Method Article

Оценка активации каспазы для оценки гибели врожденных иммунных клеток

DOI:

10.3791/64308

⸱

January 20th, 2023

 ,  , 
1Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается комплексный метод оценки активации каспазы (каспаза-1, каспаза-3, каспаза-7, каспаза-8, каспаза-9 и каспаза-11) в ответ на модели инфекции, стерильных инсультов и рака in vitro и in vivo (у мышей) для определения инициации путей гибели клеток, таких как пироптоз, апоптоз, некроптоз и паноптоз.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Врожденный иммунитет обеспечивает критическую первую линию защиты в ответ на патогены и стерильные оскорбления. Ключевым механистическим компонентом этого ответа является инициация врожденной иммунной запрограммированной клеточной смерти (PCD) для устранения инфицированных или поврежденных клеток и распространения иммунных ответов. Однако избыток PCD связан с воспалением и патологией. Таким образом, понимание активации и регуляции PCD является центральным аспектом характеристики врожденных иммунных реакций и выявления новых терапевтических мишеней по всему спектру заболевания.

Этот протокол предоставляет методы для характеристики активации врожденного иммунитета PCD путем мониторинга каспаз, семейства цистеин-зависимых протеаз, которые часто связаны с различными путями PCD, включая апоптоз, пироптоз, некроптоз и PANoptosis. Первоначальные отчеты характеризовали каспазу-2, каспазу-8, каспазу-9 и каспазу-10 как инициирующие каспазы, а каспазу-3, каспазу-6 и каспазу-7 как эффекторные каспазы при апоптозе, в то время как более поздние исследования показали, что воспалительные каспазы, каспаза-1, каспаза-4, каспаза-5 и каспаза-11, вызывают пироптоз. В настоящее время известно, что существует обширная перекрестная связь между каспазами и другими молекулами врожденного иммунитета и клеточной смерти по ранее определенным путям ПХД, что выявляет ключевой пробел в знаниях в механистическом понимании врожденного иммунитета и ПМД и приводит к характеристике ПАНоптоза. PANoptosis - это уникальный врожденный иммунный воспалительный путь PCD, регулируемый комплексами PANoptosome, которые объединяют компоненты, в том числе каспазы, из других путей гибели клеток.

Здесь приведены методы оценки активации каспаз в ответ на различные раздражители. Эти методы позволяют охарактеризовать пути ПХД как in vitro, так и in vivo, поскольку активированные каспазы подвергаются протеолитическому расщеплению, которое может быть визуализировано с помощью вестерн-блоттинга с использованием оптимальных антител и условий блоттинга. Был разработан протокол и рабочий процесс вестерн-блоттинга, которые позволяют оценить активацию нескольких каспаз из одной и той же клеточной популяции, обеспечивая всестороннюю характеристику процессов ПМД. Этот метод может применяться во всех областях исследований в области развития, гомеостаза, инфекции, воспаления и рака для оценки путей PCD на протяжении клеточных процессов в здоровье и болезнях.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Врожденная иммунная система действует как первая линия защиты во время инфекции и в ответ на стерильные раздражители, такие как повреждение тканей и изменения гомеостаза. Врожденные иммунные датчики на поверхности клетки и в цитоплазме реагируют на молекулярные паттерны, связанные с патогеном или повреждением (PAMP или DAMP, соответственно), чтобы вызвать воспалительные сигнальные пути и клеточные реакции. Одним из ключевых процессов врожденного иммунного ответа является индукция гибели клеток для удаления инфицированных или поврежденных клеток и стимулирования дальнейших врожденных и адаптивных иммунных реакций. Запрограммированная гибель клеток (PCD) является высоко....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование животных и процедуры были одобрены Комитетом по использованию и уходу за животными Детской исследовательской больницы Святого Иуды.

1. Подготовка растворов

  1. Подготовьте среду, кондиционированную L929.
    1. Планшет 1 × 106 клеток L929 (см. Таблицу материалов) в колбе для культивирования тканей объемом 182см2 , содержащей 50 мл питательных сред L929 (см. Таблицу 1 для приготовления среды).
    2. Выращивайте клетки в увлажненном инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2.
    3. Через 7 дней соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте с ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПАНоптоз наблюдался в ответ на многочисленные бактериальные, вирусные и грибковые инфекции и другие воспалительные стимулы, а также в раковых клетках 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 <.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мониторинг расщепления и активации каспазы дает одну из наиболее полных картин активации врожденного иммунного PCD как части врожденного иммунного ответа. Описанный здесь протокол демонстрирует стратегию мониторинга активации каспазы в ответ на инфекции IAV, HSV1 и F. novicida и стерильный триггер ЛПС + АТФ, но многочисленные другие стимулы могут индуцировать ПМД и могут быть использованы в этом методе, как было показано в нескольких публикациях 44,48,49,50,51,52,53,54,56

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T.-D.K. является консультантом компании Pfizer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим сотрудников лаборатории Каннеганти за их комментарии и предложения, а также благодарим доктора философии Дж. Работа в нашей лаборатории поддерживается грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 и CA253095 (для T.-D.K.) и американо-ливанскими сирийскими благотворительными организациями (для T.-D.K.). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,45 мкм; m фильтрMilliporeSCHVU05RE
шприц 10 млBD Biosciences309604
12% полиакриламидный гель с 10 лунками Bio-Rad4561043
12-луночный планшет ИглаCorning 07-200-82
18 G Игла BD Biosciences305195
25 г BD Biosciences305122
пробирка 50 мл Fisher Scientific50-809-218
70 μ Ситечко для клеток M ЧашкиCorning 431751
150 мм Corning
182-см<суп>2 колба для культуры тканейGenesee Scientific25-211
Аксессуар белый транс-лотокCytiva29-0834-18
Anti– антитело к каспазе-1AdipoGenAG-20B-0042-C100
Anti– антитело к каспазе-11Novus BiologicalsNB120-10454
Anti– Технология клеточной сигнализации антитела к каспазе-39662
Anti– Технологияклеточной сигнализации9492
Anti– Технологияклеточной сигнализации4927
Anti– Технологияклеточной сигнализации9504
Anti– Антитела к расщепленной каспазе-3 Технология сотовой сигнализации9661
Anti– расщепленное антитело к каспазе-7 Технология клеточной сигнализации9491
Anti– расщепленное антитело к каспазе-8 Технология клеточной сигнализации8592
Антимышиное HRP-конъюгированное вторичное антитело Jackson ImmunoResearch Laboratories315-035-047
Вторичное антитело против HRP-конъюгированного против кролика Jackson ImmunoResearch Laboratories111-035-047
Антикрысиное HRP-конъюгированное вторичное антитело Лаборатории иммуноисследований Джексона112-035-003
Анти– β-Actin антитела (C4) HRPSanta Cruzsc-47778 HRP
ATPInvivoGentlrl-atpl
BBL Trypticase Soy BrothBD Biosciences211768
Ванны с шарикамиChemglass Life SciencesCLS-4598-009
Биофотометр D30Eppendorf6133000010
BMESigmaM6250
Бромфенол синий Скребки для клеток SigmaBO126
CellTreat Scientific Products229315
Хемилюминесцентный имиджер (Amersham 600) Cytiva29083461
CO2  камераVetEquip901703
кюветыFisher Scientific14-955-129
Ножницы для препарированияThermo Fisher Scientific221S
DMEMThermo Fisher Scientific11995-073
DTTSigma43815
Аппарат для электрофореза Bio-Rad1658004
ЭтанолPharmco111000200
Фетальная бычья сыворотка BiowestS1620
Фильтровальная бумагаBio-Rad1703965
щипцамиFisher Scientific22-327379
Francisella novicida (штамм U112)BEI ResourcesNR-13
Гель releaser Bio-Rad1653320
ГентамицинGibco15750060
глицеринSigmaG7893
ГлицинSigmaG8898
HClSigmaH9892
Тепловой блокFisher Scientific23-043-160
Вирус простого герпеса 1 (штамм HF)ATCCVR-260
Высокий уровень глюкозы DMEM SigmaD6171
Анти для человека; R& D SystemsMAB6215
защиту человека от Антитело к каспазе-8EnzoALX-804-242
Увлажненный инкубатор Thermo Fisher Scientific51026282
Программное обеспечение для анализа изображенийImageJv1.53a
IMDMThermo Fisher Scientific12440-053
Вирус гриппа А (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) сконструировано по Hoffmann et al.
L929 клеткиATCCCCL-1клеточная линия для создания L929-кондиционированной среды
L-цистеина Thermo Fisher ScientificBP376-100
Luminata Forte Western HRP субстратMilliporeWBLUF0500стандартная чувствительность HRP субстрат
MDCK клеткиATCCCCL-34клеточная линия для определения титра вируса IAV
MethanolSigma322415
микроцентрифугаThermo Fisher Scientific75002401
Заменимые аминокислоты Gibco11140050
Обезжиренное сухое молокоKroger
NP-40 раствор Sigma492016
PBSThermo Fisher Scientific10010023
пенициллином и стрептомицином SigmaP4333
Чашка ПетриFisher Scientific07-202-011
PhosSTOPRochePHOSS-RO
Источник питания Bio-Rad164-5052
Таблетка ингибитора протеазыSigmaS8820
PVDF мембрана Шейкер с миллипорамиIPVH00010
LabnetS2035-E
SDSSigmaL3771
Хлорид натрия SigmaS9888
Дезоксихолат натрияSigma30970
Гидроксид натрияSigma72068
Пируват натрия Gibco11360-070
Квадратная чашка ПетриFisher ScientificFB0875711A
Буфер для снятияThermo Fisher Scientific21059
Super Signal Femto HRP подложкаThermo Fisher Scientific34580высокочувствительная подложка HRP
Настольная центрифугаThermo Fisher Scientific75004524
Полусухая система Trans-Blot Bio-Rad170-3940
TrisSigmaTRIS-RO
Tween 20 SigmaP1379
Сверхчистый липополисахарид (ЛПС) из E. coli 0111:B4InvivoGentlrl-3pelps
Vero cellsATCCCCL-81клеточная линия для определения титра вируса HSV1
для культуры тканей 430597 антител к каспазе-7 антител к каспазе-8 антител к каспазе-9 изоляции

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171(1996).
  2. Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Caspase ActivationInnate Immune Cell DeathProgrammed Cell DeathPANoptosisWestern BlottingInfluenza A InfectionBone Marrow MacrophagesPyroptosisApoptosisCell Death Imaging

Related Articles