Summary
Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.
Abstract
A medula óssea (MC) é o tecido mole encontrado dentro dos ossos onde ocorre principalmente a hematopoiese, processo pelo qual novas células sanguíneas são geradas. Como tal, contém células-tronco hematopoéticas e progenitoras (HSPCs), bem como células estromais de suporte que contribuem para a manutenção e regulação de HSPCs. Hematológicas e outras desordens da MB interrompem a hematopoiese afetando as células hematopoiéticas diretamente e/ou através da alteração do nicho da MB. Aqui, descrevemos um método para estudar hematopoese na saúde e malignidade através da análise fenotípica de BM murinos HSPCs e populações de nicho estromal por citometria de fluxo. Nosso método detalha os passos necessários para enriquecer as células BM nas frações endosteal e central de BM, bem como as estratégias apropriadas de gating para identificar os dois principais tipos celulares de nicho envolvidos na regulação da HSPC, as células endoteliais e as células-tronco mesenquimais. A análise fenotípica aqui proposta pode ser combinada com mutantes de camundongos, modelos de doenças e ensaios funcionais para caracterizar o compartimento HSPC e seu nicho.
Introduction
A citometria de fluxo é um método inestimável para caracterizar e isolar prospectivamente células imunes e hematopoéticas. Também está sendo cada vez mais utilizado para analisar populações estromais e epiteliais de diferentes tecidos. As células-tronco hematopoéticas (CTH) possuem propriedades únicas de auto-renovação e multipotência. Em mamíferos adultos, as CTHs residem principalmente na medula óssea (MO), onde recebem sinais de quiescência e sobrevivência do microambiente ou nicho1 circundante. As HSCs são formalmente definidas de acordo com ensaios funcionais2. No entanto, vários trabalhos marcantes têm mostrado a utilidade da citometria de fluxo na identificação de CTH. Através do uso de marcadores limitados de superfície celular, é possível discriminar populações hematopoéticas altamente enriquecidas emCTH3. A citometria de fluxo é, portanto, um método central no campo das células-tronco. Tem sido extensivamente utilizado para avaliar o impacto de supostos tipos celulares de nicho e fatores de nicho sobre as CTH. Combinando citometria de fluxo com ensaios de imagem e funcionais, demonstrou-se que as HSCs são criticamente suportadas por células-tronco mesenquimais perivasculares (CTMs) e células endoteliais (CE). As CTMs de MO são um grupo heterogêneo e têm diferentes contribuições de citocinas4, mas está bem estabelecido que as CTMs do receptor de leptina (LepR)+ são células-chave de nicho1. As CE de MC também são altamente heterogêneas e podem fazer parte de sinusóides, arteríolas e vasos transicionais tipoH5. Diferentes estudos têm mostrado a contribuição nuançada dessas diferentes CE. Por exemplo, as CE sinusoidais endostesais estão espacialmente mais próximas das CTH quiescentes6, enquanto as CEH não migratórias com menores níveis de espécies reativas de oxigênio estão localizadas próximas às CE arteriolares7. A localização endosteal versus localização central dos nichos também é muito importante. Os vasos endosteais, do tipo H, estão associados a células estromais perivasculares que são perdidas com o envelhecimento, levando à perda deCTHs8. Na leucemia mieloide aguda, as CE centrais são expandidas, enquanto os vasos endostesais e as HSCs endosteteais são perdidos9.
A maioria dos estudos na área tem se concentrado na hematopoese propriamente dita e na regulação extrínseca das CTHs pelas células. No entanto, tem sido cada vez mais reconhecido que há necessidade de melhor caracterizar os nichos que regulam outros progenitores, nomeadamente os progenitores multipotentes (MPPs), particularmente considerando que estes são os principais causadores de hematopoese em estado estacionário10. Em contraste com uma estrutura hierárquica fixa, estudos recentes têm mostrado que a hematopoese é um continuum no qual as HSCs se diferenciam em MPPs tendenciosas em um estágio inicial11. As MPPs têm sido nomeadas a partir de diferentes esquemas declassificação12, mas um recente consenso da sociedade internacional de hematologia experimental (ISEH) propôs que as MPPs sejam discriminadas como MPPs precoces e de acordo com seu viés linfoide (MPP-Ly), megacariocítico e eritroide (MPP-Mk/E) e mieloide (MPP-G/M)13. O uso da citometria de fluxo será fundamental para aprofundar o estudo da importância dos nichos de MC na regulação dessas populações. Os métodos atuais de citometria de fluxo utilizam estratégias de gating variável para diferenciar HSPCs e identificar células estromais, ou seja, CEs, usando marcadores inconsistentes. O objetivo do método atual é apresentar um fluxo de trabalho simples e reprodutível da coloração de MB para identificar subpopulações de HSPC, grupos heterogêneos de CE e CTMs LepR+. Acreditamos que esta técnica, embora comparável com métodos previamente relatados (ver, por exemplo, referência 14), fornece um protocolo atualizado e de fácil implementação para a análise fenotípica de células hematopoéticas nas duas áreas funcionais da medula, BM endosteal e central8,15, bem como de células de nicho estromal da MO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os animais utilizados neste protocolo foram alojados no biotério i3S em condições específicas livres de patógenos, em um ciclo claro-escuro de 12 h e ambiente com temperatura controlada. O acesso gratuito à ração padrão para roedores e água foi fornecido. Todos os animais receberam cuidados humanos de acordo com os critérios delineados pela Federação das Associações Europeias de Zootecnia de Laboratório para o cuidado e manuseio de animais de laboratório (Diretiva UE 2010/63/UE). O procedimento experimental realizado nos animais (eutanásia) foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal do i3S (ref. DD_2019_15) e pela Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Detalhes dos materiais utilizados ao longo deste protocolo podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de soluções e coquetéis corantes
- Solução salina tamponada com fosfato (PBS): Dissolva cinco comprimidos de PBS em 1 L de água destilada. Conservar à temperatura ambiente (TR).
- PBS 2% de soro fetal bovino (FBS): Adicionar 10 mL de FBS a 500 mL de PBS. Conservar a 4 °C.
- Tampão de lise de hemácias (1x): Adicionar 50 mL de tampão de lise de hemácias 10x a 450 mL de água deionizada. Conservar a 4 °C.
- Solução de colagenase IV e dispase II: Dissolver 30 mg de colagenase IV e 60 mg de dispase II em 30 mL de HBSS para uma solução de colagenase IV e 2 mg/mL dispase II. Preparar fresco antes de usar.
- Solução de bloqueio dos receptores Fc: Adicionar 10 μL de anticorpo anti-camundongo CD16/32 purificado a 490 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C até à utilização.
- Solução corante de viabilidade celular fluorescente: Adicionar 2 μL de corante de viabilidade celular fluorescente a 1 mL de PBS. Preparar fresco antes de usar.
- Coquetel de linhagem de biotina: Misture 100 μL de cada um dos seguintes anticorpos: biotina anti-camundongo CD3ε, biotina anti-camundongo CD4, biotina anti-camundongo CD8a, biotina anti-camundongo/humano CD11b, biotina anti-camundongo/humano CD45R/B220, biotina anti-camundongo Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) e biotina anti-camundongo TER-119/células eritroides. Conservar a 4 °C até à utilização.
- Coquetel de coloração primária de CTHs: Adicionar 10 μL de coquetel de linhagem de biotina, 10 μL de CD150 anti-camundongo (SLAM) marcado com imunofluorescência, 10 μL de ficoeritrina (PE) anti-Flk2 de camundongo (CD135), 10 μL de proteína de peridinina-clorofila (PerCP) anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL de CD48 anti-camundongo PE/Cyanine7 e 10 μL de aloficocianina (APC)/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) a 940 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C protegido da luz até à utilização.
- Coquetel de coloração primária do estroma: Adicionar 5 μL de anticorpo biotinilado de leptina R de camundongo, 6,7 μL de anticorpo anti-endomucina de camundongo anti-PE, 10 μL de PerCP anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1), 4 μL de EP/Cyanine7 anti-mouse CD31, 10 μL de APC/Cyanine7 anti-mouse CD45, e 10 μL de APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/células eritroides para 954 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C protegido da luz até à utilização.
- HSCs/solução de coloração secundária estromal: Adicionar 1 μL de estreptavidina APC a 1 mL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C protegido da luz até à utilização.
- Coquetel de coloração CE: Adicionar 10 μL de anticorpo anti-endomucina de camundongo PE, 10 μL de PerCP anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL de PE/Cyanine7 anti-mouse CD31, 10 μL de Alexa Fluor 647 anti-camundongo CD54/ICAM-1, 10 μL de APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 e 10 μL de APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/eritroides a 940 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C protegido da luz até à utilização.
- Solução corante DAPI: Adicionar 1 gota de reagente DAPI a 500 μL de PBS. Preparar fresco antes de usar.
2. Extração da amostra
- Eutanásia do animal por deslocamento cervical (detalhes dos animais utilizados para a produção dos dados apresentados neste estudo podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1). Coloque o animal com a barriga para cima em uma placa de Petri e borrife com etanol 70%. Faça um corte acima do abdômen usando uma tesoura e afaste a pele até os tornozelos.
- Pegue uma perna e, usando uma tesoura, corte em sua parte inferior (onde está a articulação entre a perna e o quadril) para separá-la do animal. Esta etapa servirá também como um método confirmatório secundário da eutanásia. Retire o pé da perna cortando o tornozelo. Coloque a perna em PBS 2% FBS gelado. Se necessário, repita o passo com a outra perna.
- Pegue o osso do quadril e, usando uma tesoura, corte atrás dele para separá-lo do animal. Coloque o osso do quadril em PBS 2% FBS gelado. Se necessário, repita o passo com o outro osso do quadril.
- Coloque a(s) perna(s) e o(s) osso(s) do quadril em uma placa de Petri e, usando um bisturi estéril, limpe os ossos. Separe a tíbia e o fêmur cortando o joelho com o bisturi. Coloque os ossos limpos em PBS 2% FBS gelado.
3. Processamento de amostras para análise de populações de células hematopoéticas na medula óssea total
- Coloque um fêmur ou tíbia em uma argamassa com PBS 2% FBS gelado e esmague o osso pressionando-o suavemente contra a parede da argamassa usando o pilão. As células BM são liberadas na solução contida na argamassa.
- Pipetar a suspensão celular resultante para cima e para baixo usando uma pipeta de 10 mL para homogeneizar e transferir para um tubo de 50 mL através de um filtro de células de 40 μm colocado sobre o tubo.
- Se os ossos esmagados não parecerem brancos neste ponto, adicione mais PBS 2% FBS à argamassa e repita o esmagamento e, em seguida, pipete para cima e para baixo e transfira a solução para o mesmo tubo de 50 mL através do mesmo filtro de células de 40 μm.
- Enxaguar a argamassa com mais um pouco de PBS 2% FBS e transferir a solução para o mesmo tubo de 50 mL através do mesmo filtro celular de 40 μm. Centrifugar o tubo de 50 ml a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C.
- Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 5 mL de tampão de lise eritrocitário (1x) em RT pipetando para cima e para baixo várias vezes. Após uma incubação de 2 minutos em RT, adicionar 15 mL de PBS 2% FBS.
- Centrifugar o tubo de 50 ml a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C. Se a pastilha de célula ainda parecer avermelhada, volte para a etapa 3.5. Caso contrário, descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 200 μL de PBS e transfira a suspensão celular para um poço de uma placa de fundo em V de 96 poços para coloração.
- Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspenda o pellet em 200 μL de solução corante fluorescente. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
- Placa de centrifugação a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspenda o pellet em 200 μL de PBS 2% FBS para lavar.
- Centrifugar a placa a 500 x g por 3 min a 4 °C, descartar o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspender a pastilha em 100 μL de solução de bloqueio dos receptores Fc. Incubar a placa durante 10 min a 4 °C protegida da luz.
- Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g por 3 min a 4 °C, descartar o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspender o pellet em 100 μL de coquetel de coloração primária de CTH. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
- Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante virando a placa para papel absorvente e ressuspender o pellet em 100 μL de solução corante secundária de CTH. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
- Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 minutos a 4 °C e eliminar o sobrenadante virando a placa para papel absorvente.
- Ressuspender o pellet em 250 μL de PBS 2% FBS e transferir a suspensão celular para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de um filtro celular de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.
NOTA: Se estiver interessado em determinar o número absoluto de populações de células hematopoéticas, adicionar contas de calibrite aos tubos de poliestireno antes da análise no citômetro16.
4. Processamento de amostras para análise de populações de células estromais na medula óssea total
- Coloque um fêmur ou tíbia em uma argamassa com PBS 2% FBS gelado e esmague o osso pressionando-o suavemente contra a parede da argamassa usando o pilão. Corte a ponta de uma ponta P1000 com uma tesoura e use-a para transferir todo o conteúdo da argamassa para um tubo de 50 mL (não passe por um filtro de células).
- Centrifugar o tubo de 50 mL a 500 x g por 5 min a 4 °C, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 3 mL de solução de colagenase IV e dispase II. Incubar o tubo a 37 °C durante 40 minutos.
- Completar o tubo para 25 mL com PBS 2% FBS e vórtice para misturar. Transfira o conteúdo do tubo de 50 mL para um novo tubo de 50 mL através de um filtro celular de 100 μm. Adicionar 15 mL de PBS 2% FBS ao antigo tubo de 50 mL e transferir a solução para o mesmo novo tubo de 50 mL através do mesmo filtro celular. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 5 mL de tampão de lise eritrocitário (1x) em RT pipetando para cima e para baixo várias vezes. Após uma incubação de 2 minutos em RT, adicionar 15 mL de PBS 2% FBS.
- Centrifugar o tubo de 50 ml a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C. Se a pastilha de célula ainda parecer avermelhada, volte para a etapa 4.4. Caso contrário, descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 200 μL de PBS 2% FBS e transfira a suspensão celular para um poço de uma placa de fundo em V de 96 poços para coloração. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C.
- Se estiver a realizar a coloração estromal, avance para o passo 4.7. Se estiver a realizar a coloração CE, avance para o passo 4.12.
- Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspenda o pellet em 100 μL de coquetel de coloração primária estromal. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
- Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante virando a placa para papel absorvente e ressuspender o pellet em 100 μL de solução corante secundária estromal. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
- Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente.
- Ressuspender o pellet em 250 μL de PBS 2% FBS e transferir a suspensão celular para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de um filtro celular de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz.
- Imediatamente antes de ir para o citômetro, adicione 35 μL de solução corante DAPI ao tubo contendo a suspensão celular para análise por citometria de fluxo e incube o tubo em RT por 5 min no escuro. Após esta incubação, manter o gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.
- Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspenda o pellet em 100 μL de coquetel de coloração CE. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
- Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente. Ressuspender o pellet em 250 μL de PBS 2% FBS e transferir a suspensão celular para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de um filtro celular de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz.
- Imediatamente antes de ir para o citômetro, adicione 35 μL de solução corante DAPI ao tubo contendo a suspensão celular para análise por citometria de fluxo e incube o tubo em RT por 5 min no escuro. Após esta incubação, manter o gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.
NOTA: Se estiver interessado em determinar os números absolutos das populações de células estromais e endoteliais, adicionar contas de calibrita aos tubos de poliestireno antes da análise no citômetro16.
5. Processamento de amostras para análise de populações de células hematopoéticas em BM triturada e lavada
- Coloque um fêmur em uma placa de Petri e corte as extremidades do osso usando um bisturi estéril.
- Lavar a parte central do osso (diáfise) passando 100 μL de PBS 2% FBS através do interior do osso uma vez de cada lado usando uma seringa de insulina sem volume morto de 0,5 mL e coletando a solução em um tubo de microcentrífuga contendo 1 mL de PBS 2% FBS. Em seguida, transferir a suspensão celular para um tubo de 50 mL marcado como BM lavado contendo 4 mL de PBS 2% FBS. Continue no gelo.
- Coloque as extremidades do osso em uma argamassa com PBS 2% FBS gelada e esmague pressionando-o suavemente contra a parede da argamassa usando o pilão. Pipetar a suspensão celular resultante para cima e para baixo usando uma pipeta de 10 mL para homogeneizar e transferir para um tubo de 50 mL marcado como BM esmagado através de um filtro de células de 40 μm.
- Se o osso triturado não parecer branco neste ponto, adicione mais PBS 2% FBS à argamassa e repita o esmagamento. Em seguida, pipetar para cima e para baixo e transferir a solução para o mesmo tubo de 50 mL (BM triturado) através do mesmo filtro celular de 40 μm.
- Enxaguar a argamassa com mais um pouco de PBS 2% FBS e transferir a solução para o mesmo tubo de 50 mL (BM triturado) através do mesmo filtro celular de 40 μm.
- Centrifugar os tubos de 50 ml correspondentes às amostras lavadas e trituradas a 500 x g durante 3 min a 4 °C.
- Siga os passos 3.5 a 3.13 (secção 3) com as amostras de BM lavadas e trituradas.
6. Preparação de controles unicolores (CCEs) para análise por citometria de fluxo
- Siga os passos 3.1 a 3.6 (secção 3) com um osso extra de um dos animais não utilizados para a análise principal, transferindo a suspensão celular final para um tubo de microcentrífuga contendo 1 ml de PBS 2% FBS em vez de um poço de uma placa de fundo em V de 96 poços.
- Transferir 100 μL da suspensão celular para 8 poços de uma placa de fundo em V de 96 poços, 100 μL para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL contendo 100 μL de PBS 2% FBS marcado como DAPI SCC, e a suspensão celular restante para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL contendo 100 μL de PBS 2% FBS marcado como não corado. Mantenha os tubos sobre gelo protegidos da luz.
- Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C e eliminar os sobrenadantes virando a placa para papel absorvente.
- Ressuspender um pellet em 100 μL de solução corante fluorescente e os demais em 100 μL de PBS 2% FBS.
- Adicionar 0,5 μL dos seguintes anticorpos, além do coquetel de linhagem de anticorpos para o qual adicionar 2 μL e o anticorpo PECy7 CD31 para o qual adicionar 0,3 μL, a cada um dos poços com suspensão celular em PBS 2% FBS (um anticorpo por poço, mesmos anticorpos usados nos painéis de análise principais ou mesmos anticorpos fluoróforos com intensidade de fluorescência e abundância de epítopos semelhantes): coquetel de linhagem de biotina, imunofluorescentemente marcado 510 anti-mouse CD150 (SLAM), PE anti-mouse Flk2 (CD135), PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1), imunofluorescentemente marcado 647 anti-mouse CD54/ICAM-1, PE/Cyanine7 anti-mouse CD48, e APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit). Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
- Adicione 100 μL de PBS 2% FBS a cada poço e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C e eliminar os sobrenadantes virando a placa para papel absorvente.
- Ressuspender todos os pellets, exceto o correspondente às células incubadas com o coquetel de linhagem de anticorpos em 180 μL de PBS 2% FBS e transferir as suspensões celulares para tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de filtros celulares de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.
- Ressuspender as células incubadas com o coquetel de anticorpos da linhagem em 100 μL de HSCs/solução de coloração secundária estromal. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
- Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C.
- Ressuspender o pellet em 180 μL de PBS 2% FBS e transferir a suspensão celular para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de um filtro de células de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.
- Imediatamente antes de ir para o citômetro, adicione 35 μL de solução corante DAPI ao tubo DAPI SCC e incube o tubo em RT por 5 min no escuro. Após esta incubação, manter o gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gráficos representativos da análise por citometria de fluxo de HSCs e MPPs em um camundongo C57Bl/6 adulto jovem saudável são mostrados na Figura 1. A estratégia de gating segue a mais recente nomenclatura harmonizadora proposta pelo ISEH13. Ao analisar o impacto de uma perturbação, como infecção ou câncer, é importante usar um mouse de controle como referência para portões normais. Os controles de fluorescência menos um (FMO) podem ser particularmente úteis para delinear os limites das portas, mas deve-se notar que a configuração cega de limites de portas com base em FMOs pode omitir células-alvo ou incluir células não-alvo. Por exemplo, quanto menor a intensidade do conjunto CD48, maior o enriquecimento para HSCs quiescentes de longa duração17. Além disso, diferentes propriedades de determinadas populações dependem da intensidade de marcadores específicos. Por exemplo, as CTHs que expressam níveis mais elevados de CD150 são mais mieloides18.
As frequências e os números absolutos obtidos na análise das populações de células hematopoéticas aplicadas a um total de quatro animais são apresentados na Tabela 1.
A Figura 2 mostra gráficos representativos da análise por citometria de fluxo de CE e CTMs. A maioria das células hematopoéticas é excluída após uma seleção Ter119/CD45 negativa. As CTMs LepR+ podem então ser prontamente identificadas, enquanto as CE verdadeiras requerem uma seleção subsequente de células Sca-1+. Embora a Sca-1 seja frequentemente usada em estudos de imunofluorescência para marcar especificamente arteríolas, este não é o caso na citometria de fluxo, pois essa técnica é altamente sensível, e as CE sempre expressam um certo (mesmo que baixo) grau de Sca-1 na superfície celular. Ao não selecionar apenas células Sca-1+, outras células não endoteliais seriam incluídas na análise, como as células mieloides que expressam CD31, o que poderia impactar significativamente a quantificação das CEs na MC. As CE podem ser analisadas como uma população inteira ou com base em marcadores específicos que revelam parcialmente sua heterogeneidade. A endomucina associada ao CD31 é muito útil para identificar o endotélio tipo H funcionalmente distinto15 (Figura 2). Além disso, já foi demonstrado que a expressão de ICAM-1 permite a discriminação entre CE arteriolar (aBMECs) e senoidal (sBMECs) (Figura 3)20.
As frequências e os números absolutos obtidos na análise das CTMs e populações de células endoteliais aplicadas a um total de quatro animais são apresentados na Tabela 2 e na Tabela 3.
Embora as áreas funcionais da MO não estejam claramente delineadas em regiões histológicas evidentes, está bem estabelecido que as áreas endostesais de revestimento ósseo e as áreas centrais de MO são enriquecidas em certos tipos celulares e eventos (por exemplo, a liberação de plaquetas/pró-plaquetas de megacariócitos nos sinusóides das áreas centrais de MB). É, portanto, útil enriquecer para tipos celulares em áreas centrais e endosteiais analisar separadamente esses dois compartimentos. Foi aplicado um método de lavagem da diáfise para enriquecer para tipos celulares centrais e esmagamento da metáfise para enriquecer para tipos de células endosteal (Figura 4A). A quantificação de aBMECs e sBMECs em tecido BM lavado (central) e triturado (endosteal) (Figura 4B) valida a aplicabilidade deste método de isolamento mecânico, uma vez que os aBMECs são notoriamente mais abundantes em regiões endosteais, e os sinusóides são mais frequentes em áreas centrais de MB.
Figura 1: Análise das populações de células hematopoéticas. Gráficos representativos mostrando a estratégia de gating para a análise por citometria de fluxo de populações de células hematopoéticas em MB total usando o software fornecido. Abreviações: FSC-H = forward scatter - height, FSC-A = forward scatter - area, Lin = lineage, LKS = Lin- Sca-1+ c-Kit+ células progenitoras hematopoéticas, MPPsLy = progenitores multipotentes - linfoides, MPPs G/M = progenitores multipotentes - granulócitos/macrófagos, MPPsMk/E = progenitores multipotentes - megacariócito/eritrócito, MPPs = progenitores multipotentes, HSCs = células-tronco hematopoéticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise das populações de células estromais. Gráficos representativos mostrando a estratégia de gating para a análise por citometria de fluxo de células estromais em MB total usando o software fornecido. Abreviações: FSC-H = forward scatter - height, FSC-A = forward scatter - area, MSCs = células-tronco mesenquimais, LepR = receptor de leptina, ECs = células endoteliais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise das células endoteliais. Gráficos representativos mostrando a estratégia de gating para a análise por citometria de fluxo de CEs em BM total utilizando o software fornecido. Abreviações: FSC-H = forward scatter - height, FSC-A = forward scatter - area, ECs = células endoteliais, aBMECs = células endoteliais da medula óssea arterial, sBMECs = células endoteliais da medula óssea senoidal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise das populações de CE em áreas centrais e endosteais . (A) Representação das diferentes partes de um osso longo murino. (B) Gráficos mostrando as diferenças estatisticamente significativas nas frequências de células endoteliais CD31+ em aBMECs (enriquecidas na amostra triturada) e sBMECs (enriquecidas na amostra lavada). Cada ponto representa um camundongo (n = 9), e as amostras são emparelhadas. O teste estatístico utilizado foi o teste t pareado. denota valor P bicaudal < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| População celular | Média da frequência de células vivas da MO ± DP (n=4) na MC total | Média da contagem de células ± DP (n=4) por fêmur na MC total | Média da frequência de células vivas da MO ± DP (n=4) na MO endosteal | Média da frequência de células vivas da MO ± DP (n=4) na MO central |
| Lin- | 3,05 ± 0,13 | 337610 ± 59414 | 3,56 ± 0,21 | 3,53 ± 0,19 |
| LKS | 0,096 ± 0,026 | 10206 ± 1794 | 0,102 ± 0,025 | 0,133 ± 0,022 |
| MPPsLy | 0,058 ± 0,011 | 6141 ± 716 | 0,058 ± 0,011 | 0,085 ± 0,007 |
| MPPsG/M | 0,011 ± 0,004 | 1233 ± 326 | 0,013 ± 0,003 | 0,014 ± 0,003 |
| MPPsMk/E | 0,0010 ± 0,0002 | 113 ± 21 | 0,0014 ± 0,0004 | 0,0012 ± 0,0005 |
| MPPs | 0,0092 ± 0,0045 | 940 ± 374 | 0,0105 ± 0,0048 | 0,0118 ± 0,0061 |
| CTHs | 0,0054 ± 0,0023 | 572 ± 191 | 0,0055 ± 0,0023 | 0,0059 ± 0,0016 |
Tabela 1: Dados quantitativos para populações de células hematopoéticas. Média de frequência em células vivas de MO das diferentes populações de células hematopoéticas analisadas em MC total, endosteal e central e contagem de células por fêmur em MC total±.
| População celular | Média de frequência de células vivas MO ± DP (n=4) | Média da contagem de células ± DP (n=4) por tíbia |
| Ecs | 0,080 ± 0,011 | 4523 ± 1521 |
| ECs do tipo H | 0,041 ± 0,006 | 2299 ± 752 |
| CE do tipo L | 0,038 ± 0,005 | 2103 ± 736 |
| CTMs | 0,180 ± 0,048 | 10270 ± 4282 |
Tabela 2: Dados quantitativos para populações de células estromais. Média de frequência em células vivas de MO e contagem de células por tíbia para as diferentes populações de células estromais analisadas em MO total±.
| População celular | Média de frequência de células vivas MO ± DP (n=4) | Média da contagem de células ± DP (n=4) por tíbia |
| Ecs | 0,064 ± 0,006 | 2255 ± 150 |
| aBMECs | 0,041 ± 0,010 | 1419 ± 286 |
| sBMECs | 0,023 ± 0,006 | 819 ± 250 |
Tabela 3: Dados quantitativos para populações de células endoteliais. Média de frequência em células vivas de MO e contagem de células por tíbia para as diferentes populações de células endoteliais analisadas em MO total±.
Tabela Suplementar 1: Detalhes dos animais utilizados no estudo. Cepa, sexo, idade e peso dos animais utilizados para produzir os dados mostrados na Figura 1, Figura 2 e Figura 3 e Tabela 1, Tabela 2 e Tabela 3. Abreviação: g = gramas. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embora o protocolo descrito seja simples e de fácil execução, atenção especial deve ser dada a etapas específicas. Por exemplo, ao se obter BM lavada (passo 5.2), o volume ou o número de vezes indicado para passar PBS 2% FBS pelo interior da parte central do osso não deve ser excedido, pois isso pode resultar em contaminação significativa da amostra lavada por populações de células endosteais.
Alterações no protocolo podem ser feitas para facilitar sua execução pelo pesquisador. Na extracção da amostra (secção 2), as pernas e/ou os ossos podem ser armazenados em PBS 2% FBS a 4 °C até 24 horas antes de procederem ao processamento e análise da amostra. No entanto, esse tempo deve ser minimizado quando possível. Durante a incubação com coquetel de coloração primário (etapa 3.10) e coquetel de coloração secundário (etapa 3.11), enquanto uma incubação de 15 min no TR é indicada, esta pode ser trocada por uma incubação de 30 min a 4 °C.
O mesmo se aplica à incubação com coquetel de coloração primária estromal (passo 4.7), solução de coloração secundária estromal (passo 4.8), coquetel de coloração de CE (passo 4.12) e incubação com anticorpos para CECs (passo 6.5); enquanto uma incubação de 15 min no TR é indicada, esta pode ser trocada por uma incubação de 30 min a 4 °C.
Outro protocolo para isolamento de MC por centrifugação de ossos longos murinos foi recentementedescrito21. Enquanto este protocolo apresenta a vantagem de um isolamento mais rápido das células BM, o protocolo aqui descrito permite a análise de populações celulares residentes em diferentes áreas dos ossos.
Uma limitação particular do método atual é que ele é baseado exclusivamente na análise fenotípica por citometria de fluxo. Isso é particularmente relevante no caso dos HSCs, o que exigiria uma validação funcional adicional. Este método pode, no entanto, ser combinado com a classificação de populações enriquecidas e o estudo dessas células em ensaios de reconstituição de longo prazo e ensaios de colônias in vitro .
Em relação à análise de células estromais, em particular CTMs e CEs, foi demonstrado anteriormente que, apesar da otimização do processamento de BM para análise por citometria de fluxo, um número significativo de células não é isolado do tecido e há uma quantificação subótima dessas células quando comparada com outros métodos, como imagens de montagem total19. No entanto, a citometria de fluxo é extremamente útil para realizar a análise quantitativa e qualitativa de MO CE e CTMs e isolá-las prospectivamente para ensaios funcionais e de expressão.
Outra limitação do método atual é o uso de uma técnica mecânica para separar as frações endosteal e central, que são, em certa medida, inevitavelmente contaminadas por células do outro compartimento. No entanto, a quantificação de aBMECs e sBMECs como explicado na seção de resultados representativos mostra que o isolamento mecânico é um método robusto para enriquecer populações celulares nessas áreas.
O método descrito permite o estudo da hematopoese em diferentes cenários e nichos estromais de HSPCs. A análise fenotípica aqui apresentada pode ser útil para estudar nichos de HSPC quando combinada com mutantes específicos de camundongos, nomeadamente linhagens EC e MSC Cre que permitem a manipulação seletiva da expressão gênica nessas populações. Por exemplo, as linhagens Cdh5(PAC)-CreERT222 e LepR-Cre23 podem ser usadas para induzir a expressão seletiva de certos genes em CE e CTMs, respectivamente. O método é útil para estudar seu impacto no compartimento estromal, bem como nas HSPCs. As linhas de Cre disponíveis para estudar o nicho vascular da MC foram recentemente revisadas em Mosteo et al.5. O estudo prospectivo de CTH-LT sem transplante tem sido limitado pela falta de linhas robustas de reportagem. O recém-descrito Mds1GFP/+Flt3Cre 6 mostrou, no entanto, alto enriquecimento de LT-HSCs e boa discriminação de progenitores a jusante expressando Flt324. A combinação desta linhagem de camundongos com outras cepas hematopoéticas, como o Vav-iCre25, com citometria de fluxo permitirá o estudo das HSPCs e sua relação com o nicho. Neoplasias hematológicas estão frequentemente associadas à ruptura da hematopoese desde os estágios iniciais, o que se reflete na alteração das frequências das células-tronco e progenitoras hematopoéticas e das populaçõesestromais9 que apresentamos para C57Bl/6 saudáveis. Estudos futuros devem explorar a aplicação de métodos semelhantes ao aqui descrito, utilizando novos equipamentos baseados em citometria de fluxo espectral que possibilitem uma caracterização fenotípica mais extensa através da análise de mais marcadores (acima de 30 simultaneamente).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
LM foi apoiado por uma bolsa do Lady Tata Memorial Trust. JR foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; Bolseira FCT UI/BD/150833/2021). O ML foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD foi apoiado por bolsas da Sociedade Americana de Hematologia, da Fundação Pablove, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) e da Sociedade Portuguesa de Hematologia. Agradecemos o apoio da Dra. Catarina Meireles e Emília Cardoso das instalações TRACY no i3s.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
References
- Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
- Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
- Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
- Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
- Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
- Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
- Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
- Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).
