Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utvärdering av kaspasaktivering för att bedöma medfödd immuncellsdöd

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64308
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

Detta protokoll beskriver en omfattande metod för att bedöma kaspasaktivering (kaspas-1, kaspas-3, kaspas-7, kaspas-8, kaspas-9 och kaspas-11) som svar på både in vitro - och in vivo (hos möss) modeller av infektion, sterila förolämpningar och cancer för att bestämma initieringen av celldödsvägar, såsom pyroptos, apoptos, nekrotos och PANoptos.

Abstract

Medfödd immunitet ger den kritiska första försvarslinjen som svar på patogener och sterila förolämpningar. En viktig mekanistisk komponent i detta svar är initieringen av medfödd immunprogrammerad celldöd (PCD) för att eliminera infekterade eller skadade celler och sprida immunsvar. Överskott av PCD är emellertid förknippat med inflammation och patologi. Att förstå aktivering och reglering av PCD är därför en central aspekt för att karakterisera medfödda immunsvar och identifiera nya terapeutiska mål över sjukdomsspektrumet.

Detta protokoll tillhandahåller metoder för att karakterisera medfödd immun-PCD-aktivering genom att övervaka kaspaser, en familj av cysteinberoende proteaser som ofta är associerade med olika PCD-vägar, inklusive apoptos, pyroptos, nekrotos och PAN-optos. Initiala rapporter karakteriserade kaspas-2, kaspas-8, kaspas-9 och kaspas-10 som initiatorkaser och kaspas-3, kaspas-6 och kaspas-7 som effektorkaspaser vid apoptos, medan senare studier fann att inflammatoriska kaspaser, kaspas-1, kaspas-4, kaspas-5 och kaspas-11, driver pyroptos. Det är nu känt att det finns omfattande överhörning mellan kaspaser och andra medfödda immun- och celldödsmolekyler över de tidigare definierade PCD-vägarna, vilket identifierar en viktig kunskapslucka i den mekanistiska förståelsen av medfödd immunitet och PCD och leder till karakterisering av PANoptos. PANoptos är en unik medfödd immuninflammatorisk PCD-väg som regleras av PANoptosom-komplex, som integrerar komponenter, inklusive kaspaser, från andra celldödsvägar.

Här tillhandahålls metoder för att bedöma aktiveringen av kaspaser som svar på olika stimuli. Dessa metoder möjliggör karakterisering av PCD-vägar både in vitro och in vivo, eftersom aktiverade kaspaser genomgår proteolytisk klyvning som kan visualiseras genom western blotting med optimala antikroppar och blottningsförhållanden. Ett protokoll och western blotting workflow har upprättats som möjliggör bedömning av aktivering av flera kaspaser från samma cellulära population, vilket ger en omfattande karakterisering av PCD-processerna. Denna metod kan tillämpas över forskningsområden inom utveckling, homeostas, infektion, inflammation och cancer för att utvärdera PCD-vägar genom cellulära processer inom hälsa och sjukdom.

Introduction

Det medfödda immunsystemet fungerar som den första försvarslinjen under infektion och som svar på sterila stimuli, såsom vävnadsskada och förändringar i homeostas. Medfödda immunsensorer på cellytan och i cytoplasman svarar på patogen- eller skadeassocierade molekylära mönster (PAMPs respektive DAMPs) för att utlösa inflammatoriska signalvägar och cellulära svar. En av nyckelprocesserna för det medfödda immunsvaret är induktionen av celldöd för att avlägsna infekterade eller skadade celler och driva ytterligare medfödda och adaptiva immunsvar. Programmerad celldöd (PCD) är en mycket bevarad process över arter, vilket belyser dess evolutionära betydelse som en medfödd immunmekanism.

Det finns flera medfödda immun-PCD-vägar som kan aktiveras i alla celltyper. Caspaser är en nyckelfamilj av högbevarade, intracellulära, cysteinberoende proteaser som är kritiska över många PCD-vägar, inklusive den traditionellt icke-inflammatoriska apoptosvägen, liksom inflammatoriska PCD-vägar såsom pyroptos, nekrotos och PANoptos 1,2,3,4,5 . Det finns 11 humana och 10 murina kaspaser som är väldefinierade, liksom pseudokaspaser som kan vara funktionella, och de flesta uttrycks konstitutivt som inaktiva monomera eller dimera pro-kaspaser som kräver klyvning för aktivering 6,7. Caspases innehåller också viktiga domäner för rekrytering och bildning av multiproteinkomplex. Dessa inkluderar caspase activation and recruitment domain (CARD), som finns i caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 och caspase-11, eller death effector domain (DED), som finns i caspase-8 och caspase-10. Genom både deras proteolytiska aktivitet och deras förmåga att bilda multiproteinkomplex är kaspaser kritiska drivkrafter för medfödd immun-PCD.

Kaspasernas roll i medfödd immun-PCD identifierades först vid apoptos, där initiatorns kaspaser, caspase-2, caspase-8, caspase-9 och caspase-10, aktiverar bödelkaspaser, caspase-3, caspase-6 och caspase-7, för att driva celldöd 8,9,10,11,12. Initiatorkaspaser kan aktiveras av olika signalkaskader; Den yttre vägen aktiverar kaspas-8 genom extracellulär ligandinducerad dödsreceptorsignalering, och den inneboende vägen aktiverar kaspas-9 genom störning av mitokondriell integritet13. Aktiverade initiatorkaspaser klyver länkaren som separerar de stora och små katalytiska underenheterna av bödelkaspaser för att producera sina aktiva former. Bödelns kaspaser klyver sedan sina substrat för att demontera cellen, vilket resulterar i DNA-nedbrytning, membranblåsning, kärnfragmentering och frisättning av apoptotiska kroppar14,15. Denna process slutar vanligtvis i en icke-lytisk och icke-inflammatorisk form av celldöd när den kombineras med omedelbar rensning av de döende cellerna genom efferocytos16. Defekter i efferocytos eller brist på fagocytiska celler kan emellertid leda till ackumulering av apoptotiska celler, som sedan genomgår lytisk och inflammatorisk celldöd17,18.

De inflammatoriska kaspaserna, inklusive kaspas-1 (människa och mus), kaspas-4 och kaspas-5 (människa) och kaspas-11 (mus), har upptäckts aktiveras under en form av inflammatorisk medfödd immun-PCD (III-PCD) som kallas pyroptos. Kaspas-1-aktivering är associerad med bildandet av inflammasomer, vilka är multiproteinkomplex innehållande en cytosolisk medfödd immunsensor, en adaptermolekyl (apoptosassocierat fläckliknande protein innehållande ett CARD [ASC]) och kaspas-1. Bildningen av detta komplex tillåter kaspas-1 att genomgå närhetsmedierad autoproteolys för att frigöra sin aktiva form, vilket kan klyva målsubstrat inklusive de proinflammatoriska cytokinerna interleukin (IL) -1β och IL-18 och den porbildande molekylen gasdermin D (GSDMD) 19,20,21,22,23 . Kaspas-11, kaspas-4 och kaspas-5 kan också aktivera GSDMD utan uppströmsbildning av inflammasomen efter avkänning av PAMPs såsom lipopolysackarid (LPS)19,20. Dessa kaspaser genomgår dimerisering följt av oligomerisering och självklyvning för aktivering vid bindning till cytosolisk LPS, vilket leder till icke-kanonisk inflammasomaktivering 24,25,26 och kaspas-1-aktivering på ett cellinneboende sätt för att inducera IL-1β och IL-18-mognad 20. Mognaden och frisättningen av dessa proinflammatoriska cytokiner karakteriserar dessa kaspaser som "inflammatoriska". Dessutom har den apoptotiska kaspas-8 visat sig lokaliseras till inflammasomen, vilket ger en länk mellan apoptotiska och pyroptotiska processer. Studier har visat att den apoptotiska kaspas-8 också är avgörande för att reglera en annan form av PCD som kallas nekrotros. Förlusten av kaspas-8 resulterar i spontan receptorinteragerande serin-treoninkinas 3 (RIPK3)-medierad blandad härstamningskinas domänliknande pseudokinas (MLKL) aktivering för att driva III-PCD-vägen för nekroptos 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

Medan kaspaser historiskt har klassificerats som "apoptotiska" eller "inflammatoriska" baserat på vilken typ av celldöd de initierar, tyder växande bevis på att det finns omfattande överhörning mellan de medfödda immun-PCD-vägarna genom kaspaser 3,4. Till exempel klyver den inflammatoriska kaspas-1 från inflammasomer den apoptotiska kaspas-7 vid dess kanoniska aktiveringsställe34. Kaspas-1-aktivering kan också leda till klyvning av apoptotiska substrat såsom poly(ADP-ribos) polymeras 1 (PARP1)36. I celler som saknar GSDMD kan kaspas-1 också klyva kaspas-337,38. Dessutom kan den kanoniskt apoptotiska kaspas-3 klyva gasdermin E (GSDME) för att inducera PCD17,18 och bearbetar också GSDMD till en inaktiv form40. Vidare har kaspas-8-rekrytering till inflammasomkomplexet observerats 39,40,41,42,43,44,45, och kaspas-8 är en nyckelregulator för kanonisk och icke-kanonisk inflammasomaktivering 39. Det finns också överlappande och redundanta roller för kaspas-8 och kaspas-1 vid många inflammatoriska tillstånd, och medfödd immun-PCD som kännetecknas av aktivering av pyroptotiska, apoptotiska och nekrototiska komponenter förekommer över sjukdomsspektrumet 39,46,47,48,49,50.

Baserat på denna överhörning mellan inflammatoriska och apoptotiska kaspaser identifierades en viktig lucka i den mekanistiska förståelsen av medfödd immunitet och PCD, vilket ledde till upptäckten av PANoptos. PANoptos är en unik form av III-PCD som aktiveras som svar på patogener, PAMPs, DAMPs och förändringar i homeostas och regleras av PANoptosomer - mångfacetterade makromolekylära komplex som integrerar komponenter från andra celldödsvägar 44,50,51,52,53,54,55 . De totala biologiska effekterna vid PANoptos kan inte enskilt förklaras av pyroptos, apoptos eller nekroptos enbart 3,4,35,36,39,46,47,48, eftersom PANoptos kännetecknas av aktivering av multipla kaspaser, inklusive kaspas-1, kaspas-11, kaspas-8, kaspas-9, kaspas-3 och/eller kaspas-7, beroende på sammanhanget: 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptos har blivit alltmer inblandad i infektiösa och inflammatoriska sjukdomar, liksom i cancer och cancerterapier 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Med tanke på den viktiga rollen av kaspaser över celldödsvägar, inklusive i apoptos, pyroptos, nekrotos och PANoptos, är det viktigt att utveckla tekniker för att karakterisera deras aktivering och förstå PCD-vägarnas fulla komplexitet. Protokollet här beskriver en metod för att stimulera celler och mäta efterföljande aktivering av kaspaser (figur 1). Denna metod utnyttjar den proteolytiska klyvningen av kaspaser, som i allmänhet krävs för deras aktivering, som ett sätt att studera dem. Genom western blotting kan proteinstorlekarna bestämmas, vilket möjliggör tydlig visualisering och differentiering av inaktiva pro-kaspaser och deras aktiverade, klyvda former.

De största fördelarna med detta protokoll är 1) dess förmåga att bedöma aktiveringen av flera kaspaser parallellt från en enda population av endogena celler för att mer exakt bestämma PCD-aktivering och 2) användningen av relativt enkla laboratorietekniker som inte kräver omfattande utbildning eller dyr utrustning. Tidigare protokoll har använt western blotting, fluorescerande reportrar eller antikroppsfärgning för att övervaka kaspasaktivering i odlingssupernatanter, cell- och vävnadslysater, hela celler via mikroskopi och in vivo 67,68,69,70,71, men dessa tekniker övervakar i allmänhet bara en eller två kaspaser i ett prov. Dessutom, medan syntetiska peptidsubstrat innehållande kaspasklyvningsställen som fluorescerar vid klyvning har använts för att övervaka kaspasaktivering i cell- eller vävnadslysat69, kan dessa substrat ofta klyvas av mer än en kaspas, vilket gör det svårt att bestämma den specifika aktiveringen av enskilda kaspaser i detta system. Dessutom tillåter användningen av västerländsk blotting snarare än användningen av fluorescerande reportrar eller andra taggbaserade metoder forskare att använda endogena celler snarare än att skapa specifika cellinjer med reportergener. Det finns flera fördelar med att använda endogena celler, inklusive det faktum att många odödliga cellinjer har brist på nyckelcelldödsmolekyler72,73, vilket kan påverka resultaten. Dessutom möjliggör användning av endogena celler utvärdering av olika celltyper, såsom makrofager, epitelceller och endotelceller, snarare än en enda härstamning. Western blotting är också en relativt enkel och kostnadseffektiv teknik som kan utföras i laboratorier runt om i världen utan behov av stor, dyr utrustning eller komplicerade inställningar.

Detta protokoll är allmänt tillämpligt över biologi för att förstå både celldödsberoende och celldödsoberoende funktioner hos caspaser, inklusive deras byggnadsställningsroller och funktioner i andra inflammatoriska signalvägar74. Att tillämpa denna metod möjliggör ett enhetligt tillvägagångssätt i studien av medfödda immun-PCD-vägar och inflammatorisk signalering över sjukdomar och tillstånd, och detta protokoll kan användas för att identifiera kritiska regleringsprocesser och mekanistiska kopplingar som kommer att informera utvecklingen av framtida terapeutiska strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djurens användning och procedurer godkändes av St. Jude Children's Research Hospital Committee on the Use and Care of Animals.

1. Förbereda lösningarna

  1. Förbered L929-konditionerade medier.
    1. Platta 1 × 106 L929-celler (se Materialtabell) i en 182 cm2 vävnadsodlingskolv innehållande 50 ml L929-odlingsmedium (se tabell 1 för beredning av mediet).
    2. Odla cellerna i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5% CO2.
    3. Efter 7 dagar, samla supernatanten och filtrera med ett 0,45 μm filter. Bered 50 ml alikvoter (förvara frysta alikvoter vid −80 °C i upp till 1 år).
  2. Bered 500 ml benmärgshärledd makrofag (BMDM) odlingsmedia (tabell 1).
  3. Bered 500 ml BMDM-stimuleringsmedium (tabell 1).
  4. Förbered 500 ml media för infektion (tabell 1).
  5. Förbered 100 ml 1 M Tris-buffert (tabell 1).
  6. Förbered 4x natriumdodecylsulfatbuffert (SDS) (tabell 1).
  7. Bered 1 ml 1 M 1,4-ditiotreitol (DTT, tabell 1).
  8. Bered 40 ml kaspaslysbuffert (tabell 1).
  9. Förbered 100 ml 1,5 M Tris-buffert (tabell 1).
  10. Bered 100 ml av en 10 % (vikt/volym) SDS-lösning (tabell 1).
  11. Bered 50 ml av en 2x RIPA-buffert (radioimmunoprecipitationsanalys) (tabell 1).
  12. Bered en 5 mg/ml LPS-lösning (tabell 1).
  13. Bered en 0,5 M ATP-lösning (tabell 1).
  14. Förbered de västra blottinglösningarna.
    1. Förbered 1 liter 5x löpande buffertlager (tabell 1).
    2. Förbered 1 liter 10x överföringsbuffertlager (tabell 1).
    3. Bered 1 l Tris-buffrad saltlösning med Tween 20 (TBST, tabell 1).
    4. Bered 100 ml av en 5 % (vikt/volym) lösning som blockerar skummjölk (tabell 1).
  15. Förbered de primära antikroppslösningarna.
    1. Bered 10 ml primär antikropp kaspas-1 (tabell 1).
    2. Bered 10 ml primär antikropp mot kaspas-11 (tabell 1).
    3. Bered 10 ml primär antikropp kaspas-3 (tabell 1).
    4. Bered 10 ml primär antikropp kaspas-7 (tabell 1).
    5. Bered 10 ml primär antikropp kaspas-8 (tabell 1).
    6. Bered 10 ml primär antikropp mot kaspas-9 (tabell 1).
    7. Bered 10 ml HRP-konjugerad primär antikropp mot β-aktin (tabell 1).
  16. Förbered de sekundära antikroppslösningarna.
    1. Förbered 10 ml sekundär antikanin sekundär antikropp (tabell 1).
    2. Bered 10 ml sekundär anti-musantikropp (tabell 1).
    3. Bered 10 ml sekundär anti-råttantikropp (tabell 1).

2. Isolera benmärgshärledda makrofager

OBS: För detta protokoll kan 6-10 veckor gamla vildtypsmöss med intakta PCD-vägar eller mutanta möss med PCD-regulatorer, effektorer eller molekyler av intresse raderade eller förändrade användas.

  1. Avliva en mus i en CO 2-kammare med en flödeshastighet som förskjuter 10% -30% av burvolymen per min i2-3 minuter. Utför sedan en sekundär eutanasimetod, såsom cervikal dislokation. Följ alla ytterligare anläggnings-, institutions- och myndighetsspecifika riktlinjer och föreskrifter där det är tillämpligt.
  2. Dissekera musen för att hämta bakbenbenen.
    1. Fäst musen på ryggen så att buken exponeras. Spraya med 70% (vol / vol) etanol för att sterilisera bakbenen och buken.
      VARNING: Etanol är brandfarligt. Håll den borta från öppen eld.
    2. Använd sax för att göra ett snitt vid mittlinjen i buken; Fortsätt att skära mot benen för att göra lårbenen synliga.
    3. Ta höger bakben och dra bort huden från kroppen mot mittlinjen. Lossa benet från kroppen genom att skära av adduktormusklerna mot mittlinjen; Skär sedan benet mellan höftleden och ryggraden. Skär sedan tassen distalt mot fotleden och ta bort överflödig vävnad från benet genom att skala av huden och använda något öppnad sax för att ta bort kalvvävnaden.
    4. Placera benet på en 70% (vol / vol) etanolindränkt handduk och dissekera skenbenet och lårbenet.
      1. Lås skenbenet och lårbenet var och en med en separat uppsättning pincett. Tryck försiktigt skenbenet mot knäledens naturliga riktning; Detta kommer att få skenbenet att bryta vid knäet.
      2. Använd pincetten och dissekeringssaxen om det behövs för att ta bort eventuell kvarvarande hängande vävnad. Spara skenbenet för senare användning genom att placera det på den etanolindränkta handduken.
      3. Samla lårbenet på samma sätt genom att knäppa av knäet.
    5. Upprepa steg 3 och 4 ovan för vänster ben för att ta bort det från kroppen och dissekera skenbenet och lårbenet.
    6. Spraya benen med 70% (vol / vol) etanol.
    7. Rengör benen genom att placera dem på en ren 70% (vol / vol) etanolindränkt handduk, klämma den köttiga delen i handduken och gnugga handduken mot benet för att ta bort överflödig vävnad.
  3. När båda lårbenen och båda skenbenen är rena, spraya alla fyra benen med 70% (vol / vol) etanol. Samla benen i en steril petriskål och skölj dem med 10 ml BMDM-odlingsmedia genom att försiktigt svänga mediet i skålen.
  4. Fyll en 10 ml spruta med 10 ml färskt BMDM-odlingsmedium och fäst en 25 G nål.
  5. Plocka upp skenbenet med pincett; Skär sedan fotleden i en ~ 45 ° vinkel.
  6. Spola benmärgen från skenbenet.
    1. Håll skenbenet över ett 50 ml rör, med den smala änden av skenbenet pekande nedåt. Fördela mediet över skenbenet från den fyllda sprutan.
    2. För in nålen (försiktigt först) i den övre änden av märgen och dosera mediet.
    3. Ta bort nålen och sätt sedan in den igen. Använd korta högtryckstryck för att dosera mediet och flytta nålen in i märgen.
    4. När media börjar strömma ut från botten av benet, använd korta, högtryckstryck för att fortsätta spola cellerna ut. Övervaka benets färg under denna process, och när benet är vitt, kassera det.
    5. Gör detta för båda skenbenen.
  7. Upprepa steg 5 och 6 ovan för lårbenen, skär vid höftleden när skenbenet skars vid fotleden. Använd samma 50 ml rör för att samla BMDM-odlingsmediet när märgen spolas.
  8. När alla fyra benen har spolats, aspirera märgen och mediet från 50 ml röret upp och ner 3x genom en 18 G nål på en 10 ml spruta, skölj rörets sidor varje gång för att sprida märgen.
  9. Justera den slutliga volymen i 50 ml röret till 30 ml med BMDM-odlingsmedia och se till att cellerna är ordentligt suspenderade.
  10. Använd en 70 μm cellsil för att filtrera BMDM-odlingsmediet från 50 ml-röret.
  11. Platta den resulterande cellsuspensionen, som innehåller benmärgens stamceller, i tre 150 mm vävnadsodlingsskålar genom att tillsätta 10 ml (eller ~ 20 × 106 celler) till varje. Tillsätt sedan ytterligare 10 ml BMDM-odlingsmedia till varje maträtt. Inkubera i en befuktad inkubator vid 37 °C.

3. Differentiering av BMDM och plätering för experimenten

  1. Inkubera de pläterade benmärgscellerna vid 37 °C i 3 dagar. Ta sedan bort varje skål och tillsätt ytterligare 5-8 ml BMDM-odlingsmedia (tabell 1). Återvänd till inkubatorn vid 37 °C.
  2. På dag 5 efter den första pläteringen, ta bort varje skål och tillsätt ytterligare 5 ml BMDM-odlingsmedia. Återvänd till inkubatorn vid 37 °C.
  3. På dag 6, ta bort varje maträtt och kassera media. Tillsätt sedan 10 ml kall (förvaras vid 4 °C) PBS för att tvätta en gång. Kassera 10 ml kall PBS-tvätt. Tillsätt sedan 10 ml färsk, kall PBS till varje maträtt och inkubera varje maträtt på is i 5 minuter.
  4. Använd en cellskrapa försiktigt cellerna från alla tre skålarna i ett 50 ml rör. Snurra försiktigt ner cellerna vid 270 × g vid 4 °C i 5 minuter. Kassera sedan supernatanten.
  5. Tillsätt 20 ml BMDM-odlingsmedia, pipettera upp och ner för att resuspendera pelleten och räkna cellerna.
    OBS: Det förväntas att varje mus kommer att ge cirka 60 × 10 6-100 × 106 celler.
  6. Planera layouten med 12 brunnar för önskad in vitro-celldöd / inflammationsstimuleringsanalys. Planera att platta 1 × 106 celler per brunn. För varje planerad stimulering, inkludera minst tre biologiska replikat och platta en uppsättning brunnar som ska skördas i kaspaslysbuffert och en andra uppsättning brunnar som ska skördas i Ripa-buffert.
  7. Platta 1 × 106 celler i 1 ml BMDM-odlingsmedia per brunn i 12-brunnsplattor. Odla över natten i en befuktad inkubator vid 37 °C innan du fortsätter till celldöd / inflammationsutvärdering. Efter inkubation över natten, ta bort mediet och tillsätt 1 ml varm (37 ° C) PBS till varje brunn för att tvätta cellerna.
  8. Ta bort PBS-tvätten och tillsätt 500 μL BMDM-stimuleringsmedium med antibiotika (om icke-bakteriestimuleringar) eller BMDM-stimuleringsmedia utan antibiotika (om bakteriestimulering) utförs (tabell 1). Inkubera i 2 timmar innan du går vidare till steg 4 för in vitro-stimulering/infektion.

4. Stimulera eller infektera cellerna

VARNING: De medel som ingår i detta protokoll är potentiellt patogena och bör hanteras med lämpliga försiktighetsåtgärder i en anläggning för biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) med godkännande från relevanta institutionella och statliga myndigheter.

  1. Stimulera BMDM att aktivera celldöd med utlösaren av intresse.
    OBS: I detta protokoll avses med influensa A-virus (IAV), herpes simplexvirus 1 (HSV1), Francisella novicidaoch LPS + ATP används för illustration, men andra utlösare kan användas.
    1. Exempel på stimulering 1: Infektera med IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (konstruerad enligt Hoffmann et al.75; virustitern för multiplicitetsbestämning av infektion [MOI] beräknas genom en plackanalys i MDCK-celler):
      1. Beräkna den virusvolym som behövs för infektion vid en mängd infektioner (MOI) med 20 plackbildande enheter (PFU) med ekvation (1) och ekvation (2):
        Equation 1
        Equation 2
        Equation 3
      2. Ta bort mediet från BMDM och tvätta cellerna en gång med 500 μL PBS. Tillsätt 450 μL IAV (20 MOI) i DMEM med hög glukoshalt utan värmeinaktiverad (HI)-FBS till varje brunn. Inkubera plattorna vid 37 °C i 1 timme i en fuktad inkubator för att möjliggöra absorption.
      3. Ta bort plattorna och tillsätt 50 μL HI-FBS. Sätt tillbaka plattorna i inkubatorn vid 37 °C. Inkubera i totalt 12 timmar.
    2. Exempel på stimulering 2: Infektera med HSV1 (HF-stam; odlad enligt beskrivningen tidigare44; virustitern för MOI-bestämning beräknas genom en plackanalys i Vero-celler):
      1. Beräkna volymen virus som behövs för infektion vid en MOI på 10 PFU med ekvation (1) och ekvation (2) från steg 1 i IAV-infektionsavsnittet ovan.
        Equation 4
      2. Ta bort mediet från BMDM. Tillsätt 450 μL HSV1 (MOI 10) i DMEM med hög glukoshalt utan HI-FBS till varje brunn. Inkubera plattorna vid 37 °C i 1 timme i en fuktad inkubator för att möjliggöra absorption.
      3. Ta bort plattorna och tillsätt 50 μL HI-FBS. Sätt tillbaka plattorna i inkubatorn vid 37 °C. Inkubera i totalt 12 timmar.
    3. Exempel stimulering 3: Infektera med F. novicida (U112 stam; odlad som beskrivits tidigare44 under aeroba förhållanden vid 37 ° C i BBL trypticase sojabuljong kompletterad med 0.2% L-cystein över natten. Subkultur sedan bakterierna i förhållandet 1:10 vid 37 °C i ytterligare 4 timmar i färskt medium innan den optiska densiteten (OD) vid 600 nm tas med det färska mediet som blindprov. Ett OD-värde på 1 motsvarar 1 × 109 kolonibildande enheter (CFU) per ml.)
      1. Beräkna volymen av F. novicida som behövs för infektion vid en MOI på 50 CFU med ekvation (3) och ekvation (4):
        Equation 5
        Equation 6
        Equation 7
      2. Ta bort mediet från BMDM. Tillsätt 500 μL F. novicida (MOI 50) i BMDM-stimuleringsmedia utan antibiotika till varje brunn. Inkubera plattorna vid 37 °C i 4 timmar i en fuktad inkubator för att möjliggöra absorption.
      3. Tvätta cellerna tre gånger med uppvärmd (37 °C) PBS och tillsätt 500 μl BMDM-stimuleringsmedium innehållande 50 μg/ml gentamycin. Sätt tillbaka plattorna i inkubatorn vid 37 °C. Inkubera över natten (16 timmar).
    4. Exempel på stimulering 4: Stimulera med LPS + ATP.
      1. Ta bort mediet från BMDM. Tillsätt 500 μL BMDM-stimuleringsmedium med antibiotika (tabell 1) innehållande 100 ng/ml LPS till varje brunn. Inkubera plattorna vid 37 °C i 3,5 timmar i en fuktad inkubator.
      2. Tillsätt 5 μl 0,5 M ATP-stamlösning (tabell 1) till varje brunn. Sätt tillbaka plattorna i inkubatorn vid 37 °C. Inkubera i 30 minuter.

5. Uppsamling av det kombinerade supernatanten och proteinlysatet som ska användas för caspase western blots

  1. Efter 4 h, 12 h eller 16 h inkubation (den specifika tidpunkten är beroende av vilken avtryckare som används), ta bort plattan från inkubatorn.
  2. Ta bort 150 μL av supernatanten; kassera eller spara detta för andra supernatantanalyser (t.ex. enzymkopplad immunosorbentanalys [ELISA]). Ta inte bort den återstående supernatanten.
  3. Skapa proteinuppsamlingslösningen genom att kombinera 50 μL kaspaslysbuffert + 100 μL 4x SDS-buffert per brunn (tabell 1). Tillsätt sedan 150 μL av blandningen till varje brunn.
  4. För varje brunn, pipettera blandningen upp och ner för att samla lyserade celler och supernatant. Under pipettering, skrapa också botten av brunnen med pipettspetsen för att störa cellerna. Efter skrapning och pipettering, samla proteinlysatet i märkta 1,5 ml rör.
  5. Använd ett värmeblock för att värma alla rör till 100 °C i 12 minuter.
  6. Pellet eventuella olösliga komponenter genom centrifugering vid 14 500 × g i 30 s vid rumstemperatur.
    OBS: Detta är en pauspunkt - proteinet från de kombinerade supernatanten och proteinlysaterna kan antingen användas omedelbart eller förvaras vid -20 ° C i upp till 2 månader eller vid -80 ° C i upp till 6 månader tills det är klart att användas.

6. Insamling av proteinlysat som ska användas för caspase western blots

  1. Efter 4 h, 12 h eller 16 h inkubation (den specifika tidpunkten är beroende av vilken avtryckare som används), ta bort plattan från inkubatorn. Ta bort all supernatant; kassera eller spara detta för andra supernatantanalyser (t.ex. ELISA).
  2. Skapa 1x Ripa-bufferten genom att späda 2x RIPA-stamlösningen (tabell 1) i en lika stor mängd avjoniserat vatten. Tillsätt sedan en fosfatashämmaretablett och en proteashämmaretablett och låt dem lösas upp. Tillsätt 150 μL 1x Ripa-buffert och 50 μL 4x SDS till varje brunn.
  3. För varje brunn, pipettera blandningen upp och ner för att samla de lyserade cellerna. Under pipettering, skrapa också botten av brunnen med pipettspetsen för att störa cellerna. Efter skrapning och pipettering, samla proteinlysatet i märkta 1,5 ml rör.
  4. Använd ett värmeblock för att värma alla rör till 100 °C i 12 minuter.
  5. Pellet eventuella olösliga komponenter genom centrifugering vid 14 500 × g i 30 s vid rumstemperatur.
    OBS: Detta är en pauspunkt - proteinlysaterna kan antingen användas omedelbart eller förvaras vid −20 ° C eller −80 ° C tills de är klara att användas.

7. Utförande av western blotting med hjälp av lysater som samlats in från BMDM enligt stegen ovan eller från vävnadshomogenat

OBS: Om du använder vävnad kan den homogeniseras för hand eller genom en kraftdriven vävnadshomogenisator. Protokollet från Simpson76 ger en detaljerad beskrivning av vävnadshomogenisering.

  1. Förbered 1x löpande buffert: Kombinera 200 ml av 5x löpande buffertlager (tabell 1) och 800 ml avjoniserat vatten. Gör denna 1x löpande buffert strax före varje experiment.
  2. Bered elektroforesapparaten med en 12 % (vikt/volym) polyakrylamidgel med 10 brunnar. Fyll elektroforesapparaten med 1x löpande buffert. Ta sedan bort gelkammen.
    OBS: För att analysera kaspas-1, kaspas-11, kaspas-3, kaspas-7, kaspas-8 och kaspas-9 för varje prov behövs sex geler.
  3. För kaspas-1, kaspas-3, kaspas-7 och kaspas-8-blottor, planera att använda 30 μL av det kombinerade supernatanten och proteinlysatet i kaspaslysbuffert eller vävnadshomogenatet. För kaspas-11 och kaspas-9 blottar, planera att använda 20 μL av proteinlysatet i Ripa-buffert eller vävnadshomogenatet. Om proverna har förvarats vid −20 °C eller −80 °C, tina dem först på is.
  4. Värm till 100 °C i 5 minuter för alla provexemplar och centrifugera vid 14 500 × g i 30 s vid 4 °C före påfyllning. Ladda sedan långsamt 20 eller 30 μL av provet i varje körfält. Undvik att något prov flödar över i de andra körfälten. För att utvärdera alla sex kaspaser samtidigt, använd samma procedur för att ladda lämpliga prover i var och en av de sex gelerna.
  5. Anslut elektroforesapparaten till strömkällan. Ställ sedan in effekten på 80 V i 20 minuter för att starta gelkörningen och justera sedan effekten till 130 V i 45-60 minuter.
  6. Titta noga på färgämnesfronten och stäng av strömmen när färgämnesfronten är längst ner på gelén men ännu inte har skjutits ut ur gelén.
  7. Medan gelén är igång, förbered 1x överföringsbuffert genom att kombinera 700 ml avjoniserat vatten, 100 ml av 10x överföringsbuffertlagret (tabell 1) och 200 ml metanol. Gör 1x-lösningen färsk varje gång.
    OBS: Var försiktig eftersom metanol är brandfarligt. Utför överföringsbuffertberedningen bort från öppna lågor.
  8. Ta försiktigt bort gelen från elektroforesapparaten med hjälp av gelreleasern.
  9. Ställ in en överföringsstapel för varje gel.
    1. Aktivera ett PVDF-membran genom att blötlägga det i metanol i 1 min.
    2. Förblöt två bitar filterpapper, gelén och PVDF-membranet i överföringsbuffert i 5 minuter. Förvara PVDF-membranet och gelen i separata behållare under denna 5 minuters inkubation.
    3. Montera överföringsstapeln på det halvtorra systemet. Börja på den nedre platinanodsidan, placera en bit filterpapper, PVDF-membranet, gelén och slutligen en bit filterpapper. Rulla försiktigt ut eller tryck ut luftbubblor mellan lagren och stäng toppen av systemet. Se till att säkerhetsskyddet är säkrat innan du går vidare.
  10. Anslut till strömkällan. Ställ in strömmen på 25 V i 45 min.
  11. När överföringen är klar, demontera överföringsstapeln och samla membranet; Lägg den i en fyrkantig petriskål (inkubationsbricka).
  12. Utför membranblockering genom att tillsätta 15 ml av en 5 % (vikt/volym) skummjölkslösning (tabell 1). Inkubera membranet på en gungande skakapparat vid 50 rpm till 70 rpm vid rumstemperatur i 1 h.
    OBS: Detta är en pauspunkt - membranet kan antingen avlägsnas efter 1 timme eller förvaras i blockeringslösning vid 4 ° C över natten.
  13. Efter 1 h eller inkubation över natten, ta bort blockeringslösningen. Tillsätt 10 ml av den utspädda antikroppslösningen (anti-kaspas-1-antikropp, anti-kaspas-11-antikropp, kombinerad anti-kaspas-3 och anti-klyvd kaspas-3-antikropp, kombinerad anti-kaspas-7 och anti-klyvd kaspas-7-antikropp, kombinerad anti-kaspas-8 och anti-klyvd kaspas-8-antikropp eller anti-kaspas-9-antikropp) (tabell 1). Placera på en gungande skakapparat vid 50 rpm till 70 rpm för att inkubera vid rumstemperatur i 2 timmar eller vid 4 °C över natten (16 timmar).
  14. Samla upp antikroppslösningen (återanvänd upp till 3x eller kassera den) och tvätta genom att tillsätta 15 ml TBST (tabell 1) till membranet på en gungande shaker vid 50 rpm till 70 rpm vid rumstemperatur i 10 min. Ignorera TBST.
  15. Upprepa tvätten med 15 ml TBST enligt steg 14 totalt 3x.
  16. Tillsätt 10 ml av den utspädda sekundära HRP-konjugerade antikroppslösningen (antikanin för blottor färgade med primära antikroppar mot kaspas-3, kaspas-7, kaspas-8 eller kaspas-9; antimus för blottor färgade med primär antikropp mot kaspas-1; anti-råtta för blottor färgade med primär antikropp mot kaspas-11) (tabell 1). Inkubera på en gungande skakapparat vid 50 rpm till 70 rpm vid rumstemperatur i 1 h.
  17. Ta bort antikroppslösningen och tvätta genom att tillsätta 15 ml TBST till membranet på en gungande shaker vid 50 rpm till 70 rpm vid rumstemperatur i 10 min. Ignorera TBST.
  18. Upprepa tvätten med 15 ml TBST enligt steg 17 totalt 3x.
  19. Tillsätt 10 ml av det högkänsliga HRP-substratet till membranet. Låt den sitta i rumstemperatur i mörkret i 1 min.
  20. Ta bort membranet från underlaget. Fortsätt direkt till avbildningen med hjälp av en kemiluminiscenskamera med tillbehörets vita transfack isatt i det nedre läget. Exponera membranet med hjälp av det automatiska exponeringsläget (vanligtvis ~ 1-2 min exponeringstid).
  21. Använd membranet från kaspas-9- eller kaspase-11-blottningen (dvs. ett membran med RIPA-lysatprover), tillsätt 10 ml strippbuffert och inkubera på en gungande skakapparat vid 50 rpm till 70 rpm vid rumstemperatur i 5 minuter.
  22. Kassera strippbufferten och tvätta genom att tillsätta 15 ml TBST till membranet på en gungande skakapparat vid 50 rpm till 70 rpm vid rumstemperatur i 10 min. Ignorera TBST.
  23. Upprepa tvätten med 15 ml TBST enligt steg 22 totalt 3x.
  24. Utför membranblockering genom att tillsätta 15 ml av en 5% (vikt/volym) skummjölkslösning. Inkubera membranet på en gungande skakapparat vid 50 rpm till 70 rpm vid rumstemperatur i 1 h.
    OBS: Detta är en pauspunkt - membranet kan antingen avlägsnas efter 1 timme eller förvaras i blockeringslösning vid 4 ° C över natten.
  25. Efter 1 h eller inkubation över natten, ta bort blockeringslösningen. Tillsätt 10 ml utspädd anti-β-aktin (HRP-konjugerad) antikroppslösning. Placera på en gungande skakapparat vid 50 rpm till 70 rpm för att inkubera vid rumstemperatur i 1,5 timmar.
  26. Ta bort antikroppslösningen och tvätta genom att tillsätta 15 ml TBST till membranet på en gungande shaker vid 50 rpm till 70 rpm vid rumstemperatur i 10 min. Ignorera TBST.
  27. Upprepa tvätten med 15 ml TBST efter steg 26 totalt 3x.
  28. Tillsätt 10 ml av HRP-substratet med standardkänslighet till membranet. Låt den sitta i rumstemperatur i mörkret i 1 min.
  29. Fortsätt direkt till avbildningen med hjälp av en kemiluminiscenskamera med tillbehörets vita transfack isatt i det nedre läget. Exponera membranet med hjälp av läget för automatisk exponering (vanligtvis <1 min exponeringstid).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PANoptos har observerats som svar på många bakteriella, virala och svampinfektioner och andra inflammatoriska stimuli, liksom i cancerceller 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 . I dessa fall har aktivering av multipla kaspaser rapporterats. Med hjälp av exempelstimuleringarna i detta protokoll som är kända för att inducera PANoptos, nämligen IAV, HSV1 och F. novicida 44,48,50,51,53,57, förväntas klyvning observeras som ett surrogat för aktivering av multipla kaspaser (figur 2A-C ). Dessutom ingår LPS + ATP som en kontroll; denna kombination är en kanonisk NLRP3-inflammasomutlösare som förväntas inducera kaspas-1-aktivering. Aktiveringen av kaspas-1 kan visualiseras som svar på var och en av dessa utlösare genom klyvning av p45-proformen till den aktiva p20-formen (figur 2D). P20-formuläret kan sedan klyva GSDMD och initiera celldöd19.

På liknande sätt observeras aktiveringen av den apoptotiska initiatorn caspase, caspase-8, vilket betecknas med närvaron av den p18-klyvda formen (figur 2A-D). Den svaga aktiveringen av kaspas-9 kan också observeras i vissa fall med dessa stimuli (figur 2A-D). Nedströms om dessa initiatorer aktiveras effektorkaspaserna caspase-3 och caspase-7; Denna aktivering observeras som bildandet av den p17/19 klyvda formen av kaspas-3 och den p20-klyvda formen av kaspas-7 (figur 2A-D). Hittills har aktiveringen av kaspas-11 inte utvärderats i stor utsträckning i PANoptos, men dess aktivering har observerats i vissa sammanhang54. Caspase-11 förblir en viktig inflammatorisk kaspas, och dess aktivering kan observeras genom bildandet av dess p26-klyvda form. Medan viss lågnivåaktivering av caspase-11 ses, observeras inte robust aktivering som svar på IAV-, HSV1- eller F. novicida-infektion eller LPS + ATP-stimulering (figur 2A-D).

Celler som saknar uppströms PANoptos-sensorer genomgår inte celldöd som svar på PANoptos-inducerande stimuli. Till exempel inducerar IAV-infektion bildandet av ZBP1-PANoptosomen 48,51,53,57 och Zbp1-/- celler skyddas från celldöd under IAV-infektion (figur 3A). På liknande sätt inducerar HSV1- och F. novicida-infektioner bildandet av AIM2-PANoptosome44, och Aim2-/- celler misslyckas med att genomgå robust celldöd som svar på dessa infektioner (figur 3B, C). I celler som har brist på uppströmssensorn som är nödvändig för PANoptosombildning reduceras eller till och med elimineras aktiveringen av kaspaser signifikant, vilket kan ses av minskningen av intensiteten hos de klyvda banden i de västra blottorna (figur 2A-C). På samma sätt skyddas celler som saknar uppströms inflammasomsensorer från celldöd som svar på deras respektive stimuli, och Nlrp3-/- celler genomgår inte celldöd som svar på LPS + ATP (figur 3D). Dessa celler visar också minskad kaspasaktivering (figur 2D).

Figure 1
Figur 1: Översikt över försöksförfarandet. Benmärg isoleras och differentieras till benmärgshärledda makrofager. Dessa celler stimuleras sedan med en utlösare som aktiverar medfödd immunsignalering och celldöd, såsom infektion eller inflammatorisk stimulans. Efter att cellerna aktiveras och börjar genomgå PCD samlas lysatet upp och analyseras av western blotting för att övervaka kaspasklyvning till deras aktiva former. Förkortningar: BMDM = makrofager som härrör från benmärg; DAMPs = skadeassocierade molekylära mönster; III-PCD = inflammatorisk medfödd immunprogrammerad celldöd; PAMPs = patogenassocierade molekylära mönster; PCD = programmerad celldöd. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Aktivering av kaspaser som svar på stimuli. Kaspasaktivering från cellodlingslysat kan bedömas genom att utvärdera storleken på de produkter som körs på en elektroforetisk gel. (AD) Immunoblotanalys av pro- (P45) och aktiverad (P20) CASP1, pro- (P43) och klyvd (P36 och P26) CASP11, pro- (P35) och klyvd (P17/P19) CASP3, pro- (P35) och klyvd (P20) CASP7, pro- (P55) och klyvd (P44 och P18) CASP8, samt pro- (P49) och klyvd (P37) CASP9 i WT och Zbp1−/−, WT och Aim2−/−, eller WT och Nlrp3−/− BMDM efter (A) IAV-infektion, (B) HSV1-infektion, (C) Francisella novicida-infektion eller (D) LPS + ATP-stimulering. Bilder är representativa för tre oberoende experiment. Förkortningar: BMDM = makrofager som härrör från benmärg; CASP1 = kaspas-1; CASP3 = kaspas-3; CASP7 = kaspas-7; CASP8 = kaspas-8; CASP9 = kaspas-9; CASP11 = kaspas-11; HSV1 = herpes simplexvirus 1; IAV = influensa A-virus; LPS = lipopolysackarid; WT = vildtyp. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Hämning av celldöd när kaspasaktivering inte sker. (AD) Representativa bilder av celldöd i WT och Zbp1−/−, WT och Aim2−/−, eller WT och Nlrp3−/− BMDM efter (A) IAV-infektion, (B) HSV1-infektion, (C) Francisella novicida-infektion, eller (D) LPS + ATP-stimulering. Den röda masken betecknar döda celler. Skalstänger = 50 μm. Bilder är representativa för tre oberoende experiment. Förkortningar: BMDM = makrofager som härrör från benmärg; HSV1 = herpes simplexvirus 1; IAV = influensa A-virus; LPS = lipopolysackarid; WT = vildtyp. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1. Klicka här för att ladda ner tabellen. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Övervakning av kaspasklyvning och aktivering ger en av de mest omfattande bilderna av medfödd immun-PCD-aktivering som en del av det medfödda immunsvaret. Protokollet som beskrivs här visar en strategi för att övervaka kaspasaktivering som svar på IAV-, HSV1- och F. novicida-infektioner och den sterila utlösaren LPS + ATP, men många andra stimuli kan inducera PCD och kan användas i denna metod, vilket har visats i flera publikationer 44,48,49,50,51,52,53,54,56, 57,58,59,60,61,62. Denna procedur kan också användas för att karakterisera den medfödda immun-PCD som svar på nya triggers, där mekanismerna för PCD förblir okända. Att använda en kombination av vildtyp och genetiskt bristfälliga celler och jämföra aktiveringen av olika kaspaser mellan dessa populationer kan ge nya insikter om sensorerna och regulatorerna som är involverade i PCD som svar på en given stimulans.

Flera tekniska punkter bör beaktas vid utförandet av denna metod. För det första, eftersom denna metod innebär att infektera eller på annat sätt stimulera celler för att inducera celldöd, är det viktigt att använda sterila tekniker för isolering av cellerna och för efterföljande stimuleringar. Kontaminering kan påverka resultaten avsevärt, vilket leder till kaspasaktivering även under ostimulerade förhållanden. För att testa för detta är det bäst att alltid inkludera en ostimulerad kontroll när du samlar in proverna och laddar geler för caspase blottar. Vid plätering av cellerna är det dessutom viktigt att se till att cellerna räknas exakt och att klumpar inte uppstår. Om cellerna klumpas ihop kommer inkonsekvent antal celler att deponeras i brunnarna, och MOI och mängden protein per brunn kommer att påverkas. Vid utförande av de västra blottarna är det god praxis att jämföra bandmönstret för den oklyvda, pro-formen av kaspasen, samt att övervaka den klyvda formen för att säkerställa att konsekventa mängder protein samlades in och laddades över brunnarna. Men när det finns en hög nivå av kaspasaktivering i ett prov kan detta orsaka en distorsion i signalen, vilket leder till vad som verkar vara en minskning av proformen i de andra proverna, som vi visar med kaspas-8 i HSV1 och F. novicida-infektioner i detta exempel (figur 2B, C). Detta inträffar sannolikt på grund av ojämn antikroppsbindning orsakad av närvaron av för mycket protein på en viss plats på membranet, eller på grund av avbildningsartefakter där substratet blir övermättat i ett enda prov. Justering av antikroppsutspädningar eller bildinställningar kan hjälpa till att lösa problemet. Dessutom, när man etablerar en infektion eller stimulering för första gången, kan det vara fördelaktigt att använda en tidsförlopp för att identifiera när aktiveringen av varje kaspase inträffar. Utan en tidskurs kan uppgifterna vara vilseledande, eftersom den enskilda tidpunkten som väljs kan vara för tidig eller för sen, vilket gör att kaspasaktivering missas och olämpliga slutsatser dras om dess engagemang. På samma sätt kan testning av olika MOI för infektiösa stimuli också vara fördelaktigt för att identifiera de specifika förhållanden under vilka kaspas(er) aktiveras.

Elektroforessteget kräver också precision. När proverna förbereds för att laddas på gelén ska rören alltid centrifugeras först och endast supernatanten ska laddas. Olösligt protein kan störa driften av gelén och den efterföljande analysen av data. Det kombinerade supernatanten och proteinlysatet bör användas för detektion av kaspas-1 snarare än ett rent celllysat. Detta kommer att förbättra detekteringens känslighet avsevärt. Caspase-3, caspase-7 och caspase-8 kan också detekteras väl i det kombinerade supernatant- och proteinlysatet. För bästa resultat vid detektering av kaspas-11 och kaspas-9 är dock proteinlysatet som samlats in i Ripa-bufferten tillräckligt. Eftersom den relativa förekomsten av varje kaspas i lysatet kan vara låg, bör så mycket prov som möjligt laddas på gelén. Detta kräver långsam och stadig pipettering för att undvika överflöd i de närliggande brunnarna. Om dålig separation observeras mellan de pro- och klyvda formerna av kaspaserna kan gelens körtid förlängas, eller en lägre andel akrylamid kan användas för att optimera separationen.

Slutligen har antikropparna som listas i detta protokoll optimerats för användning med mus-BMDM, och flera grupper har noggrant testat dem med genetiskt bristfälliga celler som kontroller för att bekräfta att det inte finns några icke-specifika band vid molekylvikterna av intresse. Medan andra antikroppar också kan fungera, är de som listas här optimala. Dessutom fungerar många av dessa antikroppar också bra i vävnadslysater, och andra cellpopulationer kan också samlas in och stimuleras in vitro för analys. Användning av cellinjer eller primära celler från människor eller andra arter är också möjligt men kommer att kräva en ytterligare bedömning av antikropparna för optimering. Humana anti-kaspas-1 (1:1 000) och humana anti-kaspas-8 (1:1 000; se materialförteckning) har framgångsrikt använts för sådana bedömningar, och samma anti-kaspas-3, anti-klyvda kaspas-3, anti-kaspas-7 och anti-klyvda kaspas-7-antikroppar som ingår i detta protokoll kan användas för både mus- och humanceller 44,56,62.

Vikten av att förstå PCD-vägar, inklusive pyroptos, apoptos, nekrotos och PANoptos, som en integrerad del av det medfödda immunsvaret växer, eftersom överhörning mellan PCD-vägar alltmer karakteriseras och celldödsmolekyler identifieras som terapeutiska mål över sjukdomsspektrumet 3,4 . Att fortsätta identifiera de medfödda immunsensorerna som inducerar PCD såväl som III-PCD och karakterisera tidpunkten och samspelet för kaspasaktivering kommer att förbättra förmågan att terapeutiskt modulera medfödda immun-PCD-vägar och förbättra patientresultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

T.-D.K. är konsult för Pfizer.

Acknowledgments

Vi tackar medlemmarna i Kanneganti-labbet för deras kommentarer och förslag, och vi tackar J. Gullett, PhD, för vetenskapligt redigeringsstöd. Arbetet i vårt laboratorium stöds av National Institutes of Health (NIH) bidrag AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 och CA253095 (till T.-D.K.) och av American Lebanese Syrian Associated Charities (till T.-D.K.). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171 (1996).
  2. Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21 (2016).
  3. Gullett, J. M., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. It's all in the PAN: Crosstalk, plasticity, redundancies, switches, and interconnectedness encompassed by PANoptosis underlying the totality of cell death-associated biological effects. Cells. 11 (9), 1495 (2022).
  4. Pandian, N., Kanneganti, T. D. PANoptosis: A unique innate immune inflammatory cell death modality. Journal of Immunology. 209 (9), 1625-1633 (2022).
  5. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  6. Shi, Y. Caspase activation: Revisiting the induced proximity model. Cell. 117 (7), 855-858 (2004).
  7. Galluzzi, L., Lopez-Soto, A., Kumar, S., Kroemer, G. Caspases connect cell-death signaling to organismal homeostasis. Immunity. 44 (2), 221-231 (2016).
  8. Fernandes-Alnemri, T., Litwack, G., Alnemri, E. S. CPP32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 30761-30764 (1994).
  9. Tewari, M., et al. Yama/CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase. Cell. 81 (5), 801-809 (1995).
  10. Nicholson, D. W., et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature. 376 (6535), 37-43 (1995).
  11. Stennicke, H. R., et al. Pro-caspase-3 is a major physiologic target of caspase-8. Journal of Biological Chemistry. 273 (42), 27084-27090 (1998).
  12. Twiddy, D., Cohen, G. M., Macfarlane, M., Cain, K. Caspase-7 is directly activated by the approximately 700-kDa apoptosome complex and is released as a stable XIAP-caspase-7 approximately 200-kDa complex. Journal of Biological Chemistry. 281 (7), 3876-3888 (2006).
  13. Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Reviews of Immunology. 38, 567-595 (2020).
  14. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
  15. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: Controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (3), 231-241 (2008).
  16. Morioka, S., Maueröder, C., Ravichandran, K. S. Living on the edge: Efferocytosis at the interface of homeostasis and pathology. Immunity. 50 (5), 1149-1162 (2019).
  17. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  18. Rogers, C., et al. Cleavage of DFNA5 by caspase-3 during apoptosis mediates progression to secondary necrotic/pyroptotic cell death. Nature Communications. 8, 14128 (2017).
  19. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  20. Shi, J., Gao, W., Shao, F. Pyroptosis: Gasdermin-mediated programmed necrotic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 245-254 (2017).
  21. Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
  22. Aglietti, R. A., et al. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7858-7863 (2016).
  23. Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341 (6151), 1250-1253 (2013).
  24. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  25. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  26. Lamkanfi, M., et al. Targeted peptidecentric proteomics reveals caspase-7 as a substrate of the caspase-1 inflammasomes. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (12), 2350-2363 (2008).
  27. Kalai, M., et al. Tipping the balance between necrosis and apoptosis in human and murine cells treated with interferon and dsRNA. Cell Death & Differentiation. 9 (9), 981-994 (2002).
  28. Li, C., et al. Development of atopic dermatitis-like skin disease from the chronic loss of epidermal caspase-8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22249-22254 (2010).
  29. Kovalenko, A., et al. Caspase-8 deficiency in epidermal keratinocytes triggers an inflammatory skin disease. Journal of Experimental Medicine. 206 (10), 2161-2177 (2009).
  30. Kang, T. B., et al. Caspase-8 serves both apoptotic and nonapoptotic roles. Journal of Immunology. 173 (5), 2976-2984 (2004).
  31. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  32. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  33. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  34. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  35. Hitomi, J., et al. Identification of a molecular signaling network that regulates a cellular necrotic cell death pathway. Cell. 135 (7), 1311-1323 (2008).
  36. Malireddi, R. K., Ippagunta, S., Lamkanfi, M., Kanneganti, T. D. Cutting edge: Proteolytic inactivation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 by the Nlrp3 and Nlrc4 inflammasomes. Journal of Immunology. 185 (6), 3127-3130 (2010).
  37. Tsuchiya, K., et al. Caspase-1 initiates apoptosis in the absence of gasdermin D. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  38. Taabazuing, C. Y., Okondo, M. C., Bachovchin, D. A. Pyroptosis and apoptosis pathways engage in bidirectional crosstalk in monocytes and macrophages. Cell Chemical Biology. 24 (4), 507-514 (2017).
  39. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. Journal of Immunology. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  40. Man, S. M., et al. Inflammasome activation causes dual recruitment of NLRC4 and NLRP3 to the same macromolecular complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7403-7408 (2014).
  41. Man, S. M., et al. Salmonella infection induces recruitment of Caspase-8 to the inflammasome to modulate IL-1beta production. Journal of Immunology. 191 (10), 5239-5246 (2013).
  42. Van Opdenbosch, N., et al. Caspase-1 engagement and TLR-induced c-FLIP expression suppress ASC/caspase-8-dependent apoptosis by inflammasome sensors NLRP1b and NLRC4. Cell Reports. 21 (12), 3427-3444 (2017).
  43. Pierini, R., et al. AIM2/ASC triggers caspase-8-dependent apoptosis in Francisella-infected caspase-1-deficient macrophages. Cell Death & Differentiation. 19 (10), 1709-1721 (2012).
  44. Lee, S., et al. AIM2 forms a complex with pyrin and ZBP1 to drive PANoptosis and host defence. Nature. 597 (7876), 415-419 (2021).
  45. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death & Differentiation. 20 (9), 1149-1160 (2013).
  46. Lukens, J. R., et al. Dietary modulation of the microbiome affects autoinflammatory disease. Nature. 516 (7530), 246-249 (2014).
  47. Gurung, P., Burton, A., Kanneganti, T. D. NLRP3 inflammasome plays a redundant role with caspase 8 to promote IL-1beta-mediated osteomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4452-4457 (2016).
  48. Kuriakose, T., et al. ZBP1/DAI is an innate sensor of influenza virus triggering the NLRP3 inflammasome and programmed cell death pathways. Science Immunology. 1 (2), (2016).
  49. Malireddi, R. K. S., et al. TAK1 restricts spontaneous NLRP3 activation and cell death to control myeloid proliferation. Journal of Experimental Medicine. 215 (4), 1023-1034 (2018).
  50. Malireddi, R. K. S., et al. Innate immune priming in the absence of TAK1 drives RIPK1 kinase activity-independent pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and inflammatory disease. Journal of Experimental Medicine. 217 (3), (2020).
  51. Christgen, S., et al. Identification of the PANoptosome: A molecular platform triggering pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 237 (2020).
  52. Malireddi, R. K. S., et al. RIPK1 distinctly regulates Yersinia-induced inflammatory cell death, PANoptosis. Immunohorizons. 4 (12), 789-796 (2020).
  53. Zheng, M., Karki, R., Vogel, P., Kanneganti, T. D. Caspase-6 is a key regulator of innate immunity, inflammasome activation, and host defense. Cell. 181 (3), 674-687 (2020).
  54. Karki, R., et al. ADAR1 restricts ZBP1-mediated immune response and PANoptosis to promote tumorigenesis. Cell Reports. 37 (3), 109858 (2021).
  55. Wang, Y., et al. Single cell analysis of PANoptosome cell death complexes through an expansion microscopy method. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (10), 531 (2022).
  56. Malireddi, R. K. S., et al. Inflammatory cell death, PANoptosis, mediated by cytokines in diverse cancer lineages inhibits tumor growth. Immunohorizons. 5 (7), 568-580 (2021).
  57. Kesavardhana, S., et al. The Zα2 domain of ZBP1 is a molecular switch regulating influenza-induced PANoptosis and perinatal lethality during development. Journal of Biological Chemistry. 295 (24), 8325-8330 (2020).
  58. Banoth, B., et al. ZBP1 promotes fungi-induced inflammasome activation and pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 18276-18283 (2020).
  59. Karki, R., et al. Interferon regulatory factor 1 regulates PANoptosis to prevent colorectal cancer. JCI Insight. 5 (12), 136720 (2020).
  60. Zheng, M., et al. Impaired NLRP3 inflammasome activation/pyroptosis leads to robust inflammatory cell death via caspase-8/RIPK3 during coronavirus infection. Journal of Biological Chemistry. 295 (41), 14040-14052 (2020).
  61. Karki, R., et al. Synergism of TNF-α and IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 184 (1), 149-168 (2021).
  62. Karki, R., et al. ZBP1-dependent inflammatory cell death, PANoptosis, and cytokine storm disrupt IFN therapeutic efficacy during coronavirus infection. Science Immunology. 7 (74), (2022).
  63. Jiang, W., Deng, Z., Dai, X., Zhao, W. PANoptosis: A new insight into oral infectious diseases. Frontiers in Immunology. 12, 789610 (2021).
  64. Chi, D., et al. Real-time induction of macrophage apoptosis, pyroptosis, and necroptosis by Enterococcus faecalis OG1RF and two root canal isolated strains. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 720147 (2021).
  65. Lin, J. F., et al. Phosphorylated NFS1 weakens oxaliplatin-based chemosensitivity of colorectal cancer by preventing PANoptosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 54 (2022).
  66. Song, M., et al. Self-assembled polymeric nanocarrier-mediated co-delivery of metformin and doxorubicin for melanoma therapy. Drug Delivery. 28 (1), 594-606 (2021).
  67. Boucher, D., Chan, A., Ross, C., Schroder, K. Quantifying caspase-1 activity in murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 1725, 163-176 (2018).
  68. Boucher, D., Duclos, C., Denault, J. B. General in vitro caspase assay procedures. Methods in Molecular Biology. 1133, 3-39 (2014).
  69. Kaushal, V., Herzog, C., Haun, R. S., Kaushal, G. P. Caspase protocols in mice. Methods in Molecular Biology. 1133, 141-154 (2014).
  70. Swacha, P., Gekara, N. O., Erttmann, S. F. Biochemical and microscopic analysis of inflammasome complex formation. Methods in Enzymology. 625, 287-298 (2019).
  71. Talley, S., et al. A caspase-1 biosensor to monitor the progression of inflammation in vivo. Journal of Immunology. 203 (9), 2497-2507 (2019).
  72. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 receptor differentially couples to distinct release pathways for IL-1beta in mouse macrophage. Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  73. Yu, J. W., et al. Cryopyrin and pyrin activate caspase-1, but not NF-kappaB, via ASC oligomerization. Cell Death & Differentiation. 13 (2), 236-249 (2006).
  74. Henry, C. M., Martin, S. J. Caspase-8 acts in a non-enzymatic role as a scaffold for assembly of a pro-inflammatory "FADDosome" complex upon TRAIL stimulation. Molecular Cell. 65 (4), 715-729 (2017).
  75. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  76. Simpson, R. J. Homogenization of mammalian tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 191
Utvärdering av kaspasaktivering för att bedöma medfödd immuncellsdöd
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, J. H., Tweedell, R. E.,… More

Han, J. H., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter