Summary
该协议描述了一种评估半胱天冬酶活化（半胱天冬酶-1，半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-7，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-11）的综合方法，以响应 体外 和 体内 （小鼠）感染，无菌侮辱和癌症模型，以确定细胞死亡途径的启动，例如焦亡，细胞凋亡，坏死性凋亡和全细胞凋亡。
Abstract
先天免疫是应对病原体和无菌侮辱的关键第一道防线。这种反应的一个关键机制组成部分是启动先天免疫程序性细胞死亡（PCD），以消除感染或受损的细胞并传播免疫反应。然而，过量的PCD与炎症和病理有关。因此，了解PCD的激活和调节是表征先天免疫反应和确定整个疾病谱的新治疗靶点的核心方面。
该协议提供了通过监测半胱天冬酶来表征先天免疫PCD激活的方法，半胱天冬酶是半胱氨酸依赖性蛋白酶家族，通常与多种PCD途径相关，包括细胞凋亡，焦亡，坏死性凋亡和PANoptosis。最初的报告将半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-10描述为引发剂半胱天冬酶，半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-7作为细胞凋亡中的效应半胱天冬酶，而后来的研究发现炎症性半胱天冬酶，半胱天冬酶-1，半胱天冬酶-4，半胱天冬酶-5和半胱天冬酶-11驱动焦亡。现在已知半胱天冬酶与其他先天免疫和细胞死亡分子在先前定义的PCD途径中存在广泛的串扰，确定了先天免疫和PCD的机制理解中的关键知识差距，并导致了PANoptosis的特征。PANoptosis是一种独特的先天免疫炎症PCD途径，由PANoptosome复合物调节，其整合了来自其他细胞死亡途径的成分，包括半胱天冬酶。
在这里，提供了评估半胱天冬酶响应各种刺激的激活的方法。这些方法允许 在体外 和 体内表征PCD途径，因为活化的半胱天冬酶经历蛋白水解切割，可以使用最佳抗体和印迹条件通过蛋白质印迹可视化。已经建立了方案和蛋白质印迹工作流程，可以评估来自同一细胞群的多个半胱天冬酶的活化，从而提供PCD过程的全面表征。该方法可以应用于发育，稳态，感染，炎症和癌症的研究领域，以评估健康和疾病中整个细胞过程中的PCD途径。
Introduction
先天免疫系统在感染期间和响应无菌刺激（例如组织损伤和体内平衡改变）时充当第一道防线。细胞表面和细胞质中的先天免疫传感器对病原体或损伤相关的分子模式（分别为PAMP或DAMP）做出反应，以触发炎症信号通路和细胞反应。先天免疫反应的关键过程之一是诱导细胞死亡以去除受感染或受损的细胞，并进一步驱动先天性和适应性免疫反应。程序性细胞死亡（PCD）是跨物种的高度保守的过程，突出了其作为先天免疫机制的进化重要性。
有几种先天免疫PCD途径可以在所有细胞类型中激活。半胱天冬酶是高度保守、细胞内、半胱氨酸依赖性蛋白酶的关键家族，在许多 PCD 途径中至关重要，包括传统的非炎症性细胞凋亡途径，以及炎性 PCD 途径，如焦亡、坏死性凋亡和 PANoptosis1，2，3，4，5.有11种人半胱天冬酶和10种鼠半胱天冬酶是明确的，以及可能具有功能的假半胱天冬酶，并且大多数组成型表达为需要切割才能激活的无活性单体或二聚体前半胱天冬酶6，7。半胱天冬酶还包含用于募集和形成多蛋白复合物的重要结构域。这些包括半胱天冬酶活化和募集结构域（CARD），可以在半胱天冬酶-1，半胱天冬酶-2，半胱天冬酶-4，半胱天冬酶-5，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-11中找到，或死亡效应域（DED），存在于半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10中。通过其蛋白水解活性和形成多蛋白复合物的能力，半胱天冬酶是先天免疫PCD的关键驱动因素。
半胱天冬酶在先天免疫PCD中的作用首先在细胞凋亡中被鉴定，其中引发剂半胱天冬酶半胱天冬酶-2，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-10激活刽子手半胱天冬酶，半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-7，以驱动细胞死亡8，9，10，11，12。引发半胱天冬酶可以通过不同的信号级联激活;外在途径通过细胞外配体诱导的死亡受体信号激活半胱天冬酶-8，内在途径通过破坏线粒体完整性激活半胱天冬酶-913。活化的引发剂半胱天冬酶切割接头，分离刽子手半胱天冬酶的大小催化亚基以产生其活性形式。然后，刽子手半胱天冬酶切割其底物以分解细胞，导致DNA降解，膜起泡，核碎裂和凋亡体的释放14，15。该过程通常以非裂解和非炎症形式的细胞死亡结束，同时通过风化细胞作用立即清除垂死细胞16。然而，胞吐作用缺陷或吞噬细胞缺乏可导致凋亡细胞积聚，然后发生溶解和炎症细胞死亡17，18。
炎症性半胱天冬酶，包括半胱天冬酶-1（人和小鼠），半胱天冬酶-4和半胱天冬酶-5（人）和半胱天冬酶-11（小鼠），已被发现在一种称为焦亡的炎症先天免疫PCD（III-PCD）形式中被激活。半胱天冬酶-1 活化与炎性小体的形成有关，炎性小体是含有胞质先天免疫传感器、衔接分子（含有 CARD [ASC] 的细胞凋亡相关斑点样蛋白）和半胱天冬酶-1 的多蛋白复合物。该复合物的形成允许半胱天冬酶-1进行邻近介导的自蛋白水解以释放其活性形式，其可以切割靶底物，包括促炎细胞因子白细胞介素（IL）-1β和IL-18以及造孔分子gasdermin D（GSDMD）19，20，21，22，23.半胱天冬酶-11、半胱天冬酶-4和半胱天冬酶-5在感应脂多糖（LPS）等PAMP后，也可以激活GSDMD，而不会上游形成炎症小体19，20。这些半胱天冬酶在与胞质LPS结合后经历二聚化，然后进行寡聚化和自切割以激活，这导致非规范炎症小体活化24，25，26和半胱天冬酶-1以细胞内在方式活化以诱导IL-1β和IL-18成熟20。这些促炎细胞因子的成熟和释放将这些半胱天冬酶描述为“炎症”。此外，已发现凋亡半胱天冬酶-8定位于炎性小体，在凋亡和焦亡过程之间提供了联系。研究发现，凋亡半胱天冬酶-8对于调节另一种形式的PCD也至关重要，称为坏死性凋亡。半胱天冬酶-8 的缺失导致自发受体相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶 3 （RIPK3） 介导的混合谱系激酶结构域样假激酶 （MLKL） 激活，以驱动坏死性凋亡的 III-PCD 途径27，28，29，30，31，32，33，34，35。
虽然半胱天冬酶历来根据它们引发的细胞死亡类型被归类为“凋亡”或“炎症性”，但越来越多的证据表明，通过半胱天冬酶的先天免疫PCD途径之间存在广泛的串扰3，4。例如，来自炎性小体的炎性半胱天冬酶-1在其典型激活位点34处切割凋亡半胱天冬酶-7。半胱天冬酶-1活化也可导致凋亡底物的切割，例如聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）36。在缺乏GSDMD的细胞中，半胱天冬酶-1也可以裂解半胱天冬酶-337，38。此外，典型的凋亡半胱天冬酶-3可以裂解加斯皮明E（GSDME）以诱导PCD17，18，并将GSDMD加工成无活性形式40。此外，已经观察到半胱天冬酶-8募集到炎性小体复合物中39，40，41，42，43，44，45，并且半胱天冬酶-8是典型和非典型炎症小体活化的关键调节因子39。在许多炎症条件下，半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-1也存在重叠和冗余的作用，并且以火光凋亡，凋亡和坏死性凋亡成分的激活为特征的先天免疫PCD发生在疾病谱39，46，47，48，49，50中。
基于炎症和凋亡半胱天冬酶之间的这种串扰，确定了先天免疫和PCD的机制理解中的一个关键差距，导致了PANoptosis的发现。PANoptosis是III-PCD的一种独特形式，其响应病原体，PAMP，DAMP和体内平衡的改变而被激活，并由PANoptosomes调节 - 多方面的大分子复合物，整合了来自其他细胞死亡途径的成分44，50，51，52，53，54，55.PAN凋亡中生物学效应的全部不能单独通过焦亡，细胞凋亡或坏死性凋亡来单独解释3，4，35，36，39，46，47，48，因为PAN凋亡的特征是激活多种半胱天冬酶，包括半胱天冬酶-1，半胱天冬酶-11，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9，半胱天冬酶-3和/或半胱天冬酶-7，取决于上下文 44，48，49，50，51，52，53，54，56，57，58，59，60，61，62. PANoptosis越来越多地与传染病和炎症性疾病以及癌症和癌症治疗有关3，4，35，36，39，44，46，47，48，49，50，51，52，53，54，56
，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66.
鉴于半胱天冬酶在细胞死亡途径中的重要作用，包括在细胞凋亡、焦亡、坏死性凋亡和全细胞凋亡中，开发表征其激活并了解PCD途径的全部复杂性的技术非常重要。这里的协议详细介绍了一种刺激细胞并测量半胱天冬酶后续活化的方法（图1）。该方法利用半胱天冬酶的蛋白水解裂解，这通常是其激活所必需的，作为研究它们的手段。通过蛋白质印迹，可以确定蛋白质大小，从而可以清晰地观察和区分无活性的半胱天冬酶原及其活化的裂解形式。
该协议的主要优点是1）它能够评估来自单个内源性细胞群的多个半胱天冬酶的激活，以更准确地确定PCD激活和2）使用相对简单的实验室技术，不需要广泛的培训或昂贵的设备。以前的方案使用蛋白质印迹、荧光报告基因或抗体染色来监测培养上清液、细胞和组织裂解物、通过显微镜和体内67，68，69，70，71的全细胞中的半胱天冬酶活化，但这些技术通常只监测样品中的一种或两种半胱天冬酶。此外，虽然含有半胱天冬酶切割位点的合成肽底物在切割时发出荧光，已被用于监测细胞或组织裂解物69中的半胱天冬酶活化，但这些底物通常可以被一种以上的半胱天冬酶切割，使得难以确定该系统中单个半胱天冬酶的特异性激活。此外，使用蛋白质印迹而不是使用荧光报告基因或其他基于标签的方法允许研究人员使用内源性细胞，而不是使用报告基因创建特定的细胞系。使用内源性细胞有多种优点，包括许多永生化细胞系缺乏关键细胞死亡分子72，73，这可能会影响结果。此外，使用内源性细胞可以评估不同的细胞类型，例如巨噬细胞，上皮细胞和内皮细胞，而不是单个谱系。蛋白质印迹也是一种相对简单且具有成本效益的技术，可以在世界各地的实验室中进行，而无需大型昂贵的设备或复杂的设置。
该协议广泛应用于生物学，以了解半胱天冬酶的细胞死亡依赖性和细胞死亡依赖性功能，包括它们的支架作用和在其他炎症信号通路中的功能74。应用这种方法允许在研究先天免疫PCD途径和跨疾病和病症的炎症信号传导中采用统一的方法，并且该协议可用于识别关键的调节过程和机制连接，这将为未来治疗策略的发展提供信息。
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Protocol
动物的使用和程序得到了圣裘德儿童研究医院动物使用和护理委员会的批准。
1. 准备解决方案
- 准备L929条件培养基。
- 板1×106 个L929细胞（参见 材料表）在含有50mLL929培养基的182cm2 组织培养瓶中（参见 表1 培养基的制备）。
- 在37°C的加湿培养箱中用5%CO2培养细胞生长细胞。
- 7天后，收集上清液，并使用0.45μm过滤器过滤。准备50mL等分试样（将冷冻等分试样在-80°C下储存长达1年）。
- 制备500 mL骨髓来源巨噬细胞（BMDM）培养基（表1）。
- 准备 500 mL BMDM 刺激培养基（表 1）。
- 准备500 mL感染培养基（表1）。
- 准备 100 mL 的 1 M Tris 缓冲液（表 1）。
- 准备4x十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液（表1）。
- 准备 1 mL 的 1 M 1，4-二硫苏糖醇（DTT， 表 1）。
- 准备40 mL半胱天冬酶裂解缓冲液（表1）。
- 准备 100 mL 的 1.5 M Tris 缓冲液（表 1）。
- 准备 100 mL 的 10%（重量/体积）SDS 溶液（表 1）。
- 准备 50 mL 的 2x 放射免疫沉淀测定 （RIPA） 缓冲液（表 1）。
- 制备5 mg/mL LPS溶液（表1）。
- 准备0.5M ATP溶液（表1）。
- 准备蛋白质印迹溶液。
- 准备 1 L 的 5x 电泳缓冲液储备液（表 1）。
- 准备 1 L 的 10x 转印缓冲液原液（表 1）。
- 用吐温20准备1L三缓冲盐水（TBST， 表1）。
- 准备 100 mL 的 5%（重量/体积）脱脂牛奶封闭溶液（表 1）。
- 制备一抗溶液。
- 准备10 mL半胱天冬酶-1一抗（表1）。
- 准备 10 mL 半胱天冬酶-11 一抗（表 1）。
- 准备10mL半胱天冬酶-3一抗（表1）。
- 准备10 mL半胱天冬酶-7一抗（表1）。
- 准备10 mL半胱天冬酶-8一抗（表1）。
- 准备10 mL半胱天冬酶-9一抗（表1）。
- 制备 10 mL HRP 偶联的 β-肌动蛋白一抗（表 1）。
- 准备二抗溶液。
- 准备10 mL抗兔二抗（表1）。
- 制备10 mL抗小鼠二抗（表1）。
- 准备10 mL抗大鼠二抗（表1）。
2. 分离骨髓来源的巨噬细胞
注意：对于该协议，可以使用具有完整PCD途径的6-10周龄野生型小鼠或具有PCD调节因子，效应子或目标分子被删除或改变的突变小鼠。
- 在CO 2室中对小鼠实施安乐死，流速每分钟置换10%-30%的笼子体积，持续2-3 分钟。然后，执行二次安乐死方法，例如颈椎脱位。在适用的情况下，请遵循所有其他设施、机构和政府特定的准则和法规。
- 解剖鼠标以取回后腿骨。
- 将鼠标固定在其背上，使腹部暴露。喷洒70%（体积/体积）乙醇对后腿和腹部进行消毒。
注意：乙醇易燃。远离明火。 - 用剪刀在腹部中线做一个切口;继续向腿部切割，使股骨可见。
- 采取右后腿，将皮肤从身体拉向中线。通过将内收肌向中线切断，将腿与身体分离;然后，切开髋关节和脊柱之间的腿。接下来，将爪子从脚踝远端切下来，并通过剥下皮肤并用略微打开的剪刀剥离小腿组织来去除骨骼中多余的组织。
- 将腿放在 70%（体积/体积）乙醇浸泡的毛巾上，解剖胫骨和股骨。
- 用一组单独的镊子扣住胫骨和股骨。轻轻地将胫骨按压在膝关节的自然方向上;这将导致胫骨在膝盖处断裂。
- 如果需要，使用镊子和解剖剪刀去除任何残留的悬挂组织。将胫骨放在浸有乙醇的毛巾上，以备后用。
- 以同样的方式收集股骨，通过折断膝盖。
- 对左腿重复上述步骤 3 和 4，将其从身体中取出并解剖胫骨和股骨。
- 用70%（体积/体积）乙醇喷洒骨头。
- 将骨头放在干净的 70%（体积/体积）乙醇浸泡的毛巾上，挤压毛巾中的肉质部分，然后将毛巾摩擦骨头以去除多余的组织，以清洁骨头。
- 将鼠标固定在其背上，使腹部暴露。喷洒70%（体积/体积）乙醇对后腿和腹部进行消毒。
- 一旦股骨和两个胫骨都清洁，用70%（体积/体积）乙醇喷洒所有四块骨头。将骨头收集在无菌培养皿中，并通过轻轻漱拭培养皿中的培养基，用 10 mL BMDM 培养基冲洗它们。
- 用 10 mL 新鲜 BMDM 培养基填充 10 mL 注射器，并连接 25 G 针头。
- 用镊子拾起胫骨;然后，以~45°角切割踝关节。
- 冲洗胫骨的骨髓。
- 将胫骨保持在 50 mL 管上，胫骨的窄端朝下。从填充的注射器中将介质分配到胫骨上。
- 将针头（首先轻轻）插入骨髓的顶端并分配培养基。
- 取出针头，然后再次插入。使用短的高压推动分配培养基并将针头移入骨髓。
- 一旦培养基开始从骨底部流出，使用短的高压推动继续冲洗细胞。在此过程中监测骨骼的颜色，当骨骼变白时，将其丢弃。
- 对两个胫骨都这样做。
- 对股骨重复上述步骤 5 和 6，在踝关节处切胫骨时在髋关节处切开。冲洗骨髓时，使用相同的 50 mL 管收集 BMDM 培养基。
- 冲洗完所有四块骨头后，通过 10 mL 注射器上的 18 G 针头将 50 mL 管中的骨髓和培养基上下吸出 3 次，每次冲洗管的侧面以分散骨髓。
- 用BMDM培养基将50 mL管中的最终体积调节至30 mL，并确保细胞完全悬浮。
- 使用 70 μm 细胞过滤器从 50 mL 管中过滤 BMDM 培养基。
- 通过将包含骨髓祖细胞的所得细胞悬液接种到三个 150 mm 组织培养皿中，每个培养皿中加入 10 mL（或 ~20 × 106 个细胞）。然后，向每个培养皿中额外添加 10 mL BMDM 培养基。在37°C的加湿培养箱中孵育。
3. 区分BMDM和实验电镀
- 将铺好的骨髓祖细胞在37°C孵育3天。然后，取出每个培养皿，并额外加入 5-8 mL BMDM 培养基（表 1）。在37°C下返回培养箱。
- 在初始接种后的第 5 天，取出每个培养皿，并额外加入 5 mL BMDM 培养基。在37°C下返回培养箱。
- 在第 6 天，取出每个培养皿，并丢弃培养基。然后，加入10mL冷（储存在4°C）PBS洗涤一次。丢弃 10 mL 冷 PBS 洗涤液。然后，向每个培养皿中加入 10 mL 新鲜、冷的 PBS，并将每个培养皿在冰上孵育 5 分钟。
- 使用细胞刮刀，将所有三个培养皿中的细胞轻轻刮到一个 50 mL 管中。在4°C下以270× g 轻轻旋转细胞5分钟;然后，弃去上清液。
- 加入 20 mL BMDM 培养基，上下移液以重悬沉淀，并计数细胞。
注意：预计每只小鼠将产生大约 60 × 10 6-100 ×10 6 个细胞。 - 计划所需的 体外 细胞死亡/炎症刺激测定的 12 孔板布局。计划每孔板 1 ×10 个 6 个细胞。对于每个计划的刺激，包括至少三个生物重复，并将一组孔板在半胱天冬酶裂解缓冲液中收获，第二组孔在RIPA缓冲液中收获。
- 板 1 × 12 孔板中每孔 1 mL BMDM 培养基中的 10 个6 个 细胞。在进行细胞死亡/炎症评估之前，在37°C的加湿培养箱中培养过夜。孵育过夜后，取出培养基，并向每个孔中加入1mL温热（37°C）PBS以洗涤细胞。
- 取出PBS洗涤液，加入500μL含抗生素的BMDM刺激培养基（如果进行非细菌刺激）或不含抗生素的BMDM刺激培养基（如果进行细菌刺激）（表1）。孵育2小时，然后进入步骤4进行 体外 刺激/感染。
4. 刺激或感染细胞
注意：本议定书中包含的制剂具有潜在的致病性，应在相关机构和政府当局的批准下，在生物安全2级（BSL2）设施中采取适当的预防措施进行处理。
- 刺激BMDMs以激活感兴趣的触发细胞死亡。
注意：就本协议而言，甲型流感病毒（IAV），单纯疱疹病毒1（HSV1）， Francisella novicida，LPS + ATP 用于说明，但也可以使用其他触发器。- 示例刺激1：感染IAV（A / Puerto Rico/8/34，H1N1 [PR8]）（根据Hoffmann等人75构建;通过MDCK细胞中的斑块测定计算感染多重性[MOI]测定的病毒滴度）：
- 使用公式 （1） 和公式 （2） 计算 20 个斑块形成单位 （PFU） 的多重感染 （MOI） 感染所需的病毒量：
- 从 BMDM 中取出培养基，并用 500 μL PBS 洗涤细胞一次。向每个孔中加入 450 μL IAV （20 MOI） 的高葡萄糖 DMEM，无需热灭活 （HI）-FBS。将板在37°C下在加湿的培养箱中孵育1小时以使其吸收。
- 取出板并加入 50 μL HI-FBS。将板返回到37°C的培养箱中。 孵育总共12小时。
- 使用公式 （1） 和公式 （2） 计算 20 个斑块形成单位 （PFU） 的多重感染 （MOI） 感染所需的病毒量：
- 示例刺激2：感染HSV1（HF菌株;如前所述培养44;通过Vero细胞中的斑块测定计算MOI测定的病毒滴度）：
- 使用上述IAV感染部分中步骤1中的公式（1）和公式（2）计算MOI为10 PFU时感染所需的病毒量。
- 从 BMDM 中取出培养基。 向每个孔中加入 450 μL HSV1 （MOI 10） 的高葡萄糖 DMEM 中，不含 HI-FBS。将板在37°C下在加湿的培养箱中孵育1小时以使其吸收。
- 取出板，加入 50 μL HI-FBS。将板返回到37°C的培养箱中。 孵育总共12小时。
- 使用上述IAV感染部分中步骤1中的公式（1）和公式（2）计算MOI为10 PFU时感染所需的病毒量。
- 示例刺激3：感染 F. novicida （U112菌株;如前所述44在37°C的BBL胰蛋白酶大豆肉汤中培养44，补充有0.2%L-半胱氨酸过夜。然后，在新鲜培养基中以1：10的比例在37°C下再传代4小时，然后使用新鲜培养基作为空白在600nm处取光密度（OD）。OD 值为 1 等于 1 × 109 个菌 落形成单位 （CFU） /mL。
- 使用公式 （3） 和公式 （4） 计算 MOI 为 50 CFU 时感染所需的 F. novicida 体积：
- 从 BMDM 中取出培养基。 向每个孔中加入 500 μL 新型 镰刀菌 （MOI 50） 在不含抗生素的 BMDM 刺激培养基中。将板在37°C下在加湿的培养箱中孵育4小时以使其吸收。
- 用温热的（37°C）PBS洗涤细胞三次，并加入含有50μg/ mL庆大霉素的500μLBMDM刺激培养基。将板返回到37°C的培养箱中。 孵育过夜（16小时）。
- 使用公式 （3） 和公式 （4） 计算 MOI 为 50 CFU 时感染所需的 F. novicida 体积：
- 示例刺激4：用LPS + ATP刺激。
- 从 BMDM 中取出培养基。 向每个孔中加入 500 μL 含有抗生素的 BMDM 刺激培养基（表 1），含有 100 ng/mL LPS。将板在37°C下在加湿的培养箱中孵育3.5小时。
- 向每个孔中加入 5 μL 0.5 M ATP 储备溶液（表 1）。将板返回到37°C的培养箱中。 孵育30分钟。
- 示例刺激1：感染IAV（A / Puerto Rico/8/34，H1N1 [PR8]）（根据Hoffmann等人75构建;通过MDCK细胞中的斑块测定计算感染多重性[MOI]测定的病毒滴度）：
5. 收集用于半胱天冬酶蛋白质印迹的联合上清液和蛋白质裂解物
- 孵育4小时，12小时或16小时后（具体时间取决于所使用的触发器），从培养箱中取出板。
- 除去 150 μL 上清液;丢弃或保存用于其他上清液分析（例如，酶联免疫吸附测定 [ELISA]）。不要除去剩余的上清液。
- 通过每孔混合 50 μL 半胱天冬酶裂解缓冲液 + 100 μL 4x SDS 缓冲液来创建蛋白质收集溶液（表 1）。然后，向每个孔中加入 150 μL 混合物。
- 对于每个孔，上下移液混合物以收集裂解的细胞和上清液。移液时，还要用移液器吸头刮孔底部以破坏细胞。刮擦和移液后，将蛋白质裂解物收集到标记的 1.5 mL 管中。
- 使用加热块将所有管加热至100°C12分钟。
- 通过在室温下以 14，500 × g 离心 30 秒来沉淀任何不溶性组分。
注意：这是一个暂停点 - 来自组合上清液和蛋白质裂解物的蛋白质可以立即使用，也可以在-20°C下储存长达2个月或在-80°C下储存长达6个月，直到准备使用。
6. 收集用于半胱天冬酶蛋白质印迹的蛋白质裂解物
- 孵育4小时，12小时或16小时后（具体时间取决于所使用的触发器），从培养箱中取出板。除去所有上清液;丢弃或保存用于其他上清液分析（例如，ELISA）。
- 通过将2x RIPA储备溶液（表1）稀释在等体积的去离子水中来创建1x RIPA缓冲液。然后，加入一片磷酸酶抑制剂片剂和一片蛋白酶抑制剂片剂，并让它们溶解。向每个孔中加入 150 μL 1x RIPA 缓冲液和 50 μL 4x SDS。
- 对于每个孔，上下移液混合物以收集裂解的细胞。移液时，还要用移液器吸头刮孔底部以破坏细胞。刮擦和移液后，将蛋白质裂解物收集到标记的 1.5 mL 管中。
- 使用加热块将所有管加热至100°C12分钟。
- 通过在室温下以 14，500 × g 离心 30 秒来沉淀任何不溶性组分。
注意：这是一个暂停点 - 蛋白质裂解物可以立即使用或储存在-20°C或-80°C直至准备使用。
7. 按照上述步骤使用从BMDM收集的裂解物或从组织匀浆中收集的裂解物进行蛋白质印迹
注意：如果使用组织，可以用手或通过动力驱动的组织均质机进行均质化。辛普森76的方案提供了组织匀浆的详细描述。
- 准备 1x 电泳缓冲液：将 200 mL 的 5x 电泳缓冲液储备液（表 1）和 800 mL 去离子水混合。在每次实验之前制作这个 1x 电泳缓冲液。
- 用12%（wt / vol）聚丙烯酰胺凝胶制备电泳仪，共10孔。用1x电泳缓冲液填充电泳仪。然后，取下凝胶梳。
注意：要分析每个样品的半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-11、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9，需要六块凝胶。 - 对于半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7和半胱天冬酶-8印迹，计划在半胱天冬酶裂解缓冲液或组织匀浆中使用30 μL组合的上清液和蛋白质裂解物。对于半胱天冬酶-11 和半胱天冬酶-9 印迹，计划在 RIPA 缓冲液或组织匀浆中使用 20 μL 的蛋白质裂解物。如果样品已储存在-20°C或-80°C，请先在冰上解冻。
- 对于所有样品，加热至100°C5分钟，并在加载前在4°C下以14，500× g 离心30秒。然后，将 20 或 30 μL 样品缓慢加载到每个泳道中。避免任何样品溢出到其他泳道中。要同时评估所有六种半胱天冬酶，请使用相同的步骤将适当的样品加载到六种凝胶中的每一种中。
- 将电泳设备连接到电源。然后，将功率设置为80 V20分钟以开始凝胶电泳，然后将功率调节至130 V45-60分钟。
- 仔细观察染料前沿，当染料前沿位于凝胶底部但尚未推出凝胶时，请关闭电源。
- 在凝胶电泳过程中，将700 mL去离子水、100 mL 10x转印缓冲液储备液（表1）和200 mL甲醇混合，制备1x转膜缓冲液。每次都使 1x 溶液新鲜。
注意：小心使用，因为甲醇是易燃的。在远离明火的地方进行转印缓冲液准备。 - 使用凝胶释放器轻轻地从电泳装置中取出凝胶。
- 为每个凝胶设置一个转印膜组。
- 通过将PVDF膜浸泡在甲醇中1分钟来激活PVDF膜。
- 在转印缓冲液中预润湿两张滤纸，凝胶和PVDF膜5分钟。在这5分钟的孵育过程中，将PVDF膜和凝胶保持在单独的容器中。
- 在半干式系统上组装传输堆栈。从底部铂阳极侧开始，放置一张滤纸，PVDF膜，凝胶，最后放置一张滤纸。轻轻地擀开或压出各层之间的气泡，然后关闭系统的顶部。在继续操作之前，请确保安全盖已固定。
- 连接到电源。将电源设置为 25 V 45 分钟。
- 转移完成后，拆卸转移堆栈，收集膜;将其放入方形培养皿（孵育盘）中。
- 通过加入 15 mL 的 5% （重量/体积） 脱脂牛奶溶液进行膜封闭（表 1）。在室温下以50rpm至70rpm在摇床上孵育膜1小时。
注意：这是一个暂停点 - 膜可以在1小时后去除或储存在4°C的封闭溶液中过夜。 - 孵育1小时或过夜后，除去封闭溶液。加入10 mL稀释的抗体溶液（抗半胱天冬酶-1抗体、抗半胱天冬酶-11抗体、抗半胱天冬酶-3和抗裂解半胱天冬酶-3抗体、抗半胱天冬酶-7和抗裂解半胱天冬酶-7抗体、抗半胱天冬酶-8和抗裂解半胱天冬酶-8抗体或抗半胱天冬酶-9抗体）（表1）。置于摇床上，以50rpm至70rpm的速度在室温下孵育2小时或在4°C孵育过夜（16小时）。
- 收集抗体溶液（重复使用至3倍或丢弃），并通过在室温下以50rpm至70rpm的摇床向膜上加入15mL TBST（表1）洗涤10分钟。丢弃 TBST。
- 按照步骤14重复用15mLTBST洗涤，总共3次。
- 加入 10 mL 稀释的二级 HRP 偶联抗体溶液（抗兔用于用针对半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8 或半胱天冬酶-9 的一抗染色的印迹;抗小鼠用于用半胱天冬酶-11 一抗染色的印迹;抗大鼠用于用半胱天冬酶-11 一抗染色的印迹）（表 1）。在室温下以50rpm至70rpm在摇床上孵育1小时。
- 除去抗体溶液，并在室温下以50rpm至70rpm的摇床向膜中加入15mL TBST洗涤10分钟。丢弃 TBST。
- 按照步骤17重复用15mLTBST洗涤，总共3次。
- 向膜中加入 10 mL 的高灵敏度 HRP 底物。让它在室温下在黑暗中静置1分钟。
- 从基材上取下膜。使用化学发光成像仪直接进行成像，并将附件白色反式托盘插入到较低位置。使用 自动曝光模式 曝光膜（通常为~1-2分钟的曝光时间）。
- 使用来自半胱天冬酶-9或半胱天冬酶-11印迹的膜（即，带有RIPA裂解物样品的膜），加入10mL剥离缓冲液，并在室温下以50rpm至70rpm在摇床上孵育5分钟。
- 弃去汽提缓冲液，并在室温下以50rpm至70rpm的摇床向膜中加入15mL TBST洗涤10分钟。丢弃 TBST。
- 按照步骤22重复用15mLTBST洗涤，总共3x。
- 通过加入 15 mL 的 5%（重量/体积）脱脂牛奶溶液进行膜封闭。在室温下以50rpm至70rpm在摇床上孵育膜1小时。
注意：这是一个暂停点 - 膜可以在1小时后去除或储存在4°C的封闭溶液中过夜。 - 孵育1小时或过夜后，除去封闭溶液。加入 10 mL 稀释的抗β肌动蛋白（HRP 偶联）抗体溶液。置于50rpm至70rpm的摇床上，在室温下孵育1.5小时。
- 除去抗体溶液，并在室温下以50rpm至70rpm的摇床向膜上加入15mL TBST洗涤10分钟。丢弃 TBST。
- 按照步骤26重复用15mLTBST洗涤，总共3x。
- 向膜上加入 10 mL 标准灵敏度 HRP 底物。让它在室温下在黑暗中静置1分钟。
- 使用化学发光成像仪直接进行成像，并将附件白色反式托盘插入到较低位置。使用 自动曝光模式曝光 膜（通常为 <1分钟的曝光时间）。
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Representative Results
已经观察到PANoptosis对许多细菌，病毒和真菌感染以及其他炎症刺激以及癌细胞的反应44，48，49，50，51，52，53，54，56，57，58，60，61，62.在这些情况下，已经报道了多个半胱天冬酶的激活。使用该协议中已知诱导全细胞凋亡的示例刺激，即IAV，HSV1和F. novicida44，48，50，51，53，57，预计可以观察到切割作为激活多个半胱天冬酶的替代物（图2A-C).此外，LPS + ATP 作为控件包含在内;这种组合是一种典型的NLRP3炎症小体触发器，有望诱导半胱天冬酶-1激活。半胱天冬酶-1的激活可以通过p45亲形式对p20活性形式的切割来观察这些触发器中的每一个（图2D）。然后，p20形式可以切割GSDMD并启动细胞死亡19。
类似地，观察到凋亡引发剂半胱天冬酶-8的活化，如p18裂解形式的存在所表示（图2A-D）。在某些情况下，也可以通过这些刺激观察到半胱天冬酶-9的弱激活（图2A-D）。在这些引发剂的下游，效应半胱天冬酶半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7被激活;这种活化被观察到为半胱天冬酶-3的p17/19裂解形式和半胱天冬酶-7的p20裂解形式的形成（图2A-D）。迄今为止，半胱天冬酶-11的激活尚未在PANoptosis中得到广泛评估，但在某些情况下已观察到其激活54。半胱天冬酶-11仍然是一种重要的炎症性半胱天冬酶，其激活可以通过其p26裂解形式的形成来观察到。虽然观察到一些低水平的半胱天冬酶-11激活，但未观察到对IAV，HSV1或F. novicida感染或LPS + ATP刺激的强烈激活（图2A-D）。
缺乏上游PANoptosis传感器的细胞不会响应PAN凋亡诱导的刺激而经历细胞死亡。例如，IAV感染诱导ZBP1-PANoptosome48，51，53，57的形成，并且Zbp1-/-细胞在IAV感染期间受到保护，免受细胞死亡（图3A）。类似地，HSV1和F. novicida感染诱导AIM2-PANoptosome44的形成，并且Aim2-/-细胞无法响应这些感染而经历强烈的细胞死亡（图3B，C）。在缺乏PANoptosome形成所需的上游传感器的细胞中，半胱天冬酶的活化显着降低甚至消除，这可以从蛋白质印迹中裂解条带强度的降低中看出（图2A-C）。同样，缺乏上游炎症小体传感器的细胞在响应其各自的刺激时受到保护，免受细胞死亡，并且Nlrp3-/-细胞不会响应LPS + ATP而经历细胞死亡（图3D）。这些细胞也显示出半胱天冬酶活化减少（图2D）。
图1：实验程序概述。 骨髓被分离并分化为骨髓来源的巨噬细胞。然后用触发器刺激这些细胞，激活先天免疫信号传导和细胞死亡，例如感染或炎症刺激。细胞激活并开始进行PCD后，通过蛋白质印迹收集和分析裂解物，以监测半胱天冬酶裂解到其活性形式。缩写：BMDMs = 骨髓来源的巨噬细胞;DAMPs = 损伤相关分子模式;III-PCD = 炎症性先天免疫程序性细胞死亡;PAMPs = 病原体相关分子模式;PCD = 程序性细胞死亡。 请点击此处查看此图的大图。
图2：半胱天冬酶响应刺激的激活。细胞培养裂解物的半胱天冬酶活化可以通过评估在电泳凝胶上运行的产品的大小来评估。（公元至日）免疫印迹分析前体（P45）和活化（P20）CASP1，前体（P43）和裂解（P36和P26）CASP11，前体（P35）和裂解（P17/P19）CASP3，前体（P35）和裂解（P20）CASP7，前体（P55）和裂解（P44和P18）CASP8，以及前体（P49）和裂解（P37）CASP9在WT和Zbp1−/−，WT和Aim2−/−， 或 （A） IAV 感染、（B） HSV1 感染、（C） 新弗朗西斯菌感染或 （D） LPS + ATP 刺激后的 WT 和 Nlrp3−/− BMDM。图像代表三个独立实验。缩写：BMDMs = 骨髓来源的巨噬细胞;CASP1 = 半胱天冬酶-1;CASP3 = 半胱天冬酶-3;CASP7 = 半胱天冬酶-7;CASP8 = 半胱天冬酶-8;CASP9 = 半胱天冬酶-9;CASP11 = 半胱天冬酶-11;HSV1 = 单纯疱疹病毒 1;IAV = 甲型流感病毒;LPS = 脂多糖;WT = 野生型。请点击此处查看此图的大图。
图3：半胱天冬酶活化未发生时抑制细胞死亡。 （公元至日）（A） IAV 感染、（B） HSV1 感染、（B） HSV1 感染、（C） 新弗朗西塞拉感染或 （D） LPS + ATP 刺激后 WT 和 Zbp1−/−、WT 和 Aim2−/− 或 WT 和 Nlrp3−/− BMDM 中细胞死亡的代表性图像。红色面具表示死细胞。比例尺 = 50 μm。图像代表三个独立实验。缩写：BMDMs = 骨髓来源的巨噬细胞;HSV1 = 单纯疱疹病毒 1;IAV = 甲型流感病毒;LPS = 脂多糖;WT = 野生型。请点击此处查看此图的大图。
表 1. 请点击此处下载此表格。
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Discussion
监测半胱天冬酶裂解和活化提供了先天免疫PCD活化作为先天免疫反应一部分的最全面图片之一。这里描述的方案展示了一种监测半胱天冬酶活化以响应IAV，HSV1和F. novicida感染以及无菌触发LPS + ATP的策略，但许多其他刺激可以诱导PCD，并且可以用于该方法，如几个出版物所示44，48，49，50，51，52，53，54，56， 57，58，59，60，61，62.该程序也可用于表征先天免疫PCD对新触发因素的反应，其中PCD的机制仍然未知。使用野生型和遗传缺陷细胞的组合，并比较这些群体之间不同半胱天冬酶的激活，可以为响应给定刺激而参与PCD的传感器和调节剂提供新的见解。
执行此方法时应考虑几个技术要点。首先，由于这种方法涉及感染或以其他方式刺激细胞以诱导细胞死亡，因此使用无菌技术来分离细胞和随后的刺激非常重要。污染会显着影响结果，即使在未刺激的条件下也会导致半胱天冬酶活化。为了测试这一点，最好在收集样品和上样半胱天冬酶印迹凝胶时始终包括未刺激的对照。此外，在对细胞进行电镀时，重要的是要确保细胞计数准确并且不会发生结块。如果细胞聚集，孔中将沉积不一致的细胞数量，并且MOI和每孔的蛋白质量将受到影响。在进行蛋白质免疫印迹时，最好比较未裂解的半胱天冬酶亲形式的条带模式，并监测裂解形式，以确保在孔中收集和加载一致数量的蛋白质。然而，当一个样品中存在高水平的半胱天冬酶活化时，这可能会导致信号失真，导致其他样品中的前型似乎减少，正如我们在本例中HSV1和 F. novicida 感染中的半胱天冬酶-8所示（图2B，C）。这可能是由于膜上特定点存在过多蛋白质而导致的抗体结合不均匀，或者由于成像伪影导致底物在单个样品中变得过饱和。调整抗体稀释度或成像设置有助于克服此问题。此外，当第一次建立感染或刺激时，使用时间过程可能有助于确定每种半胱天冬酶的激活发生时间。如果没有时间进程，数据可能会产生误导，因为选择的单个时间点可能太早或太晚，导致错过半胱天冬酶激活，并对其参与做出不适当的结论。同样，测试不同的MOI的感染性刺激也有利于确定半胱天冬酶被激活的特定条件。
电泳步骤也需要精度。准备将样品上样到凝胶上时，应始终首先离心管，并且仅应加载上清液。不溶性蛋白质会干扰凝胶的运行和随后的数据分析。复方上清液和蛋白质裂解物应用于检测半胱天冬酶-1，而不是纯细胞裂解物;这将大大提高检测的灵敏度。半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7和半胱天冬酶-8也可以在组合的上清液和蛋白质裂解物中很好地检测到。然而，为了在检测半胱天冬酶-11和半胱天冬酶-9时获得最佳结果，在RIPA缓冲液中收集的蛋白质裂解物就足够了。由于裂解物中每种半胱天冬酶的相对丰度可能较低，因此应将尽可能多的样品加载到凝胶上。这需要缓慢而稳定的移液，以避免溢出到相邻的孔中。如果在半胱天冬酶的前体和裂解形式之间观察到分离不良，则可以延长凝胶运行时间，或者可以使用较低百分比的丙烯酰胺来优化分离。
最后，该协议中列出的抗体已针对小鼠BMDM进行了优化，并且几个小组使用遗传缺陷细胞作为对照对其进行了严格测试，以确认在目标分子量下没有非特异性条带。虽然其他抗体也可能起作用，但这里列出的抗体是最佳的。此外，这些抗体中的许多在组织裂解物中也表现良好，并且可以在体外收集和刺激其他细胞群进行分析。使用来自人类或其他物种的细胞系或原代细胞也是可能的，但需要对抗体进行额外评估以进行优化。人抗半胱天冬酶-1（1：1，000）和人抗半胱天冬酶-8（1：1，000;见材料表）已成功用于此类评估，并且该协议中包含的相同的抗半胱天冬酶-3，抗半胱天冬酶-7和抗裂解半胱天冬酶-7抗体可用于小鼠和人类细胞44，56，62。
了解PCD途径（包括焦亡、细胞凋亡、坏死性凋亡和全细胞凋亡）作为先天免疫应答的一个组成部分的重要性正在增长，因为PCD途径之间的串扰越来越多地被表征，并且细胞死亡分子被确定为整个疾病谱的治疗靶点3，4.继续鉴定诱导PCD和III-PCD的先天免疫传感器，并表征半胱天冬酶激活的时间和相互作用，将提高治疗调节先天免疫PCD途径的能力并改善患者预后。
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Disclosures
T.-D.K.是辉瑞的顾问。
Acknowledgments
我们感谢Kanneganti实验室成员的意见和建议，并感谢J. Gullett博士的科学编辑支持。我们实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）拨款AI101935，AI124346，AI160179，AR056296和CA253095（给T.-D.K.）和美国黎巴嫩叙利亚相关慈善机构（给T.-D.K.）的支持。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Millipore | SCHVU05RE | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| 12% polyacrylamide gel with 10 wells | Bio-Rad | 4561043 | |
| 12-well plate | Corning | 07-200-82 | |
| 18 G needle | BD Biosciences | 305195 | |
| 25 G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 50 mL tube | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Corning | 430597 | |
| 182-cm2 tissue culture flask | Genesee Scientific | 25-211 | |
| Accessory white trans tray | Cytiva | 29-0834-18 | |
| Anti–caspase-1 antibody | AdipoGen | AG-20B-0042-C100 | |
| Anti–caspase-11 antibody | Novus Biologicals | NB120-10454 | |
| Anti–caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| Anti–caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | 9492 | |
| Anti–caspase-8 antibody | Cell Signaling Technology | 4927 | |
| Anti–caspase-9 antibody | Cell Signaling Technology | 9504 | |
| Anti–cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Anti–cleaved caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | 9491 | |
| Anti–cleaved caspase-8 antibody | Cell Signaling Technology | 8592 | |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 315-035-047 | |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-047 | |
| Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 112-035-003 | |
| Anti–β-Actin antibody (C4) HRP | Santa Cruz | sc-47778 HRP | |
| ATP | InvivoGen | tlrl-atpl | |
| BBL Trypticase Soy Broth | BD Biosciences | 211768 | |
| Bead bath | Chemglass Life Sciences | CLS-4598-009 | |
| Biophotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| BME | Sigma | M6250 | |
| Bromophenol blue | Sigma | BO126 | |
| Cell scrapers | CellTreat Scientific Products | 229315 | |
| Chemiluminescence imager (Amersham 600) | Cytiva | 29083461 | |
| CO2 chamber | VetEquip | 901703 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 221S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995-073 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| Eelectrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1658004 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1620 | |
| Filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Francisella novicida (U112 strain) | BEI Resources | NR-13 | |
| Gel releaser | Bio-Rad | 1653320 | |
| Gentamycin | Gibco | 15750060 | |
| Glycerol | Sigma | G7893 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| HCl | Sigma | H9892 | |
| Heat block | Fisher Scientific | 23-043-160 | |
| Herpes simplex virus 1 (HF strain) | ATCC | VR-260 | |
| High glucose DMEM | Sigma | D6171 | |
| Human anti–caspase-1 antibody | R&D Systems | MAB6215 | |
| Human anti–caspase-8 antibody | Enzo | ALX-804-242 | |
| Humidified incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Image analysis software | ImageJ | v1.53a | |
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440-053 | |
| Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) | constructed per Hoffmann et al. | ||
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | cell line for creating L929-conditioned media |
| L-cysteine | Thermo Fisher Scientific | BP376-100 | |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUF0500 | standard-sensitivity HRP substrate |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | cell line for determining IAV viral titer |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002401 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Nonfat dried milk powder | Kroger | ||
| NP-40 solution | Sigma | 492016 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| PhosSTOP | Roche | PHOSS-RO | |
| Power source | Bio-Rad | 164-5052 | |
| Protease inhibitor tablet | Sigma | S8820 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Rocking shaker | Labnet | S2035-E | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | |
| Super Signal Femto HRP substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | high-sensitivity HRP substrate |
| Tabletop centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004524 | |
| Trans-Blot semi-dry system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Tris | Sigma | TRIS-RO | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | tlrl-3pelps | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | cell line for determining HSV1 viral titer |
References
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