Summary
여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.
Abstract
골수(BM)는 새로운 혈액 세포가 생성되는 과정인 조혈이 주로 발생하는 뼈 내에서 발견되는 연조직입니다. 따라서 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)뿐만 아니라 HSPC의 유지 및 조절에 기여하는 지지 기질 세포를 포함합니다. 혈액학적 및 기타 BM 장애는 조혈 세포에 직접 영향을 미치거나 BM 틈새의 변경을 통해 조혈을 방해합니다. 여기에서는 유세포 분석에 의한 쥐 BM HSPC 및 기질 틈새 집단의 표현형 분석을 통해 건강 및 악성 종양의 조혈을 연구하는 방법을 설명합니다. 우리의 방법은 내피 및 중앙 BM 분획에서 BM 세포를 풍부하게 하는 데 필요한 단계와 HSPC 조절에 관여하는 두 가지 주요 틈새 세포 유형인 내피 세포 및 중간엽 줄기 세포를 식별하기 위한 적절한 게이팅 전략을 자세히 설명합니다. 여기에서 제안된 표현형 분석은 마우스 돌연변이체, 질병 모델 및 기능적 분석과 결합되어 HSPC 구획 및 그 틈새를 특성화할 수 있습니다.
Introduction
유세포 분석은 면역 및 조혈 세포를 특성화하고 전향적으로 분리하는 매우 중요한 방법입니다. 또한 다른 조직의 기질 및 상피 집단을 분석하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 조혈모세포(HSC)는 자가 재생 및 다능성의 고유한 특성을 가지고 있습니다. 성체 포유류에서 HSC는 주로 골수(BM)에 존재하며, 주변 미세환경이나 틈새1로부터 정지 및 생존 신호를 받습니다. HSC는 기능적 분석(functional assays)2에 따라 공식적으로 정의된다. 그럼에도 불구하고 몇몇 획기적인 논문은 HSC를 식별하기 위한 유세포 분석의 유용성을 보여주었습니다. 제한된 세포 표면 마커를 사용함으로써, HSC가 매우 풍부한 조혈 집단을 구별할 수 있다3. 따라서 유세포 분석은 줄기 세포 분야에서 핵심적인 방법입니다. 추정되는 틈새 세포 유형과 틈새 요인이 HSC에 미치는 영향을 평가하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 유세포 분석과 이미징 및 기능 분석을 결합함으로써 HSC는 혈관주위 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 내피 세포(EC)에 의해 결정적으로 뒷받침되는 것으로 나타났습니다. BM 중간엽 줄기세포는 이질적인 그룹이며 사이토카인 기여도가 다르지만4, 렙틴 수용체(lepR)+ 중간엽 줄기세포가 주요 틈새세포라는 것은 잘 알려져 있다1. BM EC는 또한 매우 이질적이며 정현파, 세동맥 및 H형/이행 혈관의 일부가 될 수 있다5. 여러 연구에서 이러한 다양한 EC의 미묘한 기여도를 보여주었습니다. 예를 들어, 내골 정현파 EC는 공간적으로 정지 HSC에 더 가깝고6, 활성 산소종 수치가 낮은 비이동성 HSC는 세동맥 EC7 근처에 위치한다. 틈새의 내막 대 중앙 위치도 매우 중요합니다. H형 혈관은 혈관주위 기질 세포와 연관되어 있으며, 노화와 함께 손실되어 HSC가 손실된다8. 급성 골수성 백혈병에서는 중심 EC가 확장되는 반면, 혈관내막과 혈관내골모세포이식은 소실된다9.
이 분야의 대부분의 연구는 조혈 자체와 HSC에 대한 세포의 외인성 조절에 초점을 맞추었습니다. 그러나 다른 전구체, 즉 만능 전구체(multipotent progentor, MPP)를 조절하는 틈새 물질을 더 잘 특성화할 필요가 있다는 것이 점점 더 인식되고 있으며, 특히 이들이 정상 상태에서 조혈의 주요 동인이라는 점을 고려할 때 더욱 그렇다10. 고정된 계층 구조와는 대조적으로, 최근 연구들은 조혈이 HSC가 초기 단계에서 편향된 MPP로 분화되는 연속체라는 것을 보여주었다11. MPP는 서로 다른 분류 체계의 이름을 따서 명명되었지만12, 국제실험혈액학회(International Society for Experimental Hematology, ISEH)의 최근 합의 논문에서는 MPP를 초기 MPP로 차별하고 림프구(MPP-Ly), 거핵구 및 적혈구(MPP-Mk/E), 골수성(MPP-G/M) 편향에 따라 차별할 것을 제안했다13. 유세포 분석의 사용은 이러한 집단의 조절에서 BM 틈새의 중요성을 추가로 연구하는 데 중요할 것입니다. 현재의 유세포 분석 방법은 가변 게이팅 전략을 사용하여 HSPC를 구별하고 일관되지 않은 마커를 사용하여 기질 세포, 즉 EC를 식별합니다. 현재 방법의 목표는 HSPC 하위 집단, 이질적인 EC 그룹 및 LepR+ MSC를 식별하기 위해 BM 염색의 간단하고 재현 가능한 워크플로우를 제시하는 것입니다. 우리는 이 기술이 이전에 보고된 방법(예: 참고 문헌 14 참조)과 유사하지만 두 가지 기능적 골수 영역인 내골 및 중심 BM 8,15와 BM 간질 틈새 세포에서 조혈 세포의 표현형 분석을 위한 업데이트되고 구현하기 쉬운 프로토콜을 제공한다고 믿습니다.
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Protocol
이 프로토콜에 사용된 동물은 12시간 명암 주기 및 온도 제어 환경에서 특정 병원체가 없는 조건에서 i3S 동물 시설에 수용되었습니다. 표준 설치류 차우와 물에 대한 무료 접근이 제공되었습니다. 모든 동물은 실험실 동물의 관리 및 취급에 대해 유럽 실험실 동물 과학 협회 연맹(EU Directive 2010/63/EU)에서 설명한 기준에 따라 인도적 관리를 받았습니다. 동물에 대해 수행된 실험 절차(안락사)는 i3S 동물 윤리 위원회(ref. DD_2019_15)와 Direção-Geral de Alimentação e Veterinária의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜 전반에 걸쳐 사용되는 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표에서 찾을 수 있습니다.
1. 용액 준비 및 염색 칵테일
- 인산염 완충 식염수(PBS): PBS 정제 5개를 증류수 1L에 녹입니다. 실온(RT)에서 보관하십시오.
- PBS 2% 소 태아 혈청(FBS): PBS 500mL에 FBS 10mL를 추가합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 적혈구(RBC) 용해 완충액(1x): 450mL의 탈이온수에 10x RBC 용해 완충액 50mL를 추가합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 콜라게나제 IV 및 디스파아제 II 용액: 30mg/mL 콜라게나제 IV 및 60mg/mL 디스파아제 II 용액에 대해 HBSS 30mL에 1mg의 콜라게나제 IV와 2mg의 디스파아제 II를 용해합니다. 사용하기 전에 신선하게 준비하십시오.
- Fc 수용체 차단 용액: 정제된 항-마우스 CD16/32 항체 10μL를 PBS 2% FBS 490μL에 추가합니다. 신선하게 또는 전날에 준비하십시오. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
- 형광 세포 생존 염료 염색 용액: 1mL의 PBS에 형광 세포 생존 염료 2μL를 추가합니다. 사용하기 전에 신선하게 준비하십시오.
- 비오틴 계통 칵테일: 비오틴 항-마우스 CD3ε, 비오틴 항-마우스 CD4, 비오틴 항-마우스 CD8a, 비오틴 항-마우스/인간 CD11b, 비오틴 항-마우스/인간 CD45R/B220, 비오틴 항-마우스 Ly-6G/Ly-6C(Gr-1) 및 비오틴 항-마우스 TER-119/적혈구 세포. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
- HSC 1차 염색 칵테일: 10μL의 비오틴 계통 칵테일, 10μL의 면역형광 태그가 지정된 510 항-마우스 CD150(SLAM), 10μL의 피코에리트린(PE) 항-마우스 Flk2(CD135), 10μL의 페리디닌-엽록소-단백질(PerCP) 항-마우스 Ly-6A/E(Sca-1), 10μL의 PE/Cyanine7 항-마우스 CD48 및 10μL의 알로피코시아닌(APC)/시아닌7 항-마우스 CD117(c-kit)을 940μL의 PBS 2% FBS에 추가합니다. 신선하게 또는 전날에 준비하십시오. 사용할 때까지 빛으로부터 보호되는 4 °C에서 보관하십시오.
- 기질 1차 염색 칵테일: 5μL의 마우스 렙틴 R 비오티닐화 항체, 6.7μL의 PE 항-마우스 엔도무신 항체, 10μL의 PerCP 항-마우스 Ly-6A/E(Sca-1), 4μL의 PE/Cyanine7 항-마우스 CD31, 10μL의 APC/Cyanine7 항-마우스 CD45 및 10μL의 APC/Cyanine7 항-마우스 TER-119/적혈구 세포를 954μL의 PBS 2% FBS에 추가합니다. 신선하게 또는 전날에 준비하십시오. 사용할 때까지 빛으로부터 보호되는 4 °C에서 보관하십시오.
- HSCs/stromal 2차 염색 용액: 1μL의 APC 스트렙타비딘을 PBS 2% FBS 1mL에 추가합니다. 신선하게 또는 전날에 준비하십시오. 사용할 때까지 빛으로부터 보호되는 4 °C에서 보관하십시오.
- EC 염색 칵테일: PE 항-마우스 엔도뮤신 항체 10μL, PerCP 항-마우스 Ly-6A/E(Sca-1) 10μL, PE/Cyanine7 항-마우스 CD31 10μL, Alexa Fluor 647 항-마우스 CD54/ICAM-1 10μL, APC/Cyanine7 항-마우스 CD45 10μL, APC/Cyanine7 항-마우스 TER-119/적혈구 세포 10μL를 PBS 2% FBS 940μL에 추가합니다. 신선하게 또는 전날에 준비하십시오. 사용할 때까지 빛으로부터 보호되는 4 °C에서 보관하십시오.
- DAPI 염색 용액: 500μL의 PBS에 DAPI 시약 1방울을 추가합니다. 사용하기 전에 신선하게 준비하십시오.
2. 시료 추출
- 경추 탈구에 의해 동물을 안락사시킵니다(이 연구에서 제시된 데이터를 생성하는 데 사용된 동물의 세부 사항은 보충 표 1에서 찾을 수 있음). 배꼽이 위로 향하게 한 동물을 페트리 접시에 놓고 70 % 에탄올을 뿌립니다. 가위를 사용하여 복부 위를 절개하고 피부를 발목까지 잡아 당깁니다.
- 한쪽 다리를 잡고 가위를 사용하여 바닥 (다리와 엉덩이 사이의 관절이있는 곳)을 잘라 동물과 분리하십시오. 이 단계는 안락사의 2차 확증 방법으로도 사용됩니다. 발목을 잘라 다리에서 발을 떼어냅니다. 다리를 얼음처럼 차가운 PBS 2% FBS에 넣습니다. 필요한 경우 다른 다리로 단계를 반복하십시오.
- 엉덩이 뼈를 잡고 가위를 사용하여 동물과 분리하십시오. 엉덩이 뼈를 얼음처럼 차가운 PBS 2% FBS에 넣습니다. 필요한 경우 다른 엉덩이 뼈로 단계를 반복하십시오.
- 다리와 엉덩이 뼈를 페트리 접시에 넣고 멸균 메스를 사용하여 뼈를 청소합니다. 메스로 무릎을 절단하여 경골과 대퇴골을 분리합니다. 깨끗한 뼈를 얼음처럼 차가운 PBS 2% FBS에 넣습니다.
3. 전체 골수에서 조혈 세포 집단 분석을 위한 샘플 처리
- 얼음처럼 차가운 PBS 2% FBS가 있는 박격포에 대퇴골이나 경골을 넣고 유봉을 사용하여 모르타르 벽에 부드럽게 눌러 뼈를 부수십시오. BM 세포는 모르타르에 들어있는 용액으로 방출됩니다.
- 생성된 세포 현탁액을 10 mL 피펫을 이용하여 상하로 피펫팅하여 균질화하고 튜브 상부에 놓인 40 μm 세포 여과기를 통해 50 mL 튜브로 옮깁니다.
- 이 시점에서 으깬 뼈가 하얗게 보이지 않으면 박격포에 PBS 2% FBS를 더 넣고 분쇄를 반복한 다음 위아래로 피펫을 하고 동일한 40μm 세포 여과기를 통해 동일한 50mL 튜브에 용액을 옮깁니다.
- PBS 2% FBS로 모르타르를 헹구고 동일한 40μm 셀 스트레이너를 통해 동일한 50mL 튜브로 용액을 옮깁니다. 50 mL 튜브를 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 RT에서 5mL의 RBC 용해 완충액(1x)에 세포 펠릿을 여러 번 위아래로 피펫팅하여 재현탁합니다. RT에서 2분 배양한 후 15mL의 PBS 2% FBS를 추가합니다.
- 50 mL 튜브를 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿이 여전히 붉게 보이면 3.5단계로 돌아갑니다. 그렇지 않은 경우 상층액을 버리고 펠렛을 200μL의 PBS에 재현탁한 다음 염색을 위해 세포 현탁액을 96웰 V-바닥판의 웰로 옮깁니다.
- 플레이트를 4°C에서 3분 동안 500 x g 로 원심분리합니다. 플레이트를 흡수성 종이에 뒤집어 상층액을 버리고 200μL의 형광 염료 염색 용액에 펠릿을 재현탁합니다. 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 4°C에서 3분 동안 500 x g 의 원심분리기 플레이트. 플레이트를 흡수지 위에 뒤집어 상청액을 버리고 펠렛을 200 μL의 PBS 2% FBS에 재현탁하여 세척한다.
- 플레이트를 4°C에서 3분 동안 500 x g 에서 원심분리하고, 플레이트를 흡수지 위에 뒤집어 상층액을 버리고, 펠릿을 Fc 수용체 차단 용액 100μL에 재현탁합니다. 플레이트를 빛으로부터 보호되는 4°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- 100 μL의 PBS 2% FBS를 첨가하고 위아래로 몇 번 피펫팅하여 세척합니다. 플레이트를 4°C에서 3분 동안 500 x g 로 원심분리하고, 플레이트를 흡수지 위에 뒤집어 상층액을 버리고, 펠릿을 HSC 1차 염색 칵테일 100μL에 재현탁합니다. 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 100 μL의 PBS 2% FBS를 첨가하고 위아래로 몇 번 피펫팅하여 세척합니다. 플레이트를 4°C에서 3분 동안 500 x g 에서 원심분리하고, 플레이트를 흡수지 위에 뒤집어 상층액을 버리고, 펠릿을 HSCs 2차 염색 용액 100μL에 재현탁합니다. 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 100 μL의 PBS 2% FBS를 첨가하고 위아래로 몇 번 피펫팅하여 세척합니다. 플레이트를 4°C에서 3분 동안 500 x g 에서 원심분리하고 플레이트를 흡수지 위로 뒤집어 상층액을 버립니다.
- 펠릿을 250μL의 PBS 2% FBS에 재현탁하고 세포 현탁액을 40μm 세포 여과기를 통해 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 유세포 분석이 있을 때까지 빛으로부터 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 조혈 세포 집단의 절대 수를 결정하는 데 관심이 있는 경우 세포분석기16에서 분석하기 전에 폴리스티렌 튜브에 Calibrite 비드를 추가합니다.
4. 전체 골수에서 기질 세포 집단 분석을 위한 시료 처리
- 얼음처럼 차가운 PBS 2% FBS가 있는 박격포에 대퇴골이나 경골을 넣고 유봉을 사용하여 모르타르 벽에 부드럽게 눌러 뼈를 부수십시오. 가위를 사용하여 P1000 팁의 끝을 자르고 이를 사용하여 모르타르의 모든 내용물을 50mL 튜브에 옮깁니다(셀 스트레이너를 통과하지 마십시오).
- 50 mL 튜브를 4°C에서 5분 동안 500 x g 로 원심분리하고, 상청액을 버리고, 펠릿을 콜라게나제 IV 및 디스파제 II 용액 3 mL에 재현탁시킨다. 튜브를 37°C에서 40분 동안 배양합니다.
- PBS 2% FBS로 튜브를 25mL로 채우고 볼텍스하여 혼합합니다. 50 mL 튜브의 내용물을 100 μm 셀 스트레이너를 통해 새로운 50 mL 튜브로 옮깁니다. PBS 2% FBS 15mL를 기존 50mL 튜브에 넣고 용액을 동일한 세포 여과기를 통해 동일한 새 50mL 튜브로 옮깁니다. 4 °C에서 5분 동안 500 x g로 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 RT에서 5mL의 RBC 용해 완충액(1x)에 세포 펠릿을 여러 번 위아래로 피펫팅하여 재현탁합니다. RT에서 2분 배양한 후 15mL의 PBS 2% FBS를 추가합니다.
- 50 mL 튜브를 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿이 여전히 붉게 보이면 4.4단계로 돌아갑니다. 그렇지 않은 경우 상층액을 버리고 펠렛을 200μL의 PBS 2% FBS에 재현탁하고 염색을 위해 세포 현탁액을 96웰 V-바닥 플레이트의 웰로 옮깁니다. 플레이트를 4°C에서 3분 동안 500 x g 로 원심분리합니다.
- 기질 염색을 수행하는 경우 4.7단계로 진행합니다. EC 염색을 수행하는 경우 4.12단계로 진행합니다.
- 플레이트를 흡수성 페이퍼로 뒤집어 상층액을 버리고 펠릿을 100μL의 기질 1차 염색 칵테일에 재현탁합니다. 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 100 μL의 PBS 2% FBS를 첨가하고 위아래로 몇 번 피펫팅하여 세척합니다. 플레이트를 4°C에서 3분 동안 500 x g 로 원심분리하고, 플레이트를 흡수지 위에 뒤집어 상층액을 버리고, 펠릿을 100 μL의 기질 2차 염색 용액에 재현탁시킨다. 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 100 μL의 PBS 2% FBS를 첨가하고 위아래로 몇 번 피펫팅하여 세척합니다. 플레이트를 4°C에서 3분 동안 500 x g 로 원심분리합니다. 플레이트를 흡수성 종이에 뒤집어 상청액을 버립니다.
- 펠릿을 250μL의 PBS 2% FBS에 재현탁하고 세포 현탁액을 40μm 세포 여과기를 통해 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
- 세포분석기로 이동하기 직전에 유세포 분석을 위해 세포 현탁액이 들어 있는 튜브에 DAPI 염색 용액 35μL를 추가하고 튜브를 어두운 곳에서 RT에서 5분 동안 배양합니다. 이 배양 후 유세포 분석이 있을 때까지 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
- 플레이트를 흡수성 종이에 뒤집어 상층액을 버리고 펠릿을 100μL의 ECs 염색 칵테일에 재현탁합니다. 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 100 μL의 PBS 2% FBS를 첨가하고 위아래로 몇 번 피펫팅하여 세척합니다. 플레이트를 4°C에서 3분 동안 500 x g 로 원심분리합니다.
- 플레이트를 흡수성 종이에 뒤집어 상청액을 버립니다. 펠릿을 250μL의 PBS 2% FBS에 재현탁하고 세포 현탁액을 40μm 세포 여과기를 통해 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
- 세포분석기로 이동하기 직전에 유세포 분석을 위해 세포 현탁액이 들어 있는 튜브에 DAPI 염색 용액 35μL를 추가하고 튜브를 어두운 곳에서 RT에서 5분 동안 배양합니다. 이 배양 후 유세포 분석이 있을 때까지 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 기질 및 내피 세포 집단의 절대 수를 결정하는 데 관심이 있는 경우 세포분석기16에서 분석하기 전에 폴리스티렌 튜브에 Calibrite 비드를 추가합니다.
5. 분쇄 및 홍조된 BM에서 조혈 세포 집단 분석을 위한 샘플 처리
- 페트리 접시에 대퇴골을 놓고 멸균 메스를 사용하여 뼈 끝을 자릅니다.
- 100 μL의 PBS 2% FBS를 각 측면에서 한 번씩 뼈의 내부를 통해 통과시켜 뼈의 중앙 부분(diaphysis)을 세척하고, 1 mL의 PBS 2% FBS가 들어있는 미세원심분리 튜브에 용액을 수집하여 골의 중앙부(diaphysis)를 세척한다. 이어서, 세포 현탁액을 4 mL의 PBS 2% FBS를 함유하는 플러싱된 BM으로 표지된 50 mL 튜브 내로 옮긴다. 얼음 위에 보관하십시오.
- 얼음처럼 차가운 PBS 2% FBS가 있는 모르타르에 뼈 끝을 넣고 유봉을 사용하여 모르타르 벽에 부드럽게 눌러 으깬다. 생성된 세포 현탁액을 10 mL 피펫을 이용하여 상하로 피펫팅하여 균질화하고, 40 μm 세포 스트레이너를 통해 분쇄된 BM으로 표지된 50 mL 튜브에 옮긴다.
- 이 시점에서 으깬 뼈가 하얗게 보이지 않으면 박격포에 PBS 2% FBS를 더 넣고 분쇄를 반복합니다. 그런 다음 위아래로 피펫을 하고 동일한 40μm 세포 여과기를 통해 동일한 50mL 튜브(분쇄된 BM)로 용액을 옮깁니다.
- 모르타르를 PBS 2% FBS로 헹구고 용액을 동일한 40μm 셀 스트레이너를 통해 동일한 50mL 튜브(분쇄된 BM)로 옮깁니다.
- 세척 및 분쇄된 샘플에 해당하는 50 mL 튜브를 4°C에서 3분 동안 500 x g 에서 원심분리한다.
- 3.5-3.13단계(섹션 3)를 플러시 및 분쇄된 BM 샘플과 함께 수행합니다.
6. 유세포 분석을 위한 단색 대조군(SCC) 준비
- 3.1 내지 3.6단계(섹션 3)에 따라 주 분석에 사용되지 않은 동물 중 하나의 추가 뼈를 사용하여 최종 세포 현탁액을 96웰 V-바닥 플레이트의 웰 대신 PBS 2% FBS 1mL가 들어 있는 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 세포 현탁액 100μL를 96웰 V-바닥 플레이트의 8웰에 옮기고, 100μL를 DAPI SCC로 표지된 PBS 2% FBS 100μL가 포함된 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 옮기고, 나머지 세포 현탁액을 염색되지 않은 것으로 표지된 PBS 2% FBS 100μL가 들어 있는 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 옮깁니다. 튜브를 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
- 플레이트를 4°C에서 3분 동안 500 x g 로 원심분리하고 플레이트를 흡수지 위에 뒤집어 상층액을 버립니다.
- 100 μL의 형광 염료 염색 용액에 하나의 펠릿을 재현탁하고 나머지 100 μL의 PBS 2% FBS에 현탁합니다.
- PBS 2% FBS에 세포 현탁액이 있는 각 웰에 2μL를 추가하는 항체의 계통 칵테일과 0.3μL를 추가하는 PECy7 CD31 항체를 제외하고 다음 항체 0.5μL를 추가합니다(웰당 하나의 항체, 주요 분석 패널에 사용된 동일한 항체 또는 유사한 형광 강도 및 에피토프 풍부도를 갖는 동일한 형광단 항체). 비오틴 계통 칵테일, 면역형광 태그 510 항-마우스 CD150(SLAM), PE 항-마우스 Flk2(CD135), PerCP 항-마우스 Ly-6A/E(Sca-1), 면역형광 태그 647 항-마우스 CD54/ICAM-1, PE/Cyanine7 항-마우스 CD48 및 APC/Cyanine7 항-마우스 CD117(c-kit). 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.
- PBS 2% FBS 100μL를 각 웰에 넣고 위아래로 몇 번 피펫팅하여 세척합니다. 플레이트를 4°C에서 3분 동안 500 x g 로 원심분리하고 플레이트를 흡수지 위에 뒤집어 상층액을 버립니다.
- 항체의 계보 칵테일과 함께 배양된 세포에 해당하는 펠릿을 제외한 모든 펠릿을 180μL의 PBS 2% FBS에 재현탁하고 세포 현탁액을 40μm 세포 스트레이너를 통해 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 유세포 분석이 있을 때까지 빛으로부터 얼음 위에 보관하십시오.
- 항체의 계보 칵테일과 함께 배양된 세포를 100μL의 HSC/기질 2차 염색 용액에 재현탁합니다. 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 100 μL의 PBS 2% FBS를 첨가하고 위아래로 몇 번 피펫팅하여 세척합니다. 플레이트를 4°C에서 3분 동안 500 x g 로 원심분리합니다.
- 펠릿을 PBS 2% FBS 180μL에 재현탁하고 세포 현탁액을 40μm 세포 여과기를 통해 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 유세포 분석이 있을 때까지 빛으로부터 얼음 위에 보관하십시오.
- 세포분석기로 이동하기 직전에 DAPI SCC 튜브에 35μL의 DAPI 염색 용액을 넣고 어두운 곳에서 5분 동안 RT에서 튜브를 배양합니다. 이 배양 후 유세포 분석이 있을 때까지 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
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Representative Results
건강한 젊은 성인 C57Bl/6 마우스에서 HSC 및 MPP의 유세포 분석 분석의 대표적인 플롯이 그림 1에 나와 있습니다. 게이팅 전략은 ISEH13에서 제안한 최신 조화 명명법을 따릅니다. 감염이나 암과 같은 섭동의 영향을 분석할 때 대조군 마우스를 정상 게이트의 기준으로 사용하는 것이 중요합니다. FMO(Fluorescence-minus-one) 제어는 게이트의 경계를 묘사하는 데 특히 유용할 수 있지만, FMO를 기반으로 게이트 한계를 맹목적으로 설정하면 표적 세포를 생략하거나 비표적 세포를 포함할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 예를 들어, CD48 세트의 강도가 낮을수록, 정지 장기 HSCs에 대한 농축이 더 높아진다17. 또한, 특정 모집단의 다른 특성은 특정 마커의 강도에 의존합니다. 예를 들어, 더 높은 CD150 수준을 발현하는 HSC는 더 골수성 편향적이다18.
총 4마리의 동물에 적용된 조혈 세포 집단의 분석에서 얻어진 빈도 및 절대수를 표 1에 제시하였다.
그림 2는 EC 및 MSC의 유세포 분석의 대표적인 플롯을 보여줍니다. 대부분의 조혈 세포는 Ter119/CD45 음성 선택 후 제외됩니다. 그런 다음 LepR+ 중간엽 줄기세포를 쉽게 식별할 수 있는 반면, 실제 EC는 Sca-1+ 세포의 후속 선택이 필요합니다. Sca-1은 세동맥을 특이적으로 표시하기 위해 면역형광 연구에서 자주 사용되지만, 이 기술은 매우 민감하고 EC는 항상 세포 표면에서 특정(낮더라도) 정도의 Sca-1을 발현하기 때문에 유세포 분석에서는 그렇지 않습니다. Sca-1+ 세포만 선택하지 않음으로써, CD31 발현 골수 세포와 같은 다른 비내피 세포가 분석에 포함될 수 있으며, 이는 BM에서 EC의 정량화에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. EC는 전체 모집단으로 분석하거나 이질성을 부분적으로 드러내는 특정 마커를 기반으로 분석할 수 있습니다. CD31과 조합된 엔도뮤신은 기능적으로 구별되는 H형 내피15를 식별하는 데 매우 유용합니다(그림 2). 또한, ICAM-1 발현은 세동맥(aBMEC)과 정현파 EC(sBMEC)를 구별할 수 있는 것으로 이전에 밝혀졌습니다(그림 3)20.
총 4마리의 동물에 적용된 중간엽 줄기세포와 내피 세포 집단의 분석에서 얻어진 빈도 및 절대수를 표 2 및 표 3에 제시하였다.
BM 기능 영역은 명백한 조직학적 영역에서 명확하게 묘사되지 않지만, 뼈 내막 영역과 중앙 BM 영역이 특정 세포 유형 및 사건(예: 중앙 BM 영역의 정현파에 있는 거핵구에서 혈소판/전혈소판 방출)에서 풍부하다는 것은 잘 확립되어 있습니다. 따라서 이 두 구획을 개별적으로 분석하기 위해 중앙 및 내골 영역의 세포 유형을 풍부하게 하는 것이 유용합니다. 우리는 중심 세포 유형을 풍부하게 하기 위해 골반을 플러싱하고 내골 세포 유형을 풍부하게 하기 위해 골반을 분쇄하는 방법을 적용했습니다(그림 4A). 홍조(중앙) 및 분쇄된(내골) BM 조직(그림 4B)에서 aBMEC 및 sBMEC의 정량화는 aBMEC가 내골 영역에서 더 풍부하기로 악명 높고 정현파가 중앙 BM 영역에서 더 빈번하기 때문에 이 기계적 분리 방법의 적용 가능성을 검증합니다.
그림 1: 조혈 세포 집단 분석. 제공된 소프트웨어를 사용하여 전체 BM에서 조혈 세포 집단의 유세포 분석을 위한 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 플롯. 약어: FSC-H = 전방 산란 - 높이, FSC-A = 전방 산란 - 면적, Lin = 혈통, LKS = Lin- Sca-1+ c-Kit+ 조혈 전구 세포, MPPLy = 다능성 전구체 - 림프성, MPPG/M = 다능성 전구체 - 과립구/대식세포, MPPMk/E = 다능성 전구체 - 거핵구/적혈구, MPP = 다능성 전구체, HSC = 조혈 줄기 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 기질 세포 집단 분석. 제공된 소프트웨어를 사용하여 전체 BM에서 기질 세포의 유세포 분석을 위한 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 플롯. 약어: FSC-H = 전방 산란 - 높이, FSC-A = 전방 산란 - 면적, MSCs = 중간엽 줄기 세포, LepR = 렙틴 수용체, EC = 내피 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 내피 세포 분석. 제공된 소프트웨어를 사용하여 전체 BM에서 EC의 유세포 분석을 위한 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 플롯. 약어: FSC-H = 전방 산란 - 높이, FSC-A = 전방 산란 - 면적, ECs = 내피 세포, aBMEC = 동맥 골수 내피 세포, sBMEC = 정현파 골수 내피 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 중앙 및 내골 영역의 EC 개체군 분석 . (A) 쥐 장골의 다른 부분의 표현. (B) aBMEC(분쇄된 샘플에서 농축됨) 및 sBMEC(플러싱된 샘플에서 농축됨)에서 CD31+ 내피 세포의 빈도에서 통계적으로 유의한 차이를 보여주는 플롯. 각 점은 마우스(n = 9)를 나타내며 샘플은 쌍을 이룹니다. 사용된 통계 검정은 쌍체 T-검정이었습니다. 는 양측 P-값 < 0.0001을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 세포 집단 | 주파수의 평균 총 BM에서 SD ± BM 살아있는 세포의 수(n=4) | 총 BM에서 대퇴골당 세포 수 ± SD(n=4)의 평균 | 주파수의 평균 내분비 BM에서 SD ± BM 살아있는 세포의 (n=4) | 주파수의 평균 중앙 BM에서 SD ± BM 살아있는 세포의 수(n=4) |
| 린- | 3.05 ± 0.13 | 337610 ± 59414 | 3.56 ± 0.21 | 3.53 ± 0.19 |
| 증권 시세 표시기 | 0.096 ± 0.026 | 10206 ± 1794 | 0.102 ± 0.025 | 0.133 ± 0.022 |
| MPPsLy | 0.058 ± 0.011 | 6141 ± 716 | 0.058 ± 0.011 | 0.085 ± 0.007 |
| MPPG/M | 0.011 ± 0.004 | 1233 ± 326 | 0.013 ± 0.003 | 0.014 ± 0.003 |
| MPPMk/E | 0.0010 ± 0.0002 | 113 ± 21 | 0.0014 ± 0.0004 | 0.0012 ± 0.0005 |
| MPPs (MPP) | 0.0092 ± 0.0045 | 940 ± 374 | 0.0105 ± 0.0048 | 0.0118 ± 0.0061 |
| HSCs (HSC) | 0.0054 ± 0.0023 | 572 ± 191 | 0.0055 ± 0.0023 | 0.0059 ± 0.0016 |
표 1: 조혈 세포 집단에 대한 정량적 데이터. 전체, 내골 및 중심 BM에서 분석된 상이한 조혈 세포 집단의 BM 살아있는 세포의 빈도 평균 및 총 BM의 대퇴골당 세포 수. 평균 ± 표준 편차(SD), n = 4로 표시된 데이터.
| 세포 집단 | 주파수의 평균 BM 살아있는 세포의 SD ±(n=4) | 경골당 세포 수 ± SD(n=4)의 평균 |
| ECs (이커) | 0.080 ± 0.011 | 4523 ± 1521 |
| 유형 H EC | 0.041 ± 0.006 | 2299 ± 752 |
| 유형 L ECs | 0.038 ± 0.005 | 2103 ± 736 |
| MSCs | 0.180 ± 0.048 | 10270 ± 4282 |
표 2: 기질 세포 집단에 대한 정량적 데이터. BM 살아있는 세포의 빈도 평균 및 전체 BM에서 분석된 다양한 기질 세포 집단에 대한 경골당 세포 수. 평균 ± 표준 편차(SD), n = 4로 표시된 데이터.
| 세포 집단 | 주파수의 평균 BM 살아있는 세포의 SD ±(n=4) | 경골당 세포 수 ± SD(n=4)의 평균 |
| ECs (이커) | 0.064 ± 0.006 | 2255 ± 150 |
| aBMECs (aBMECs) | 0.041 ± 0.010 | 1419 ± 286 |
| sBMEC | 0.023 ± 0.006 | 819 ± 250 |
표 3: 내피 세포 집단에 대한 정량적 데이터. 전체 BM에서 분석된 상이한 내피 세포 집단에 대한 BM 살아있는 세포의 빈도 평균 및 경골당 세포 수. 평균 ± 표준 편차(SD), n = 4로 표시된 데이터.
보충 표 1: 연구에 사용된 동물의 세부 사항. 균주, 성별, 연령 및 체중을 생산하기 위해 사용된 동물의 데이터는 도 1, 도 2, 및 도 3 및 표 1, 표 2 및 표 3에 나타내었다. 약어: g = 그램. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
설명된 프로토콜은 간단하고 수행하기 쉽지만 특정 단계에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 예를 들어, 플러싱된 BM을 얻을 때(단계 5.2), 뼈의 중앙 부분의 내부를 통해 PBS 2% FBS를 통과시키도록 지시된 부피 또는 횟수는 초과되어서는 안 되는데, 이는 내분비 세포 집단에 의해 플러싱된 샘플의 상당한 오염을 초래할 수 있기 때문이다.
조사자의 실행을 용이하게 하기 위해 프로토콜을 변경할 수 있습니다. 샘플 추출(섹션 2)에서 다리 및/또는 뼈는 샘플 처리 및 분석을 진행하기 전에 최대 24시간 동안 4°C의 PBS 2% FBS에 보관할 수 있습니다. 그러나 가능하면 이 시간을 최소화해야 합니다. HSCs 1차 염색 칵테일(단계 3.10) 및 2차 염색 칵테일(단계 3.11)을 사용한 인큐베이션 동안, RT에서 15분 인큐베이션이 지시되는 반면, 이것은 4°C에서 30분 인큐베이션으로 교환될 수 있다.
기질 1차 염색 칵테일(단계 4.7), 기질 2차 염색 용액(단계 4.8), ECs 염색 칵테일(단계 4.12) 및 SCCs에 대한 항체를 사용한 배양(단계 6.5)에도 동일하게 적용됩니다. RT에서 15분 배양이 지시되는 동안, 이것은 4°C에서 30분 배양으로 교환될 수 있다.
쥐 장골의 원심분리에 의한 BM 분리를 위한 또 다른 프로토콜이 최근에 기술되었다21. 이 프로토콜은 BM 세포의 더 빠른 분리의 이점을 제공하지만, 여기에 설명된 프로토콜은 뼈의 다른 영역에 존재하는 세포 집단의 분석을 허용합니다.
현재 방법의 특별한 한계는 유세포 분석에 의한 표현형 분석에만 기초한다는 것입니다. 이는 추가 기능 검증이 필요한 HSC의 경우 특히 관련이 있습니다. 그러나 이 방법은 농축 집단의 분류 및 장기 재구성 분석 및 시험관 내 콜로니 분석에서 이러한 세포의 연구와 결합될 수 있습니다.
기질 세포 분석, 특히 중간엽 줄기세포(MSC) 및 EC와 관련하여, 유세포 분석을 위한 BM 처리의 최적화에도 불구하고 상당한 수의 세포가 조직에서 분리되지 않으며, 전체 마운트 이미징(whole-mount imaging)과 같은 다른 방법과 비교할 때 이러한 세포의 정량화가 최적이 아닌 것으로 나타났다19. 그럼에도 불구하고 유세포 분석은 BM EC 및 MSC의 정량적 및 정성적 분석을 수행하고 기능 및 발현 분석을 위해 전향적으로 분리하는 데 매우 유용합니다.
현재 방법의 또 다른 한계는 내골과 중심 분획을 분리하기 위한 기계적 기술을 사용하는 것인데, 이는 어느 정도 다른 구획의 세포에 의해 필연적으로 오염됩니다. 그럼에도 불구하고, 대표 결과 섹션에 설명된 바와 같이 aBMEC 및 sBMEC의 정량화는 기계적 분리가 이러한 영역에서 세포 집단을 풍부하게 하는 강력한 방법임을 보여줍니다.
설명된 방법은 HSPC의 다양한 설정 및 기질 틈새에서 조혈을 연구할 수 있습니다. 여기에 제시된 표현형 분석은 특정 마우스 돌연변이, 즉 이러한 집단에서 유전자 발현의 선택적 조작을 가능하게 하는 EC 및 MSC Cre 라인과 결합될 때 HSPC 틈새를 연구하는 데 유용할 수 있습니다. 예를 들어, Cdh5(PAC)-CreERT222 및 LepR-Cre23 라인은 각각 EC 및 MSC에서 특정 유전자의 발현을 선택적으로 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 기질 구획 및 HSPC에 미치는 영향을 연구하는 데 유용합니다. 혈관 BM 틈새를 연구하기 위해 사용 가능한 Cre 라인은 최근 Mosteo et al.5에서 검토되었습니다. 이식이 없는 LT-HSC에 대한 전향적 연구는 강력한 리포터 라인의 부족으로 인해 제한되었습니다. 그러나 최근에 기술된 Mds1GFP/+Flt3Cre 6은 LT-HSC의 높은 농축과 Flt324를 발현하는 다운스트림 전구체로부터 우수한 식별을 달성하는 것으로 나타났습니다. 이 마우스 라인과 Vav-iCre25와 같은 다른 조혈 균주를 유세포 분석과 결합하면 HSPC 및 틈새 시장과의 관계를 연구할 수 있습니다. 혈액 악성 종양은 초기 단계부터 조혈 중단과 관련이 있는 경우가 많으며, 이는 조혈 줄기 세포 및 전구 세포와 간질 집단의 빈도 변화9에 반영되어 건강한 C57Bl/6에 대해 여기에서 제시한 것입니다. 향후 연구에서는 더 많은 마커(동시에 30개 이상)의 분석을 통해 보다 광범위한 표현형 특성화를 가능하게 하는 스펙트럼 유세포 분석을 기반으로 하는 새로운 장비를 사용하여 여기에 설명된 것과 유사한 방법의 적용을 탐색해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
LM은 Lady Tata Memorial Trust의 보조금으로 지원되었습니다. JR은 Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT 펠로우십 UI/BD/150833/2021). ML은 FCT (FCT 펠로우십 2021.04773.BD)의 박사 학위 펠로우십의 지원을 받았습니다. DD는 미국 혈액학 학회, Pablove 재단, FCT(EXPL/MED-ONC/0522/2021) 및 포르투갈 혈액학 학회의 보조금으로 지원되었습니다. i3s에 있는 TRACY 시설의 Dr. Catarina Meireles와 Emilia Cardoso의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
References
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