Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Evaluering af caspaseaktivering for at vurdere medfødt immuncelledød

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64308
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

Denne protokol beskriver en omfattende metode til vurdering af caspaseaktivering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 og caspase-11) som reaktion på både in vitro og in vivo (hos mus) modeller for infektion, sterile fornærmelser og kræft for at bestemme initieringen af celledødsveje, såsom pyroptose, apoptose, nekrotose og PANoptose.

Abstract

Medfødt immunitet giver den kritiske første forsvarslinje som reaktion på patogener og sterile fornærmelser. En vigtig mekanistisk komponent i dette respons er initieringen af medfødt immunprogrammeret celledød (PCD) for at eliminere inficerede eller beskadigede celler og udbrede immunresponser. Imidlertid er overskydende PCD forbundet med betændelse og patologi. Derfor er forståelse af aktivering og regulering af PCD et centralt aspekt ved karakterisering af medfødte immunresponser og identifikation af nye terapeutiske mål på tværs af sygdomsspektret.

Denne protokol tilvejebringer metoder til karakterisering af medfødt immun-PCD-aktivering ved overvågning af caspaser, en familie af cysteinafhængige proteaser, der ofte er forbundet med forskellige PCD-veje, herunder apoptose, pyroptose, nekrotose og PANoptose. Indledende rapporter karakteriserede caspase-2, caspase-8, caspase-9 og caspase-10 som initiator-caspaser og caspase-3, caspase-6 og caspase-7 som effektor-caspaser i apoptose, mens senere undersøgelser fandt de inflammatoriske caspaser, caspase-1, caspase-4, caspase-5 og caspase-11, drev pyroptose. Det er nu kendt, at der er omfattende krydstale mellem caspaserne og andre medfødte immun- og celledødsmolekyler på tværs af de tidligere definerede PCD-veje, hvilket identificerer et centralt videnshul i den mekanistiske forståelse af medfødt immunitet og PCD og fører til karakterisering af PANoptosis. PANoptose er en unik medfødt immuninflammatorisk PCD-vej reguleret af PANoptosome-komplekser, som integrerer komponenter, herunder caspaser, fra andre celledødsveje.

Her tilvejebringes metoder til vurdering af aktiveringen af caspaser som reaktion på forskellige stimuli. Disse metoder muliggør karakterisering af PCD-veje både in vitro og in vivo, da aktiverede caspaser gennemgår proteolytisk spaltning, der kan visualiseres ved western blotting ved anvendelse af optimale antistoffer og blottingbetingelser. Der er etableret en protokol og western blotting-arbejdsgang, der muliggør vurdering af aktiveringen af flere caspaser fra den samme cellulære population, hvilket giver en omfattende karakterisering af PCD-processerne. Denne metode kan anvendes på tværs af forskningsområder inden for udvikling, homeostase, infektion, inflammation og kræft til at evaluere PCD-veje gennem cellulære processer inden for sundhed og sygdom.

Introduction

Det medfødte immunsystem fungerer som den første forsvarslinje under infektion og som reaktion på sterile stimuli, såsom vævsskade og ændringer i homeostase. Medfødte immunsensorer på celleoverfladen og i cytoplasmaet reagerer på patogen- eller skadeassocierede molekylære mønstre (henholdsvis PAMP'er eller DAMP'er) for at udløse inflammatoriske signalveje og cellulære reaktioner. En af nøgleprocesserne i det medfødte immunrespons er induktion af celledød for at fjerne inficerede eller beskadigede celler og drive yderligere medfødte og adaptive immunresponser. Programmeret celledød (PCD) er en meget bevaret proces på tværs af arter, der fremhæver dens evolutionære betydning som en medfødt immunmekanisme.

Der er flere medfødte immun-PCD-veje, der kan aktiveres i alle celletyper. Caspaser er en nøglefamilie af stærkt konserverede, intracellulære, cysteinafhængige proteaser, der er kritiske på tværs af mange PCD-veje, herunder den traditionelt ikke-inflammatoriske apoptosevej samt inflammatoriske PCD-veje såsom pyroptose, nekrotose og PANoptosis 1,2,3,4,5 . Der er 11 humane og 10 murine caspaser, der er veldefinerede, samt pseudo-caspaser, der kan være funktionelle, og de fleste udtrykkes konstitutivt som inaktive monomere eller dimeriske pro-caspaser, der kræver spaltning til aktivering 6,7. Kaspaser indeholder også vigtige domæner til rekruttering og dannelse af multiproteinkomplekser. Disse omfatter caspase aktivering og rekruttering domæne (CARD), som kan findes i caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 og caspase-11, eller død effektor domæne (DED), som findes i caspase-8 og caspase-10. Gennem både deres proteolytiske aktivitet og deres evne til at danne multiproteinkomplekser er caspaser kritiske drivkræfter for medfødt immun-PCD.

Caspasernes rolle i medfødt immun-PCD blev først identificeret i apoptose, hvor initiatorcaspaserne, caspase-2, caspase-8, caspase-9 og caspase-10, aktiverer bødlekaspaserne, caspase-3, caspase-6 og caspase-7, for at drive celledød 8,9,10,11,12. Initiator-caspaser kan aktiveres af forskellige signalkaskader; Den ydre vej aktiverer caspase-8 gennem ekstracellulær ligand-induceret dødsreceptorsignalering, og den indre vej aktiverer caspase-9 gennem forstyrrelse af mitokondrieintegritet13. Aktiverede initiatorcaspaser spalter linkeren, der adskiller de store og små katalytiske underenheder af bødlekaser for at producere deres aktive former. Bødlekaserne spalter derefter deres substrater for at adskille cellen, hvilket resulterer i DNA-nedbrydning, membranblæsning, nuklear fragmentering og frigivelse af apoptotiske legemer14,15. Denne proces ender typisk i en ikke-lytisk og ikke-inflammatorisk form for celledød, når den kombineres med den øjeblikkelige clearance af de døende celler ved efferocytose16. Imidlertid kan defekter i efferocytose eller mangel på fagocytiske celler føre til akkumulering af apoptotiske celler, som derefter gennemgår lytisk og inflammatorisk celledød17,18.

De inflammatoriske caspaser, herunder caspase-1 (menneske og mus), caspase-4 og caspase-5 (menneske) og caspase-11 (mus), har vist sig at blive aktiveret under en form for inflammatorisk medfødt immun-PCD (III-PCD) kaldet pyroptose. Caspase-1-aktivering er forbundet med dannelsen af inflammasomer, som er multiproteinkomplekser indeholdende en cytosolisk medfødt immunsensor, et adaptormolekyle (apoptoseassocieret specklignende protein indeholdende et CARD [ASC]) og caspase-1. Dannelsen af dette kompleks tillader caspase-1 at gennemgå nærhedsmedieret autoproteolyse for at frigive sin aktive form, som kan spalte målsubstrater, herunder de proinflammatoriske cytokiner interleukin (IL)-1β og IL-18 og det poredannende molekyle gasdermin D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspase-11, caspase-4 og caspase-5 kan også aktivere GSDMD uden opstrøms dannelse af inflammasomet efter detektering af PAMP'er såsom lipopolysaccharid (LPS)19,20. Disse caspaser gennemgår dimerisering efterfulgt af oligomerisering og selvspaltning til aktivering ved binding til cytosolisk LPS, hvilket fører til ikke-kanonisk inflammasomaktivering 24,25,26 og caspase-1-aktivering på en celle-iboende måde for at inducere IL-1β og IL-18 modning 20. Modningen og frigivelsen af disse proinflammatoriske cytokiner karakteriserer disse caspaser som "inflammatoriske". Derudover har den apoptotiske caspase-8 vist sig at lokalisere til inflammasomet, hvilket giver en forbindelse mellem apoptotiske og pyroptotiske processer. Undersøgelser har vist, at den apoptotiske caspase-8 også er kritisk for regulering af en anden form for PCD kaldet necroptosis. Tabet af caspase-8 resulterer i spontan receptor-interagerende serin-threonin kinase 3 (RIPK3)-medieret blandet afstamning kinase domæne-lignende pseudokinase (MLKL) aktivering for at drive III-PCD vejen for necroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

Mens caspaser historisk er blevet klassificeret som "apoptotisk" eller "inflammatorisk" baseret på den type celledød, de initierer, tyder voksende beviser på, at der er omfattende krydstale mellem de medfødte immun-PCD-veje gennem caspaser 3,4. For eksempel spalter den inflammatoriske caspase-1 fra inflammasomer den apoptotiske caspase-7 på sit kanoniske aktiveringssted34. Caspase-1-aktivering kan også føre til spaltning af apoptotiske substrater, såsom poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1)36. I celler, der mangler GSDMD, kan caspase-1 også spalte caspase-337,38. Derudover kan den kanonisk apoptotiske caspase-3 spalte gasdermin E (GSDME) for at inducere PCD17,18 og behandler også GSDMD i en inaktiv form40. Desuden er caspase-8 rekruttering til inflammasomkomplekset blevet observeret 39,40,41,42,43,44,45, og caspase-8 er en nøgleregulator for kanonisk og ikke-kanonisk inflammasomaktivering 39. Der er også overlappende og overflødige roller for caspase-8 og caspase-1 i mange inflammatoriske tilstande, og medfødt immun-PCD karakteriseret ved aktivering af pyroptotiske, apoptotiske og necroptotiske komponenter forekommer på tværs af sygdomsspektret 39,46,47,48,49,50.

Baseret på denne krydstale mellem inflammatoriske og apoptotiske caspaser blev der identificeret et centralt hul i den mekanistiske forståelse af medfødt immunitet og PCD, hvilket førte til opdagelsen af PANoptose. PANoptose er en unik form for III-PCD, der aktiveres som reaktion på patogener, PAMP'er, DAMP'er og ændringer i homeostase og reguleres af PANoptosomer - mangefacetterede makromolekylære komplekser, der integrerer komponenter fra andre celledødsveje 44,50,51,52,53,54,55 . Totaliteten af de biologiske virkninger i PANoptose kan ikke individuelt redegøres for ved pyroptose, apoptose eller necroptose alene 3,4,35,36,39,46,47,48, da PANoptose er karakteriseret ved aktivering af flere caspaser, herunder caspase-1, caspase-11, caspase-8, caspase-9, caspase-3 og / eller caspase-7, Afhængigt af konteksten 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptose er i stigende grad blevet impliceret i infektiøse og inflammatoriske sygdomme samt i kræft og kræftbehandlinger 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

I betragtning af den væsentlige rolle, som caspaser spiller på tværs af celledødsveje, herunder i apoptose, pyroptose, nekrotose og PANoptose, er det vigtigt at udvikle teknikker til at karakterisere deres aktivering og forstå den fulde kompleksitet af PCD-veje. Protokollen her beskriver en metode til at stimulere celler og måle den efterfølgende aktivering af caspaser (figur 1). Denne metode udnytter den proteolytiske spaltning af caspaser, som generelt er nødvendig for deres aktivering, som et middel til at studere dem. Gennem western blotting kan proteinstørrelserne bestemmes, hvilket muliggør klar visualisering og differentiering af inaktive pro-caspaser og deres aktiverede, spaltede former.

De største fordele ved denne protokol er 1) dens evne til at vurdere aktiveringen af flere caspaser parallelt fra en enkelt population af endogene celler for mere præcist at bestemme PCD-aktivering og 2) brugen af relativt enkle laboratorieteknikker, der ikke kræver omfattende træning eller dyrt udstyr. Tidligere protokoller har brugt western blotting, fluorescerende reportere eller antistoffarvning til at overvåge caspaseaktivering i kultursupernatanter, celle- og vævslysater, hele celler via mikroskopi og in vivo 67,68,69,70,71, men disse teknikker overvåger generelt kun en eller to caspaser i en prøve. Mens syntetiske peptidsubstrater indeholdende caspase spaltningssteder, der fluorescerer ved spaltning, er blevet brugt til at overvåge caspaseaktivering i celle- eller vævslysater69, kan disse substrater ofte spaltes af mere end en caspase, hvilket gør det vanskeligt at bestemme den specifikke aktivering af individuelle caspaser i dette system. Derudover giver brugen af western blotting snarere end brugen af fluorescerende reportere eller andre tagbaserede metoder forskere mulighed for at bruge endogene celler i stedet for at skabe specifikke cellelinjer med reportergener. Der er flere fordele ved at bruge endogene celler, herunder det faktum, at mange udødeliggjorte cellelinjer manglernøglecelledødsmolekyler 72,73, hvilket kan påvirke resultaterne. Derudover giver brug af endogene celler mulighed for evaluering af forskellige celletyper, såsom makrofager, epitelceller og endotelceller, snarere end en enkelt afstamning. Western blotting er også en relativt enkel og omkostningseffektiv teknik, der kan udføres i laboratorier rundt om i verden uden behov for stort, dyrt udstyr eller komplicerede opsætninger.

Denne protokol er bredt anvendelig på tværs af biologi til at forstå både celledødsafhængige og celledødsuafhængige funktioner hos caspaser, herunder deres stilladsroller og funktioner i andre inflammatoriske signalveje74. Anvendelse af denne metode giver mulighed for en samlet tilgang i undersøgelsen af medfødte immun-PCD-veje og inflammatorisk signalering på tværs af sygdomme og tilstande, og denne protokol kan bruges til at identificere kritiske reguleringsprocesser og mekanistiske forbindelser, der vil informere udviklingen af fremtidige terapeutiske strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrenes brug og procedurer blev godkendt af St. Jude Children's Research Hospital Committee on the Use and Care of Animals.

1. Forberedelse af løsningerne

  1. Forbered medier med L929-kondition.
    1. Plade 1 × 106 L929-celler (se materialetabel) i en 182 cm2 vævskulturkolbe indeholdende 50 ml L929-dyrkningsmedier (se tabel 1 vedrørende fremstilling af medier).
    2. Cellerne dyrkes i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
    3. Efter 7 dage opsamles supernatanten, og filteret filtreres med et 0,45 μm filter. Forbered 50 ml alikvoter (opbevar frosne delprøver ved -80 °C i op til 1 år).
  2. Forbered 500 ml knoglemarvsafledte makrofagkulturmedier (BMDM) (tabel 1).
  3. Forbered 500 ml BMDM-stimuleringsmedier (tabel 1).
  4. Forbered 500 ml medier til infektion (tabel 1).
  5. Forbered 100 ml 1 M Tris buffer (tabel 1).
  6. Forbered 4x natriumdodecylsulfat (SDS) buffer (tabel 1).
  7. Der fremstilles 1 ml 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT, tabel 1).
  8. Forbered 40 ml caspase lysebuffer (tabel 1).
  9. Forbered 100 ml 1,5 M Tris buffer (tabel 1).
  10. Forbered 100 ml af en 10% (vægt/vol) SDS-opløsning (tabel 1).
  11. Der fremstilles 50 ml af en buffer på 2x radioaktivt immunudfældningsassay (RIPA) (tabel 1).
  12. Forbered en 5 mg/ml LPS-opløsning (tabel 1).
  13. Forbered en 0,5 M ATP-opløsning (tabel 1).
  14. Forbered de vestlige blotting-opløsninger.
    1. Forbered 1 L 5x løbende bufferlager (tabel 1).
    2. Forbered 1 L 10x overførselsbufferlager (tabel 1).
    3. Forbered 1 liter Tris-bufret saltvand med Tween 20 (TBST, tabel 1).
    4. Forbered 100 ml af en 5% (vægt/vol) skummetmælksblokerende opløsning (tabel 1).
  15. Forbered de primære antistofopløsninger.
    1. Forbered 10 ml caspase-1 primært antistof (tabel 1).
    2. Forbered 10 ml caspase-11 primært antistof (tabel 1).
    3. Forbered 10 ml caspase-3 primært antistof (tabel 1).
    4. Forbered 10 ml caspase-7 primært antistof (tabel 1).
    5. Forbered 10 ml caspase-8 primært antistof (tabel 1).
    6. Forbered 10 ml caspase-9 primært antistof (tabel 1).
    7. Forbered 10 ml HRP-konjugeret primært β-actin primært antistof (tabel 1).
  16. Forbered de sekundære antistofopløsninger.
    1. Forbered 10 ml anti-kanin sekundært antistof (tabel 1).
    2. Forbered 10 ml sekundært antistof mod mus (tabel 1).
    3. Forbered 10 ml sekundært antistof mod rotter (tabel 1).

2. Isolering af knoglemarvsafledte makrofager

BEMÆRK: Til denne protokol kan 6-10 uger gamle vildtypemus med intakte PCD-veje eller mutante mus med PCD-regulatorer, effektorer eller molekyler af interesse slettes eller ændres.

  1. Aflive en mus i et CO 2 kammer med en strømningshastighed, der fortrænger 10% -30% af burvolumen pr. Min i2-3 min. Udfør derefter en sekundær eutanasi-metode, såsom cervikal dislokation. Følg alle yderligere facilitets-, institutions- og regeringsspecifikke retningslinjer og bestemmelser, hvor det er relevant.
  2. Disseker musen for at hente bagbenets knogler.
    1. Fastgør musen på ryggen, så maven er udsat. Spray med 70% (vol / vol) ethanol for at sterilisere bagbenene og maven.
      FORSIGTIG: Ethanol er brandfarligt. Hold det væk fra åben ild.
    2. Brug en saks til at lave et snit i midterlinjen af maven; Fortsæt med at skære mod benene for at gøre lårbenene synlige.
    3. Tag højre bagben og træk huden væk fra kroppen mod midterlinjen. Fjern benet fra kroppen ved at skære adduktormusklerne mod midterlinjen; Skær derefter benet mellem hofteleddet og rygsøjlen. Skær derefter poten distalt af til anklen, og fjern overskydende væv fra knoglen ved at skrælle huden af og bruge let åbnet saks til at fjerne kalvevævet.
    4. Placer benet på et 70% (vol / vol) ethanol-gennemblødt håndklæde og dissekere skinnebenet og lårbenet.
      1. Lås skinnebenet og lårbenet hver med et separat sæt tang. Tryk forsigtigt skinnebenet mod knæleddets naturlige retning; Dette vil få skinnebenet til at bryde ved knæet.
      2. Brug tang og dissekeresaks, hvis det er nødvendigt for at fjerne eventuelt resterende hængende væv. Gem skinnebenet til senere brug ved at placere det på det ethanol-gennemblødte håndklæde.
      3. Saml lårbenet på samme måde ved at snappe knæet af.
    5. Gentag trin 3 og 4 ovenfor for venstre ben for at fjerne det fra kroppen og dissekere skinnebenet og lårbenet.
    6. Spray knoglerne med 70% (vol / vol) ethanol.
    7. Rens knoglerne ved at placere dem på et rent 70% (vol / vol) ethanol-gennemblødt håndklæde, klemme den kødfulde del i håndklædet og gnide håndklædet mod knoglen for at fjerne overskydende væv.
  3. Når begge lårben og begge skinneben er rene, spray alle fire knogler med 70% (vol / vol) ethanol. Saml knoglerne i en steril petriskål og skyl dem med 10 ml BMDM kulturmedier ved forsigtigt at svinge mediet i fadet.
  4. Fyld en 10 ml sprøjte med 10 ml friske BMDM kulturmedier og påsæt en 25 G kanyle.
  5. Pick up tibia ved hjælp af tang; Skær derefter ankelleddet i en ~ 45 ° vinkel.
  6. Skyl knoglemarven fra skinnebenet.
    1. Hold skinnebenet over et 50 ml rør, med den smalle ende af skinnebenet pegende nedad. Fordel mediet over skinnebenet fra den fyldte sprøjte.
    2. Indsæt nålen (forsigtigt først) i den øverste ende af marven og dispenser mediet.
    3. Fjern nålen, og indsæt den igen. Brug korte højtryksskub til at dispensere mediet og flytte nålen ind i marven.
    4. Når mediet begynder at strømme ud fra bunden af knoglen, skal du bruge korte højtryksskub for at fortsætte med at skylle cellerne ud. Overvåg knoglens farve under denne proces, og kassér den, når knoglen er hvid.
    5. Gør dette for begge tibias.
  7. Gentag trin 5 og 6 ovenfor for lårbenene, skær ved hofteleddet, da skinnebenet blev skåret i ankelleddet. Brug det samme 50 ml rør til at opsamle BMDM-kulturmediet, når marven skylles.
  8. Når alle fire knogler er skyllet, suges marven og mediet fra 50 ml røret op og ned 3x gennem en 18 G kanyle på en 10 ml sprøjte, og siderne af røret skylles hver gang for at sprede marven.
  9. Juster det endelige volumen i 50 ml røret til 30 ml med BMDM-kulturmedier, og sørg for, at cellerne er grundigt suspenderet.
  10. Brug en 70 μm cellesi til at filtrere BMDM-kulturmediet fra 50 ml røret.
  11. Plade den resulterende cellesuspension, som indeholder knoglemarvsstamcellerne, i tre 150 mm vævskulturskåle ved at tilsætte 10 ml (eller ~ 20 × 106 celler) til hver. Tilsæt derefter yderligere 10 ml BMDM-kulturmedier til hver skål. Der inkuberes i en befugtet inkubator ved 37 °C.

3. Differentiering af BMDM'erne og plettering til eksperimenterne

  1. De belagte knoglemarvsstamceller inkuberes ved 37 °C i 3 dage. Fjern derefter hver skål, og tilsæt yderligere 5-8 ml BMDM-kulturmedier (tabel 1). Vend tilbage til inkubatoren ved 37 °C.
  2. På dag 5 efter den første plettering fjernes hver skål, og der tilsættes yderligere 5 ml BMDM-kulturmedier. Vend tilbage til inkubatoren ved 37 °C.
  3. På dag 6 skal du fjerne hver skål og kassere mediet. Derefter tilsættes 10 ml kold (opbevares ved 4 °C) PBS for at vaske én gang. Kassér de 10 ml kold PBS-vask. Derefter tilsættes 10 ml frisk, kold PBS til hver skål, og hver skål inkuberes på is i 5 minutter.
  4. Brug en celleskraber til forsigtigt at skrabe cellerne fra alle tre skåle til et 50 ml rør. Drej forsigtigt cellerne ned ved 270 × g ved 4 °C i 5 minutter; Derefter kasseres supernatanten.
  5. Tilsæt 20 ml BMDM-kulturmedier, pipette op og ned for at resuspendere pelleten, og tæl cellerne.
    BEMÆRK: Det forventes, at hver mus vil give ca. 60 × 10 6-100 × 106 celler.
  6. Planlæg pladelayoutet med 12 brønde til den ønskede in vitro-celledød /inflammationsstimuleringsanalyse. Planlæg at plade 1 × 106 celler pr. Brønd. For hver planlagt stimulering skal der inkluderes mindst tre biologiske replikater og plade et sæt brønde, der skal høstes i caspase lysis buffer og et andet sæt brønde, der skal høstes i RIPA buffer.
  7. Plade 1 × 106 celler i 1 ml BMDM-kulturmedier pr. hul i plader med 12 huller. Dyrkning natten over i en befugtet inkubator ved 37 ° C, før du fortsætter til celledød / inflammationsevaluering. Efter inkubation natten over fjernes mediet, og der tilsættes 1 ml varm (37 °C) PBS til hvert hul for at vaske cellerne.
  8. Fjern PBS-vasken, og tilsæt 500 μL BMDM-stimuleringsmedier med antibiotika (hvis der udføres ikke-bakterielle stimuleringer) eller BMDM-stimuleringsmedier uden antibiotika (hvis der udføres bakteriestimuleringer) (tabel 1). Der inkuberes i 2 timer, før du går videre til trin 4 for in vitro stimulation/infektion.

4. Stimulering eller infektion af cellerne

FORSIGTIG: De midler, der er inkluderet i denne protokol, er potentielt patogene og skal håndteres med passende forholdsregler i et biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) facilitet med godkendelse fra de relevante institutionelle og statslige myndigheder.

  1. Stimulere BMDM'erne til at aktivere celledød med udløseren af interesse.
    BEMÆRK: I denne protokol er influenza A-virus (IAV), herpes simplex virus 1 (HSV1), Francisella novicida, og LPS + ATP bruges til illustration, men andre udløsere kan bruges.
    1. Eksempel på stimulering 1: Inficere med IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (konstrueret i henhold til Hoffmann et al.75; den virale titer til bestemmelse af multipliciteten af infektion [MOI] beregnes ved et plaqueassay i MDCK-celler):
      1. Beregn mængden af virus, der er nødvendig til infektion ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 20 plakdannende enheder (PFU) ved hjælp af ligning (1) og ligning (2):
        Equation 1
        Equation 2
        Equation 3
      2. Fjern mediet fra BMDM'erne, og vask cellerne én gang med 500 μL PBS. Der tilsættes 450 μL IAV (20 MOI) i DMEM med højt glukoseindhold uden varmeinaktiveret (HI)-FBS til hvert hul. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 1 time i en befugtet inkubator for at tillade absorption.
      3. Fjern pladerne, og tilsæt 50 μL HI-FBS. Pladerne sættes tilbage i inkubatoren ved 37 °C. Inkuber i alt 12 timer.
    2. Eksempel på stimulering 2: Inficere med HSV1 (HF-stamme; dyrket som beskrevet tidligere44; den virale titer til MOI-bestemmelse beregnes ved et plaque-assay i Vero-celler):
      1. Beregn mængden af virus, der er nødvendig til infektion ved en MOI på 10 PFU ved hjælp af ligning (1) og ligning (2) fra trin 1 i afsnittet IAV-infektion ovenfor.
        Equation 4
      2. Fjern mediet fra BMDM'erne. Der tilsættes 450 μL HSV1 (MOI 10) i DMEM med højt glukoseindhold uden HI-FBS til hvert hul. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 1 time i en befugtet inkubator for at tillade absorption.
      3. Fjern pladerne, og tilsæt 50 μL HI-FBS. Pladerne sættes tilbage i inkubatoren ved 37 °C. Inkuber i alt 12 timer.
    3. Eksempel på stimulation 3: Inficere med F. novicida (U112 stamme; dyrket som beskrevet tidligere44 under aerobe forhold ved 37 °C i BBL Trypticase Soy Broth suppleret med 0,2% L-cystein natten over. Derefter subkultureres bakterierne i forholdet 1:10 ved 37 °C i yderligere 4 timer i frisk medium, før den optiske densitet (OD) tages ved 600 nm ved hjælp af det friske medium som blindprøve. En OD-værdi på 1 svarer til 1 × 109 kolonidannende enheder (CFU) pr. ml.)
      1. Beregn mængden af F. novicida , der er nødvendig til infektion ved en MOI på 50 CFU ved hjælp af ligning (3) og ligning (4):
        Equation 5
        Equation 6
        Equation 7
      2. Fjern mediet fra BMDM'erne. Der tilsættes 500 μL F. novicida (MOI 50) i BMDM-stimuleringsmedier uden antibiotika til hvert hul. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 4 timer i en befugtet inkubator for at tillade absorption.
      3. Cellerne vaskes tre gange med opvarmet (37 °C) PBS og tilsættes 500 μL BMDM-stimuleringsmedier indeholdende 50 μg/ml gentamycin. Pladerne sættes tilbage i inkubatoren ved 37 °C. Inkuber natten over (16 timer).
    4. Eksempel på stimulering 4: Stimuler med LPS + ATP.
      1. Fjern mediet fra BMDM'erne. Der tilsættes 500 μL BMDM-stimuleringsmedier med antibiotika (tabel 1) indeholdende 100 ng/ml LPS til hvert hul. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 3,5 timer i en befugtet inkubator.
      2. Der tilsættes 5 μL 0,5 M ATP-stamopløsning (tabel 1) til hvert hul. Pladerne sættes tilbage i inkubatoren ved 37 °C. Inkuber i 30 min.

5. Opsamling af det kombinerede supernatant og proteinlysat til anvendelse til caspase western blots

  1. Efter 4 timer, 12 timer eller 16 timers inkubation (den specifikke timing afhænger af den anvendte udløser), fjern pladen fra inkubatoren.
  2. 150 μL supernatanten fjernes. Kassér eller gem dette til andre supernatantanalyser (f.eks. enzymbundet immunosorbentassay [ELISA]). De resterende supernatanter må ikke fjernes.
  3. Opret proteinopsamlingsopløsningen ved at kombinere 50 μL caspase lysisbuffer + 100 μL 4x SDS-buffer pr. Brønd (tabel 1). Derefter tilsættes 150 μL af blandingen til hvert hul.
  4. For hvert hul pipetteres blandingen op og ned for at opsamle de lyserede celler og supernatanten. Under pipettering skal du også skrabe bunden af brønden med pipettespidsen for at forstyrre cellerne. Efter skrabning og pipettering samles proteinlysatet i mærkede 1,5 ml rør.
  5. Brug en varmeblok til at opvarme alle rørene til 100 °C i 12 minutter.
  6. Pellet eventuelle uopløselige komponenter ved centrifugering ved 14.500 × g i 30 s ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Dette er et pausepunkt – proteinet fra den kombinerede supernatant og proteinlysater kan enten anvendes straks eller opbevares ved −20 °C i op til 2 måneder eller ved −80 °C i op til 6 måneder, indtil det er klar til brug.

6. Indsamling af proteinlysatet, der skal bruges til caspase western blots

  1. Efter 4 timer, 12 timer eller 16 timers inkubation (den specifikke timing afhænger af den anvendte udløser), fjern pladen fra inkubatoren. Alle supernatanter fjernes. Kassér eller gem dette til andre supernatantanalyser (f.eks. ELISA).
  2. Der oprettes 1x RIPA-bufferen ved at fortynde 2x RIPA-stamopløsningen (tabel 1) i et tilsvarende volumen deioniseret vand. Derefter tilsættes en fosfatasehæmmertablet og en proteasehæmmertablet, og lad dem opløses. Tilsæt 150 μL 1x RIPA buffer og 50 μL 4x SDS til hvert hul.
  3. For hvert hul pipetteres blandingen op og ned for at opsamle de lyserede celler. Under pipettering skal du også skrabe bunden af brønden med pipettespidsen for at forstyrre cellerne. Efter skrabning og pipettering samles proteinlysatet i mærkede 1,5 ml rør.
  4. Brug en varmeblok til at opvarme alle rørene til 100 °C i 12 minutter.
  5. Pellet eventuelle uopløselige komponenter ved centrifugering ved 14.500 × g i 30 s ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Dette er et pausepunkt – proteinlysaterne kan enten bruges med det samme eller opbevares ved -20 °C eller -80 °C, indtil de er klar til brug.

7. Udførelse af western blotting ved hjælp af lysater indsamlet fra BMDM'erne ved at følge ovenstående trin eller fra vævshomogenater

BEMÆRK: Hvis du bruger væv, kan det homogeniseres manuelt eller gennem en kraftdrevet vævshomogenisator. Protokollen fra Simpson76 giver en detaljeret beskrivelse af vævshomogenisering.

  1. Forbered 1x løbende buffer: Kombiner 200 ml af 5x løbende bufferlager (tabel 1) og 800 ml deioniseret vand. Lav denne 1x kørende buffer lige før hvert eksperiment.
  2. Elektroforeseapparatet fremstilles med en 12% (vægt/vol) polyacrylamidgel med 10 huller. Fyld elektroforeseapparatet med 1x løbende buffer. Fjern derefter gelkammen.
    BEMÆRK: For at analysere caspase-1, caspase-11, caspase-3, caspase-7, caspase-8 og caspase-9 for hver prøve er der brug for seks geler.
  3. Til caspase-1, caspase-3, caspase-7 og caspase-8 blots planlægges det at anvende 30 μL af den kombinerede supernatant og proteinlysat i caspaselysebuffer eller vævshomogenat. Til caspase-11 og caspase-9 blots skal du planlægge at bruge 20 μL proteinlysat i RIPA-bufferen eller vævshomogenatet. Hvis prøverne har været opbevaret ved -20 °C eller -80 °C, skal de først tøs op på is.
  4. For alle prøverne opvarmes til 100 °C i 5 minutter og centrifugeres ved 14 500 × g i 30 s ved 4 °C inden påfyldning. Derefter læsses langsomt 20 eller 30 μL af prøven i hver bane. Undgå at prøve løber over i de andre baner. For at evaluere alle seks caspaser på én gang skal du bruge den samme procedure til at indlæse de relevante prøver i hver af de seks geler.
  5. Tilslut elektroforeseapparatet til strømkilden. Indstil derefter effekten til 80 V i 20 minutter for at starte gelkørslen, og juster derefter effekten til 130 V i 45-60 min.
  6. Se farvestoffronten omhyggeligt, og sluk for strømmen, når farvestoffronten er i bunden af gelen, men endnu ikke er skubbet ud af gelen.
  7. Mens gelen kører, fremstilles 1x overførselsbuffer ved at kombinere 700 ml deioniseret vand, 100 ml af 10x overførselsbufferlageret (tabel 1) og 200 ml methanol. Gør 1x-opløsningen frisk hver gang.
    BEMÆRK: Vær forsigtig, da methanol er brandfarligt. Udfør forberedelsen af overførselsbufferen væk fra åben ild.
  8. Fjern gelen forsigtigt fra elektroforeseapparatet ved hjælp af geludløseren.
  9. Opret en overførselsstak for hver gel.
    1. Aktivér en PVDF-membran ved at lægge den i blød i methanol i 1 min.
    2. Forvåd to stykker filterpapir, gelen og PVDF-membranen i overførselsbuffer i 5 min. Opbevar PVDF-membranen og gelen i separate beholdere under denne 5 minutters inkubation.
    3. Saml overførselsstakken på det halvtørre system. Begynd på den nederste platinanodeside, læg et stykke filterpapir, PVDF-membranen, gelen og til sidst et stykke filterpapir. Rul forsigtigt ud eller tryk luftbobler ud mellem lagene, og luk toppen af systemet. Sørg for, at sikkerhedsdækslet er fastgjort, før du fortsætter.
  10. Tilslut til strømkilden. Indstil effekten til 25 V i 45 min.
  11. Når overførslen er afsluttet, skal du adskille overførselsstakken og samle membranen; Læg den i en firkantet petriskål (inkubationsbakke).
  12. Udfør membranblokering ved at tilsætte 15 ml af en 5% (vægt/vol) skummetmælksopløsning (tabel 1). Inkuber membranen på en gyngeryster ved 50 o / min til 70 o / min ved stuetemperatur i 1 time.
    BEMÆRK: Dette er et pausepunkt – membranen kan enten fjernes efter 1 time eller opbevares i blokerende opløsning ved 4 °C natten over.
  13. Efter 1 time eller inkubation natten over fjernes blokeringsopløsningen. Tilsæt 10 ml af den fortyndede antistofopløsning (anti-caspase-1-antistof, anti-caspase-11-antistof, kombineret anti-caspase-3 og anti-spaltet caspase-3-antistof, kombineret anti-caspase-7 og anti-spaltet caspase-7-antistof, kombineret anti-caspase-8 og anti-spaltet caspase-8-antistof eller anti-caspase-9-antistof) (tabel 1). På en vipperyster anbringes ved 50 o/min til 70 o/min for at inkubere ved stuetemperatur i 2 timer eller ved 4 °C natten over (16 timer).
  14. Antistofopløsningen opsamles (genbrug op til 3x eller kassér den), og vask ved at tilsætte 15 ml TBST (tabel 1) til membranen på en vipperyster ved 50 rpm til 70 rpm ved stuetemperatur i 10 min. Kassér TBST.
  15. Gentag vasken med 15 ml TBST efter trin 14 i alt 3x.
  16. Der tilsættes 10 ml af den fortyndede sekundære HRP-konjugerede antistofopløsning (antikanin mod blots farvet med primære antistoffer mod caspase-3, caspase-7, caspase-8 eller caspase-9; antimus til blots farvet med primært antistof mod caspase-1; anti-rotte til blots farvet med primært antistof mod caspase-11) (tabel 1). Inkuber på en gyngeryster ved 50 o / min til 70 o / min ved stuetemperatur i 1 time.
  17. Antistofopløsningen fjernes, og vaskes ved at tilsætte 15 ml TBST til membranen på en vipperyster ved 50 rpm til 70 rpm ved stuetemperatur i 10 min. Kassér TBST.
  18. Gentag vasken med 15 ml TBST efter trin 17 i alt 3x.
  19. Der tilsættes 10 ml af det højfølsomme HRP-substrat til membranen. Lad det sidde ved stuetemperatur i mørke i 1 min.
  20. Fjern membranen fra underlaget. Fortsæt direkte til billeddannelsen ved hjælp af et kemiluminescenskamera med tilbehørets hvide transbakke indsat i den nederste position. Udsæt membranen ved hjælp af automatisk eksponeringstilstand (generelt ~ 1-2 minutters eksponeringstid).
  21. Brug membranen fra caspase-9 eller caspase-11 blotting (dvs. en membran med RIPA lysatprøver), tilsæt 10 ml stripping buffer og inkuber på en vippende ryster ved 50 rpm til 70 rpm ved stuetemperatur i 5 min.
  22. Afskaf strippebufferen, og vask ved at tilsætte 15 ml TBST til membranen på en vipperyster ved 50 rpm til 70 rpm ved stuetemperatur i 10 min. Kassér TBST.
  23. Gentag vasken med 15 ml TBST efter trin 22 i alt 3x.
  24. Udfør membranblokering ved at tilsætte 15 ml af en 5% (vægt/vol) skummetmælksopløsning. Inkuber membranen på en gyngeryster ved 50 o / min til 70 o / min ved stuetemperatur i 1 time.
    BEMÆRK: Dette er et pausepunkt – membranen kan enten fjernes efter 1 time eller opbevares i blokerende opløsning ved 4 °C natten over.
  25. Efter 1 time eller inkubation natten over fjernes blokeringsopløsningen. Der tilsættes 10 ml af den fortyndede anti-β-actin (HRP-konjugerede) antistofopløsning. Anbring på en gyngeryster ved 50 o / min til 70 o / min for at inkubere ved stuetemperatur i 1,5 timer.
  26. Antistofopløsningen fjernes, og vask ved at tilsætte 15 ml TBST til membranen på en vipperyster ved 50 o/min til 70 o/min ved stuetemperatur i 10 minutter. Kassér TBST.
  27. Gentag vasken med 15 ml TBST efter trin 26 i alt 3x.
  28. Der tilsættes 10 ml af det standardfølsomme HRP-substrat til membranen. Lad det sidde ved stuetemperatur i mørke i 1 min.
  29. Fortsæt direkte til billeddannelsen ved hjælp af et kemiluminescenskamera med tilbehørets hvide transbakke indsat i den nederste position. Udsæt membranen ved hjælp af automatisk eksponeringstilstand (generelt <1 min eksponeringstid).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PANoptose er blevet observeret som reaktion på talrige bakterielle, virale og svampeinfektioner og andre inflammatoriske stimuli såvel som i kræftceller 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 . I disse tilfælde er aktivering af flere caspaser blevet rapporteret. Ved hjælp af eksempelstimuleringerne i denne protokol, der vides at inducere PANoptose, nemlig IAV, HSV1 og F. novicida 44,48,50,51,53,57, forventes det, at spaltning kan observeres som surrogat for aktivering af flere caspaser (figur 2A-C ). Derudover er LPS + ATP inkluderet som en kontrol; denne kombination er en kanonisk NLRP3 inflammasomudløser, der forventes at inducere caspase-1-aktivering. Aktiveringen af caspase-1 kan visualiseres som reaktion på hver af disse udløsere ved spaltningen af p45-pro-formen til den aktive p20-form (figur 2D). P20-formularen kan derefter spalte GSDMD og starte celledød19.

Tilsvarende observeres aktiveringen af den apoptotiske initiator caspase, caspase-8, som betegnet ved tilstedeværelsen af den p18 spaltede form (figur 2A-D). Den svage aktivering af caspase-9 kan også observeres i nogle tilfælde med disse stimuli (figur 2A-D). Nedstrøms for disse initiatorer aktiveres effektorcaspaserne caspase-3 og caspase-7; denne aktivering observeres som dannelsen af p17/19 spaltet form af caspase-3 og p20 spaltet form af caspase-7 (figur 2A-D). Hidtil er aktiveringen af caspase-11 ikke blevet bredt evalueret i PANoptosis, men dens aktivering er blevet observeret i nogle sammenhænge54. Caspase-11 forbliver en vigtig inflammatorisk caspase, og dens aktivering kan observeres ved dannelsen af dens p26 spaltede form. Mens der ses en vis caspase-11-aktivering på lavt niveau, observeres robust aktivering ikke som reaktion på IAV-, HSV1- eller F. novicida-infektion eller LPS + ATP-stimulering (figur 2A-D).

Celler, der mangler opstrøms PANoptose-sensorer, gennemgår ikke celledød som reaktion på PANoptose-inducerende stimuli. For eksempel inducerer IAV-infektion dannelsen af ZBP1-PANoptosome 48,51,53,57, og Zbp1-/- celler er beskyttet mod celledød under IAV-infektion (figur 3A). Tilsvarende inducerer HSV1- og F. novicida-infektioner dannelsen af AIM2-PANoptosome44, og Aim2-/- celler undlader at gennemgå robust celledød som reaktion på disse infektioner (figur 3B, C). I celler, der mangler opstrømssensoren, der er nødvendig for PANoptosomdannelse, reduceres aktiveringen af caspaser signifikant eller elimineres, som det kan ses ved reduktionen i intensiteten af de spaltede bånd i de vestlige blots (figur 2A-C). På samme måde er celler, der mangler opstrøms inflammasomsensorer, beskyttet mod celledød som reaktion på deres respektive stimuli, og Nlrp3-/- celler gennemgår ikke celledød som reaktion på LPS + ATP (figur 3D). Disse celler viser også reduceret caspaseaktivering (figur 2D).

Figure 1
Figur 1: Oversigt over forsøgsproceduren. Knoglemarv isoleres og differentieres til knoglemarvsafledte makrofager. Disse celler stimuleres derefter med en udløser, der aktiverer medfødt immunsignalering og celledød, såsom infektion eller en inflammatorisk stimulus. Efter at cellerne aktiveres og begynder at gennemgå PCD, opsamles lysatet og analyseres ved western blotting for at overvåge caspase spaltning til deres aktive former. Forkortelser: BMDM'er = knoglemarvsafledte makrofager; DAMPs = skadesrelaterede molekylære mønstre; III-PCD = inflammatorisk medfødt immunprogrammeret celledød; PAMPs = patogenassocierede molekylære mønstre; PCD = programmeret celledød. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Aktivering af caspaser som reaktion på stimuli. Caspaseaktivering fra cellekulturlysater kan vurderes ved at evaluere størrelsen af de produkter, der kører på en elektroforetisk gel. (A-D) Immunoblotanalyse af pro- (P45) og aktiveret (P20) CASP1, pro- (P43) og spaltet (P36 og P26) CASP11, pro- (P35) og spaltet (P17/P19) CASP3, pro- (P35) og spaltet (P20) CASP7, pro- (P55) og spaltet (P44 og P18) CASP8 og pro- (P49) og spaltet (P37) CASP9 i WT og Zbp1−/−, WT og Aim2−/−, eller WT og Nlrp3−/− BMDM'er efter (A) IAV-infektion, (B) HSV1-infektion, (C) Francisella novicida-infektion eller (D) LPS + ATP-stimulering. Billeder er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter. Forkortelser: BMDM'er = knoglemarvsafledte makrofager; CASP1 = caspase-1; CASP3 = caspase-3; CASP7 = caspase-7; CASP8 = caspase-8; CASP9 = caspase-9; CASP11 = caspase-11; HSV1 = herpes simplex virus 1; IAV = influenza A-virus; LPS = lipopolysaccharid; WT = vildtype. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Hæmning af celledød, når caspaseaktivering ikke forekommer. (A-D) Repræsentative billeder af celledød i WT og Zbp1−/−, WT og Aim2−/− eller WT og Nlrp3−/− BMDM'er efter (A) IAV-infektion, (B) HSV1-infektion, (C) Francisella novicida-infektion eller (D) LPS + ATP-stimulering. Den røde maske betegner døde celler. Skalastænger = 50 μm. Billeder er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter. Forkortelser: BMDM'er = knoglemarvsafledte makrofager; HSV1 = herpes simplex virus 1; IAV = influenza A-virus; LPS = lipopolysaccharid; WT = vildtype. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1. Klik her for at downloade denne tabel. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Overvågning af caspase spaltning og aktivering giver et af de mest omfattende billeder af medfødt immun PCD-aktivering som en del af det medfødte immunrespons. Protokollen beskrevet her demonstrerer en strategi til overvågning af caspaseaktivering som reaktion på IAV-, HSV1- og F. novicida-infektioner og den sterile udløser LPS + ATP, men mange andre stimuli kan inducere PCD og kan bruges i denne metode, som det er vist i flere publikationer 44,48,49,50,51,52,53,54,56, 57,58,59,60,61,62. Denne procedure kan også bruges til at karakterisere den medfødte immun-PCD som reaktion på nye udløsere, hvor PCD-mekanismerne forbliver ukendte. Brug af en kombination af vildtype- og genetisk mangelfulde celler og sammenligning af aktiveringen af forskellige caspaser mellem disse populationer kan give ny indsigt i de sensorer og regulatorer, der er involveret i PCD som reaktion på en given stimulus.

Flere tekniske punkter bør overvejes, når du udfører denne metode. For det første, da denne metode involverer infektion eller på anden måde stimulerende celler til at fremkalde celledød, er det vigtigt at anvende sterile teknikker til isolering af cellerne og til de efterfølgende stimuleringer. Forurening kan påvirke resultaterne betydeligt, hvilket fører til caspaseaktivering selv under ustimulerede forhold. For at teste for dette er det bedst altid at inkludere en ustimuleret kontrol, når du indsamler prøverne og lægger geler til caspase blots. Derudover er det vigtigt at sikre, at cellerne tælles nøjagtigt, og at klumpning ikke forekommer, når cellerne pletteres. Hvis cellerne klumpes, vil inkonsekvent antal celler blive deponeret i brøndene, og MOI og mængden af protein pr. Brønd vil blive påvirket. Ved udførelse af de vestlige blots er det god praksis at sammenligne båndmønsteret for den onkelede, pro-form af caspase samt at overvåge den spaltede form for at sikre, at ensartede mængder protein blev opsamlet og fyldt over brøndene. Men når der er et højt niveau af caspaseaktivering i en prøve, kan dette forårsage en forvrængning i signalet, hvilket fører til, hvad der ser ud til at være en reduktion i pro-formen i de andre prøver, som vi viser med caspase-8 i HSV1 og F. novicida infektioner i dette eksempel (figur 2B, C). Dette sker sandsynligvis på grund af ujævn antistofbinding forårsaget af tilstedeværelsen af for meget protein på et bestemt sted på membranen eller på grund af billeddannelsesartefakter, hvor substratet bliver overmættet i en enkelt prøve. Justering af antistoffortyndinger eller billeddannelsesindstillinger kan hjælpe med at løse dette problem. Derudover, når der etableres en infektion eller stimulering for første gang, kan det være gavnligt at bruge et tidskursus til at identificere, hvornår aktiveringen af hver caspase opstår. Uden et tidsforløb kan dataene være vildledende, da det valgte individuelle tidspunkt kan være for tidligt eller for sent, hvilket medfører, at caspaseaktivering overses, og der drages uhensigtsmæssige konklusioner om dets involvering. På samme måde kan testning af forskellige MOI'er for infektiøse stimuli også være gavnligt for at identificere de specifikke forhold, hvorunder caspase (er) aktiveres.

Elektroforesetrinnet kræver også præcision. Når prøverne lægges i gelen, skal glassene altid centrifugeres først, og kun supernatanten skal fyldes. Uopløseligt protein kan forstyrre gelens løb og den efterfølgende analyse af dataene. Den kombinerede supernatant og proteinlysat bør anvendes til påvisning af caspase-1 i stedet for et rent cellelysat. Dette vil i høj grad forbedre detekteringens følsomhed. Caspase-3, caspase-7 og caspase-8 kan også påvises godt i det kombinerede supernatant og proteinlysat. For de bedste resultater ved påvisning af caspase-11 og caspase-9 er proteinlysatet opsamlet i RIPA-bufferen tilstrækkeligt. Da den relative forekomst af hver caspase i lysatet kan være lav, skal så meget prøve som muligt lægges på gelen. Dette kræver langsom og stabil pipettering for at undgå overløb i de nærliggende brønde. Hvis der observeres dårlig adskillelse mellem de pro- og spaltede former af caspaserne, kan gelens driftstid forlænges, eller en lavere procentdel acrylamid kan bruges til at optimere adskillelsen.

Endelig er antistofferne anført i denne protokol blevet optimeret til brug med muse-BMDM'er, og flere grupper har nøje testet dem ved hjælp af genetisk mangelfulde celler som kontroller for at bekræfte, at der ikke er nogen ikke-specifikke bånd ved molekylvægtene af interesse. Mens andre antistoffer også kan virke, er dem, der er anført her, optimale. Derudover fungerer mange af disse antistoffer også godt i vævslysater, og andre cellepopulationer kan også indsamles og stimuleres in vitro til analyse. Brug af cellelinjer eller primære celler fra mennesker eller andre arter er også muligt, men vil kræve en yderligere vurdering af antistofferne til optimering. Human anti-caspase-1 (1:1,000) og human anti-caspase-8 (1:1,000; se materialetabel) er blevet anvendt med succes til sådanne vurderinger, og de samme anti-caspase-3, anti-spaltede caspase-3, anti-caspase-7 og anti-spaltede caspase-7 antistoffer inkluderet i denne protokol kan anvendes til både muse- og humane celler 44,56,62.

Vigtigheden af at forstå PCD-veje, herunder pyroptose, apoptose, nekrotose og PANoptose, som en integreret bestanddel af det medfødte immunrespons vokser, da krydstale mellem PCD-veje i stigende grad karakteriseres, og celledødsmolekyler identificeres som terapeutiske mål på tværs af sygdomsspektret 3,4 . Fortsat at identificere de medfødte immunsensorer, der inducerer PCD såvel som III-PCD og karakteriserer timingen og samspillet mellem caspaseaktivering, vil forbedre evnen til terapeutisk at modulere medfødte immun-PCD-veje og forbedre patientresultaterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

T.-D.K. er konsulent for Pfizer.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer af Kanneganti-laboratoriet for deres kommentarer og forslag, og vi takker J. Gullett, ph.d., for videnskabelig redigeringsstøtte. Arbejdet i vores laboratorium støttes af National Institutes of Health (NIH) tilskud AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 og CA253095 (til T.-D.K.) og af de amerikanske libanesiske syriske associerede velgørenhedsorganisationer (til T.-D.K.). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171 (1996).
  2. Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21 (2016).
  3. Gullett, J. M., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. It's all in the PAN: Crosstalk, plasticity, redundancies, switches, and interconnectedness encompassed by PANoptosis underlying the totality of cell death-associated biological effects. Cells. 11 (9), 1495 (2022).
  4. Pandian, N., Kanneganti, T. D. PANoptosis: A unique innate immune inflammatory cell death modality. Journal of Immunology. 209 (9), 1625-1633 (2022).
  5. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  6. Shi, Y. Caspase activation: Revisiting the induced proximity model. Cell. 117 (7), 855-858 (2004).
  7. Galluzzi, L., Lopez-Soto, A., Kumar, S., Kroemer, G. Caspases connect cell-death signaling to organismal homeostasis. Immunity. 44 (2), 221-231 (2016).
  8. Fernandes-Alnemri, T., Litwack, G., Alnemri, E. S. CPP32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 30761-30764 (1994).
  9. Tewari, M., et al. Yama/CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase. Cell. 81 (5), 801-809 (1995).
  10. Nicholson, D. W., et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature. 376 (6535), 37-43 (1995).
  11. Stennicke, H. R., et al. Pro-caspase-3 is a major physiologic target of caspase-8. Journal of Biological Chemistry. 273 (42), 27084-27090 (1998).
  12. Twiddy, D., Cohen, G. M., Macfarlane, M., Cain, K. Caspase-7 is directly activated by the approximately 700-kDa apoptosome complex and is released as a stable XIAP-caspase-7 approximately 200-kDa complex. Journal of Biological Chemistry. 281 (7), 3876-3888 (2006).
  13. Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Reviews of Immunology. 38, 567-595 (2020).
  14. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
  15. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: Controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (3), 231-241 (2008).
  16. Morioka, S., Maueröder, C., Ravichandran, K. S. Living on the edge: Efferocytosis at the interface of homeostasis and pathology. Immunity. 50 (5), 1149-1162 (2019).
  17. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  18. Rogers, C., et al. Cleavage of DFNA5 by caspase-3 during apoptosis mediates progression to secondary necrotic/pyroptotic cell death. Nature Communications. 8, 14128 (2017).
  19. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  20. Shi, J., Gao, W., Shao, F. Pyroptosis: Gasdermin-mediated programmed necrotic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 245-254 (2017).
  21. Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
  22. Aglietti, R. A., et al. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7858-7863 (2016).
  23. Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341 (6151), 1250-1253 (2013).
  24. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  25. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  26. Lamkanfi, M., et al. Targeted peptidecentric proteomics reveals caspase-7 as a substrate of the caspase-1 inflammasomes. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (12), 2350-2363 (2008).
  27. Kalai, M., et al. Tipping the balance between necrosis and apoptosis in human and murine cells treated with interferon and dsRNA. Cell Death & Differentiation. 9 (9), 981-994 (2002).
  28. Li, C., et al. Development of atopic dermatitis-like skin disease from the chronic loss of epidermal caspase-8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22249-22254 (2010).
  29. Kovalenko, A., et al. Caspase-8 deficiency in epidermal keratinocytes triggers an inflammatory skin disease. Journal of Experimental Medicine. 206 (10), 2161-2177 (2009).
  30. Kang, T. B., et al. Caspase-8 serves both apoptotic and nonapoptotic roles. Journal of Immunology. 173 (5), 2976-2984 (2004).
  31. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  32. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  33. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  34. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  35. Hitomi, J., et al. Identification of a molecular signaling network that regulates a cellular necrotic cell death pathway. Cell. 135 (7), 1311-1323 (2008).
  36. Malireddi, R. K., Ippagunta, S., Lamkanfi, M., Kanneganti, T. D. Cutting edge: Proteolytic inactivation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 by the Nlrp3 and Nlrc4 inflammasomes. Journal of Immunology. 185 (6), 3127-3130 (2010).
  37. Tsuchiya, K., et al. Caspase-1 initiates apoptosis in the absence of gasdermin D. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  38. Taabazuing, C. Y., Okondo, M. C., Bachovchin, D. A. Pyroptosis and apoptosis pathways engage in bidirectional crosstalk in monocytes and macrophages. Cell Chemical Biology. 24 (4), 507-514 (2017).
  39. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. Journal of Immunology. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  40. Man, S. M., et al. Inflammasome activation causes dual recruitment of NLRC4 and NLRP3 to the same macromolecular complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7403-7408 (2014).
  41. Man, S. M., et al. Salmonella infection induces recruitment of Caspase-8 to the inflammasome to modulate IL-1beta production. Journal of Immunology. 191 (10), 5239-5246 (2013).
  42. Van Opdenbosch, N., et al. Caspase-1 engagement and TLR-induced c-FLIP expression suppress ASC/caspase-8-dependent apoptosis by inflammasome sensors NLRP1b and NLRC4. Cell Reports. 21 (12), 3427-3444 (2017).
  43. Pierini, R., et al. AIM2/ASC triggers caspase-8-dependent apoptosis in Francisella-infected caspase-1-deficient macrophages. Cell Death & Differentiation. 19 (10), 1709-1721 (2012).
  44. Lee, S., et al. AIM2 forms a complex with pyrin and ZBP1 to drive PANoptosis and host defence. Nature. 597 (7876), 415-419 (2021).
  45. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death & Differentiation. 20 (9), 1149-1160 (2013).
  46. Lukens, J. R., et al. Dietary modulation of the microbiome affects autoinflammatory disease. Nature. 516 (7530), 246-249 (2014).
  47. Gurung, P., Burton, A., Kanneganti, T. D. NLRP3 inflammasome plays a redundant role with caspase 8 to promote IL-1beta-mediated osteomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4452-4457 (2016).
  48. Kuriakose, T., et al. ZBP1/DAI is an innate sensor of influenza virus triggering the NLRP3 inflammasome and programmed cell death pathways. Science Immunology. 1 (2), (2016).
  49. Malireddi, R. K. S., et al. TAK1 restricts spontaneous NLRP3 activation and cell death to control myeloid proliferation. Journal of Experimental Medicine. 215 (4), 1023-1034 (2018).
  50. Malireddi, R. K. S., et al. Innate immune priming in the absence of TAK1 drives RIPK1 kinase activity-independent pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and inflammatory disease. Journal of Experimental Medicine. 217 (3), (2020).
  51. Christgen, S., et al. Identification of the PANoptosome: A molecular platform triggering pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 237 (2020).
  52. Malireddi, R. K. S., et al. RIPK1 distinctly regulates Yersinia-induced inflammatory cell death, PANoptosis. Immunohorizons. 4 (12), 789-796 (2020).
  53. Zheng, M., Karki, R., Vogel, P., Kanneganti, T. D. Caspase-6 is a key regulator of innate immunity, inflammasome activation, and host defense. Cell. 181 (3), 674-687 (2020).
  54. Karki, R., et al. ADAR1 restricts ZBP1-mediated immune response and PANoptosis to promote tumorigenesis. Cell Reports. 37 (3), 109858 (2021).
  55. Wang, Y., et al. Single cell analysis of PANoptosome cell death complexes through an expansion microscopy method. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (10), 531 (2022).
  56. Malireddi, R. K. S., et al. Inflammatory cell death, PANoptosis, mediated by cytokines in diverse cancer lineages inhibits tumor growth. Immunohorizons. 5 (7), 568-580 (2021).
  57. Kesavardhana, S., et al. The Zα2 domain of ZBP1 is a molecular switch regulating influenza-induced PANoptosis and perinatal lethality during development. Journal of Biological Chemistry. 295 (24), 8325-8330 (2020).
  58. Banoth, B., et al. ZBP1 promotes fungi-induced inflammasome activation and pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 18276-18283 (2020).
  59. Karki, R., et al. Interferon regulatory factor 1 regulates PANoptosis to prevent colorectal cancer. JCI Insight. 5 (12), 136720 (2020).
  60. Zheng, M., et al. Impaired NLRP3 inflammasome activation/pyroptosis leads to robust inflammatory cell death via caspase-8/RIPK3 during coronavirus infection. Journal of Biological Chemistry. 295 (41), 14040-14052 (2020).
  61. Karki, R., et al. Synergism of TNF-α and IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 184 (1), 149-168 (2021).
  62. Karki, R., et al. ZBP1-dependent inflammatory cell death, PANoptosis, and cytokine storm disrupt IFN therapeutic efficacy during coronavirus infection. Science Immunology. 7 (74), (2022).
  63. Jiang, W., Deng, Z., Dai, X., Zhao, W. PANoptosis: A new insight into oral infectious diseases. Frontiers in Immunology. 12, 789610 (2021).
  64. Chi, D., et al. Real-time induction of macrophage apoptosis, pyroptosis, and necroptosis by Enterococcus faecalis OG1RF and two root canal isolated strains. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 720147 (2021).
  65. Lin, J. F., et al. Phosphorylated NFS1 weakens oxaliplatin-based chemosensitivity of colorectal cancer by preventing PANoptosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 54 (2022).
  66. Song, M., et al. Self-assembled polymeric nanocarrier-mediated co-delivery of metformin and doxorubicin for melanoma therapy. Drug Delivery. 28 (1), 594-606 (2021).
  67. Boucher, D., Chan, A., Ross, C., Schroder, K. Quantifying caspase-1 activity in murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 1725, 163-176 (2018).
  68. Boucher, D., Duclos, C., Denault, J. B. General in vitro caspase assay procedures. Methods in Molecular Biology. 1133, 3-39 (2014).
  69. Kaushal, V., Herzog, C., Haun, R. S., Kaushal, G. P. Caspase protocols in mice. Methods in Molecular Biology. 1133, 141-154 (2014).
  70. Swacha, P., Gekara, N. O., Erttmann, S. F. Biochemical and microscopic analysis of inflammasome complex formation. Methods in Enzymology. 625, 287-298 (2019).
  71. Talley, S., et al. A caspase-1 biosensor to monitor the progression of inflammation in vivo. Journal of Immunology. 203 (9), 2497-2507 (2019).
  72. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 receptor differentially couples to distinct release pathways for IL-1beta in mouse macrophage. Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  73. Yu, J. W., et al. Cryopyrin and pyrin activate caspase-1, but not NF-kappaB, via ASC oligomerization. Cell Death & Differentiation. 13 (2), 236-249 (2006).
  74. Henry, C. M., Martin, S. J. Caspase-8 acts in a non-enzymatic role as a scaffold for assembly of a pro-inflammatory "FADDosome" complex upon TRAIL stimulation. Molecular Cell. 65 (4), 715-729 (2017).
  75. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  76. Simpson, R. J. Homogenization of mammalian tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).

Tags

Immunologi og infektion nummer 191
Evaluering af caspaseaktivering for at vurdere medfødt immuncelledød
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, J. H., Tweedell, R. E.,… More

Han, J. H., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter