Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Flowcytometrianalyse av murine benmarg hematopoietiske stam- og stamceller og stromale nisjeceller

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64248
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

Summary

Her beskriver vi en enkel protokoll for isolering og farging av murine benmargceller til fenotype hemopoietiske stam- og stamceller sammen med de støttende nisjeendotel- og mesenkymale stamceller. En metode for å berike celler som ligger i endosteale og sentrale benmargsområder er også inkludert.

Abstract

Benmargen (BM) er det myke vevet som finnes i bein hvor hematopoiesis, prosessen der nye blodceller genereres, primært forekommer. Som sådan inneholder den hematopoietiske stam- og stamceller (HSPCs), samt støttende stromale celler som bidrar til vedlikehold og regulering av HSPCer. Hematologiske og andre BM-lidelser forstyrrer hematopoiesis ved å påvirke hematopoietiske celler direkte og / eller gjennom endring av BM-nisjen. Her beskriver vi en metode for å studere hematopoiesen ved helse og malignitet gjennom fenotypisk analyse av murine BM HSPCs og stromale nisjepopulasjoner ved flowcytometri. Vår metode beskriver de nødvendige trinnene for å berike BM-celler i endosteal og sentrale BM-fraksjoner, samt passende gatingstrategier for å identifisere de to viktige nisjecelletyper som er involvert i HSPC-regulering, endotelceller og mesenkymale stamceller. Den fenotypiske analysen som foreslås her, kan kombineres med musemutanter, sykdomsmodeller og funksjonelle analyser for å karakterisere HSPC-rommet og dets nisje.

Introduction

Flowcytometri er en uvurderlig metode for å karakterisere og prospektivt isolere immun- og hematopoietiske celler. Det blir også i økende grad brukt til å analysere stromale og epitelpopulasjoner av forskjellige vev. Den hematopoietiske stamcellen (HSC) har unike egenskaper av selvfornyelse og multipotens. Hos voksne pattedyr bor HSC primært i benmargen (BM), hvor de mottar ro- og overlevelsessignaler fra det omkringliggende mikromiljøet eller nisje1. HSC er formelt definert i henhold til funksjonsanalyser2. Likevel har flere banebrytende artikler vist nytten av flowcytometri for å identifisere HSC-er. Ved bruk av begrensede celleoverflatemarkører er det mulig å diskriminere hematopoietiske populasjoner som er svært beriket i HSCs3. Flowcytometri er derfor en sentral metode i stamcellefeltet. Det har blitt mye brukt til å evaluere virkningen av antatte nisjecelletyper og nisjefaktorer på HSC. Ved å kombinere flowcytometri med avbildning og funksjonelle analyser, har det vist seg at HSC støttes kritisk av perivaskulære mesenkymale stamceller (MSC) og endotelceller (EC). BM MSC er en heterogen gruppe og har forskjellige cytokinbidrag4, men det er veletablert at leptinreseptor (LepR) + MSC er viktige nisjeceller1. BM EC er også svært heterogen og kan være en del av sinusoider, arterioler og type H / overgangskar5. Ulike studier har vist det nyanserte bidraget fra disse ulike EC-ene. For eksempel er endosteal sinusformede EC romlig nærmere hvilende HSC6, mens ikke-migrerende HSC med lavere nivåer av reaktive oksygenarter ligger nær arteriolære ECs7. Den endosteal versus sentrale plasseringen av nisjer er også svært viktig. Endosteal type H-kar er assosiert med perivaskulære stromale celler som går tapt med aldring, noe som fører til tap av HSCs8. Ved akutt myelogen leukemi utvides sentrale e-KREFTER, mens endostealkar og endosteal HSC går tapt9.

De fleste studier på feltet har fokusert på selve hematopoiesen og på cellens ytre regulering av HSC. Det har imidlertid blitt stadig mer anerkjent at det er behov for å bedre karakterisere nisjene som regulerer andre forfedre, nemlig multipotente progenitorer (MPP), spesielt med tanke på at de er de viktigste driverne for hematopoiesis i steady state10. I motsetning til en fast hierarkisk struktur har nyere studier vist at hematopoiesis er et kontinuum der HSC skiller seg ut i partiske MPP på et tidlig stadium11. MPPer har blitt oppkalt etter forskjellige klassifikasjonssystemer12, men en nylig konsensusartikkel fra International Society for Experimental Hematology (ISEH) foreslo at MPPer skulle diskrimineres som tidlige MPPer og i henhold til deres lymfoide (MPP-Ly), megakaryocytiske og erytroide (MPP-Mk / E) og myeloide (MPP-G / M) bias13. Bruk av flowcytometri vil være avgjørende for videre studier av betydningen av BM-nisjer i reguleringen av disse populasjonene. Nåværende flowcytometrimetoder bruker variable gating-strategier for å differensiere HSPCer og identifisere stromale celler, nemlig ECs, ved hjelp av inkonsistente markører. Målet med den nåværende metoden er å presentere en enkel og reproduserbar arbeidsflyt for BM-farging for å identifisere HSPC-underpopulasjoner, heterogene grupper av EC og LepR + MSC. Vi tror at denne teknikken, selv om den er sammenlignbar med tidligere rapporterte metoder (se for eksempel referanse 14), gir en oppdatert og lett å implementere protokoll for fenotypisk analyse av hematopoietiske celler i de to funksjonelle margområdene, endosteal og sentral BM 8,15, samt BM stromale nisjeceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrene som ble brukt i denne protokollen ble plassert på i3S dyreavdeling under spesifikke patogenfrie forhold i en 12 timers lys-mørk syklus og temperaturkontrollert miljø. Fri tilgang til standard gnager chow og vann ble gitt. Alle dyrene fikk human omsorg i henhold til kriteriene skissert av Federation of European Laboratory Animal Science Associations for omsorg og håndtering av forsøksdyr (EU-direktiv 2010/63 / EU). Den eksperimentelle prosedyren som ble utført på dyrene (eutanasi) ble godkjent av i3S Animal Ethics Committee (ref. DD_2019_15) og Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Detaljer om materialene som brukes i denne protokollen finnes i materialfortegnelsen.

1. Tilberedning av løsninger og farging av cocktailer

  1. Fosfatbufret saltvann (PBS): Løs opp fem PBS-tabletter i 1 liter destillert vann. Oppbevares i romtemperatur (RT).
  2. PBS 2% føtal bovint serum (FBS): Tilsett 10 ml FBS til 500 ml PBS. Oppbevares ved 4 °C.
  3. Røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer (1x): Tilsett 50 ml 10x RBC lysisbuffer til 450 ml avionisert vann. Oppbevares ved 4 °C.
  4. Kollagenase IV og dispase II oppløsning: Løs opp 30 mg kollagenase IV og 60 mg dispase II i 30 ml HBSS for en 1 mg / ml kollagenase IV og 2 mg / ml dispase II oppløsning. Forbered fersk før bruk.
  5. Fc-reseptorblokkerende løsning: Tilsett 10 μL renset anti-mus CD16/32 antistoff til 490 μL PBS 2% FBS. Forbered deg fersk eller dagen før. Oppbevares ved 4 °C inntil bruk.
  6. Fluorescerende celle levedyktighet fargestoff fargeløsning: Tilsett 2 μL fluorescerende celle levedyktighet fargestoff til 1 ml PBS. Forbered fersk før bruk.
  7. Biotin avstamning cocktail: Bland 100 μL av hvert av følgende antistoffer: biotin anti-mus CD3ε, biotin anti-mus CD4, biotin anti-mus CD8a, biotin anti-mus / human CD11b, biotin anti-mus / human CD45R / B220, biotin anti-mus Ly-6G / Ly-6C (Gr-1), og biotin anti-mus TER-119 / erytroide celler. Oppbevares ved 4 °C inntil bruk.
  8. HSCs primære fargingscocktail: Tilsett 10 μL biotinavstamningscocktail, 10 μL immunfluorescerende merket 510 anti-mus CD150 (SLAM), 10 μL phycoerythrin (PE) anti-mus Flk2 (CD135), 10 μL peridinin-klorofyllprotein (PerCP) anti-mus Ly-6A / E (Sca-1), 10 μL PE / Cyanine7 anti-mus CD48 og 10 μL allophycocyanin (APC) / Cyanine7 anti-mus CD117 (c-kit) til 940 μL PBS 2% FBS. Forbered deg fersk eller dagen før. Oppbevares ved 4 °C, beskyttet mot lys inntil bruk.
  9. Stromal primærfarging cocktail: Legg til 5 μL av mus leptin R biotinylert antistoff, 6,7 μL av PE anti-mus endomucin antistoff, 10 μL av PerCP anti-mus Ly-6A / E (Sca-1), 4 μL av PE / Cyanine7 anti-mus CD31, 10 μL av APC / Cyanine7 anti-mus CD45, og 10 μL av APC / Cyanine7 anti-mus TER-119 / erytroide celler til 954 μL av PBS 2% FBS. Forbered deg fersk eller dagen før. Oppbevares ved 4 °C, beskyttet mot lys inntil bruk.
  10. HSCS / stromal sekundærfargeløsning: Tilsett 1 μL APC streptavidin til 1 ml PBS 2% FBS. Forbered deg fersk eller dagen før. Oppbevares ved 4 °C, beskyttet mot lys inntil bruk.
  11. ECs farging cocktail: Tilsett 10 μL PE anti-mus endomucin antistoff, 10 μL PerCP anti-mus Ly-6A / E (Sca-1), 10 μL av PE / Cyanine7 anti-mus CD31, 10 μL Alexa Fluor 647 anti-mus CD54 / ICAM-1, 10 μL APC / Cyanine7 anti-mus CD45 og 10 μL APC / Cyanine7 anti-mus TER-119 / erytroide celler til 940 μL PBS 2% FBS. Forbered deg fersk eller dagen før. Oppbevares ved 4 °C, beskyttet mot lys inntil bruk.
  12. DAPI-fargeløsning: Tilsett 1 dråpe DAPI-reagens til 500 μL PBS. Forbered fersk før bruk.

2. Prøveutvinning

  1. Avliving av dyret ved cervikal luksasjon (detaljer om dyrene som ble brukt til å produsere dataene som presenteres i denne studien, finnes i tilleggstabell 1). Legg dyret med magen opp på en petriskål og spray med 70% etanol. Lag et kutt over magen med saks og trekk bort huden helt til anklene.
  2. Ta tak i ett ben og, ved hjelp av saks, kutt på bunnen (hvor leddet mellom benet og hoften er) for å skille det fra dyret. Dette trinnet vil også tjene som en sekundær bekreftende metode for eutanasi. Fjern foten fra beinet ved å kutte i ankelen. Plasser benet i iskald PBS 2% FBS. Gjenta om nødvendig trinnet med det andre benet.
  3. Ta tak i hoftebenet, og bruk saks kuttet bak det for å skille det fra dyret. Plasser hoftebenet i iskald PBS 2% FBS. Gjenta om nødvendig trinnet med det andre hoftebenet.
  4. Legg benet (e) og hoftebenet (e) i en petriskål, og rengjør beinene ved hjelp av en steril skalpell. Separat tibia og lårben ved å kutte i kneet med skalpellen. Plasser de rene beinene i iskald PBS 2% FBS.

3. Prøvebehandling for analyse av hematopoietiske cellepopulasjoner i total benmarg

  1. Legg et lårben eller tibia i en mørtel med iskald PBS 2% FBS og knus beinet ved å trykke det forsiktig mot veggen av mørtelen ved hjelp av pestle. BM-celler slippes ut i løsningen inneholdt i mørtelen.
  2. Pipetter den resulterende cellesuspensjonen opp og ned ved hjelp av en 10 ml pipette for å homogenisere og overføre til et 50 ml rør gjennom en 40 μm cellesil plassert på toppen av røret.
  3. Hvis de knuste beinene ikke ser hvite ut på dette tidspunktet, tilsett mer PBS 2% FBS i mørtelen og gjenta knusingen, og pipett deretter opp og ned og overfør løsningen til det samme 50 ml røret gjennom den samme 40 μm cellesilen.
  4. Skyll mørtelen med litt mer PBS 2% FBS og overfør oppløsningen til det samme 50 ml røret gjennom den samme 40 μm cellesilen. Sentrifuger 50 ml røret ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  5. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 ml RBC-lysebuffer (1x) ved RT ved å pipettere opp og ned flere ganger. Etter en 2 min inkubasjon ved RT, legg til 15 ml PBS 2% FBS.
  6. Sentrifuger 50 ml røret ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Hvis cellepelleten fortsatt ser rødlig ut, går du tilbake til trinn 3.5. Hvis ikke, kast supernatanten, resuspender pelleten i 200 μL PBS, og overfør cellesuspensjonen til en brønn med en 96-brønns V-bunnplate for farging.
  7. Sentrifuger platen ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten ved å vippe platen på absorberende papir og resuspender pelleten i 200 mikroliter fluorescerende fargestofffargeløsning. Inkuber platen i 15 min ved RT i mørket.
  8. Sentrifugeplate ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten ved å vippe platen på absorberende papir og resuspender pelleten i 200 mikrol PBS 2% FBS for å vaske.
  9. Sentrifuger platen ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C, kast supernatanten ved å vippe platen på absorberende papir og resuspender pelleten i 100 mikrol Fc-reseptorblokkerende oppløsning. Inkuber platen i 10 minutter ved 4 °C, beskyttet mot lys.
  10. Tilsett 100 μL PBS 2% FBS og pipette opp og ned et par ganger for å vaske. Sentrifuger platen ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C, kast supernatanten ved å vippe platen på absorberende papir, og resuspender pelleten i 100 mikrol HSCs primære fargecocktail. Inkuber platen i 15 min ved RT i mørket.
  11. Tilsett 100 μL PBS 2% FBS og pipette opp og ned et par ganger for å vaske. Sentrifuger platen ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C, kast supernatanten ved å vippe platen på absorberende papir, og resuspender pelleten i 100 mikrol HSCs sekundærfargeløsning. Inkuber platen i 15 min ved RT i mørket.
  12. Tilsett 100 μL PBS 2% FBS og pipette opp og ned et par ganger for å vaske. Sentrifuger platen ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C og kast supernatanten ved å vippe platen på absorberende papir.
  13. Resuspender pelleten i 250 μL PBS 2% FBS og overfør cellesuspensjonen til et 5 ml polystyren rundbunnsrør gjennom en 40 μm cellesil. Oppbevares på is beskyttet mot lys inntil flowcytometrianalyse.
    MERK: Hvis du er interessert i å bestemme det absolutte antall hematopoietiske cellepopulasjoner, legg Calibrite Perler til polystyrenrørene før analyse i cytometer16.

4. Prøvebehandling for analyse av stromale cellepopulasjoner i total benmarg

  1. Legg et lårben eller tibia i en mørtel med iskald PBS 2% FBS og knus beinet ved å trykke det forsiktig mot veggen av mørtelen ved hjelp av pestle. Klipp spissen av en P1000-spiss med en saks og bruk den til å overføre alt innholdet i mørtelen til et 50 ml rør (ikke pass gjennom en cellesil).
  2. Sentrifuger 50 ml røret ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C, kast supernatanten og resuspender pelleten i 3 ml kollagenase IV og dispase II-oppløsning. Inkuber røret ved 37 °C i 40 minutter.
  3. Fyll på røret til 25 ml med PBS 2% FBS og virvel for å blande. Overfør innholdet i 50 ml røret til et nytt 50 ml rør gjennom en 100 μm cellesil. Tilsett 15 ml PBS 2% FBS til det gamle 50 ml røret og overfør løsningen til det samme nye 50 ml røret gjennom samme cellesil. Sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  4. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 ml RBC-lysebuffer (1x) ved RT ved å pipettere opp og ned flere ganger. Etter en 2 min inkubasjon ved RT, legg til 15 ml PBS 2% FBS.
  5. Sentrifuger 50 ml røret ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Hvis cellepelleten fortsatt ser rødlig ut, går du tilbake til trinn 4.4. Hvis ikke, kast supernatanten, resuspender pelleten i 200 μL PBS 2% FBS, og overfør cellesuspensjonen til en brønn på en 96-brønns V-bunnplate for farging. Sentrifuger platen ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C.
  6. Hvis du utfører stromal farging, fortsett til trinn 4.7. Hvis du utfører EC-farging, fortsett til trinn 4.12.
  7. Kast supernatanten ved å snu platen på absorberende papir og resuspender pelleten i 100 mikrol stromal primærfargingscocktail. Inkuber platen i 15 min ved RT i mørket.
  8. Tilsett 100 μL PBS 2% FBS og pipette opp og ned et par ganger for å vaske. Sentrifuger platen ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C, kast supernatanten ved å vippe platen på absorberende papir og resuspender pelleten i 100 mikrol stromale sekundærfargeoppløsning. Inkuber platen i 15 min ved RT i mørket.
  9. Tilsett 100 μL PBS 2% FBS og pipette opp og ned et par ganger for å vaske. Sentrifuger platen ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten ved å vippe platen på absorberende papir.
  10. Resuspender pelleten i 250 μL PBS 2% FBS og overfør cellesuspensjonen til et 5 ml polystyren rundbunnsrør gjennom en 40 μm cellesil. Hold isen beskyttet mot lys.
  11. Like før du går til cytometeret, tilsett 35 μL DAPI-fargeløsning til røret som inneholder cellesuspensjonen for flowcytometrianalyse og inkuber røret ved RT i 5 minutter i mørket. Etter denne inkubasjonen, hold isen beskyttet mot lys til flowcytometrianalyse.
  12. Kast supernatanten ved å vippe platen på absorberende papir og resuspender pelleten i 100 mikrol ECs fargecocktail. Inkuber platen i 15 min ved RT i mørket.
  13. Tilsett 100 μL PBS 2% FBS og pipette opp og ned et par ganger for å vaske. Sentrifuger platen ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C.
  14. Kast supernatanten ved å vippe platen på absorberende papir. Resuspender pelleten i 250 μL PBS 2% FBS og overfør cellesuspensjonen til et 5 ml polystyren rundbunnsrør gjennom en 40 μm cellesil. Hold isen beskyttet mot lys.
  15. Like før du går til cytometeret, tilsett 35 μL DAPI-fargeløsning til røret som inneholder cellesuspensjonen for flowcytometrianalyse og inkuber røret ved RT i 5 minutter i mørket. Etter denne inkubasjonen, hold isen beskyttet mot lys til flowcytometrianalyse.
    MERK: Hvis du er interessert i å bestemme det absolutte antall stromale og endotelcellepopulasjoner, legg Calibrite Perler til polystyrenrørene før analyse i cytometer16.

5. Prøvebehandling for analyse av hematopoietiske cellepopulasjoner i knust og spylt BM

  1. Legg et lårben på en petriskål og kutt endene av beinet ved hjelp av en steril skalpell.
  2. Skyll den sentrale delen av benet (diafysen) ved å føre 100 μL PBS 2% FBS gjennom innsiden av beinet en gang fra hver side ved hjelp av en insulinsprøyte uten dødvolum 0,5 ml og samle oppløsningen i et mikrosentrifugerør inneholdende 1 ml PBS 2% FBS. Deretter overføres cellesuspensjonen til et 50 ml rør merket som skyllet BM inneholdende 4 ml PBS 2% FBS. Hold på is.
  3. Plasser endene av beinet i en mørtel med iskald PBS 2% FBS og knus ved å trykke den forsiktig mot mørtelveggen ved hjelp av pestle. Pipetter den resulterende cellesuspensjonen opp og ned ved hjelp av en 10 ml pipette for å homogenisere og overføre til et 50 ml rør merket som knust BM gjennom en 40 μm cellesil.
  4. Hvis det knuste beinet ikke ser hvitt ut på dette tidspunktet, tilsett mer PBS 2% FBS i mørtelen og gjenta knusingen. Deretter pipetterer du opp og ned og overfører oppløsningen til det samme 50 ml røret (knust BM) gjennom den samme 40 μm cellesilen.
  5. Skyll mørtelen med litt mer PBS 2% FBS og overfør oppløsningen til det samme 50 ml røret (knust BM) gjennom den samme 40 μm cellesilen.
  6. Sentrifuger 50 ml rørene som tilsvarer de spylte og knuste prøvene ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C.
  7. Følg trinn 3.5 til 3.13 (avsnitt 3) med de spylte og knuste BM-prøvene.

6. Utarbeidelse av enkeltfargekontroller (SCC) for flowcytometrianalyse

  1. Følg trinn 3.1 til 3.6 (avsnitt 3) med et ekstra ben fra et av dyrene som ikke ble brukt til hovedanalysen, og overfør den endelige cellesuspensjonen til et mikrosentrifugerør inneholdende 1 ml PBS 2% FBS i stedet for en brønn med en 96-brønns V-bunnplate.
  2. Overfør 100 μL av cellesuspensjonen til 8 brønner med en 96-brønns V-bunnplate, 100 μL til et 5 ml polystyren rundbunnsrør inneholdende 100 μL PBS 2% FBS merket som DAPI SCC, og den gjenværende cellesuspensjonen til et 5 ml polystyren rundbunnsrør inneholdende 100 μL PBS 2% FBS merket som ufarget. Hold rørene på is beskyttet mot lys.
  3. Sentrifuger platen ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C og kast supernatantene ved å vippe platen på absorberende papir.
  4. Suspender en pellet i 100 μL fluorescerende fargestoffløsning og de resterende i 100 μL PBS 2% FBS.
  5. Legg til 0,5 μL av følgende antistoffer, bortsett fra avstamningscocktailen av antistoffer som tilsetter 2 μL og PECy7 CD31-antistoffet som tilsetter 0,3 μL, til hver av brønnene med cellesuspensjon i PBS 2% FBS (ett antistoff per brønn, samme antistoffer som brukes i hovedanalysepanelene eller samme fluoroforantistoffer med lignende fluorescensintensitet og epitopmengde): biotin avstamning cocktail, immunfluorescerende merket 510 anti-mus CD150 (SLAM), PE anti-mus Flk2 (CD135), PerCP anti-mus Ly-6A / E (Sca-1), immunfluorescerende merket 647 anti-mus CD54 / ICAM-1, PE / Cyanine7 anti-mus CD48, og APC / Cyanine7 anti-mus CD117 (c-kit). Inkuber platen i 15 min ved RT i mørket.
  6. Tilsett 100 μL PBS 2% FBS i hver brønn og pipett opp og ned noen ganger for å vaske. Sentrifuger platen ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C og kast supernatantene ved å vippe platen på absorberende papir.
  7. Resuspender alle pellets bortsett fra den som tilsvarer cellene inkubert med avstamningscocktailen av antistoffer i 180 μL PBS 2% FBS og overfør cellesuspensjonene til 5 ml polystyren rundbunnsrør gjennom 40 μm cellesiler. Oppbevares på is beskyttet mot lys inntil flowcytometrianalyse.
  8. Resuspender cellene som inkuberes med avstamningscocktailen av antistoffer i 100 μL HSC / stromale sekundærfargeløsning. Inkuber platen i 15 min ved RT i mørket.
  9. Tilsett 100 μL PBS 2% FBS og pipette opp og ned et par ganger for å vaske. Sentrifuger platen ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C.
  10. Resuspender pelleten i 180 μL PBS 2% FBS og overfør cellesuspensjonen til et 5 ml polystyren rundbunnsrør gjennom en 40 μm cellesil. Oppbevares på is beskyttet mot lys inntil flowcytometrianalyse.
  11. Like før du går til cytometeret, tilsett 35 μL DAPI-fargeløsning til DAPI SCC-røret og inkuber røret ved RT i 5 minutter i mørket. Etter denne inkubasjonen, hold isen beskyttet mot lys til flowcytometrianalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative plott av flowcytometrianalyse av HSC og MPP hos en frisk ung voksen C57Bl/6-mus er vist i figur 1. Gating-strategien følger den siste harmoniserende nomenklaturen foreslått av ISEH13. Når du analyserer virkningen av en forstyrrelse, for eksempel infeksjon eller kreft, er det viktig å bruke en kontrollmus som referanse for normale porter. Fluorescens-minus-one (FMO) kontroller kan være spesielt nyttige for å avgrense grensene til portene, men det bør bemerkes at blindt å sette opp portgrenser basert på FMOer kan utelate målceller eller inkludere ikke-målceller. For eksempel, jo lavere intensiteten til CD48-settet, desto høyere er anrikningen for hvilende langvarige HSC-er17. Videre er forskjellige egenskaper hos visse populasjoner avhengige av intensiteten til spesifikke markører. For eksempel er HSC-er som uttrykker høyere CD150-nivåer mer myeloid-partisk18.

Frekvensene og absolutte tall oppnådd i analysen av hematopoietiske cellepopulasjoner anvendt på totalt fire dyr er presentert i tabell 1.

Figur 2 viser representative plott av flowcytometrianalyse av EC og MSC. De fleste hematopoietiske celler ekskluderes etter negativt Ter119/CD45-seleksjon. LepR + MSCs kan da lett identifiseres, mens ekte ECs krever et påfølgende utvalg av Sca-1 + celler. Mens Sca-1 ofte brukes i immunfluorescensstudier for å spesifikt merke arterioler, er dette ikke tilfelle i flowcytometri, da denne teknikken er svært følsom, og ECs uttrykker alltid en viss (selv om lav) grad av Sca-1 på celleoverflaten. Ved ikke å velge bare Sca-1 + celler, vil andre ikke-endotelceller bli inkludert i analysen, for eksempel CD31-uttrykkende myeloide celler, noe som kan påvirke kvantifiseringen av ECs i BM betydelig. ECs kan analyseres som en hel befolkning eller basert på spesifikke markører som delvis avslører deres heterogenitet. Endomucin i kombinasjon med CD31 er svært nyttig for å identifisere det funksjonelt distinkte type H-endotelet15 (figur 2). Videre er det tidligere vist at ICAM-1-uttrykk tillater diskriminering mellom arteriolære (aBMECs) og sinusformede ECs (sBMECs) (figur 3)20.

Frekvensene og absolutte tall oppnådd i analysen av MSC og endotelcellepopulasjoner anvendt på totalt fire dyr er presentert i tabell 2 og tabell 3.

Selv om BM-funksjonelle områder ikke er klart avgrenset i tydelige histologiske regioner, er det veletablert at benforingende endostealområder og sentrale BM-områder er anriket i visse celletyper og hendelser (f.eks. frigjøring av blodplater / pro-blodplater fra megakaryocytter i sinusoider i sentrale BM-områder). Det er derfor nyttig å berike for celletyper i sentrale og endosteale områder for å analysere disse to rommene separat. Vi brukte en metode for å skylle diafysen for å berike for sentrale celletyper og knuse metafysen for å berike for endosteale celletyper (figur 4A). Kvantifiseringen av aBMECs og sBMECs i skyllet (sentralt) og knust (endostealt) BM-vev (figur 4B) validerer anvendeligheten av denne mekaniske isolasjonsmetoden, da aBMECs er notorisk mer rikelig i endosteale regioner, og sinusoider er hyppigere i sentrale BM-områder.

Figure 1
Figur 1 Analyse av hematopoietiske cellepopulasjoner. Representative plott som viser gatingstrategien for flowcytometrianalyse av hematopoietiske cellepopulasjoner i total BM ved bruk av den medfølgende programvaren. Forkortelser: FSC-H = fremoverspredning - høyde, FSC-A = fremoverspredning - areal, Lin = avstamning, LKS = Lin- Sca-1+ c-Kit + hematopoietiske stamceller, MPPLy = multipotente forfedre - lymfoide, MPPG / M = multipotente progenitorer - granulocytt / makrofag, MPPMk / E = multipotente progenitorer - megakaryocyt / erytrocytt, MPPs = multipotente forfedre, HSCs = hematopoietiske stamceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Analyse av stromale cellepopulasjoner. Representative plott som viser gatingstrategi for flowcytometrianalyse av stromale celler i total BM ved bruk av medfølgende programvare. Forkortelser: FSC-H = fremoverspredning - høyde, FSC-A = fremoverspredningsareal, MSC = mesenkymale stamceller, LepR = leptinreseptor, ECs = endotelceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Analyse av endotelceller. Representative plott som viser gatingstrategien for flowcytometrianalyse av ECs i total BM ved bruk av den medfølgende programvaren. Forkortelser: FSC-H = fremoverspredning - høyde, FSC-A = fremoverspredning - areal, ECs = endotelceller, aBMECs = arterielle benmargendotelceller, sBMECs = sinusformede benmargendotelceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Analyse av EC-populasjoner i sentrale og endosteale områder . (A) Representasjon av de forskjellige delene av et murine langt bein. (B) Plott som viser de statistisk signifikante forskjellene i frekvensene til CD31+ endotelceller i aBMECs (anriket i den knuste prøven) og sBMECs (anriket i den spylte prøven). Hvert punkt representerer en mus (n = 9), og prøvene er paret. Den statistiske testen som ble brukt var paret T-test. angir tosidig P-verdi < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Cellepopulasjon Gjennomsnitt av frekvens av BM levende celler ± SD (n = 4) i total BM Gjennomsnitt av celletall ± SD (n = 4) per femur i total BM Gjennomsnitt av frekvens av BM levende celler ± SD (n = 4) i endosteal BM Gjennomsnitt av frekvens av BM levende celler ± SD (n = 4) i sentral BM
Lin- 3,05 ± 0,13 337610 ± 59414 3,56 ± 0,21 3,53 ± 0,19
LKS 0,096 ± 0,026 10206 ± 1794 0,102 ± 0,025 0,133 ± 0,022
MPPsLy 0,058 ± 0,011 6141 ± 716 0,058 ± 0,011 0,085 ± 0,007
MPP-erG/M 0,011 ± 0,004 1233 ± 326 0,013 ± 0,003 0,014 ± 0,003
MPPsMk / E 0,0010 ± 0,0002 113 ± 21 0,0014 ± 0,0004 0,0012 ± 0,0005
MPP-er 0,0092 ± 0,0045 940 ± 374 0,0105 ± 0,0048 0,0118 ± 0,0061
HSC-er 0,0054 ± 0,0023 572 ± 191 0,0055 ± 0,0023 0,0059 ± 0,0016

Tabell 1: Kvantitative data for hematopoietiske cellepopulasjoner. Gjennomsnitt av frekvens i BM levende celler av de forskjellige hematopoietiske cellepopulasjonene analysert totalt, endostealt og sentralt BM og celletall per lårben i total BM. Data vist som gjennomsnittlig ± standardavvik (SD), n = 4.

Cellepopulasjon Gjennomsnitt av frekvens av BM levende celler ± SD (n = 4) Gjennomsnittlig antall celler ± SD (n=4) per tibia
Ecs 0,080 ± 0,011 4523 ± 1521
Type H EC 0,041 ± 0,006 2299 ± 752
Type L ECs 0,038 ± 0,005 2103 ± 736
MSC-er 0,180 ± 0,048 10270 ± 4282

Tabell 2: Kvantitative data for stromale cellepopulasjoner. Gjennomsnitt av frekvens i BM levende celler og celletall per tibia for de forskjellige stromale cellepopulasjonene analysert i total BM. Data vist som gjennomsnittlig ± standardavvik (SD), n = 4.

Cellepopulasjon Gjennomsnitt av frekvens av BM levende celler ± SD (n = 4) Gjennomsnittlig antall celler ± SD (n=4) per tibia
Ecs 0,064 ± 0,006 2255 ± 150
aBMECs 0,041 ± 0,010 1419 ± 286
sBMECs 0,023 ± 0,006 819 ± 250

Tabell 3: Kvantitative data for endotelcellepopulasjoner. Gjennomsnitt av frekvens i BM levende celler og celletall per tibia for de forskjellige endotelcellepopulasjonene analysert i total BM. Data vist som gjennomsnitt ± standardavvik (SD), n = 4.

Tilleggstabell 1: Detaljer om dyrene som ble brukt i studien. Stamme, kjønn, alder og vekt av dyrene som brukes til å produsere dataene vist i figur 1, figur 2 og figur 3 og tabell 1, tabell 2 og tabell 3. Forkortelse: g = gram. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens protokollen beskrevet er enkel og lett å utføre, bør spesiell oppmerksomhet rettes mot bestemte trinn. For eksempel, når du oppnår skyllet BM (trinn 5.2), bør volumet eller antall ganger indikert for å passere PBS 2% FBS gjennom innsiden av den sentrale delen av benet ikke overskrides, da dette kan føre til betydelig kontaminering av den spylte prøven av endosteale cellepopulasjoner.

Endringer i protokollen kan gjøres for å lette utførelsen av etterforskeren. Ved prøveekstraksjon (seksjon 2) kan ben og/eller bein lagres i PBS 2 % FBS ved 4 °C i opptil 24 timer før prøvebehandling og analyse går videre. Denne tiden bør imidlertid minimeres når det er mulig. Under inkubasjon med HSCs primære fargingscocktail (trinn 3.10) og sekundærfargingscocktail (trinn 3.11), mens en 15 min inkubasjon ved RT er indikert, kan dette byttes ut med en 30 min inkubasjon ved 4 °C.

Det samme gjelder inkubasjon med stromal primærfargingscocktail (trinn 4.7), stromal sekundærfargeløsning (trinn 4.8), ECs fargingscocktail (trinn 4.12) og inkubasjon med antistoffer for SCC (trinn 6.5); mens en 15 min inkubasjon ved RT er indikert, kan dette byttes ut med en 30 min inkubasjon ved 4 °C.

En annen protokoll for BM-isolering ved sentrifugering av murine lange bein ble nylig beskrevet21. Mens denne protokollen presenterer fordelen med raskere isolasjon av BM-cellene, tillater protokollen beskrevet her analyse av cellepopulasjoner bosatt i forskjellige områder av beinene.

En spesiell begrensning ved dagens metode er at den utelukkende er basert på fenotypisk analyse ved flowcytometri. Dette er spesielt relevant når det gjelder HSC-er, som vil kreve ytterligere funksjonell validering. Denne metoden kan imidlertid kombineres med sortering av berikede populasjoner og studiet av disse cellene i langsiktige rekonstitueringsanalyser og in vitro-kolonianalyser .

Når det gjelder stromalcelleanalyse, spesielt MSC og EC, har det tidligere blitt vist at, til tross for optimalisering av BM-prosessering for flowcytometrianalyse, er et betydelig antall celler ikke isolert fra vevet, og det er en suboptimal kvantifisering av disse cellene sammenlignet med andre metoder som helmontert avbildning19. Likevel er flowcytometri ekstremt nyttig for å utføre den kvantitative og kvalitative analysen av BM ECs og MSCs og å prospektivt isolere dem for funksjonelle og ekspresjonsanalyser.

En annen begrensning av den nåværende metoden er bruken av en mekanisk teknikk for å skille endosteal og sentrale fraksjoner, som til en viss grad uunngåelig er forurenset av celler fra det andre rommet. Likevel viser kvantifiseringen av aBMECs og sBMECs som forklart i den representative resultatdelen at den mekaniske isolasjonen er en robust metode for å berike for cellepopulasjoner i disse områdene.

Den beskrevne metoden tillater studier av hematopoiesis i forskjellige innstillinger og stromale nisjer av HSPCs. Den fenotypiske analysen som her presenteres, kan være nyttig for å studere HSPC-nisjer når de kombineres med spesifikke musemutanter, nemlig EC- og MSC Cre-linjer som muliggjør selektiv manipulering av genuttrykk i disse populasjonene. For eksempel kan linjene Cdh5(PAC)-CreERT222 og LepR-Cre23 brukes til å indusere ekspresjonen av visse gener selektivt i henholdsvis EC og MSC. Metoden er nyttig for å studere deres innvirkning på stromalrommet så vel som på HSPCs. Tilgjengelige Cre-linjer for å studere vaskulær BM-nisje har nylig blitt gjennomgått i Mosteo et al.5. Den prospektive studien av LT-HSC uten transplantasjon har vært begrenset av mangelen på robuste reporterlinjer. Den nylig beskrevne Mds1GFP/+Flt3Cre 6 har imidlertid vist seg å oppnå høy anrikning av LT-HSC og god diskriminering fra nedstrøms forfedre som uttrykker Flt324. Kombinasjonen av denne muselinjen og andre hematopoietiske stammer, som Vav-iCre25, med flowcytometri vil tillate studier av HSPCer og deres forhold til nisje. Hematologiske maligniteter er ofte forbundet med forstyrrelsen av hematopoiesis fra de tidligste stadiene, noe som gjenspeiles i endringen av frekvensene av hematopoietiske stam- og stamceller og av stromale populasjoner9 som vi her har presentert for sunn C57Bl / 6. Fremtidige studier bør utforske anvendelsen av lignende metoder som den her beskrevet ved bruk av nytt utstyr basert på spektral flowcytometri som muliggjør en mer omfattende fenotypisk karakterisering gjennom analyse av flere markører (over 30 samtidig).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

LM ble støttet av et stipend fra Lady Tata Memorial Trust. JR ble støttet av et doktorgradsstipend fra Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT fellesskap UI/BD/150833/2021). ML ble støttet av et PhD-stipend fra FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD ble støttet av tilskudd fra American Society of Hematology, Pablove Foundation, FCT (EXPL / MED-ONC / 0522/2021) og det portugisiske samfunnet for hematologi. Vi takker støtten fra Dr. Catarina Meireles og Emilia Cardoso fra TRACY-anlegget på i3s.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody BioLegend 116114
APC Streptavidin BioLegend 405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody BioLegend 105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody BioLegend 103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibody BioLegend 100304
Biotin anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100404
Biotin anti-mouse CD8a antibody BioLegend 100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody BioLegend 108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibody BioLegend 101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody BioLegend 103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody BioLegend 115929
Calibrite 2 Color Beads BD Biosciences 349502
Collagenase IV Merck Life Science C1889
Dispase II Merck Life Science D4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin ThermoFisher Scientific 10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175095
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody R&D systems BAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) ThermoFisher Scientific R37606 DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibody ThermoFisher Scientific 12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135) ThermoFisher Scientific 12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody BioLegend 102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody BioLegend 103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody BioLegend 108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tablets Merck Life Science P4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibody BioLegend 101302
RBC lysis buffer 10x BioLegend 420302
Zombie Violet Fixable Viability Dye BioLegend 423114 fluorescent dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).

Tags

Tilbaketrekking utgave 187
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L.,… More

Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L., Lopes, M., Duarte, D. Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells. J. Vis. Exp. (187), e64248, doi:10.3791/64248 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter