ें और धोने के लिए कुछ बार ऊपर और नीचे पिपेट जोड़ें। प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। प्लेट को शोषक कागज पर पलटकर सतह पर तैरनेवाला को फेंक दें।
  10. पीबीएस 2% एफबीएस के 250 μL में गोली को पुन: निलंबित करें और सेल निलंबन को 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से 5 mL पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें। बर्फ को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  11. साइटोमीटर पर जाने से ठीक पहले, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए सेल सस्पेंशन युक्त ट्यूब में 35 μL DAPI धुंधला घोल जोड़ें और अंधेरे में 5 मिनट के लिए RT पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें। इस इनक्यूबेशन के बाद, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण तक प्रकाश से सुरक्षित बर्फ पर रखें।
  12. प्लेट को शोषक कागज पर पलटकर सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और कॉकटेल को 100 μL ईसी धुंधला करने वाले कॉकटेल में फिर से निलंबित करें। अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  13. 100 μL PBS 2% FBS जोड़ें और धोने के लिए कुछ बार ऊपर और नीचे पिपेट जोड़ें। प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  14. प्लेट को शोषक कागज पर पलटकर सतह पर तैरनेवाला को फेंक दें। पीबीएस 2% एफबीएस के 250 μL में गोली को पुन: निलंबित करें और सेल निलंबन को 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से 5 mL पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें। बर्फ को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  15. साइटोमीटर पर जाने से ठीक पहले, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए सेल सस्पेंशन युक्त ट्यूब में 35 μL DAPI धुंधला घोल जोड़ें और अंधेरे में 5 मिनट के लिए RT पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें। इस इनक्यूबेशन के बाद, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण तक प्रकाश से सुरक्षित बर्फ पर रखें।
    नोट: यदि स्ट्रोमल और एंडोथेलियल सेल आबादी की पूर्ण संख्या निर्धारित करने में रुचि रखते हैं, तो साइटोमीटर16 में विश्लेषण से पहले पॉलीस्टाइनिन ट्यूबों में कैलिब्राइट बीड्स जोड़ें।

5. कुचल और फ्लश किए गए बीएम में हेमटोपोइएटिक सेल आबादी के विश्लेषण के लिए नमूना प्रसंस्करण

  1. एक पेट्री डिश पर एक फीमर रखें और एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके हड्डी के सिरों को काट लें।
  2. हड्डी के मध्य भाग (डायफिसिस) को पीबीएस 2% एफबीएस के 100 μL को हड्डी के अंदर से एक बार बिना मृत मात्रा 0.5 एमएल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके और 1 मिलीलीटर पीबीएस 2% एफबीएस युक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में समाधान एकत्र करके फ्लश करें। इसके बाद, सेल निलंबन को फ्लश ्ड बीएम के रूप में लेबल किए गए 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 4 एमएल पीबीएस 2% एफबीएस होता है। बर्फ पर रहो।
  3. हड्डी के सिरों को बर्फ-ठंडा पीबीएस 2% एफबीएस के साथ मोर्टार में रखें और मूसल का उपयोग करके मोर्टार की दीवार के खिलाफ धीरे से दबाकर कुचल दें। परिणामी सेल निलंबन को 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके ऊपर और नीचे किया जाता है ताकि 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से कुचल बीएम के रूप में लेबल की गई 50 एमएल ट्यूब में समरूप और स्थानांतरित किया जा सके।
  4. यदि कुचल हड्डी इस बिंदु पर सफेद नहीं दिखती है, तो मोर्टार में अधिक पीबीएस 2% एफबीएस जोड़ें और क्रशिंग को दोहराएं। फिर ऊपर और नीचे पिपेट करें और उसी 40 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से घोल को उसी 50 mL ट्यूब (क्रश BM) में स्थानांतरित करें।
  5. मोर्टार को कुछ और पीबीएस 2% एफबीएस के साथ कुल्ला करें और उसी 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से उसी 50 mL ट्यूब (कुचल बीएम) में घोल को स्थानांतरित करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 x g पर फ्लश किए गए और कुचल नमूनों के अनुरूप 50 एमएल ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. फ्लश और क्रश किए गए बीएम नमूनों के साथ चरण 3.5 से 3.13 (अनुभाग 3) का पालन करें।

6. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए एकल-रंग नियंत्रण (एससीसी) की तैयारी

  1. मुख्य विश्लेषण के लिए उपयोग नहीं किए गए जानवरों में से एक से एक अतिरिक्त हड्डी के साथ चरण 3.1 से 3.6 (खंड 3) का पालन करें, अंतिम सेल निलंबन को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 96-वेल वी-बॉटम प्लेट के कुएं के बजाय पीबीएस 2% एफबीएस के 1 एमएल होते हैं।
  2. सेल सस्पेंशन के 100 μL को 96-वेल वी-बॉटम प्लेट के 8 कुओं में स्थानांतरित करें, 100 μL को 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 100 μL PBS 2% FBS को DAPI SCC के रूप में लेबल किया गया है, और शेष सेल निलंबन को 5 mL पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 100 μL PBS 2% FBS के रूप में लेबल किया गया है। बर्फ पर ट्यूबों को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  3. प्लेट को 500 x g पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और प्लेट को शोषक कागज पर पलटकर सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
  4. फ्लोरोसेंट डाई धुंधला समाधान के 100 μL में एक गोली को फिर से निलंबित करें और शेष को पीबीएस 2% एफबीएस के 100 μL में डालें।
  5. एंटीबॉडी के वंश कॉकटेल के अलावा निम्नलिखित एंटीबॉडी के 0.5 μL जोड़ें, जिसके लिए 2 μL और PECy7 CD31 एंटीबॉडी जोड़ें, जिसके लिए PBS 2% FBS में सेल निलंबन के साथ प्रत्येक कुएं में 0.3 μL जोड़ें (प्रति अच्छी तरह से एक एंटीबॉडी, मुख्य विश्लेषण पैनलों में उपयोग किए जाने वाले समान एंटीबॉडी या समान फ्लोरोफोरे एंटीबॉडी समान प्रतिदीप्ति तीव्रता और एपिटोप बहुतायत के साथ): बायोटिन वंशावली कॉकटेल, इम्यूनोफ्लोरोसेंटली टैग की गईं 510 एंटी-माउस सीडी 150 (एसएलएएम), पीई एंटी-माउस एफएलके 2 (सीडी 135), परसीपी एंटी-माउस एलवाई -6 ए / ई (एससीए -1), इम्यूनोफ्लोरोसेंटली टैग 647 एंटी-माउस सीडी 54 / आईसीएएम -1, पीई / साइनिन 7 एंटी-माउस सीडी 48, और एपीसी / अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  6. प्रत्येक कुएं में पीबीएस 2% एफबीएस के 100 μL जोड़ें और धोने के लिए कुछ बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। प्लेट को 500 x g पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और प्लेट को शोषक कागज पर पलटकर सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
  7. पीबीएस 2% एफबीएस के 180 μL में एंटीबॉडी के वंश कॉकटेल के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं के अलावा सभी छर्रों को फिर से निलंबित करें और सेल निलंबन को 40 μm सेल स्ट्रेनर्स के माध्यम से 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूबों में स्थानांतरित करें। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण तक बर्फ को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  8. 100 μL HSCs/स्ट्रोमल सेकेंडरी स्टेनिंग सॉल्यूशन में एंटीबॉडी के वंश कॉकटेल के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  9. 100 μL PBS 2% FBS जोड़ें और धोने के लिए कुछ बार ऊपर और नीचे पिपेट जोड़ें। प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  10. पीबीएस 2% एफबीएस के 180 μL में गोली को पुन: निलंबित करें और सेल निलंबन को 40 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से 5 mL पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण तक बर्फ को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  11. साइटोमीटर पर जाने से ठीक पहले, DAPI SCC ट्यूब में DAPI धुंधला घोल के 35 μL जोड़ें और अंधेरे में 5 मिनट के लिए RT पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें। इस इनक्यूबेशन के बाद, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण तक प्रकाश से सुरक्षित बर्फ पर रखें।

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Representative Results

एक स्वस्थ युवा वयस्क C57Bl/6 माउस में HSC और MPPs के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के प्रतिनिधि प्लॉट चित्र 1 में दिखाए गए हैं। गेटिंग रणनीति आईएसईएच13 द्वारा प्रस्तावित नवीनतम सामंजस्यपूर्ण नामकरण का अनुसरण करती है। संक्रमण या कैंसर जैसे गड़बड़ी के प्रभाव का विश्लेषण करते समय, सामान्य द्वार के लिए संदर्भ के रूप में एक नियंत्रण माउस का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। फ्लोरेसेंस-माइनस-वन (एफएमओ) नियंत्रण विशेष रूप से गेट की सीमाओं को चित्रित करने के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एफएमओ के आधार पर गेट सीमा ओं को आंख बंद करके स्थापित करना लक्ष्य कोशिकाओं को छोड़ सकता है या गैर-लक्ष्य कोशिकाओं को शामिल कर सकता है। उदाहरण के लिए, सीडी 48 सेट की तीव्रता जितनी कम होगी, दीर्घकालिक एचएससी17 के लिए संवर्धन उतना ही अधिक होगा। इसके अलावा, कुछ आबादी के विभिन्न गुण विशिष्ट मार्करों की तीव्रता पर निर्भर करते हैं। उदाहरण के लिए, उच्च सीडी 150 स्तर व्यक्त करने वाले एचएससी अधिक माइलॉयड-पक्षपाती18 हैं।

कुल चार जानवरों पर लागू हेमटोपोइएटिक सेल आबादी के विश्लेषण में प्राप्त आवृत्तियों और पूर्ण संख्याओं को तालिका 1 में प्रस्तुत किया गया है।

चित्रा 2 ईसी और एमएससी के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के प्रतिनिधि भूखंडों को दर्शाता है। अधिकांश हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को टेर 119 / सीडी 45 नकारात्मक चयन के बाद बाहर रखा गया है। एलईपीआर + एमएससी को तब आसानी से पहचाना जा सकता है, जबकि सच्चे ईसी को एससीए -1 + कोशिकाओं के बाद के चयन की आवश्यकता होती है। जबकि एससीए -1 का उपयोग अक्सर इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययनों में विशेष रूप से धमनी को चिह्नित करने के लिए किया जाता है, फ्लो साइटोमेट्री में ऐसा नहीं है, क्योंकि यह तकनीक अत्यधिक संवेदनशील है, और ईसी हमेशा सेल की सतह पर एससीए -1 की एक निश्चित (भले ही कम) डिग्री व्यक्त करते हैं। केवल एससीए -1 + कोशिकाओं का चयन नहीं करके, अन्य गैर-एंडोथेलियल कोशिकाओं को विश्लेषण में शामिल किया जाएगा, जैसे कि सीडी 31-व्यक्त माइलॉयड कोशिकाएं, जो बीएम में ईसी की मात्रा का ठहराव को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकती हैं। सीडी 31 के साथ संयोजन में एंडोम्यूसिन कार्यात्मक रूप से अलग प्रकार एच एंडोथेलियम15 (चित्रा 2) की पहचान करने के लिए बहुत उपयोगी है। इसके अलावा, यह पहले दिखाया गया है कि आईसीएएम -1 अभिव्यक्ति धमनी (एबीएमईसी) और साइनसोइडल ईसी (एसबीएमईसी) (चित्रा 3)20 के बीच भेदभाव की अनुमति देती है।

कुल चार जानवरों पर लागू एमएससी और एंडोथेलियल सेल आबादी के विश्लेषण में प्राप्त आवृत्तियों और पूर्ण संख्याओं को तालिका 2 और तालिका 3 में प्रस्तुत किया गया है।

यद्यपि बीएम कार्यात्मक क्षेत्रों को स्पष्ट हिस्टोलॉजिकल क्षेत्रों में स्पष्ट रूप से चित्रित नहीं किया गया है, यह अच्छी तरह से स्थापित है कि हड्डी-अस्तर एंडोस्टोल क्षेत्रों और केंद्रीय बीएम क्षेत्रों को कुछ सेल प्रकारों और घटनाओं में समृद्ध किया जाता है (उदाहरण के लिए, केंद्रीय बीएम क्षेत्रों के साइनसोइड्स में मेगाकारियोसाइट्स से प्लेटलेट्स / प्रो-प्लेटलेट्स की रिहाई)। इसलिए, इन दो डिब्बों का अलग-अलग विश्लेषण करने के लिए केंद्रीय और एंडोस्टोल क्षेत्रों में सेल प्रकारों के लिए समृद्ध करना उपयोगी है। हमने केंद्रीय सेल प्रकारों के लिए समृद्ध करने के लिए डायफिसिस को फ्लश करने और एंडोस्टेल सेल प्रकारों (चित्रा 4 ए) को समृद्ध करने के लिए मेटाफिसिस को कुचलने की एक विधि लागू की। फ्लश (केंद्रीय) और कुचल (एंडोस्टोल) बीएम ऊतक (चित्रा 4 बी) में एबीएमईसी और एसबीएमईसी की मात्रा इस यांत्रिक अलगाव विधि की प्रयोज्यता को मान्य करती है, क्योंकि एबीएमईसी एंडोस्टोल क्षेत्रों में कुख्यात रूप से अधिक प्रचुर मात्रा में हैं, और साइनसोइड केंद्रीय बीएम क्षेत्रों में अधिक बार होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: हेमटोपोइएटिक सेल आबादी का विश्लेषण। प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कुल बीएम में हेमटोपोइएटिक सेल आबादी के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति दिखाने वाले प्रतिनिधि प्लॉट। संक्षेप: एफएससी-एच = फॉरवर्ड स्कैटर - ऊंचाई, एफएससी-ए = फॉरवर्ड स्कैटर - क्षेत्र, लिन = वंश, एलकेएस = लिन- एससीए -1 + सी-किट + हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाएं, एमपीपीएलवाई = मल्टीपोटेंट पूर्वज - लिम्फोइड, एमपीपी जी / एम = मल्टीपोटेंट पूर्वज - ग्रैनुलोसाइट / मैक्रोफेज, एमपीपी एमके / ई = मल्टीपोटेंट पूर्वज - मेगाकैरियोसाइट/ एरिथ्रोसाइट,एमपीपी = मल्टीपोटेंट पूर्वज, एचएससी = हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्ट्रोमल सेल आबादी का विश्लेषण। प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कुल बीएम में स्ट्रोमल कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति दिखाने वाले प्रतिनिधि प्लॉट। संक्षेप: एफएससी-एच = फॉरवर्ड स्कैटर - ऊंचाई, एफएससी-ए = फॉरवर्ड स्कैटर - क्षेत्र, एमएससी = मेसेनकाइमल स्टेम सेल, एलईपीआर = लेप्टिन रिसेप्टर, ईसी = एंडोथेलियल कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एंडोथेलियल कोशिकाओं का विश्लेषण। प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कुल बीएम में ईसीएस के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति दिखाने वाले प्रतिनिधि प्लॉट। संक्षेप: एफएससी-एच = फॉरवर्ड स्कैटर - ऊंचाई, एफएससी-ए = फॉरवर्ड स्कैटर - क्षेत्र, ईसी = एंडोथेलियल कोशिकाएं, एबीएमईसी = धमनी अस्थि मज्जा एंडोथेलियल कोशिकाएं, एसबीएमईसी = साइनसॉइडल अस्थि मज्जा एंडोथेलियल कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: केंद्रीय और एंडोचोरी क्षेत्रों में ईसी आबादी का विश्लेषण । (ए) एक मुराइन लंबी हड्डी के विभिन्न हिस्सों का प्रतिनिधित्व। (बी) एबीएमईसी (कुचल नमूने में समृद्ध) और एसबीएमईसी (फ्लश किए गए नमूने में समृद्ध) में सीडी 31 + एंडोथेलियल कोशिकाओं की आवृत्तियों में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दिखाने वाले प्लॉट। प्रत्येक बिंदु एक माउस (एन = 9) का प्रतिनिधित्व करता है, और नमूने जोड़े जाते हैं। उपयोग किया गया सांख्यिकीय परीक्षण युग्मित टी-परीक्षण था। दो पूंछ वाले पी-मान < 0.0001 को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सेल की आबादी कुल BM में SD (n = 4) ± BM जीवित कोशिकाओं के freq का औसत कुल बीएम में सेल काउंट का औसत एसडी (एन = 4) प्रति फीमर ± एंडोस्टेल बीएम में एसडी (एन = 4) ± बीएम जीवित कोशिकाओं के फ्रीक्यू का औसत। केंद्रीय बीएम में एसडी (एन = 4) ± बीएम जीवित कोशिकाओं के फ्रीक्यू का औसत।
लिन- 3.05 ± 0.13 337610 ± 59414 3.56 ± 0.21 3.53 ± 0.19
LKS 0.096 ± 0.026 10206 ± 1794 0.102 ± 0.025 0.133 ± 0.022
MPPsLy 0.058 ± 0.011 6141 ± 716 0.058 ± 0.011 0.085 ± 0.007
एमपीपीजी / 0.011 ± 0.004 1233 ± 326 0.013 ± 0.003 0.014 ± 0.003
एमपीपीएमके / 0.0010 ± 0.0002 113 ± 21 0.0014 ± 0.0004 0.0012 ± 0.0005
एमपीपी 0.0092 ± 0.0045 940 ± 374 0.0105 ± 0.0048 0.0118 ± 0.0061
एचएससी 0.0054 ± 0.0023 572 ± 191 0.0055 ± 0.0023 0.0059 ± 0.0016

तालिका 1: हेमटोपोइएटिक सेल आबादी के लिए मात्रात्मक डेटा। विभिन्न हेमटोपोइएटिक सेल आबादी की बीएम जीवित कोशिकाओं में आवृत्ति का औसत कुल, एंडोस्टोल, और केंद्रीय बीएम में विश्लेषण किया जाता है और कुल बीएम में प्रति फीमर सेल की गणना की जाती है। डेटा को मानक विचलन (एसडी), एन = 4 ± औसत के रूप में दिखाया गया है।

सेल की आबादी एसडी (एन = 4) ± बीएम जीवित कोशिकाओं के फ्रीक्यू का औसत। सेल काउंट का औसत एसडी (एन = 4) प्रति टिबिया ±
ईसीएस 0.080 ± 0.011 4523 ± 1521
टाइप एच ईसी 0.041 ± 0.006 2299 ± 752
टाइप एल ईसी 0.038 ± 0.005 2103 ± 736
MSCs 0.180 ± 0.048 10270 ± 4282

तालिका 2: स्ट्रोमल सेल आबादी के लिए मात्रात्मक डेटा। कुल बीएम में विश्लेषण किए गए विभिन्न स्ट्रोमल सेल आबादी के लिए बीएम जीवित कोशिकाओं में आवृत्ति और प्रति टिबिया सेल गणना का औसत। डेटा को मानक विचलन (एसडी), एन = 4 ± औसत के रूप में दिखाया गया है।

सेल की आबादी एसडी (एन = 4) ± बीएम जीवित कोशिकाओं के फ्रीक्यू का औसत। सेल काउंट का औसत एसडी (एन = 4) प्रति टिबिया ±
ईसीएस 0.064 ± 0.006 2255 ± 150
aBMECs 0.041 ± 0.010 1419 ± 286
एसबीएमईसी 0.023 ± 0.006 819 ± 250

तालिका 3: एंडोथेलियल सेल आबादी के लिए मात्रात्मक डेटा। बीएम जीवित कोशिकाओं में आवृत्ति का औसत और कुल बीएम में विश्लेषण किए गए विभिन्न एंडोथेलियल सेल आबादी के लिए प्रति टिबिया सेल गणना। डेटा को मानक विचलन (एसडी), एन = 4 ± औसत के रूप में दिखाया गया है।

पूरक तालिका 1: अध्ययन में उपयोग किए गए जानवरों का विवरण। चित्रा 1, चित्रा 2, और चित्रा 3 और तालिका 1, तालिका 2, और तालिका 3 में दिखाए गए डेटा का उत्पादन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों के तनाव, लिंग, आयु और वजन। संक्षिप्त नाम: जी = ग्राम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जबकि वर्णित प्रोटोकॉल सरल और प्रदर्शन करने में आसान है, विशिष्ट चरणों पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, फ्लश ्ड बीएम (चरण 5.2) प्राप्त करते समय, हड्डी के मध्य भाग के अंदर से पीबीएस 2% एफबीएस को पारित करने के लिए इंगित मात्रा या संख्या को पार नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप एंडोस्टोल सेल आबादी द्वारा फ्लश किए गए नमूने का महत्वपूर्ण संदूषण हो सकता है।

जांचकर्ता द्वारा इसके निष्पादन को सुविधाजनक बनाने के लिए प्रोटोकॉल में परिवर्तन किए जा सकते हैं। नमूना निष्कर्षण (खंड 2) में, पैर और / या हड्डियों को नमूना प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए आगे बढ़ने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस 2% एफबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, जब संभव हो तो इस समय को कम से कम किया जाना चाहिए। एचएससी प्राथमिक धुंधला कॉकटेल (चरण 3.10) और द्वितीयक धुंधला कॉकटेल (चरण 3.11) के साथ इनक्यूबेशन के दौरान, जबकि आरटी पर 15 मिनट की इनक्यूबेशन इंगित की जाती है, इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट इनक्यूबेशन के लिए बदला जा सकता है।

स्ट्रोमल प्राइमरी स्टेनिंग कॉकटेल (चरण 4.7), स्ट्रोमल सेकेंडरी स्टेनिंग सॉल्यूशन (चरण 4.8), ईसीएस स्टेनिंग कॉकटेल (चरण 4.12) और एससीसी के लिए एंटीबॉडी वाले इनक्यूबेशन (चरण 6.5) वाले इनक्यूबेशन पर भी यही लागू होता है; जबकि आरटी पर 15 मिनट की इनक्यूबेशन का संकेत दिया गया है, इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट इनक्यूबेशन के लिए आदान-प्रदान किया जा सकता है।

मुराइन लंबी हड्डियों के सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा बीएम अलगाव के लिए एक और प्रोटोकॉल हाल ही मेंवर्णित किया गया था 21. जबकि यह प्रोटोकॉल बीएम कोशिकाओं के तेजी से अलगाव का लाभ प्रस्तुत करता है, यहां वर्णित प्रोटोकॉल हड्डियों के विभिन्न क्षेत्रों में रहने वाली सेल आबादी के विश्लेषण की अनुमति देता है।

वर्तमान विधि की एक विशेष सीमा यह है कि यह पूरी तरह से फ्लो साइटोमेट्री द्वारा फेनोटाइपिक विश्लेषण पर आधारित है। यह एचएससी के मामले में विशेष रूप से प्रासंगिक है, जिसके लिए आगे कार्यात्मक सत्यापन की आवश्यकता होगी। हालांकि, इस विधि को समृद्ध आबादी की छंटाई और दीर्घकालिक पुनर्गठन परख और इन विट्रो कॉलोनी परख ों में इन कोशिकाओं के अध्ययन के साथ जोड़ा जा सकता है।

स्ट्रोमल सेल विश्लेषण के बारे में, विशेष रूप से एमएससी और ईसी में, यह पहले दिखाया गया है कि, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए बीएम प्रसंस्करण के अनुकूलन के बावजूद, कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या ऊतक से अलग नहीं होती है और पूरे-माउंट इमेजिंग19 जैसे अन्य तरीकों की तुलना में इन कोशिकाओं का एक उप-परिमाणीकरण होता है।. फिर भी, फ्लो साइटोमेट्री बीएम ईसी और एमएससी के मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण करने और कार्यात्मक और अभिव्यक्ति परख के लिए उन्हें भावी प्रभाव से अलग करने के लिए बेहद उपयोगी है।

वर्तमान विधि की एक और सीमा एंडोचोरी और केंद्रीय अंशों को अलग करने के लिए एक यांत्रिक तकनीक का उपयोग है, जो कुछ हद तक अनिवार्य रूप से दूसरे डिब्बे से कोशिकाओं द्वारा दूषित होते हैं। फिर भी, प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में बताए गए अनुसार एबीएमईसी और एसबीएमईसी की मात्रा का परिमाणीकरण दर्शाता है कि यांत्रिक अलगाव इन क्षेत्रों में सेल आबादी के लिए समृद्ध करने का एक मजबूत तरीका है।

वर्णित विधि विभिन्न सेटिंग्स और एचएसपीसी के स्ट्रोमल niches में हेमटोपोइजिस के अध्ययन की अनुमति देती है। यहां प्रस्तुत फेनोटाइपिक विश्लेषण विशिष्ट माउस उत्परिवर्ती, अर्थात् ईसी और एमएससी सीआरई लाइनों के साथ संयुक्त होने पर एचएसपीसी आला का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है जो इन आबादी में जीन अभिव्यक्ति के चयनात्मक हेरफेर को सक्षम करते हैं। उदाहरण के लिए, सीडीएच 5 (पीएसी) -सीआरईआरटी 222 और एलईपीआर-सीआरई23 लाइनों का उपयोग क्रमशः ईसी और एमएससी में चुनिंदा जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है। यह विधि स्ट्रोमल कम्पार्टमेंट के साथ-साथ एचएसपीसी पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। संवहनी बीएम आला का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध सीआरई लाइनों की हाल ही में मोओस्टियो एट अल.5 में समीक्षा की गई है। प्रत्यारोपण के बिना एलटी-एचएससी का संभावित अध्ययन मजबूत रिपोर्टर लाइनों की कमी से सीमित हो गया है। हाल ही में वर्णित एमडीएस 1जीएफपी / + एफएलटी 3सीआरई 6 को एलटी-एचएससी के उच्च संवर्धन और एफएलटी 324 को व्यक्त करने वाले डाउनस्ट्रीम पूर्वजों से अच्छे भेदभाव को प्राप्त करने के लिए दिखाया गया है। फ्लो साइटोमेट्री के साथ इस माउस लाइन और अन्य हेमटोपोइएटिक उपभेदों का संयोजन, जैसे वाव-आईसीआरई25, एचएसपीसी के अध्ययन और आला के साथ उनके संबंधों की अनुमति देगा। हेमेटोलॉजिकल विकृतियां अक्सर शुरुआती चरणों से हेमटोपोइजिस के विघटन से जुड़ी होती हैं, जो हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं और स्ट्रोमल आबादी9 की आवृत्तियों के परिवर्तन में परिलक्षित होती हैं जिन्हें हमने यहां स्वस्थ सी 57बीएल / 6 के लिए प्रस्तुत किया है। भविष्य के अध्ययनों को वर्णक्रमीय प्रवाह साइटोमेट्री के आधार पर नए उपकरणों का उपयोग करके वर्णित समान तरीकों के आवेदन का पता लगाना चाहिए जो अधिक मार्करों (एक साथ 30 से ऊपर) के विश्लेषण के माध्यम से अधिक व्यापक फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एलएम को लेडी टाटा मेमोरियल ट्रस्ट से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। जेआर को फंडाको पैरा ए सिएन्सिया ई टेक्नोलोगिया (एफसीटी) से पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था; एफसीटी फैलोशिप यूआई/बीडी/150833/2021)। एमएल को एफसीटी (एफसीटी फैलोशिप 2021.04773.BD) से पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। डीडी को अमेरिकन सोसाइटी ऑफ हेमेटोलॉजी, पाब्लोव फाउंडेशन, एफसीटी (एक्सपीएल / मेड-ओएनसी / 0522/2021), और पुर्तगाली सोसाइटी ऑफ हेमेटोलॉजी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम आई 3 एस में ट्रेसी सुविधा के डॉ कैटरीना मीरेल्स और एमिलिया कार्डोसो के समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody BioLegend 116114
APC Streptavidin BioLegend 405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody BioLegend 105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody BioLegend 103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibody BioLegend 100304
Biotin anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100404
Biotin anti-mouse CD8a antibody BioLegend 100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody BioLegend 108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibody BioLegend 101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody BioLegend 103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody BioLegend 115929
Calibrite 2 Color Beads BD Biosciences 349502
Collagenase IV Merck Life Science C1889
Dispase II Merck Life Science D4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin ThermoFisher Scientific 10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175095
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody R&D systems BAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) ThermoFisher Scientific R37606 DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibody ThermoFisher Scientific 12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135) ThermoFisher Scientific 12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody BioLegend 102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody BioLegend 103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody BioLegend 108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tablets Merck Life Science P4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibody BioLegend 101302
RBC lysis buffer 10x BioLegend 420302
Zombie Violet Fixable Viability Dye BioLegend 423114 fluorescent dye

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References

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वापसी अंक 187
म्यूरिन अस्थि मज्जा हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं और स्ट्रोमल आला कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
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Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L.,… More

Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L., Lopes, M., Duarte, D. Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells. J. Vis. Exp. (187), e64248, doi:10.3791/64248 (2022).

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