Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64308
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

Dit protocol beschrijft een uitgebreide methode voor het beoordelen van caspase-activering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 en caspase-11) in reactie op zowel in vitro als in vivo (bij muizen) modellen van infectie, steriele beledigingen en kanker om de initiatie van celdoodroutes te bepalen, zoals pyroptose, apoptose, necroptose en PANoptose.

Abstract

Aangeboren immuniteit biedt de kritieke eerste verdedigingslinie als reactie op ziekteverwekkers en steriele beledigingen. Een belangrijke mechanistische component van deze respons is de initiatie van aangeboren immuungeprogrammeerde celdood (PCD) om geïnfecteerde of beschadigde cellen te elimineren en immuunresponsen te verspreiden. Overtollig PCD wordt echter geassocieerd met ontsteking en pathologie. Daarom is het begrijpen van de activering en regulatie van PCD een centraal aspect van het karakteriseren van aangeboren immuunresponsen en het identificeren van nieuwe therapeutische doelen in het hele ziektespectrum.

Dit protocol biedt methoden voor het karakteriseren van aangeboren immuun-PCD-activering door caspasen te monitoren, een familie van cysteïne-afhankelijke proteasen die vaak worden geassocieerd met verschillende PCD-routes, waaronder apoptose, pyroptose, necroptose en PANoptose. Eerste rapporten karakteriseerden caspase-2, caspase-8, caspase-9 en caspase-10 als initiator caspases en caspase-3, caspase-6 en caspase-7 als effector caspases in apoptose, terwijl latere studies vonden dat de inflammatoire caspasen, caspase-1, caspase-4, caspase-5 en caspase-11, pyroptose veroorzaken. Het is nu bekend dat er uitgebreide overspraak is tussen de caspasen en andere aangeboren immuun- en celdoodmoleculen over de eerder gedefinieerde PCD-routes, waardoor een belangrijke kenniskloof wordt geïdentificeerd in het mechanistische begrip van aangeboren immuniteit en PCD en leidt tot de karakterisering van PANoptose. PANoptose is een unieke aangeboren immuuninflammatoire PCD-route gereguleerd door PANoptosoomcomplexen, die componenten, waaronder caspasen, van andere celdoodroutes integreren.

Hier worden methoden gegeven voor het beoordelen van de activering van caspasen als reactie op verschillende stimuli. Deze methoden maken de karakterisering van PCD-routes mogelijk, zowel in vitro als in vivo, omdat geactiveerde caspasen proteolytische splitsing ondergaan die kan worden gevisualiseerd door western blotting met behulp van optimale antilichamen en blottingcondities. Er zijn een protocol en western blotting workflow opgesteld die de beoordeling van de activering van meerdere caspasen uit dezelfde cellulaire populatie mogelijk maken, waardoor een uitgebreide karakterisering van de PCD-processen wordt geboden. Deze methode kan worden toegepast op onderzoeksgebieden in ontwikkeling, homeostase, infectie, ontsteking en kanker om PCD-routes te evalueren tijdens cellulaire processen in gezondheid en ziekte.

Introduction

Het aangeboren immuunsysteem fungeert als de eerste verdedigingslinie tijdens infectie en als reactie op steriele stimuli, zoals weefselbeschadiging en veranderingen in homeostase. Aangeboren immuunsensoren op het celoppervlak en in het cytoplasma reageren op pathogene of schade-geassocieerde moleculaire patronen (respectievelijk PAMPs of DAMPs) om ontstekingssignaleringsroutes en cellulaire reacties te activeren. Een van de belangrijkste processen van de aangeboren immuunrespons is de inductie van celdood om geïnfecteerde of beschadigde cellen te verwijderen en verdere aangeboren en adaptieve immuunresponsen te stimuleren. Geprogrammeerde celdood (PCD) is een zeer geconserveerd proces tussen soorten, wat het evolutionaire belang ervan als een aangeboren immuunmechanisme benadrukt.

Er zijn verschillende aangeboren immuun PCD-routes die in alle celtypen kunnen worden geactiveerd. Caspasen zijn een belangrijke familie van sterk geconserveerde, intracellulaire, cysteïne-afhankelijke proteasen die van cruciaal belang zijn voor veel PCD-routes, waaronder de traditioneel niet-inflammatoire apoptoseroute, evenals inflammatoire PCD-routes zoals pyroptose, necroptose en PANoptose 1,2,3,4,5 . Er zijn 11 menselijke en 10 muriene caspasen die goed gedefinieerd zijn, evenals pseudo-caspasen die functioneel kunnen zijn, en de meeste worden constitutief uitgedrukt als inactieve monomere of dimerische pro-caspasen die decolleté vereisen voor activering 6,7. Caspasen bevatten ook belangrijke domeinen voor de rekrutering en vorming van multiproteïnecomplexen. Deze omvatten het caspase-activerings- en rekruteringsdomein (CARD), dat te vinden is in caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 en caspase-11, of het death effector-domein (DED), dat wordt gevonden in caspase-8 en caspase-10. Door zowel hun proteolytische activiteit als hun vermogen om multiproteïnecomplexen te vormen, zijn caspasen kritieke aanjagers van aangeboren immuun-PCD.

De rol van caspasen in aangeboren immuun-PCD werd voor het eerst geïdentificeerd in apoptose, waarbij de initiator caspases, caspase-2, caspase-8, caspase-9 en caspase-10, de beul caspases, caspase-3, caspase-6 en caspase-7 activeren om celdood 8,9,10,11,12 te veroorzaken. Initiator caspasen kunnen worden geactiveerd door diverse signaalcascades; De extrinsieke route activeert caspase-8 door extracellulaire ligand-geïnduceerde doodsreceptorsignalering en de intrinsieke route activeert caspase-9 door de verstoring van mitochondriale integriteit13. Geactiveerde initiator caspasen splitsen de linker en scheiden de grote en kleine katalytische subeenheden van beul caspasen om hun actieve vormen te produceren. De caspasen van de beul splitsen vervolgens hun substraten om de cel te demonteren, wat resulteert in DNA-degradatie, membraanblebbing, nucleaire fragmentatie en het vrijkomen van apoptotische lichamen14,15. Dit proces eindigt meestal in een niet-lytische en niet-inflammatoire vorm van celdood in combinatie met de onmiddellijke klaring van de stervende cellen door efferocytose16. Defecten in efferocytose of een gebrek aan fagocytische cellen kunnen echter leiden tot de accumulatie van apoptotische cellen, die vervolgens lytische en inflammatoire celdood ondergaan17,18.

De inflammatoire caspasen, waaronder caspase-1 (mens en muis), caspase-4 en caspase-5 (menselijk) en caspase-11 (muis), zijn ontdekt te worden geactiveerd tijdens een vorm van inflammatoir aangeboren immuun PCD (III-PCD) genaamd pyroptose. Caspase-1-activering is geassocieerd met de vorming van inflammasomen, multiproteïnecomplexen die een cytosolische aangeboren immuunsensor, een adaptermolecuul (apoptose-geassocieerd speck-achtig eiwit met een CARD [ASC]) en caspase-1 bevatten. De vorming van dit complex stelt caspase-1 in staat om nabijheidsgemedieerde autoproteolyse te ondergaan om zijn actieve vorm vrij te geven, die doelsubstraten kan splitsen, waaronder de pro-inflammatoire cytokines interleukine (IL) -1β en IL-18 en het porievormende molecuul gasdermine D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspase-11, caspase-4 en caspase-5 kunnen GSDMD ook activeren zonder de stroomopwaartse vorming van het inflammasoom na het detecteren van PAMP's zoals lipopolysaccharide (LPS)19,20. Deze caspasen ondergaan dimerisatie gevolgd door oligomerisatie en zelfsplitsing voor activering na binding aan cytosolisch LPS, wat leidt tot niet-canonieke inflammasoomactivering24,25,26 en caspase-1 activering op een celintrinsieke manier om IL-1β en IL-18 rijping20 te induceren. De rijping en afgifte van deze pro-inflammatoire cytokines karakteriseren deze caspasen als 'inflammatoir'. Bovendien is gebleken dat de apoptotische caspase-8 zich lokaliseert naar het inflammasoom, waardoor een verband wordt gelegd tussen apoptotische en pyroptotische processen. Studies hebben aangetoond dat de apoptotische caspase-8 ook van cruciaal belang is voor het reguleren van een andere vorm van PCD genaamd necroptose. Het verlies van caspase-8 resulteert in spontane receptor-interagerende serine-threonine kinase 3 (RIPK3)-gemedieerde gemengde lineage kinase domein-like pseudokinase (MLKL) activering om de III-PCD route van necroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35 aan te sturen.

Hoewel caspasen historisch zijn geclassificeerd als "apoptotisch" of "inflammatoir" op basis van het type celdood dat ze initiëren, suggereert groeiend bewijs dat er uitgebreide overspraak is tussen de aangeboren immuun-PCD-routes door caspasen 3,4. Bijvoorbeeld, de inflammatoire caspase-1 van inflammasomen splitst de apoptotische caspase-7 op zijn canonieke activeringsplaats34. Caspase-1 activering kan ook leiden tot de splitsing van apoptotische substraten zoals poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1)36. In cellen zonder GSDMD kan caspase-1 ook caspase-337,38 splijten. Bovendien kan de canoniek apoptotische caspase-3 gasdermin E (GSDME) splitsen om PCD17,18 te induceren en verwerkt ook GSDMD in een inactieve vorm40. Verder is caspase-8 rekrutering voor het inflammasoomcomplex waargenomen 39,40,41,42,43,44,45, en caspase-8 is een belangrijke regulator van canonieke en niet-canonieke inflammasoomactivatie 39. Er zijn ook overlappende en redundante rollen voor caspase-8 en caspase-1 in veel ontstekingsaandoeningen, en aangeboren immuun-PCD gekenmerkt door de activering van pyroptotische, apoptotische en necroptotische componenten komt voor in het ziektespectrum 39,46,47,48,49,50.

Op basis van deze overspraak tussen inflammatoire en apoptotische caspasen werd een belangrijke kloof in het mechanistische begrip van aangeboren immuniteit en PCD geïdentificeerd, wat leidde tot de ontdekking van PANoptose. PANoptose is een unieke vorm van III-PCD die wordt geactiveerd als reactie op pathogenen, PAMP's, DAMP's en veranderingen in homeostase en wordt gereguleerd door PANoptosomen - veelzijdige macromoleculaire complexen die componenten van andere celdoodroutes integreren 44,50,51,52,53,54,55 . De totaliteit van de biologische effecten in PANoptose kan niet individueel worden verklaard door pyroptose, apoptose of necroptose alleen 3,4,35,36,39,46,47,48, aangezien PANoptose wordt gekenmerkt door de activering van meerdere caspasen, waaronder caspase-1, caspase-11, caspase-8, caspase-9, caspase-3 en/of caspase-7, afhankelijk van de context 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptose is in toenemende mate betrokken bij infectie- en ontstekingsziekten, evenals bij kankers en kankertherapieën 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Gezien de essentiële rol van caspasen in celdoodroutes, waaronder apoptose, pyroptose, necroptose en PANoptose, is het belangrijk om technieken te ontwikkelen om hun activering te karakteriseren en de volledige complexiteit van de PCD-routes te begrijpen. Het protocol beschrijft hier een methode om cellen te stimuleren en de daaropvolgende activering van caspasen te meten (figuur 1). Deze methode maakt gebruik van de proteolytische splitsing van caspasen, die over het algemeen nodig is voor hun activering, als een middel om ze te bestuderen. Door middel van western blotting kunnen de eiwitgroottes worden bepaald, waardoor de inactieve pro-caspasen en hun geactiveerde, gesplitste vormen duidelijk kunnen worden gevisualiseerd en gedifferentieerd.

De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn 1) het vermogen om de activering van meerdere caspasen parallel van een enkele populatie van endogene cellen te beoordelen om pcd-activering nauwkeuriger te bepalen en 2) het gebruik van relatief eenvoudige laboratoriumtechnieken die geen uitgebreide training of dure apparatuur vereisen. Eerdere protocollen hebben westerse blotting, fluorescerende reporters of antilichaamkleuring gebruikt om caspase-activering in kweeksupernatanten, cel- en weefsellysaten, hele cellen via microscopie en in vivo 67,68,69,70,71 te controleren, maar deze technieken controleren over het algemeen slechts één of twee caspasen in een monster. Bovendien, terwijl synthetische peptidesubstraten die caspasesplitsingsplaatsen bevatten die fluoresceren bij splitsing zijn gebruikt om caspase-activering in cel- of weefsellysaten te controleren69, kunnen deze substraten vaak door meer dan één caspase worden gesplitst, waardoor het moeilijk is om de specifieke activering van individuele caspasen in dit systeem te bepalen. Bovendien stelt het gebruik van western blotting in plaats van het gebruik van fluorescerende reporters of andere op tags gebaseerde methoden onderzoekers in staat om endogene cellen te gebruiken in plaats van specifieke cellijnen te maken met reportergenen. Er zijn meerdere voordelen aan het gebruik van endogene cellen, waaronder het feit dat veel vereeuwigde cellijnen een tekort hebben aan belangrijke celdoodmoleculen72,73, wat de resultaten zou kunnen beïnvloeden. Bovendien maakt het gebruik van endogene cellen de evaluatie van verschillende celtypen mogelijk, zoals macrofagen, epitheelcellen en endotheelcellen, in plaats van een enkele afstamming. Western blotting is ook een relatief eenvoudige en kosteneffectieve techniek die kan worden uitgevoerd in laboratoria over de hele wereld zonder de noodzaak van grote, dure apparatuur of gecompliceerde opstellingen.

Dit protocol is breed toepasbaar in de biologie om zowel de celdoodafhankelijke als celdoodonafhankelijke functies van caspasen te begrijpen, inclusief hun steigerrollen en functies in andere ontstekingssignaleringsroutes74. Het toepassen van deze methode maakt een uniforme aanpak mogelijk in de studie van aangeboren immuun-PCD-routes en ontstekingssignalering tussen ziekten en aandoeningen, en dit protocol kan worden gebruikt om kritieke regulerende processen en mechanistische verbindingen te identificeren die de ontwikkeling van toekomstige therapeutische strategieën zullen informeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het gebruik en de procedures voor dieren werden goedgekeurd door het St. Jude Children's Research Hospital Committee on the Use and Care of Animals.

1. De oplossingen voorbereiden

  1. Bereid L929-geconditioneerde media voor.
    1. Plaat 1 × 106 L929-cellen (zie materiaaltabel) in een 182 cm 2-weefselkweekkolf met 50 ml L929-kweekmedia (zie tabel 1 voor de bereiding van de media).
    2. Kweek de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
    3. Verzamel na 7 dagen het supernatant en filter met een filter van 0,45 μm. Bereid 50 ml aliquots (bewaar bevroren aliquots bij −80 °C gedurende maximaal 1 jaar).
  2. Bereid 500 ml van van beenmerg afgeleide macrofaag (BMDM) kweekmedia (tabel 1).
  3. Bereid 500 ml BMDM-stimulatiemedia voor (tabel 1).
  4. Bereid 500 ml media voor infectie voor (tabel 1).
  5. Bereid 100 ml 1 M Tris-buffer (tabel 1).
  6. Bereid 4x natriumdodecylsulfaat (SDS) buffer (tabel 1).
  7. Bereid 1 ml 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT, tabel 1).
  8. Bereid 40 ml caspase lysisbuffer (tabel 1).
  9. Bereid 100 ml Tris-buffer van 1,5 M voor (tabel 1).
  10. Bereid 100 ml van een 10% (wt/vol) SDS-oplossing (tabel 1).
  11. Bereid 50 ml van een 2x radioimmunoprecipitatietest (RIPA) buffer (tabel 1).
  12. Bereid een LPS-oplossing van 5 mg/ml (tabel 1).
  13. Bereid een ATP-oplossing van 0,5 M (tabel 1).
  14. Bereid de westerse blotting oplossingen.
    1. Bereid 1 L van 5x lopende buffervoorraad (tabel 1).
    2. Bereid 1 L van 10x transferbuffervoorraad (tabel 1).
    3. Bereid 1 L Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST, tabel 1).
    4. Bereid 100 ml van een 5% (wt/vol) magere melkblokkeringsoplossing (tabel 1).
  15. Bereid de primaire antilichaamoplossingen voor.
    1. Bereid 10 ml caspase-1 primair antilichaam (tabel 1).
    2. Bereid 10 ml caspase-11 primair antilichaam (tabel 1).
    3. Bereid 10 ml caspase-3 primair antilichaam (tabel 1).
    4. Bereid 10 ml caspase-7 primair antilichaam (tabel 1).
    5. Bereid 10 ml caspase-8 primair antilichaam (tabel 1).
    6. Bereid 10 ml caspase-9 primair antilichaam (tabel 1).
    7. Bereid 10 ml HRP-geconjugeerd β-actine primair antilichaam (tabel 1).
  16. Bereid de secundaire antilichaamoplossingen voor.
    1. Bereid 10 ml anti-konijn secundair antilichaam (tabel 1).
    2. Bereid 10 ml secundair antilichaam tegen muizen voor (tabel 1).
    3. Bereid 10 ml secundaire antistoffen tegen ratten voor (tabel 1).

2. Isoleren van beenmerg-afgeleide macrofagen

OPMERKING: Voor dit protocol kunnen 6-10 weken oude wild-type muizen met intacte PCD-routes of gemuteerde muizen met de PCD-regulatoren, effectoren of moleculen van belang verwijderd of gewijzigd worden gebruikt.

  1. Euthanaseer een muis in een CO 2-kamer met een stroomsnelheid die 10% -30% van het kooivolume per minuut gedurende2-3 minuten verplaatst. Voer vervolgens een secundaire euthanasiemethode uit, zoals cervicale dislocatie. Volg alle aanvullende facilitaire, instellings- en overheidsspecifieke richtlijnen en voorschriften waar van toepassing.
  2. Ontleed de muis om de achterpootbeenderen op te halen.
    1. Pin de muis op zijn rug zodat de buik bloot komt te liggen. Spray met 70% (vol/vol) ethanol om de achterpoten en buik te steriliseren.
      LET OP: Ethanol is ontvlambaar. Houd het uit de buurt van open vuur.
    2. Gebruik een schaar om een incisie te maken op de middellijn van de buik; Blijf naar de benen toe snijden om de dijbenen zichtbaar te maken.
    3. Neem het rechterachterbeen en trek de huid weg van het lichaam naar de middellijn. Maak het been los van het lichaam door de adductorenspieren naar de middellijn te snijden; Snijd vervolgens het been tussen het heupgewricht en de wervelkolom. Knip vervolgens de poot distaal van de enkel af en verwijder overtollig weefsel van het bot door de huid af te pellen en een licht geopende schaar te gebruiken om het kuitweefsel te verwijderen.
    4. Leg het been op een met ethanol gedrenkte handdoek van 70% (vol/vol) en ontleed het scheenbeen en het dijbeen.
      1. Klem het scheenbeen en het dijbeen elk met een aparte set tangen. Druk het scheenbeen zachtjes tegen de natuurlijke richting van het kniegewricht; Hierdoor breekt het scheenbeen bij de knie.
      2. Gebruik indien nodig de tang en ontleedschaar om eventueel achtergebleven hangend weefsel te verwijderen. Bewaar het scheenbeen voor later gebruik door het op de in ethanol gedrenkte handdoek te leggen.
      3. Verzamel het dijbeen op dezelfde manier, door de knie af te breken.
    5. Herhaal stap 3 en 4 hierboven voor het linkerbeen om het uit het lichaam te verwijderen en het scheenbeen en het dijbeen te ontleden.
    6. Spuit de botten in met 70% (vol/vol) ethanol.
    7. Reinig de botten door ze op een schone 70% (vol / vol) met ethanol gedrenkte handdoek te leggen, het vlezige deel in de handdoek te knijpen en de handdoek tegen het bot te wrijven om overtollig weefsel te verwijderen.
  3. Zodra beide dijbenen en beide scheenbenen schoon zijn, spuit je alle vier de botten in met 70% (vol/vol) ethanol. Verzamel de botten in een steriele petrischaal en spoel ze af met 10 ml BMDM-kweekmedia door de media voorzichtig in de schaal te zwenken.
  4. Vul een spuit van 10 ml met 10 ml vers BMDM-cultuurmedium en bevestig een naald van 25 g.
  5. Pak het scheenbeen op met een tang; Snijd vervolgens het enkelgewricht in een hoek van ~ 45 °.
  6. Spoel het beenmerg uit het scheenbeen.
    1. Houd het scheenbeen boven een buis van 50 ml, met het smalle uiteinde van het scheenbeen naar beneden gericht. Strooi de media over het scheenbeen uit de gevulde spuit.
    2. Steek de naald (eerst voorzichtig) aan de bovenkant van het merg en verdeel de media.
    3. Verwijder de naald en breng opnieuw in. Gebruik korte, hogedrukdrukken om de media af te geven en de naald in het merg te verplaatsen.
    4. Zodra de media uit de bodem van het bot beginnen te stromen, gebruik je korte, hogedrukdrukken om de cellen verder weg te spoelen. Controleer de kleur van het bot tijdens dit proces en wanneer het bot wit is, gooit u het weg.
    5. Doe dit voor beide scheenben.
  7. Herhaal stap 5 en 6 hierboven voor de dijbenen, snijden in het heupgewricht terwijl het scheenbeen bij het enkelgewricht werd gesneden. Gebruik dezelfde buis van 50 ml om de BMDM-kweekmedia te verzamelen terwijl het merg wordt gespoeld.
  8. Zodra alle vier de botten zijn gespoeld, zuigt u het merg en de media uit de buis van 50 ml 3x op en neer door een naald van 18 G op een spuit van 10 ml en spoelt u de zijkanten van de buis elke keer om het merg te verspreiden.
  9. Pas het uiteindelijke volume in de buis van 50 ml aan tot 30 ml met BMDM-kweekmedia en zorg ervoor dat de cellen grondig worden gesuspendeerd.
  10. Gebruik een 70 μm celzeef om de BMDM-kweekmedia uit de buis van 50 ml te filteren.
  11. Plaats de resulterende celsuspensie, die de beenmergvoorlopercellen bevat, in drie weefselkweekschalen van 150 mm door 10 ml (of ~ 20 × 106 cellen) aan elk toe te voegen. Voeg vervolgens een extra 10 ml BMDM-cultuurmedia toe aan elk gerecht. Incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 °C.

3. Differentiëren van de BMDM's en plating voor de experimenten

  1. Incubeer de vergulde beenmergvoorlopercellen bij 37 °C gedurende 3 dagen. Verwijder vervolgens elk gerecht en voeg een extra 5-8 ml BMDM-kweekmedia toe (tabel 1). Keer terug naar de couveuse bij 37 °C.
  2. Verwijder op dag 5 na de eerste beplating elk gerecht en voeg nog eens 5 ml BMDM-kweekmedia toe. Keer terug naar de couveuse bij 37 °C.
  3. Verwijder op dag 6 elk gerecht en gooi de media weg. Voeg vervolgens 10 ml koude (bewaard bij 4 °C) PBS toe om eenmaal te wassen. Gooi de 10 ml koude PBS-was weg. Voeg vervolgens 10 ml verse, koude PBS toe aan elk gerecht en incubeer elk gerecht gedurende 5 minuten op ijs.
  4. Schraap met behulp van een celschraper de cellen voorzichtig van alle drie de gerechten in één buis van 50 ml. Draai de cellen voorzichtig af bij 270 × g bij 4 °C gedurende 5 minuten; Gooi vervolgens het supernatant weg.
  5. Voeg 20 ml BMDM-kweekmedia toe, pipetteer op en neer om de pellet te resuspenderen en tel de cellen.
    OPMERKING: Verwacht wordt dat elke muis ongeveer 60 × 10 6-100 × 106 cellen zal opleveren.
  6. Plan de 12-well plaatlay-out voor de gewenste in vitro celdood / ontstekingsstimulatietest. Plan om 1 × 106 cellen per put te plaatsen. Neem voor elke geplande stimulatie ten minste drie biologische replicaties op en plaat één set putten die moeten worden geoogst in caspase lysisbuffer en een tweede set putten die moeten worden geoogst in RIPA-buffer.
  7. Plaat 1 × 106 cellen in 1 ml BMDM-kweekmedia per put in 12-putplaten. Kweek 's nachts in een bevochtigde incubator bij 37 °C voordat u overgaat tot de celdood/ontstekingsevaluatie. Verwijder na een nacht incubatie de media en voeg 1 ml warme (37 °C) PBS toe aan elke put om de cellen te wassen.
  8. Verwijder de PBS-wassing en voeg 500 μl BMDM-stimulatiemedia toe met antibiotica (bij het uitvoeren van niet-bacteriële stimulaties) of BMDM-stimulatiemedia zonder antibiotica (bij het uitvoeren van bacteriële stimulaties) (tabel 1). Incubeer gedurende 2 uur voordat u naar stap 4 gaat voor in vitro stimulatie/infectie.

4. Het stimuleren of infecteren van de cellen

LET OP: De in dit protocol opgenomen agentia zijn potentieel pathogeen en moeten met de juiste voorzorgsmaatregelen worden behandeld in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) faciliteit met goedkeuring van de relevante institutionele en overheidsinstanties.

  1. Stimuleer de BMDM's om celdood te activeren met de trigger van interesse.
    OPMERKING: Voor de toepassing van dit protocol wordt influenza A-virus (IAV), herpes simplex-virus 1 (HSV1), Francisella novicidaen LPS + ATP worden ter illustratie gebruikt, maar er kunnen ook andere triggers worden gebruikt.
    1. Voorbeeld stimulatie 1: Infecteren met IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (geconstrueerd volgens Hoffmann et al.75; de virale titer voor de multipliciteit van infectie [MOI] bepaling wordt berekend door een plaque assay in MDCK cellen):
      1. Bereken het volume virus dat nodig is voor infectie bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 20 plaquevormende eenheden (PFU) met behulp van vergelijking (1) en vergelijking (2):
        Equation 1
        Equation 2
        Equation 3
      2. Verwijder de media uit de BMDM's en was de cellen eenmaal met 500 μL PBS. Voeg 450 μL IAV (20 MOI) in dmem met een hoog glucosegehalte zonder warmte-geïnactiveerde (HI)-FBS toe aan elke put. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 1 uur in een bevochtigde incubator om absorptie mogelijk te maken.
      3. Verwijder de platen en voeg 50 μL HI-FBS toe. Breng de platen terug naar de incubator bij 37 °C. Incubeer gedurende een totaal van 12 uur.
    2. Voorbeeld stimulatie 2: Infecteren met HSV1 (HF-stam; gekweekt zoals eerder beschreven44; de virale titer voor MOI-bepaling wordt berekend door een plaquetest in Vero-cellen):
      1. Bereken het volume virus dat nodig is voor infectie bij een MOI van 10 PFU met behulp van vergelijking (1) en vergelijking (2) uit stap 1 in de sectie IAV-infectie hierboven.
        Equation 4
      2. Verwijder de media uit de BMDM's. Voeg 450 μL HSV1 (MOI 10) in dmm's met een hoog glucosegehalte zonder HI-FBS toe aan elke put. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 1 uur in een bevochtigde incubator om absorptie mogelijk te maken.
      3. Verwijder de platen en voeg 50 μL HI-FBS toe. Breng de platen terug naar de incubator bij 37 °C. Incubeer gedurende een totaal van 12 uur.
    3. Voorbeeld stimulatie 3: Infecteren met F. novicida (U112 stam; gekweekt zoals eerder beschreven44 onder aerobe omstandigheden bij 37 °C in BBL Trypticase Sojabouillon aangevuld met 0,2% L-cysteïne 's nachts. Subcultuur vervolgens de bacteriën in een verhouding van 1:10 bij 37 °C gedurende nog eens 4 uur in vers medium voordat de optische dichtheid (OD) bij 600 nm wordt ingenomen met behulp van het verse medium als blanco. Een OD-waarde van 1 komt overeen met 1 × 109 kolonievormende eenheden (CFU) per ml.)
      1. Bereken het volume F . novicida dat nodig is voor infectie bij een MOI van 50 CFU met behulp van vergelijking (3) en vergelijking (4):
        Equation 5
        Equation 6
        Equation 7
      2. Verwijder de media uit de BMDM's. Voeg 500 μL F. novicida (MOI 50) in BMDM-stimulatiemedia zonder antibiotica toe aan elk putje. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 4 uur in een bevochtigde incubator om absorptie mogelijk te maken.
      3. Was de cellen driemaal met verwarmde (37 °C) PBS en voeg 500 μL BMDM-stimulatiemedia toe die 50 μg/ml gentamycine bevatten. Breng de platen terug naar de incubator bij 37 °C. Incubeer 's nachts (16 uur).
    4. Voorbeeld stimulatie 4: Stimuleer met LPS + ATP.
      1. Verwijder de media uit de BMDM's. Voeg 500 μL BMDM-stimulatiemedia met antibiotica (tabel 1) met 100 ng/ml LPS toe aan elk putje. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 3,5 uur in een bevochtigde incubator.
      2. Voeg 5 μL 0,5 M ATP-stamoplossing (tabel 1) toe aan elk putje. Breng de platen terug naar de incubator bij 37 °C. Incubeer gedurende 30 min.

5. Het verzamelen van het gecombineerde supernatant en eiwitlysaat voor gebruik voor caspase western blots

  1. Na 4 uur, 12 uur of 16 uur incubatie (de specifieke timing is afhankelijk van de gebruikte trigger), verwijdert u de plaat uit de couveuse.
  2. Verwijder 150 μL van het supernatant; gooi dit weg of bewaar dit voor andere supernatantanalyses (bijv. enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA]). Verwijder het resterende supernatant niet.
  3. Maak de eiwitverzamelingsoplossing door 50 μL caspase lysisbuffer + 100 μL 4x SDS-buffer per put te combineren (tabel 1). Voeg vervolgens 150 μL van het mengsel toe aan elk putje.
  4. Pipet voor elk putje het mengsel op en neer om de gelyseerde cellen en het supernatant te verzamelen. Schraap tijdens het pipetteren ook de bodem van de put met de pipetpunt om de cellen te verstoren. Na het schrapen en pipetteren, verzamelt u het eiwitlysaat in gelabelde buisjes van 1,5 ml.
  5. Gebruik een warmteblok om alle buizen gedurende 12 minuten tot 100 °C te verwarmen.
  6. Pellet alle onoplosbare componenten door te centrifugeren bij 14.500 × g gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Dit is een pauzepunt - het eiwit van het gecombineerde supernatant en eiwitlysaten kan onmiddellijk worden gebruikt of worden opgeslagen bij −20 °C gedurende maximaal 2 maanden of bij −80 °C gedurende maximaal 6 maanden totdat het klaar is voor gebruik.

6. Het verzamelen van het eiwit lysaat voor gebruik voor caspase western blots

  1. Na 4 uur, 12 uur of 16 uur incubatie (de specifieke timing is afhankelijk van de gebruikte trigger), verwijdert u de plaat uit de couveuse. Verwijder al het supernatant; gooi dit weg of bewaar dit voor andere supernatantanalyses (bijv. ELISA).
  2. Maak de 1x RIPA-buffer door de 2x RIPA-stamoplossing (tabel 1) te verdunnen in een gelijk volume gedeïoniseerd water. Voeg vervolgens een fosfataseremmertablet en een proteaseremmertablet toe en laat ze oplossen. Voeg 150 μL 1x RIPA-buffer en 50 μL 4x SDS toe aan elke put.
  3. Pipet voor elke put het mengsel op en neer om de gelyseerde cellen te verzamelen. Schraap tijdens het pipetteren ook de bodem van de put met de pipetpunt om de cellen te verstoren. Na het schrapen en pipetteren, verzamelt u het eiwitlysaat in gelabelde buisjes van 1,5 ml.
  4. Gebruik een warmteblok om alle buizen gedurende 12 minuten tot 100 °C te verwarmen.
  5. Pellet alle onoplosbare componenten door te centrifugeren bij 14.500 × g gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Dit is een pauzepunt - de eiwitlysaten kunnen onmiddellijk worden gebruikt of worden opgeslagen bij −20 °C of −80 °C totdat ze klaar zijn voor gebruik.

7. Het uitvoeren van western blotting met behulp van de lysaten verzameld uit de BMDM's volgens de bovenstaande stappen of uit weefselhomogenaten

OPMERKING: Als weefsel wordt gebruikt, kan het met de hand of via een door kracht aangedreven weefselhomogenisator worden gehomogeniseerd. Het protocol van Simpson76 geeft een gedetailleerde beschrijving van weefselhomogenisatie.

  1. Bereid 1x lopende buffer voor: Combineer 200 ml van de 5x lopende buffervoorraad (tabel 1) en 800 ml gedeïoniseerd water. Maak deze 1x lopende buffer vlak voor elk experiment.
  2. Bereid het elektroforese-apparaat voor met een 12% (wt/vol) polyacrylamidegel met 10 putjes. Vul het elektroforese-apparaat met 1x lopende buffer. Verwijder vervolgens de gelkam.
    OPMERKING: Om caspase-1, caspase-11, caspase-3, caspase-7, caspase-8 en caspase-9 voor elk monster te analyseren, zijn zes gels nodig.
  3. Voor caspase-1, caspase-3, caspase-7 en caspase-8 vlekken, plan om 30 μL van het gecombineerde supernatant en eiwitlysaat te gebruiken in caspase lysisbuffer of het weefselhomogenaat. Voor caspase-11 en caspase-9 blots, plan om 20 μL van het eiwitlysaat in RIPA-buffer of het weefselhomogenaat te gebruiken. Als de monsters zijn bewaard bij −20 °C of −80 °C, ontdooi ze dan eerst op ijs.
  4. Verwarm voor alle monsters gedurende 5 minuten tot 100 °C en centrifugeer gedurende 30 s bij 4 °C bij 14.500 × g voordat u ze laadt. Laad vervolgens langzaam 20 of 30 μL van het monster in elke rijstrook. Vermijd dat er monsters overlopen naar de andere rijstroken. Om alle zes caspasen tegelijk te evalueren, gebruikt u dezelfde procedure om de juiste monsters in elk van de zes gels te laden.
  5. Sluit het elektroforeseapparaat aan op de stroombron. Stel vervolgens het vermogen in op 80 V gedurende 20 minuten om de gelrun te starten en pas het vermogen vervolgens aan op 130 V gedurende 45-60 minuten.
  6. Let goed op de kleurstofvoorkant en schakel de stroom uit wanneer de kleurstofvoorkant zich aan de onderkant van de gel bevindt, maar nog niet uit de gel is geduwd.
  7. Terwijl de gel draait, bereidt u 1x transferbuffer voor door 700 ml gedeïoniseerd water, 100 ml van de 10x transferbuffervoorraad (tabel 1) en 200 ml methanol te combineren. Maak de 1x oplossing elke keer vers.
    OPMERKING: Wees voorzichtig omdat methanol ontvlambaar is. Voer de voorbereiding van de transferbuffer uit de buurt van open vuur uit.
  8. Verwijder de gel voorzichtig uit het elektroforeseapparaat met behulp van de gelreleaser.
  9. Stel één transferstack in voor elke gel.
    1. Activeer een PVDF-membraan door het gedurende 1 minuut in methanol te weken.
    2. Maak twee stukken filtreerpapier, de gel en het PVDF-membraan gedurende 5 minuten voorbevochtigd in de transferbuffer. Bewaar het PVDF-membraan en de gel in afzonderlijke containers tijdens deze incubatietijd van 5 minuten.
    3. Monteer de transferstack op het halfdroge systeem. Begin aan de onderkant van de platina anodezijde en plaats een stuk filterpapier, het PVDF-membraan, de gel en ten slotte een stuk filterpapier. Rol voorzichtig luchtbellen uit of druk ze uit tussen de lagen en sluit de bovenkant van het systeem. Zorg ervoor dat de veiligheidsafdekking is vastgezet voordat u verder gaat.
  10. Sluit aan op de voedingsbron. Stel het vermogen in op 25 V gedurende 45 minuten.
  11. Nadat de overdracht is voltooid, demonteer u de overdrachtsstapel en verzamelt u het membraan; Plaats het in een vierkante petrischaal (incubatiebak).
  12. Voer membraanblokkering uit door 15 ml van een 5% (wt/vol) magere melkoplossing toe te voegen (tabel 1). Incubeer het membraan op een schommelende schudder bij 50 tpm tot 70 tpm bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    OPMERKING: Dit is een pauzepunt – het membraan kan na 1 uur worden verwijderd of 's nachts in een blokkerende oplossing bij 4 °C worden bewaard.
  13. Verwijder na 1 uur of incubatie 's nachts de blokkerende oplossing. Voeg 10 ml van de verdunde antilichaamoplossing toe (anti-caspase-1-antilichaam, anti-caspase-11-antilichaam, gecombineerd anti-caspase-3- en anti-gespleten caspase-3-antilichaam, gecombineerd anti-caspase-7- en anti-gespleten caspase-7-antilichaam, gecombineerd anti-caspase-8- en anti-gespleten caspase-8-antilichaam of anti-caspase-9-antilichaam) (tabel 1). Plaats op een schommelende schudder bij 50 rpm tot 70 rpm om te incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur of bij 4 °C 's nachts (16 uur).
  14. Verzamel de antilichaamoplossing (hergebruik tot 3x of gooi het weg) en was door 15 ml TBST (tabel 1) toe te voegen aan het membraan op een schommelschudder bij 50 tpm tot 70 tpm bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gooi de TBST weg.
  15. Herhaal de was met 15 ml TBST na stap 14 in totaal 3x.
  16. Voeg 10 ml van de verdunde secundaire HRP-geconjugeerde antilichaamoplossing toe (anti-konijn voor vlekken gekleurd met primaire antilichamen tegen caspase-3, caspase-7, caspase-8 of caspase-9; anti-muis voor vlekken gekleurd met primair antilichaam tegen caspase-1; anti-rat voor vlekken gekleurd met primair antilichaam tegen caspase-11) (tabel 1). Incubeer op een schommelende schudder bij 50 tpm tot 70 tpm bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  17. Verwijder de antilichaamoplossing en was door 15 ml TBST aan het membraan toe te voegen op een schommelende shaker bij 50 tpm tot 70 tpm bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gooi de TBST weg.
  18. Herhaal de was met 15 ml TBST na stap 17 in totaal 3x.
  19. Voeg 10 ml van het zeer gevoelige HRP-substraat toe aan het membraan. Laat het 1 minuut op kamertemperatuur in het donker staan.
  20. Verwijder het membraan van het substraat. Ga direct naar de beeldvorming, met behulp van een chemiluminescentie-imager met de witte translade van het accessoire in de onderste positie. Belicht het membraan met behulp van de automatische belichtingsmodus (over het algemeen ~ 1-2 minuten belichtingstijd).
  21. Gebruik het membraan van de caspase-9 of caspase-11 blotting (d.w.z. een membraan met RIPA-lysaatmonsters), voeg 10 ml strippingbuffer toe en incubeer op een schommelende shaker bij 50 rpm tot 70 rpm bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  22. Gooi de stripbuffer weg en was door 15 ml TBST aan het membraan toe te voegen op een schommelschudder bij 50 tpm tot 70 tpm bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gooi de TBST weg.
  23. Herhaal de was met 15 ml TBST na stap 22 in totaal 3x.
  24. Voer membraanblokkering uit door 15 ml van een 5% (wt / vol) magere melkoplossing toe te voegen. Incubeer het membraan op een schommelende schudder bij 50 tpm tot 70 tpm bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    OPMERKING: Dit is een pauzepunt – het membraan kan na 1 uur worden verwijderd of 's nachts in een blokkerende oplossing bij 4 °C worden bewaard.
  25. Verwijder na 1 uur of incubatie 's nachts de blokkerende oplossing. Voeg 10 ml van de verdunde anti-β-actine (HRP-geconjugeerde) antilichaamoplossing toe. Plaats op een schommelende schudder bij 50 rpm tot 70 rpm om gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur te incuberen.
  26. Verwijder de antilichaamoplossing en was door 15 ml TBST aan het membraan toe te voegen op een schommelende schudder bij 50 tpm tot 70 tpm bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gooi de TBST weg.
  27. Herhaal de was met 15 ml TBST na stap 26 in totaal 3x.
  28. Voeg 10 ml van het standaardgevoelige HRP-substraat toe aan het membraan. Laat het 1 minuut op kamertemperatuur in het donker staan.
  29. Ga direct naar de beeldvorming, met behulp van een chemiluminescentie-imager met de witte translade van het accessoire in de onderste positie. Belicht het membraan met behulp van de automatische belichtingsmodus (over het algemeen <1 min belichtingstijd).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PANoptosis is waargenomen als reactie op talrijke bacteriële, virale en schimmelinfecties en andere ontstekingsstimuli, evenals in kankercellen 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 . In deze gevallen is de activering van meerdere caspasen gemeld. Met behulp van de voorbeeldstimulaties in dit protocol waarvan bekend is dat ze PANoptosis induceren, namelijk IAV, HSV1 en F. novicida 44,48,50,51,53,57, wordt verwacht dat splitsing kan worden waargenomen als een surrogaat voor de activering van meerdere caspasen (figuur 2A-C ). Daarnaast is LPS + ATP inbegrepen als controle; deze combinatie is een canonieke NLRP3-inflammasoomtrigger die naar verwachting caspase-1-activering zal induceren. De activering van caspase-1 kan worden gevisualiseerd als reactie op elk van deze triggers door de splitsing van de p45 pro-vorm naar de p20 actieve vorm (figuur 2D). De p20-vorm kan dan GSDMD splitsen en celdood19 initiëren.

Evenzo wordt de activering van de apoptotische initiator caspase, caspase-8, waargenomen, zoals aangegeven door de aanwezigheid van de p18-gesplitste vorm (figuur 2A-D). De zwakke activering van caspase-9 kan in sommige gevallen ook worden waargenomen met deze stimuli (figuur 2A-D). Stroomafwaarts van deze initiatiefnemers worden de effector caspases caspase-3 en caspase-7 geactiveerd; deze activering wordt waargenomen als de vorming van de p17/19 gesplitste vorm van caspase-3 en de p20 gekloofde vorm van caspase-7 (figuur 2A-D). Tot op heden is de activering van caspase-11 niet op grote schaal geëvalueerd in PANoptose, maar de activering ervan is in sommige contexten waargenomen54. Caspase-11 blijft een belangrijke inflammatoire caspase en de activering ervan kan worden waargenomen door de vorming van de p26-gesplitste vorm. Hoewel enige caspase-11-activering op laag niveau wordt waargenomen, wordt robuuste activering niet waargenomen als reactie op IAV-, HSV1- of F. novicida-infectie of LPS + ATP-stimulatie (figuur 2A-D).

Cellen zonder upstream PANoptosis-sensoren ondergaan geen celdood als reactie op PANoptose-inducerende stimuli. IAV-infectie induceert bijvoorbeeld de vorming van het ZBP1-PANoptosoom 48,51,53,57 en Zbp1-/- cellen worden beschermd tegen celdood tijdens IAV-infectie (figuur 3A). Evenzo induceren HSV1- en F. novitida-infecties de vorming van het AIM2-PANoptosoom44, en Aim2-/- cellen ondergaan geen robuuste celdood als reactie op deze infecties (figuur 3B, C). In cellen met een tekort aan de stroomopwaartse sensor die nodig is voor panoptosoomvorming, wordt de activering van caspasen aanzienlijk verminderd of zelfs geëlimineerd, zoals te zien is aan de vermindering van de intensiteit van de gespleten banden in de westelijke vlekken (figuur 2A-C). Evenzo worden cellen zonder stroomopwaartse inflammasoomsensoren beschermd tegen celdood als reactie op hun respectieve stimuli, en Nlrp3-/- cellen ondergaan geen celdood als reactie op LPS + ATP (figuur 3D). Deze cellen vertonen ook een verminderde caspase-activering (figuur 2D).

Figure 1
Figuur 1: Overzicht van de experimentele procedure. Beenmerg wordt geïsoleerd en gedifferentieerd in van beenmerg afgeleide macrofagen. Deze cellen worden vervolgens gestimuleerd met een trigger die aangeboren immuunsignalering en celdood activeert, zoals een infectie of een ontstekingsprikkel. Nadat de cellen zijn geactiveerd en PCD beginnen te ondergaan, wordt het lysaat verzameld en geanalyseerd door western blotting om caspase-splitsing naar hun actieve vormen te controleren. Afkortingen: BMDM's = van beenmerg afgeleide macrofagen; DAMPs = schade-geassocieerde moleculaire patronen; III-PCD = inflammatoire aangeboren immuungeprogrammeerde celdood; PAMPs = pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen; PCD = geprogrammeerde celdood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Activering van caspasen als reactie op prikkels. Caspase-activering uit celkweeklysaten kan worden beoordeeld door de grootte van de producten op een elektroforetische gel te evalueren. (A-D) Immunoblot analyse van pro- (P45) en geactiveerde (P20) CASP1, pro- (P43) en gekloofde (P36 en P26) CASP11, pro- (P35) en gekloofde (P17/P19) CASP3, pro- (P35) en gekloofde (P20) CASP7, pro- (P55) en gekloofde (P44 en P18) CASP8, en pro- (P49) en gekloofde (P37) CASP9 in WT en Zbp1−/−, WT en Aim2−/−, of WT en Nlrp3−/− BMDM's na (A) IAV-infectie, (B) HSV1-infectie, (C) Francisella novicida-infectie of (D) LPS + ATP-stimulatie. Beelden zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. Afkortingen: BMDM's = van beenmerg afgeleide macrofagen; CASP1 = caspase-1; CASP3 = caspase-3; CASP7 = caspase-7; CASP8 = caspase-8; CASP9 = caspase-9; CASP11 = caspase-11; HSV1 = herpes simplex virus 1; IAV = influenza A-virus; LPS = lipopolysaccharide; WT = wild-type. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Remming van celdood wanneer caspase-activering niet optreedt. (A-D) Representatieve beelden van celdood in WT en Zbp1−/−, WT en Aim2−/−, of WT en Nlrp3−/− BMDM's na (A) IAV-infectie, (B) HSV1-infectie, (C) Francisella novidida-infectie of (D) LPS + ATP-stimulatie. Het rode masker duidt op dode cellen. Schaalstaven = 50 μm. Beelden zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. Afkortingen: BMDM's = van beenmerg afgeleide macrofagen; HSV1 = herpes simplex virus 1; IAV = influenza A-virus; LPS = lipopolysaccharide; WT = wild-type. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1. Klik hier om deze tabel te downloaden. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het monitoren van caspase splitsing en activering biedt een van de meest uitgebreide beelden van aangeboren immuun PCD-activering als onderdeel van de aangeboren immuunrespons. Het hier beschreven protocol demonstreert een strategie om caspase-activering te controleren als reactie op IAV-, HSV1- en F. novicida-infecties en de steriele trigger LPS + ATP, maar tal van andere stimuli kunnen PCD induceren en kunnen in deze methode worden gebruikt, zoals is aangetoond in verschillende publicaties 44,48,49,50,51,52,53,54,56, 57,58,59,60,61,62. Deze procedure kan ook worden gebruikt om de aangeboren immuun-PCD te karakteriseren als reactie op nieuwe triggers, waarbij de mechanismen van PCD onbekend blijven. Het gebruik van een combinatie van wild-type en genetisch deficiënte cellen en het vergelijken van de activering van verschillende caspasen tussen deze populaties kan nieuwe inzichten opleveren in de sensoren en regulatoren die betrokken zijn bij PCD als reactie op een bepaalde stimulus.

Bij het uitvoeren van deze methode moet rekening worden gehouden met verschillende technische punten. Ten eerste, omdat deze methode het infecteren of anderszins stimuleren van cellen omvat om celdood te induceren, is het belangrijk om steriele technieken te gebruiken voor de isolatie van de cellen en voor de daaropvolgende stimulaties. Besmetting kan de resultaten aanzienlijk beïnvloeden, wat leidt tot activering van caspase, zelfs in niet-gestimuleerde omstandigheden. Om dit te testen, is het het beste om altijd een niet-gestimuleerde controle op te nemen bij het verzamelen van de monsters en het laden van gels voor de caspase-vlekken. Bovendien is het bij het plateren van de cellen belangrijk om ervoor te zorgen dat de cellen nauwkeurig worden geteld en dat er geen klontering optreedt. Als de cellen samengeklonterd zijn, zullen inconsistente aantallen cellen in de putten worden afgezet en zullen de MOI en de hoeveelheid eiwit per put worden beïnvloed. Bij het uitvoeren van de western blots is het een goede gewoonte om het bandingpatroon van de oomaven, pro-vorm van de caspase te vergelijken, en om de gesplitste vorm te controleren om ervoor te zorgen dat consistente hoeveelheden eiwit werden verzameld en over de putten werden geladen. Wanneer er echter een hoog niveau van caspase-activering in één monster is, kan dit een vervorming in het signaal veroorzaken, wat leidt tot wat lijkt op een vermindering van de pro-vorm in de andere monsters, zoals we laten zien met caspase-8 in HSV1 en F. novičida-infecties in dit voorbeeld (figuur 2B, C). Dit gebeurt waarschijnlijk als gevolg van ongelijke antilichaambinding veroorzaakt door de aanwezigheid van te veel eiwit op een bepaalde plek op het membraan, of vanwege beeldvormingsartefacten waarbij het substraat oververzadigd raakt in een enkel monster. Het aanpassen van de antilichaamverdunningen of beeldvormingsinstellingen kan dit probleem helpen oplossen. Bovendien, wanneer u voor de eerste keer een infectie of stimulatie vaststelt, kan het gebruik van een tijdsverloop nuttig zijn om te identificeren wanneer de activering van elke caspase optreedt. Zonder een tijdsverloop kunnen de gegevens misleidend zijn, omdat het geselecteerde individuele tijdstip te vroeg of te laat kan zijn, waardoor caspase-activering wordt gemist en ongepaste conclusies worden getrokken over de betrokkenheid ervan. Evenzo kan het testen van verschillende MOI's op infectieuze stimuli ook nuttig zijn om de specifieke omstandigheden te identificeren waaronder caspase (en) worden geactiveerd.

De elektroforesestap vereist ook precisie. Bij het voorbereiden van het laden van de monsters op de gel, moeten de buizen altijd eerst worden gecentrifugeerd en moet alleen het supernatant worden geladen. Onoplosbaar eiwit kan interfereren met de werking van de gel en de daaropvolgende analyse van de gegevens. Het gecombineerde supernatant en eiwitlysaat moet worden gebruikt voor de detectie van caspase-1 in plaats van een zuiver cellysaat; Dit zal de gevoeligheid van detectie aanzienlijk verbeteren. Caspase-3, caspase-7 en caspase-8 kunnen ook goed worden gedetecteerd in het gecombineerde supernatant en eiwitlysaat. Voor de beste resultaten bij het detecteren van caspase-11 en caspase-9 is het eiwitlysaat dat in de RIPA-buffer wordt verzameld echter voldoende. Omdat de relatieve abundantie van elke caspase in het lysaat laag kan zijn, moet zoveel mogelijk monster op de gel worden geladen. Dit vereist langzaam en gestaag pipetteren om te voorkomen dat het overloopt in de naburige putten. Als er een slechte scheiding wordt waargenomen tussen de pro- en gespleten vormen van de caspasen, kan de gellooptijd worden verlengd of kan een lager percentage acrylamide worden gebruikt om de scheiding te optimaliseren.

Ten slotte zijn de antilichamen die in dit protocol worden vermeld, geoptimaliseerd voor gebruik met BMDM's van muizen, en verschillende groepen hebben ze rigoureus getest met behulp van genetisch deficiënte cellen als controles om te bevestigen dat er geen niet-specifieke banden zijn bij de moleculaire gewichten van belang. Hoewel andere antilichamen ook kunnen werken, zijn de hier genoemde optimaal. Bovendien werken veel van deze antilichamen ook goed in weefsellysaten en kunnen andere celpopulaties ook in vitro worden verzameld en gestimuleerd voor analyse. Het gebruik van cellijnen of primaire cellen van mensen of andere soorten is ook mogelijk, maar vereist een aanvullende beoordeling van de antilichamen voor optimalisatie. Menselijke anti-caspase-1 (1:1.000) en menselijke anti-caspase-8 (1:1.000; zie Materiaaltabel) zijn met succes gebruikt voor dergelijke beoordelingen, en dezelfde anti-caspase-3, anti-gespleten caspase-3, anti-caspase-7 en anti-gespleten caspase-7 antilichamen die in dit protocol zijn opgenomen, kunnen worden gebruikt voor zowel muis- als menselijke cellen 44,56,62.

Het belang van het begrijpen van PCD-routes, waaronder pyroptose, apoptose, necroptose en PANoptose, als een integraal onderdeel van de aangeboren immuunrespons groeit, omdat overspraak tussen PCD-routes steeds meer wordt gekarakteriseerd en celdoodmoleculen worden geïdentificeerd als therapeutische doelen in het ziektespectrum 3,4 . Het blijven identificeren van de aangeboren immuunsensoren die zowel PCD als III-PCD induceren en de timing en het samenspel van caspase-activering karakteriseren, zal het vermogen verbeteren om aangeboren immuun-PCD-routes therapeutisch te moduleren en de patiëntresultaten te verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

T.-D.K. is consultant voor Pfizer.

Acknowledgments

We bedanken leden van het Kanneganti-lab voor hun opmerkingen en suggesties, en we bedanken J. Gullett, PhD, voor wetenschappelijke bewerkingsondersteuning. Het werk in ons lab wordt ondersteund door National Institutes of Health (NIH) subsidies AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 en CA253095 (aan T.-D.K.) en door de Amerikaanse Libanese Syrian Associated Charities (aan T.-D.K.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171 (1996).
  2. Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21 (2016).
  3. Gullett, J. M., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. It's all in the PAN: Crosstalk, plasticity, redundancies, switches, and interconnectedness encompassed by PANoptosis underlying the totality of cell death-associated biological effects. Cells. 11 (9), 1495 (2022).
  4. Pandian, N., Kanneganti, T. D. PANoptosis: A unique innate immune inflammatory cell death modality. Journal of Immunology. 209 (9), 1625-1633 (2022).
  5. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  6. Shi, Y. Caspase activation: Revisiting the induced proximity model. Cell. 117 (7), 855-858 (2004).
  7. Galluzzi, L., Lopez-Soto, A., Kumar, S., Kroemer, G. Caspases connect cell-death signaling to organismal homeostasis. Immunity. 44 (2), 221-231 (2016).
  8. Fernandes-Alnemri, T., Litwack, G., Alnemri, E. S. CPP32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 30761-30764 (1994).
  9. Tewari, M., et al. Yama/CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase. Cell. 81 (5), 801-809 (1995).
  10. Nicholson, D. W., et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature. 376 (6535), 37-43 (1995).
  11. Stennicke, H. R., et al. Pro-caspase-3 is a major physiologic target of caspase-8. Journal of Biological Chemistry. 273 (42), 27084-27090 (1998).
  12. Twiddy, D., Cohen, G. M., Macfarlane, M., Cain, K. Caspase-7 is directly activated by the approximately 700-kDa apoptosome complex and is released as a stable XIAP-caspase-7 approximately 200-kDa complex. Journal of Biological Chemistry. 281 (7), 3876-3888 (2006).
  13. Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Reviews of Immunology. 38, 567-595 (2020).
  14. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
  15. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: Controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (3), 231-241 (2008).
  16. Morioka, S., Maueröder, C., Ravichandran, K. S. Living on the edge: Efferocytosis at the interface of homeostasis and pathology. Immunity. 50 (5), 1149-1162 (2019).
  17. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  18. Rogers, C., et al. Cleavage of DFNA5 by caspase-3 during apoptosis mediates progression to secondary necrotic/pyroptotic cell death. Nature Communications. 8, 14128 (2017).
  19. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  20. Shi, J., Gao, W., Shao, F. Pyroptosis: Gasdermin-mediated programmed necrotic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 245-254 (2017).
  21. Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
  22. Aglietti, R. A., et al. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7858-7863 (2016).
  23. Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341 (6151), 1250-1253 (2013).
  24. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  25. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  26. Lamkanfi, M., et al. Targeted peptidecentric proteomics reveals caspase-7 as a substrate of the caspase-1 inflammasomes. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (12), 2350-2363 (2008).
  27. Kalai, M., et al. Tipping the balance between necrosis and apoptosis in human and murine cells treated with interferon and dsRNA. Cell Death & Differentiation. 9 (9), 981-994 (2002).
  28. Li, C., et al. Development of atopic dermatitis-like skin disease from the chronic loss of epidermal caspase-8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22249-22254 (2010).
  29. Kovalenko, A., et al. Caspase-8 deficiency in epidermal keratinocytes triggers an inflammatory skin disease. Journal of Experimental Medicine. 206 (10), 2161-2177 (2009).
  30. Kang, T. B., et al. Caspase-8 serves both apoptotic and nonapoptotic roles. Journal of Immunology. 173 (5), 2976-2984 (2004).
  31. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  32. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  33. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  34. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  35. Hitomi, J., et al. Identification of a molecular signaling network that regulates a cellular necrotic cell death pathway. Cell. 135 (7), 1311-1323 (2008).
  36. Malireddi, R. K., Ippagunta, S., Lamkanfi, M., Kanneganti, T. D. Cutting edge: Proteolytic inactivation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 by the Nlrp3 and Nlrc4 inflammasomes. Journal of Immunology. 185 (6), 3127-3130 (2010).
  37. Tsuchiya, K., et al. Caspase-1 initiates apoptosis in the absence of gasdermin D. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  38. Taabazuing, C. Y., Okondo, M. C., Bachovchin, D. A. Pyroptosis and apoptosis pathways engage in bidirectional crosstalk in monocytes and macrophages. Cell Chemical Biology. 24 (4), 507-514 (2017).
  39. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. Journal of Immunology. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  40. Man, S. M., et al. Inflammasome activation causes dual recruitment of NLRC4 and NLRP3 to the same macromolecular complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7403-7408 (2014).
  41. Man, S. M., et al. Salmonella infection induces recruitment of Caspase-8 to the inflammasome to modulate IL-1beta production. Journal of Immunology. 191 (10), 5239-5246 (2013).
  42. Van Opdenbosch, N., et al. Caspase-1 engagement and TLR-induced c-FLIP expression suppress ASC/caspase-8-dependent apoptosis by inflammasome sensors NLRP1b and NLRC4. Cell Reports. 21 (12), 3427-3444 (2017).
  43. Pierini, R., et al. AIM2/ASC triggers caspase-8-dependent apoptosis in Francisella-infected caspase-1-deficient macrophages. Cell Death & Differentiation. 19 (10), 1709-1721 (2012).
  44. Lee, S., et al. AIM2 forms a complex with pyrin and ZBP1 to drive PANoptosis and host defence. Nature. 597 (7876), 415-419 (2021).
  45. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death & Differentiation. 20 (9), 1149-1160 (2013).
  46. Lukens, J. R., et al. Dietary modulation of the microbiome affects autoinflammatory disease. Nature. 516 (7530), 246-249 (2014).
  47. Gurung, P., Burton, A., Kanneganti, T. D. NLRP3 inflammasome plays a redundant role with caspase 8 to promote IL-1beta-mediated osteomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4452-4457 (2016).
  48. Kuriakose, T., et al. ZBP1/DAI is an innate sensor of influenza virus triggering the NLRP3 inflammasome and programmed cell death pathways. Science Immunology. 1 (2), (2016).
  49. Malireddi, R. K. S., et al. TAK1 restricts spontaneous NLRP3 activation and cell death to control myeloid proliferation. Journal of Experimental Medicine. 215 (4), 1023-1034 (2018).
  50. Malireddi, R. K. S., et al. Innate immune priming in the absence of TAK1 drives RIPK1 kinase activity-independent pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and inflammatory disease. Journal of Experimental Medicine. 217 (3), (2020).
  51. Christgen, S., et al. Identification of the PANoptosome: A molecular platform triggering pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 237 (2020).
  52. Malireddi, R. K. S., et al. RIPK1 distinctly regulates Yersinia-induced inflammatory cell death, PANoptosis. Immunohorizons. 4 (12), 789-796 (2020).
  53. Zheng, M., Karki, R., Vogel, P., Kanneganti, T. D. Caspase-6 is a key regulator of innate immunity, inflammasome activation, and host defense. Cell. 181 (3), 674-687 (2020).
  54. Karki, R., et al. ADAR1 restricts ZBP1-mediated immune response and PANoptosis to promote tumorigenesis. Cell Reports. 37 (3), 109858 (2021).
  55. Wang, Y., et al. Single cell analysis of PANoptosome cell death complexes through an expansion microscopy method. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (10), 531 (2022).
  56. Malireddi, R. K. S., et al. Inflammatory cell death, PANoptosis, mediated by cytokines in diverse cancer lineages inhibits tumor growth. Immunohorizons. 5 (7), 568-580 (2021).
  57. Kesavardhana, S., et al. The Zα2 domain of ZBP1 is a molecular switch regulating influenza-induced PANoptosis and perinatal lethality during development. Journal of Biological Chemistry. 295 (24), 8325-8330 (2020).
  58. Banoth, B., et al. ZBP1 promotes fungi-induced inflammasome activation and pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 18276-18283 (2020).
  59. Karki, R., et al. Interferon regulatory factor 1 regulates PANoptosis to prevent colorectal cancer. JCI Insight. 5 (12), 136720 (2020).
  60. Zheng, M., et al. Impaired NLRP3 inflammasome activation/pyroptosis leads to robust inflammatory cell death via caspase-8/RIPK3 during coronavirus infection. Journal of Biological Chemistry. 295 (41), 14040-14052 (2020).
  61. Karki, R., et al. Synergism of TNF-α and IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 184 (1), 149-168 (2021).
  62. Karki, R., et al. ZBP1-dependent inflammatory cell death, PANoptosis, and cytokine storm disrupt IFN therapeutic efficacy during coronavirus infection. Science Immunology. 7 (74), (2022).
  63. Jiang, W., Deng, Z., Dai, X., Zhao, W. PANoptosis: A new insight into oral infectious diseases. Frontiers in Immunology. 12, 789610 (2021).
  64. Chi, D., et al. Real-time induction of macrophage apoptosis, pyroptosis, and necroptosis by Enterococcus faecalis OG1RF and two root canal isolated strains. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 720147 (2021).
  65. Lin, J. F., et al. Phosphorylated NFS1 weakens oxaliplatin-based chemosensitivity of colorectal cancer by preventing PANoptosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 54 (2022).
  66. Song, M., et al. Self-assembled polymeric nanocarrier-mediated co-delivery of metformin and doxorubicin for melanoma therapy. Drug Delivery. 28 (1), 594-606 (2021).
  67. Boucher, D., Chan, A., Ross, C., Schroder, K. Quantifying caspase-1 activity in murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 1725, 163-176 (2018).
  68. Boucher, D., Duclos, C., Denault, J. B. General in vitro caspase assay procedures. Methods in Molecular Biology. 1133, 3-39 (2014).
  69. Kaushal, V., Herzog, C., Haun, R. S., Kaushal, G. P. Caspase protocols in mice. Methods in Molecular Biology. 1133, 141-154 (2014).
  70. Swacha, P., Gekara, N. O., Erttmann, S. F. Biochemical and microscopic analysis of inflammasome complex formation. Methods in Enzymology. 625, 287-298 (2019).
  71. Talley, S., et al. A caspase-1 biosensor to monitor the progression of inflammation in vivo. Journal of Immunology. 203 (9), 2497-2507 (2019).
  72. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 receptor differentially couples to distinct release pathways for IL-1beta in mouse macrophage. Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  73. Yu, J. W., et al. Cryopyrin and pyrin activate caspase-1, but not NF-kappaB, via ASC oligomerization. Cell Death & Differentiation. 13 (2), 236-249 (2006).
  74. Henry, C. M., Martin, S. J. Caspase-8 acts in a non-enzymatic role as a scaffold for assembly of a pro-inflammatory "FADDosome" complex upon TRAIL stimulation. Molecular Cell. 65 (4), 715-729 (2017).
  75. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  76. Simpson, R. J. Homogenization of mammalian tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).

Tags

Immunologie en infectie Nummer 191
Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, J. H., Tweedell, R. E.,… More

Han, J. H., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter