Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Evaluering av kaspaseaktivering for å vurdere medfødt immuncelledød

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64308
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

Denne protokollen beskriver en omfattende metode for å vurdere caspaseaktivering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 og caspase-11) som respons på både in vitro og in vivo (hos mus) infeksjonsmodeller, sterile fornærmelser og kreft for å bestemme initiering av celledødsveier, som pyroptose, apoptose, nekrotose og PANoptose.

Abstract

Medfødt immunitet gir den kritiske første forsvarslinjen som svar på patogener og sterile fornærmelser. En viktig mekanistisk komponent i denne responsen er initiering av medfødt immunprogrammert celledød (PCD) for å eliminere infiserte eller skadede celler og forplante immunresponser. Imidlertid er overflødig PCD assosiert med betennelse og patologi. Derfor er forståelse av aktivering og regulering av PCD et sentralt aspekt ved å karakterisere medfødte immunresponser og identifisere nye terapeutiske mål over hele sykdomsspekteret.

Denne protokollen gir metoder for å karakterisere medfødt immun-PCD-aktivering ved å overvåke caspaser, en familie av cysteinavhengige proteaser som ofte er forbundet med forskjellige PCD-veier, inkludert apoptose, pyroptose, nekroptose og PANoptose. Innledende rapporter karakteriserte caspase-2, caspase-8, caspase-9 og caspase-10 som initiatorkaspaser og caspase-3, caspase-6 og caspase-7 som effektorcaspaser i apoptose, mens senere studier fant de inflammatoriske caspasene, caspase-1, caspase-4, caspase-5 og caspase-11, driver pyroptose. Det er nå kjent at det er omfattende kryssprat mellom caspasene og andre medfødte immun- og celledødsmolekyler over de tidligere definerte PCD-veiene, og identifiserer et sentralt kunnskapsgap i den mekanistiske forståelsen av medfødt immunitet og PCD og fører til karakterisering av PANoptose. PANoptose er en unik medfødt immuninflammatorisk PCD-vei regulert av PANoptosomkomplekser, som integrerer komponenter, inkludert caspaser, fra andre celledødsveier.

Her er metoder for å vurdere aktiveringen av caspaser som respons på ulike stimuli gitt. Disse metodene tillater karakterisering av PCD-veier både in vitro og in vivo, da aktiverte caspaser gjennomgår proteolytisk spaltning som kan visualiseres ved vestlig blotting ved bruk av optimale antistoffer og blottingsbetingelser. En protokoll og vestlig blottingsarbeidsflyt er etablert som gjør det mulig å vurdere aktiveringen av flere caspaser fra samme cellulære populasjon, noe som gir en omfattende karakterisering av PCD-prosessene. Denne metoden kan brukes på tvers av forskningsområder innen utvikling, homeostase, infeksjon, betennelse og kreft for å evaluere PCD-veier gjennom cellulære prosesser i helse og sykdom.

Introduction

Det medfødte immunsystemet fungerer som den første forsvarslinjen under infeksjon og som respons på sterile stimuli, som vevskader og endringer i homeostase. Medfødte immunsensorer på celleoverflaten og i cytoplasma reagerer på patogen- eller skadeassosierte molekylære mønstre (henholdsvis PAMPs eller DAMPs) for å utløse inflammatoriske signalveier og cellulære responser. En av nøkkelprosessene i den medfødte immunresponsen er induksjon av celledød for å fjerne infiserte eller skadede celler og drive videre medfødte og adaptive immunresponser. Programmert celledød (PCD) er en svært konservert prosess på tvers av arter, og fremhever dens evolusjonære betydning som en medfødt immunmekanisme.

Det finnes flere medfødte immun-PCD-veier som kan aktiveres i alle celletyper. Kaspaser er en nøkkelfamilie av høyt konserverte, intracellulære, cysteinavhengige proteaser som er kritiske over mange PCD-veier, inkludert den tradisjonelt ikke-inflammatoriske apoptoseveien, samt inflammatoriske PCD-veier som pyroptose, nekroptose og PANoptose 1,2,3,4,5 . Det er 11 humane og 10 murine caspaser som er veldefinerte, samt pseudo-caspaser som kan være funksjonelle, og de fleste er konstitutivt uttrykt som inaktive monomere eller dimere pro-caspaser som krever spaltning for aktivering 6,7. Kaspaser inneholder også viktige domener for rekruttering og dannelse av multiproteinkomplekser. Disse inkluderer caspase aktiverings- og rekrutteringsdomenet (CARD), som finnes i caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 og caspase-11, eller dødseffektordomenet (DED), som finnes i caspase-8 og caspase-10. Gjennom både deres proteolytiske aktivitet og deres evne til å danne multiproteinkomplekser, er caspaser kritiske drivere for medfødt immun-PCD.

Rollen til caspaser i medfødt immun-PCD ble først identifisert i apoptose, hvor initiatoren caspases, caspase-2, caspase-8, caspase-9 og caspase-10, aktiverer bøddelkaspasene, caspase-3, caspase-6 og caspase-7, for å drive celledød 8,9,10,11,12. Initiatorkaspaser kan aktiveres ved forskjellige signalkaskader; Den ekstrinsiske banen aktiverer caspase-8 gjennom ekstracellulær ligandindusert dødsreseptorsignalering, og den indre banen aktiverer caspase-9 gjennom forstyrrelsen av mitokondriell integritet13. Aktiverte initiatorcaspaser spalter linkeren som skiller de store og små katalytiske underenhetene av bøddelkaspaser for å produsere deres aktive former. Bøddelkaspasene spalter deretter underlagene sine for å demontere cellen, noe som resulterer i DNA-nedbrytning, membranblebbing, kjernefysisk fragmentering og frigjøring av apoptotiske legemer14,15. Denne prosessen slutter vanligvis i en ikke-lytisk og ikke-inflammatorisk form for celledød når kombinert med umiddelbar clearance av de døende cellene ved efferocytose16. Imidlertid kan defekter i efferocytose eller mangel på fagocytiske celler føre til akkumulering av apoptotiske celler, som deretter gjennomgår lytisk og inflammatorisk celledød17,18.

De inflammatoriske caspasene, inkludert caspase-1 (menneske og mus), caspase-4 og caspase-5 (human) og caspase-11 (mus), har blitt oppdaget å være aktivert under en form for inflammatorisk medfødt immun-PCD (III-PCD) kalt pyroptose. Caspase-1-aktivering er assosiert med dannelsen av inflammasomer, som er multiproteinkomplekser som inneholder en cytosolisk medfødt immunsensor, et adaptermolekyl (apoptose-assosiert flekklignende protein som inneholder et CARD [ASC]) og caspase-1. Dannelsen av dette komplekset tillater caspase-1 å gjennomgå nærhetsmediert autoproteolyse for å frigjøre sin aktive form, som kan spalte målsubstrater, inkludert de proinflammatoriske cytokinene interleukin (IL)-1β og IL-18 og det poredannende molekylet gasdermin D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspase-11, caspase-4 og caspase-5 kan også aktivere GSDMD uten oppstrøms dannelse av inflammasomet etter sensing av PAMPs som lipopolysakkarid (LPS) 19,20. Disse caspasene gjennomgår dimerisering etterfulgt av oligomerisering og selvspaltning for aktivering ved binding til cytosolisk LPS, noe som fører til ikke-kanonisk inflammasomaktivering 24,25,26 og kaspase-1-aktivering på en celle-iboende måte for å indusere IL-1β og IL-18 modning 20. Modningen og frigjøringen av disse proinflammatoriske cytokinene karakteriserer disse caspasene som "inflammatoriske". I tillegg har den apoptotiske caspase-8 blitt funnet å lokalisere til inflammasomet, noe som gir en sammenheng mellom apoptotiske og pyroptotiske prosesser. Studier har funnet at den apoptotiske caspase-8 også er kritisk for å regulere en annen form for PCD kalt nekroptose. Tapet av caspase-8 resulterer i spontan reseptorinteragerende serin-treoninkinase 3 (RIPK3)-mediert blandet avstamning kinase domenelignende pseudokinase (MLKL) aktivering for å drive III-PCD-banen for nekroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

Mens caspaser historisk har blitt klassifisert som "apoptotisk" eller "inflammatorisk" basert på typen celledød de initierer, tyder økende bevis på at det er omfattende kryssprat mellom de medfødte immun-PCD-veiene gjennom caspases 3,4. For eksempel spalter den inflammatoriske caspase-1 fra inflammasomer den apoptotiske caspase-7 på sitt kanoniske aktiveringssted34. Caspase-1-aktivering kan også føre til spaltning av apoptotiske substrater som poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) 36. I celler som mangler GSDMD, kan caspase-1 også spalte caspase-337,38. I tillegg kan den kanonisk apoptotiske caspase-3 spalte gasdermin E (GSDME) for å indusere PCD17,18 og behandler også GSDMD til en inaktiv form40. Videre har caspase-8 rekruttering til inflammasomkomplekset blitt observert 39,40,41,42,43,44,45, og caspase-8 er en nøkkelregulator for kanonisk og ikke-kanonisk inflammasomaktivering 39. Det er også overlappende og overflødige roller for caspase-8 og caspase-1 ved mange inflammatoriske tilstander, og medfødt immun-PCD karakterisert ved aktivering av pyroptotiske, apoptotiske og nekrototiske komponenter forekommer over hele sykdomsspekteret 39,46,47,48,49,50.

Basert på denne krysstalen mellom inflammatoriske og apoptotiske caspaser ble det identifisert et nøkkelgap i den mekanistiske forståelsen av medfødt immunitet og PCD, noe som førte til oppdagelsen av PANoptose. PANoptose er en unik form for III-PCD som aktiveres som respons på patogener, PAMPs, DAMPs og endringer i homeostase og reguleres av PANoptosomes - mangefasetterte makromolekylære komplekser som integrerer komponenter fra andre celledødsveier 44,50,51,52,53,54,55 . Totaliteten av de biologiske effektene ved PANoptose kan ikke individuelt forklares ved pyroptose, apoptose eller nekroptose alene 3,4,35,36,39,46,47,48, da PANoptose er karakterisert ved aktivering av flere caspaser, inkludert caspase-1, caspase-11, caspase-8, caspase-9, caspase-3 og/eller caspase-7, avhengig av konteksten 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . Panoptose har i økende grad blitt involvert i smittsomme og inflammatoriske sykdommer, samt i kreft og kreftbehandling 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Gitt den essensielle rollen som caspaser på tvers av celledødsveier, inkludert i apoptose, pyroptose, nekroptose og PANoptose, er det viktig å utvikle teknikker for å karakterisere deres aktivering og forstå den fulle kompleksiteten av PCD-banene. Protokollen her beskriver en metode for å stimulere celler og måle den påfølgende aktiveringen av caspaser (figur 1). Denne metoden utnytter den proteolytiske spaltningen av caspaser, som vanligvis kreves for aktivering, som et middel til å studere dem. Gjennom vestlig blotting kan proteinstørrelsene bestemmes, noe som muliggjør klar visualisering og differensiering av inaktive pro-caspaser og deres aktiverte, spaltede former.

De største fordelene med denne protokollen er 1) dens evne til å vurdere aktiveringen av flere caspaser parallelt fra en enkelt populasjon av endogene celler for mer nøyaktig å bestemme PCD-aktivering og 2) bruk av relativt enkle laboratorieteknikker som ikke krever omfattende opplæring eller dyrt utstyr. Tidligere protokoller har brukt vestlig blotting, fluorescerende reportere eller antistofffarging for å overvåke caspaseaktivering i kultursupernatanter, celle- og vevslysater, hele celler via mikroskopi, og in vivo 67,68,69,70,71, men disse teknikkene overvåker vanligvis bare en eller to caspaser i en prøve. Videre, mens syntetiske peptidsubstrater som inneholder caspase-spaltningssteder som fluorescerer ved spaltning har blitt brukt til å overvåke caspaseaktivering i celle- eller vevslysater69, kan disse substratene ofte spaltes av mer enn en caspase, noe som gjør det vanskelig å bestemme den spesifikke aktiveringen av individuelle caspaser i dette systemet. I tillegg tillater bruken av vestlig blotting i stedet for bruk av fluorescerende reportere eller andre tag-baserte metoder forskere å bruke endogene celler i stedet for å lage spesifikke cellelinjer med reportergener. Det er flere fordeler med å bruke endogene celler, inkludert det faktum at mange immortaliserte cellelinjer er mangelfull i viktige celledødsmolekyler72,73, noe som kan påvirke resultatene. I tillegg tillater bruk av endogene celler evaluering av forskjellige celletyper, for eksempel makrofager, epitelceller og endotelceller, i stedet for en enkelt avstamning. Western blotting er også en relativt enkel og kostnadseffektiv teknikk som kan utføres i laboratorier rundt om i verden uten behov for stort, dyrt utstyr eller kompliserte oppsett.

Denne protokollen er allment anvendelig på tvers av biologi for å forstå både celledødsavhengige og celledødsuavhengige funksjoner av caspaser, inkludert deres stillasroller og funksjoner i andre inflammatoriske signalveier74. Bruk av denne metoden muliggjør en enhetlig tilnærming i studiet av medfødte immun-PCD-veier og inflammatorisk signalering på tvers av sykdommer og tilstander, og denne protokollen kan brukes til å identifisere kritiske reguleringsprosesser og mekanistiske forbindelser som vil informere utviklingen av fremtidige terapeutiske strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrebruk og prosedyrer ble godkjent av St. Jude Children's Research Hospital Committee on the Use and Care of Animals.

1. Klargjøre løsningene

  1. Klargjør L929-betingede medier.
    1. Plate 1 × 106 L929 celler (se materialfortegnelse) i en 182 cm2 vevskulturkolbe inneholdende 50 ml L929 kulturmedium (se tabell 1 for tilberedning av mediet).
    2. Dyrk cellene i en fuktet inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
    3. Etter 7 dager, samle supernatanten og filtrer ved hjelp av et 0,45 μm filter. Tilbered 50 ml alikoter (oppbevar frosne alikoter ved -80 °C i opptil 1 år).
  2. Klargjør 500 ml dyrkningsmedium for benmargsderiverte makrofager (BMDM) (tabell 1).
  3. Klargjør 500 ml BMDM-stimuleringsmedier (tabell 1).
  4. Klargjør 500 ml medier for infeksjon (tabell 1).
  5. Klargjør 100 ml 1 M Tris-buffer (tabell 1).
  6. Klargjør 4x natriumdodecylsulfatbuffer (SDS) (tabell 1).
  7. Klargjør 1 ml 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT, tabell 1).
  8. Klargjør 40 ml kaspase lysebuffer (tabell 1).
  9. Forbered 100 ml med 1,5 M Tris buffer (tabell 1).
  10. Klargjør 100 ml av en 10 % (vekt/vol) SDS-oppløsning (tabell 1).
  11. Klargjør 50 ml av en 2x radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (tabell 1).
  12. Tilbered en 5 mg/ml LPS-oppløsning (tabell 1).
  13. Forbered en 0,5 M ATP-løsning (tabell 1).
  14. Forbered de vestlige blottingsløsningene.
    1. Forbered 1 L av 5x løpende bufferlager (tabell 1).
    2. Forbered 1 l 10x overføringsbufferlager (tabell 1).
    3. Tilbered 1 l Tris-bufret saltvann med Tween 20 (TBST, tabell 1).
    4. Tilbered 100 ml av en 5 % (vekt/vol) skummet melkblokkeringsløsning (tabell 1).
  15. Forbered de primære antistoffløsningene.
    1. Klargjør 10 ml caspase-1 primærantistoff (tabell 1).
    2. Klargjør 10 ml caspase-11 primærantistoff (tabell 1).
    3. Klargjør 10 ml caspase-3 primærantistoff (tabell 1).
    4. Klargjør 10 ml caspase-7 primærantistoff (tabell 1).
    5. Klargjør 10 ml caspase-8 primærantistoff (tabell 1).
    6. Klargjør 10 ml caspase-9 primærantistoff (tabell 1).
    7. Klargjør 10 ml HRP-konjugert β-aktin primærantistoff (tabell 1).
  16. Forbered de sekundære antistoffløsningene.
    1. Klargjør 10 ml antikanin sekundært antistoff (tabell 1).
    2. Klargjør 10 ml med sekundært antistoff mot mus (tabell 1).
    3. Klargjør 10 ml med sekundært antistoff mot rotter (tabell 1).

2. Isolering av makrofager fra benmargen

MERK: For denne protokollen kan 6-10 uker gamle villtypemus med intakte PCD-veier eller mutante mus med PCD-regulatorer, effektorer eller molekyler av interesse slettet eller endret brukes.

  1. Avlive en mus i et CO 2 -kammer med en strømningshastighet som fortrenger 10% -30% av burvolumet per min i2-3 minutter. Deretter utfører du en sekundær eutanasimetode, for eksempel cervikal dislokasjon. Følg alle ytterligere anleggs-, institusjons- og regjeringsspesifikke retningslinjer og forskrifter der det er aktuelt.
  2. Dissekere musen for å hente bakbenet.
    1. Fest musen på ryggen slik at magen blir utsatt. Spray med 70% (vol / vol) etanol for å sterilisere bakbena og magen.
      FORSIKTIG: Etanol er brannfarlig. Hold den borte fra åpen ild.
    2. Bruk saks til å lage et snitt på midtlinjen av magen; Fortsett å kutte mot bena for å gjøre lårbenene synlige.
    3. Ta høyre bakben og trekk huden bort fra kroppen mot midtlinjen. Løsne benet fra kroppen ved å kutte adduktormusklene mot midtlinjen; Deretter kutter du benet mellom hofteleddet og ryggraden. Deretter kutter du poten av distalt for ankelen, og fjerner overflødig vev fra beinet ved å skrelle av huden og bruke litt åpnet saks for å fjerne leggvevet.
    4. Legg benet på et 70% (vol / vol) etanol-gjennomvåt håndkle og dissekere tibia og lårbenet.
      1. Fest tibia og lårben hver med et eget sett med tang. Trykk forsiktig tibia mot kneleddets naturlige retning; Dette vil føre til at tibia bryter ved kneet.
      2. Bruk tangen og dissekere saksen om nødvendig for å fjerne gjenværende hengende vev. Lagre tibia for senere bruk ved å plassere den på etanol-gjennomvåt håndkle.
      3. Samle lårbenet på samme måte, ved å knipse av kneet.
    5. Gjenta trinn 3 og 4 ovenfor for venstre ben for å fjerne det fra kroppen og dissekere tibia og lårben.
    6. Spray beinene med 70% (vol / vol) etanol.
    7. Rengjør beinene ved å plassere dem på et rent 70% (vol / vol) etanol-gjennomvåt håndkle, klemme den kjøttfulle delen i håndkleet og gni håndkleet mot beinet for å fjerne overflødig vev.
  3. Når begge lårbenene og begge tibias er rene, spray alle fire beinene med 70% (vol / vol) etanol. Samle beinene i en steril petriskål og skyll dem med 10 ml BMDM-kulturmedier ved å forsiktig skylle mediet i fatet.
  4. Fyll en 10 ml sprøyte med 10 ml ferskt BMDM dyrkningsmedium og fest en 25 G kanyle.
  5. Plukk opp tibia ved hjelp av tang; Deretter kutter du ankelleddet i en ~ 45 ° vinkel.
  6. Skyll benmargen fra tibia.
    1. Hold tibia over et 50 ml rør, med den smale enden av tibia pekende nedover. Dispenser media over tibia fra den fylte sprøyten.
    2. Stikk nålen (forsiktig først) inn i den øvre enden av margen og dispenser mediet.
    3. Fjern kanylen og sett den inn igjen. Bruk korte, høytrykkstrykk for å dispensere mediet og flytte nålen inn i margen.
    4. Når mediet begynner å strømme ut fra bunnen av beinet, bruk korte, høytrykkstrykk for å fortsette å skylle cellene ut. Overvåk fargen på beinet under denne prosessen, og når beinet er hvitt, kast det.
    5. Gjør dette for begge tibias.
  7. Gjenta trinn 5 og 6 ovenfor for lårbenene, kutt i hofteleddet da tibia ble kuttet i ankelleddet. Bruk det samme 50 ml røret til å samle BMDM-dyrkningsmediet når margen skylles.
  8. Når alle fire benene er spylt, aspirer margen og mediet fra 50 ml røret opp og ned 3x gjennom en 18 G nål på en 10 ml sprøyte, skyll sidene av røret hver gang for å spre margen.
  9. Juster det endelige volumet i 50 ml røret til 30 ml med BMDM dyrkningsmedium, og sørg for at cellene er grundig suspendert.
  10. Bruk en 70 μm cellesil for å filtrere BMDM-kulturmediet fra 50 ml-røret.
  11. Plate den resulterende cellesuspensjonen, som inneholder benmargens stamceller, i tre 150 mm vevskulturretter ved å tilsette 10 ml (eller ~ 20 × 106 celler) til hver. Deretter tilsettes ytterligere 10 ml BMDM-kulturmedier til hver tallerken. Inkuber i en fuktet inkubator ved 37 °C.

3. Differensiering av BMDM-er og plating for eksperimentene

  1. Inkuber de belagte benmargsstamcellene ved 37 °C i 3 dager. Fjern deretter hver tallerken, og tilsett ytterligere 5-8 ml BMDM-kulturmedier (tabell 1). Gå tilbake til inkubatoren ved 37 °C.
  2. På dag 5 etter den første platingen, fjern hver tallerken, og tilsett ytterligere 5 ml BMDM-kulturmedier. Gå tilbake til inkubatoren ved 37 °C.
  3. På dag 6, fjern hver tallerken, og kast mediet. Tilsett deretter 10 ml kald (lagret ved 4 °C) PBS for å vaske en gang. Kast 10 ml kald PBS-vask. Tilsett deretter 10 ml frisk, kald PBS til hver tallerken, og rug hver tallerken på is i 5 minutter.
  4. Bruk en celleskrape, skrap forsiktig cellene fra alle tre rettene inn i ett 50 ml rør. Senk cellene forsiktig ned ved 270 × g ved 4 °C i 5 minutter; Kast deretter supernatanten.
  5. Tilsett 20 ml BMDM-dyrkningsmedier, pipett opp og ned for å resuspendere pelleten, og tell cellene.
    MERK: Det forventes at hver mus vil gi omtrent 60 × 10 6-100 × 106 celler.
  6. Planlegg 12-brønns plateoppsettet for ønsket in vitro-celledød / inflammasjonsstimuleringsanalyse. Planlegg å plate 1 × 106 celler per brønn. For hver planlagt stimulering, inkluder minst tre biologiske replikater, og plate ett sett brønner som skal høstes i caspase lysis buffer og et andre sett med brønner som skal høstes i RIPA buffer.
  7. Plate 1 × 106 celler i 1 ml BMDM dyrkningsmedium per brønn i 12-brønnsplater. Dyrkning over natten i fuktet inkubator ved 37 °C før man går videre til celledød/inflammasjonsevaluering. Etter inkubering over natten, fjern mediet og tilsett 1 ml varm (37 °C) PBS i hver brønn for å vaske cellene.
  8. Fjern PBS-vasken, og tilsett 500 μL BMDM-stimuleringsmedier med antibiotika (hvis du utfører ikke-bakterielle stimuleringer) eller BMDM-stimuleringsmedier uten antibiotika (hvis du utfører bakteriell stimulering) (tabell 1). Inkuber i 2 timer før du går videre til trinn 4 for in vitro stimulering/infeksjon.

4. Stimulere eller infisere cellene

FORSIKTIG: Midlene som er inkludert i denne protokollen er potensielt patogene og skal håndteres med passende forholdsregler i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) anlegg med godkjenning fra relevante institusjonelle og statlige myndigheter.

  1. Stimulere BMDM-ene til å aktivere celledød med utløseren av interesse.
    MERK: I forbindelse med denne protokollen, influensa A-virus (IAV), herpes simplex virus 1 (HSV1), Francisella novicidaog LPS + ATP brukes til illustrasjon, men andre utløsere kan brukes.
    1. Eksempel stimulering 1: Infect med IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (konstruert i henhold til Hoffmann et al.75; virustiteren for mangfoldet av infeksjon [MOI] bestemmelse beregnes ved en plakkanalyse i MDCK-celler):
      1. Beregn volumet av virus som trengs for infeksjon ved en mangfoldighet av infeksjon (MOI) av 20 plakkdannende enheter (PFU) ved hjelp av ligning (1) og ligning (2):
        Equation 1
        Equation 2
        Equation 3
      2. Fjern mediet fra BMDM-ene og vask cellene en gang med 500 μL PBS. Tilsett 450 μL IAV (20 MOI) i DMEM med høy glukose uten varmeinaktivert (HI)-FBS til hver brønn. Inkuber platene ved 37 °C i 1 time i en fuktet inkubator for å tillate absorpsjon.
      3. Fjern platene og tilsett 50 μL HI-FBS. Sett platene tilbake til inkubatoren ved 37 °C. Inkubere i totalt 12 timer.
    2. Eksempelstimulering 2: Infiser med HSV1 (HF-stamme; dyrket som beskrevet tidligere44; virustiteren for MOI-bestemmelse beregnes ved en plakkanalyse i Vero-celler):
      1. Beregn volumet av virus som trengs for infeksjon ved en MOI på 10 PFU ved hjelp av ligning (1) og ligning (2) fra trinn 1 i IAV-infeksjonsavsnittet ovenfor.
        Equation 4
      2. Fjern mediet fra BMDM-ene. Tilsett 450 μL HSV1 (MOI 10) i DMEM med høy glukose uten HI-FBS til hver brønn. Inkuber platene ved 37 °C i 1 time i en fuktet inkubator for å tillate absorpsjon.
      3. Fjern platene, og tilsett 50 μL HI-FBS. Sett platene tilbake til inkubatoren ved 37 °C. Inkubere i totalt 12 timer.
    3. Eksempelstimulering 3: Infiser med F. novicida (U112-stamme; dyrket som beskrevet tidligere44 under aerobe forhold ved 37 °C i BBL Trypticase Soyabuljong supplert med 0,2 % L-cystein over natten. Deretter subkulturerer du bakteriene i forholdet 1:10 ved 37 °C i ytterligere 4 timer i ferskt medium før du tar den optiske tettheten (OD) ved 600 nm ved å bruke det friske mediet som et tomt. En OD-verdi på 1 tilsvarer 1 × 109 kolonidannende enheter (CFU) per ml.)
      1. Beregn volumet av F. novicida som trengs for infeksjon ved en MOI på 50 CFU ved hjelp av ligning (3) og ligning (4):
        Equation 5
        Equation 6
        Equation 7
      2. Fjern mediet fra BMDM-ene. Tilsett 500 μL F. novicida (MOI 50) i BMDM-stimuleringsmedier uten antibiotika til hver brønn. Inkuber platene ved 37 °C i 4 timer i en fuktet inkubator for å tillate absorpsjon.
      3. Vask cellene tre ganger med oppvarmet (37 °C) PBS og tilsett 500 mikrol BMDM-stimuleringsmedier inneholdende 50 μg/ml gentamycin. Sett platene tilbake til inkubatoren ved 37 °C. Inkubere over natten (16 timer).
    4. Eksempel stimulering 4: Stimuler med LPS + ATP.
      1. Fjern mediet fra BMDM-ene. Tilsett 500 μL BMDM-stimuleringsmedier med antibiotika (tabell 1) inneholdende 100 ng/ml LPS til hver brønn. Inkuber platene ved 37 °C i 3,5 timer i en fuktet inkubator.
      2. Tilsett 5 μL 0,5 M ATP-lagerløsning (tabell 1) til hver brønn. Sett platene tilbake til inkubatoren ved 37 °C. Inkuber i 30 min.

5. Oppsamling av kombinert supernatant og proteinlysat som skal brukes til caspase western blots

  1. Etter 4 timer, 12 timer eller 16 timer inkubasjon (den spesifikke timingen er avhengig av utløseren som brukes), fjern platen fra inkubatoren.
  2. Fjern 150 μL av supernatanten; forkast eller lagre dette for andre supernatantanalyser (f.eks. enzymbundet immunosorbentanalyse [ELISA]). Ikke fjern resten av supernatanten.
  3. Lag proteinoppsamlingsløsningen ved å kombinere 50 μL kaspaselysebuffer + 100 μL 4x SDS-buffer per brønn (tabell 1). Deretter tilsettes 150 μL av blandingen til hver brønn.
  4. For hver brønn, pipetter blandingen opp og ned for å samle lyserte celler og supernatant. Mens du pipetterer, skrap også bunnen av brønnen med pipettespissen for å forstyrre cellene. Etter skraping og pipettering, samle proteinlysatet i merkede 1,5 ml rør.
  5. Bruk en varmeblokk til å varme opp alle rørene til 100 °C i 12 minutter.
  6. Pellet eventuelle uløselige komponenter ved sentrifugering ved 14 500 × g i 30 s ved romtemperatur.
    MERK: Dette er et pausepunkt – proteinet fra den kombinerte supernatanten og proteinlysatene kan enten brukes umiddelbart eller lagres ved -20 °C i opptil 2 måneder eller ved -80 °C i opptil 6 måneder til det er klart til bruk.

6. Oppsamling av proteinlysat som skal brukes til caspase western blots

  1. Etter 4 timer, 12 timer eller 16 timer inkubasjon (den spesifikke timingen er avhengig av utløseren som brukes), fjern platen fra inkubatoren. Fjern all supernatant; forkast eller lagre dette for andre supernatantanalyser (f.eks.
  2. Lag 1x RIPA-bufferen ved å fortynne 2x RIPA-stamløsningen (tabell 1) i et likt volum avionisert vann. Deretter legger du til en fosfatasehemmertablett og en proteasehemmertablett, og lar dem oppløses. Legg til 150 μL 1x RIPA-buffer og 50 μL 4x SDS til hver brønn.
  3. For hver brønn, pipetter blandingen opp og ned for å samle de lyserte cellene. Mens du pipetterer, skrap også bunnen av brønnen med pipettespissen for å forstyrre cellene. Etter skraping og pipettering, samle proteinlysatet i merkede 1,5 ml rør.
  4. Bruk en varmeblokk til å varme opp alle rørene til 100 °C i 12 minutter.
  5. Pellet eventuelle uløselige komponenter ved sentrifugering ved 14 500 × g i 30 s ved romtemperatur.
    MERK: Dette er et pausepunkt – proteinlysatene kan enten brukes umiddelbart eller lagres ved -20 °C eller -80 °C til de er klare til bruk.

7. Utføre vestlig blotting ved hjelp av lysatene samlet fra BMDM-ene ved å følge trinnene ovenfor eller fra vevshomogenater

MERK: Hvis du bruker vev, kan det homogeniseres for hånd eller gjennom en kraftdrevet vevshomogenisator. Protokollen av Simpson76 gir en detaljert beskrivelse av vevshomogenisering.

  1. Forbered 1x løpende buffer: Kombiner 200 ml av 5x løpende bufferlager (tabell 1) og 800 ml avionisert vann. Lag denne 1x løpende bufferen rett før hvert eksperiment.
  2. Forbered elektroforeseapparatet med en 12% (vekt/vol) polyakrylamidgel med 10 brønner. Fyll elektroforeseapparatet med 1x løpende buffer. Fjern deretter gelkammen.
    MERK: For å analysere caspase-1, caspase-11, caspase-3, caspase-7, caspase-8 og caspase-9 for hver prøve, vil seks geler være nødvendig.
  3. For caspase-1, caspase-3, caspase-7 og caspase-8 blots, planlegger å bruke 30 μL av det kombinerte supernatant og proteinlysat i caspase lysis buffer eller vevshomogenatet. For caspase-11 og caspase-9 blots, planlegg å bruke 20 μL av proteinlysatet i RIPA-buffer eller vevshomogenatet. Hvis prøvene har vært lagret ved −20 °C eller −80 °C, tine dem på is først.
  4. For alle prøvene, varm opp til 100 °C i 5 minutter, og sentrifuger ved 14 500 × g i 30 s ved 4 °C før belastning. Deretter legger du sakte 20 eller 30 μL av prøven inn i hvert kjørefelt. Unngå at prøven flyter over i de andre kjørefeltene. For å evaluere alle seks caspases samtidig, bruk samme prosedyre for å laste de riktige prøvene i hver av de seks gelene.
  5. Koble elektroforeseapparatet til strømkilden. Sett deretter effekten til 80 V i 20 minutter for å starte gelkjøringen, og juster deretter effekten til 130 V i 45-60 minutter.
  6. Se fargestofffronten nøye, og slå av strømmen når fargestofffronten er i bunnen av gelen, men ennå ikke er presset ut av gelen.
  7. Mens gelen kjører, klargjør du 1x overføringsbuffer ved å kombinere 700 ml avionisert vann, 100 ml av 10x overføringsbufferlager (tabell 1) og 200 ml metanol. Gjør 1x-løsningen frisk hver gang.
    MERK: Vær forsiktig da metanol er brannfarlig. Utfør forberedelsen av overføringsbufferen vekk fra åpen ild.
  8. Fjern gelen forsiktig fra elektroforeseapparatet ved å bruke gelutløseren.
  9. Sett opp en overføringsstabel for hver gel.
    1. Aktiver en PVDF-membran ved å suge den i metanol i 1 min.
    2. Forvåt to stykker filterpapir, gelen og PVDF-membranen i overføringsbuffer i 5 minutter. Hold PVDF membran og gel i separate beholdere i løpet av denne 5 min inkubasjon.
    3. Monter overføringsstakken på det halvtørre systemet. Begynn på den nederste platinanonodesiden, plasser ett stykke filterpapir, PVDF-membranen, gelen og til slutt ett stykke filterpapir. Rull forsiktig ut eller press ut luftbobler mellom lagene, og lukk toppen av systemet. Forsikre deg om at sikkerhetsdekselet er sikret før du fortsetter.
  10. Koble til strømkilden. Sett effekten til 25 V i 45 minutter.
  11. Etter at overføringen er fullført, demonter overføringsstakken og samle membranen; legg den i en firkantet petriskål (inkubasjonsbrett).
  12. Utfør membranblokkering ved å tilsette 15 ml skummet melkløsning på 5 % (vekt/vol) (tabell 1). Inkuber membranen på en gyngende shaker ved 50 o / min til 70 o / min ved romtemperatur i 1 time.
    MERK: Dette er et pausepunkt – membranen kan enten fjernes etter 1 time eller oppbevares i blokkeringsløsning ved 4 °C over natten.
  13. Etter 1 time eller over natten inkubasjon, fjern blokkeringsløsningen. Legg til 10 ml av den fortynnede antistoffløsningen (anti-caspase-1 antistoff, anti-caspase-11 antistoff, kombinert anti-caspase-3 og anti-spaltet caspase-3 antistoff, kombinert anti-caspase-7 og anti-spaltet caspase-7 antistoff, kombinert anti-caspase-8 og anti-spaltet caspase-8 antistoff, eller anti-caspase-9 antistoff) (tabell 1). Plasser på en gyngende shaker ved 50 o / min til 70 o / min for å ruge ved romtemperatur i 2 timer eller ved 4 ° C over natten (16 timer).
  14. Samle antistoffoppløsningen (gjenbruk opptil 3x eller kast den), og vask ved å tilsette 15 ml TBST (tabell 1) til membranen på en gyngende shaker ved 50 o / min til 70 o / min ved romtemperatur i 10 minutter. Kast TBST.
  15. Gjenta vasken med 15 ml TBST etter trinn 14, totalt 3x.
  16. Tilsett 10 ml av den fortynnede sekundære HRP-konjugerte antistoffløsningen (antikanin for flekker farget med primære antistoffer mot caspase-3, caspase-7, caspase-8 eller caspase-9; anti-mus for flekker farget med primært antistoff mot caspase-1; anti-rotte for flekker farget med primært antistoff mot caspase-11) (tabell 1). Inkuber på en gyngende shaker ved 50 o / min til 70 o / min ved romtemperatur i 1 time.
  17. Fjern antistoffoppløsningen, og vask ved å tilsette 15 ml TBST til membranen på en gyngende shaker ved 50 o / min til 70 o / min ved romtemperatur i 10 minutter. Kast TBST.
  18. Gjenta vasken med 15 ml TBST etter trinn 17, totalt 3x.
  19. Tilsett 10 ml av det høyfølsomme HRP-substratet til membranen. La den stå i romtemperatur i mørket i 1 min.
  20. Fjern membranen fra underlaget. Fortsett direkte til avbildningen ved hjelp av en kjemiluminescensavbildning med tilbehørets hvite transbrett satt inn i nedre posisjon. Eksponer membranen ved hjelp av automatisk eksponeringsmodus (vanligvis ~ 1-2 min eksponeringstid).
  21. Bruk membranen fra caspase-9 eller caspase-11 blotting (dvs. en membran med RIPA lysatprøver), tilsett 10 ml strippebuffer og inkuber på en gyngende shaker ved 50 o / min til 70 o / min ved romtemperatur i 5 minutter.
  22. Kast strippebufferen, og vask ved å tilsette 15 ml TBST til membranen på en gyngende shaker ved 50 o / min til 70 o / min ved romtemperatur i 10 minutter. Kast TBST.
  23. Gjenta vasken med 15 ml TBST etter trinn 22, totalt 3x.
  24. Utfør membranblokkering ved å tilsette 15 ml av en 5 % (vekt/vol) skummet melkløsning. Inkuber membranen på en gyngende shaker ved 50 o / min til 70 o / min ved romtemperatur i 1 time.
    MERK: Dette er et pausepunkt – membranen kan enten fjernes etter 1 time eller oppbevares i blokkeringsløsning ved 4 °C over natten.
  25. Etter 1 time eller over natten inkubasjon, fjern blokkeringsløsningen. Tilsett 10 ml av den fortynnede anti-β-aktin (HRP-konjugerte) antistoffoppløsningen. Plasser på en gyngende shaker ved 50 o / min til 70 o / min for å inkubere ved romtemperatur i 1,5 time.
  26. Fjern antistoffoppløsningen og vask ved å tilsette 15 ml TBST til membranen på en gyngeshaker ved 50 o / min til 70 o / min ved romtemperatur i 10 minutter. Kast TBST.
  27. Gjenta vasken med 15 ml TBST etter trinn 26, totalt 3x.
  28. Tilsett 10 ml av HRP-substratet med standardfølsomhet til membranen. La den stå i romtemperatur i mørket i 1 min.
  29. Fortsett direkte til avbildningen ved hjelp av en kjemiluminescensavbildning med tilbehørets hvite transbrett satt inn i nedre posisjon. Eksponer membranen ved hjelp av automatisk eksponeringsmodus (vanligvis <1 min eksponeringstid).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Panoptose har blitt observert som respons på mange bakterielle, virale og soppinfeksjoner og andre inflammatoriske stimuli, samt i kreftceller 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 . I disse tilfellene er aktivering av flere caspaser rapportert. Ved å bruke eksempelstimuleringene i denne protokollen som er kjent for å indusere PANoptose, nemlig IAV, HSV1 og F. novicida 44,48,50,51,53,57, forventes det at spaltning kan observeres som et surrogat for aktivering av flere caspaser (figur 2A-C ). I tillegg er LPS + ATP inkludert som en kontroll. Denne kombinasjonen er en kanonisk NLRP3-inflammasomutløser som forventes å indusere caspase-1-aktivering. Aktiveringen av caspase-1 kan visualiseres som respons på hver av disse utløserne ved spaltning av p45 pro-form til p20 aktiv form (figur 2D). P20-skjemaet kan da spalte GSDMD og initiere celledød19.

På samme måte observeres aktiveringen av den apoptotiske initiatoren caspase, caspase-8, som betegnet ved tilstedeværelsen av p18-spaltet form (figur 2A-D). Den svake aktiveringen av caspase-9 kan også observeres i noen tilfeller med disse stimuli (figur 2A-D). Nedstrøms for disse initiatorene aktiveres effektorkaspasene caspase-3 og caspase-7; Denne aktiveringen observeres som dannelsen av den p17/19 spaltede formen av caspase-3 og den p20-spaltede formen av caspase-7 (figur 2A-D). Hittil har aktiveringen av caspase-11 ikke blitt mye evaluert i PANoptose, men aktiveringen har blitt observert i noen sammenhenger54. Caspase-11 forblir en viktig inflammatorisk caspase, og dens aktivering kan observeres ved dannelsen av sin p26-spaltede form. Mens noe lavnivå caspase-11-aktivering er sett, observeres ikke robust aktivering som respons på IAV, HSV1 eller F. novicida-infeksjon eller LPS + ATP-stimulering (figur 2A-D).

Celler som mangler oppstrøms PANoptose-sensorer, gjennomgår ikke celledød som respons på PANoptose-induserende stimuli. For eksempel induserer IAV-infeksjon dannelsen av ZBP1-PANoptosome 48,51,53,57, og Zbp1-/- celler er beskyttet mot celledød under IAV-infeksjon (figur 3A). På samme måte induserer HSV1- og F. novicida-infeksjoner dannelsen av AIM2-PANoptosome44, og Aim2-/- celler unnlater å gjennomgå robust celledød som respons på disse infeksjonene (figur 3B,C). I celler som er mangelfull i oppstrømssensoren som er nødvendig for PANoptosomdannelse, blir aktiveringen av caspaser signifikant redusert eller til og med eliminert, noe som kan ses ved reduksjonen i intensiteten til de spaltede båndene i de vestlige flekkene (figur 2A-C). På samme måte er celler som mangler oppstrøms inflammasomsensorer beskyttet mot celledød som respons på deres respektive stimuli, og Nlrp3-/- celler gjennomgår ikke celledød som respons på LPS + ATP (figur 3D). Disse cellene viser også redusert kaspaseaktivering (figur 2D).

Figure 1
Figur 1: Oversikt over eksperimentell prosedyre. Benmarg er isolert og differensiert i benmargsavledede makrofager. Disse cellene stimuleres deretter med en utløser som aktiverer medfødt immunsignalering og celledød, for eksempel infeksjon eller en inflammatorisk stimulus. Etter at cellene aktiveres og begynner å gjennomgå PCD, samles lysatet og analyseres ved vestlig blotting for å overvåke caspase-spaltning til deres aktive former. Forkortelser: BMDM = benmargsavledede makrofager; DAMPs = skadeassosierte molekylære mønstre; III-PCD = inflammatorisk medfødt immunprogrammert celledød; PAMPs = patogenassosierte molekylære mønstre; PCD = programmert celledød. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Aktivering av caspaser som respons på stimuli. Kaspaseaktivering fra cellekulturlysater kan vurderes ved å evaluere størrelsen på produktene som kjøres på en elektroforetisk gel. (AD) Immunoblotanalyse av pro- (P45) og aktivert (P20) CASP1, pro- (P43) og spaltet (P36 og P26) CASP11, pro- (P35) og spaltet (P17/P19) CASP3, pro- (P35) og spaltet (P20) CASP7, pro- (P55) og spaltet (P44 og P18) CASP8, og pro- (P49) og spaltet (P37) CASP9 i WT og Zbp1−/−, WT og Aim2−/−, eller WT og Nlrp3−/− BMDM etter (A) IAV-infeksjon, (B) HSV1-infeksjon, (C) Francisella novicida-infeksjon eller (D) LPS + ATP-stimulering. Bilder er representative for tre uavhengige eksperimenter. Forkortelser: BMDM = benmargsavledede makrofager; CASP1 = caspase-1; CASP3 = caspase-3; CASP7 = caspase-7; CASP8 = caspase-8; CASP9 = caspase-9; CASP11 = caspase-11; HSV1 = herpes simplex virus 1; IAV = influensa A-virus; LPS = lipopolysakkarid; WT = villtype. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Hemming av celledød når kaspaseaktivering ikke forekommer. (AD) Representative bilder av celledød ved WT og Zbp1−/−, WT og Aim2−/−, eller WT og Nlrp3−/− BMDM etter (A) IAV-infeksjon, (B) HSV1-infeksjon, (C) Francisella novicida-infeksjon eller (D) LPS + ATP-stimulering. Den røde masken betegner døde celler. Skalastenger = 50 μm. Bilder er representative for tre uavhengige eksperimenter. Forkortelser: BMDM = benmargsavledede makrofager; HSV1 = herpes simplex virus 1; IAV = influensa A-virus; LPS = lipopolysakkarid; WT = villtype. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1. Klikk her for å laste ned denne tabellen. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Overvåking av caspase-spaltning og aktivering gir et av de mest omfattende bildene av medfødt immun-PCD-aktivering som en del av den medfødte immunresponsen. Protokollen beskrevet her demonstrerer en strategi for å overvåke caspaseaktivering som respons på IAV, HSV1 og F. novicida infeksjoner og den sterile utløseren LPS + ATP, men mange andre stimuli kan indusere PCD og kan brukes i denne metoden, som det har blitt vist i flere publikasjoner 44,48,49,50,51,52,53,54,56, 57,58,59,60,61,62. Denne prosedyren kan også brukes til å karakterisere den medfødte immun-PCD som respons på nye utløsere, hvor mekanismene til PCD forblir ukjente. Ved å bruke en kombinasjon av villtype og genetisk mangelfulle celler og sammenligne aktiveringen av forskjellige caspaser mellom disse populasjonene, kan det gi ny innsikt i sensorene og regulatorene som er involvert i PCD som respons på en gitt stimulus.

Flere tekniske punkter bør vurderes når du utfører denne metoden. For det første, da denne metoden innebærer å infisere eller på annen måte stimulere celler til å indusere celledød, er det viktig å bruke sterile teknikker for isolering av cellene og for de påfølgende stimuleringene. Forurensning kan påvirke resultatene betydelig, noe som fører til caspaseaktivering selv under ustimulerte forhold. For å teste for dette, er det best å alltid inkludere en ustimulert kontroll når du samler prøvene og laster geler for caspase blots. I tillegg, når plating cellene, er det viktig å sikre at cellene telles nøyaktig og at klumping ikke forekommer. Hvis cellene er klumpet, vil inkonsekvent antall celler bli avsatt i brønnene, og MOI og mengden protein per brønn vil bli påvirket. Når du utfører de vestlige flekkene, er det god praksis å sammenligne båndmønsteret til den uncleaved, pro-form av caspase, samt å overvåke spaltet form for å sikre at konsistente mengder protein ble samlet og lastet over brønnene. Men når det er et høyt nivå av caspaseaktivering i en prøve, kan dette forårsake en forvrengning i signalet, noe som fører til det som ser ut til å være en reduksjon i proformen i de andre prøvene, som vi viser med caspase-8 i HSV1 og F. novicida infeksjoner i dette eksemplet (figur 2B,C). Dette skjer sannsynligvis på grunn av ujevn antistoffbinding forårsaket av tilstedeværelsen av for mye protein på et bestemt sted på membranen, eller på grunn av bildeartefakter der substratet blir overmettet i en enkelt prøve. Justering av antistofffortynninger eller bildeinnstillinger kan bidra til å løse dette problemet. I tillegg, når du etablerer en infeksjon eller stimulering for første gang, kan bruk av et tidsforløp være gunstig for å identifisere når aktiveringen av hver caspase oppstår. Uten et tidsforløp kan dataene være misvisende, da det individuelle tidspunktet som velges kan være for tidlig eller for sent, noe som fører til at caspaseaktivering blir savnet og upassende konklusjoner kan gjøres om involveringen. På samme måte kan testing av forskjellige MOIer for smittsomme stimuli også være fordelaktig for å identifisere de spesifikke forholdene under hvilke caspase (er) aktiveres.

Elektroforesetrinnet krever også presisjon. Når du forbereder deg på å legge prøvene på gelen, skal rørene alltid sentrifugeres først, og bare supernatanten skal lastes. Uoppløselig protein kan forstyrre driften av gelen og den påfølgende analysen av dataene. Den kombinerte supernatanten og proteinlysatet bør brukes til påvisning av caspase-1 i stedet for et rent cellelysat. Dette vil i stor grad forbedre følsomheten for deteksjon. Caspase-3, caspase-7 og caspase-8 kan også påvises godt i det kombinerte supernatant- og proteinlysatet. For best resultat ved påvisning av caspase-11 og caspase-9 er imidlertid proteinlysatet samlet i RIPA-bufferen tilstrekkelig. Siden den relative overfloden av hver caspase i lysatet kan være lav, bør så mye prøve som mulig lastes på gelen. Dette krever langsom og jevn pipettering for å unngå å renne over i nabobrønnene. Hvis det observeres dårlig separasjon mellom de pro- og spaltede formene av caspasene, kan gelens kjøretid forlenges, eller en lavere prosentandel akrylamid kan brukes til å optimalisere separasjonen.

Endelig har antistoffene som er oppført i denne protokollen blitt optimalisert for bruk med mus-BMDM, og flere grupper har grundig testet dem ved hjelp av genetisk mangelfulle celler som kontroller for å bekrefte at det ikke er noen ikke-spesifikke bånd ved molekylvektene av interesse. Mens andre antistoffer også kan fungere, er de som er oppført her optimale. I tillegg fungerer mange av disse antistoffene også godt i vevslysater, og andre cellepopulasjoner kan også samles og stimuleres in vitro for analyse. Bruk av cellelinjer eller primære celler fra mennesker eller andre arter er også mulig, men vil kreve en ytterligere vurdering av antistoffene for optimalisering. Human anti-caspase-1 (1:1,000) og human anti-caspase-8 (1:1,000; se materialfortegnelse) har blitt brukt med hell for slike vurderinger, og de samme anti-caspase-3, anti-spaltet caspase-3, anti-caspase-7 og anti-spaltet caspase-7 antistoffer inkludert i denne protokollen kan brukes for både mus og humane celler 44,56,62.

Viktigheten av å forstå PCD-veier, inkludert pyroptose, apoptose, nekroptose og PANoptose, som en integrert del av den medfødte immunresponsen, vokser, ettersom krysstale mellom PCD-veier i økende grad blir karakterisert, og celledødsmolekyler blir identifisert som terapeutiske mål over hele sykdomsspekteret 3,4 . Fortsatt å identifisere de medfødte immunsensorene som induserer PCD så vel som III-PCD og karakteriserer timingen og samspillet mellom caspaseaktivering, vil forbedre evnen til terapeutisk å modulere medfødte immun-PCD-veier og forbedre pasientens utfall.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

T.-D.K. er konsulent for Pfizer.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av Kanneganti-laboratoriet for deres kommentarer og forslag, og vi takker J. Gullett, PhD, for vitenskapelig redigeringsstøtte. Arbeid i laboratoriet vårt støttes av National Institutes of Health (NIH) tilskudd AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 og CA253095 (til TDK) og av American Libanese Syrian Associated Charities (til TDK). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171 (1996).
  2. Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21 (2016).
  3. Gullett, J. M., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. It's all in the PAN: Crosstalk, plasticity, redundancies, switches, and interconnectedness encompassed by PANoptosis underlying the totality of cell death-associated biological effects. Cells. 11 (9), 1495 (2022).
  4. Pandian, N., Kanneganti, T. D. PANoptosis: A unique innate immune inflammatory cell death modality. Journal of Immunology. 209 (9), 1625-1633 (2022).
  5. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  6. Shi, Y. Caspase activation: Revisiting the induced proximity model. Cell. 117 (7), 855-858 (2004).
  7. Galluzzi, L., Lopez-Soto, A., Kumar, S., Kroemer, G. Caspases connect cell-death signaling to organismal homeostasis. Immunity. 44 (2), 221-231 (2016).
  8. Fernandes-Alnemri, T., Litwack, G., Alnemri, E. S. CPP32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 30761-30764 (1994).
  9. Tewari, M., et al. Yama/CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase. Cell. 81 (5), 801-809 (1995).
  10. Nicholson, D. W., et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature. 376 (6535), 37-43 (1995).
  11. Stennicke, H. R., et al. Pro-caspase-3 is a major physiologic target of caspase-8. Journal of Biological Chemistry. 273 (42), 27084-27090 (1998).
  12. Twiddy, D., Cohen, G. M., Macfarlane, M., Cain, K. Caspase-7 is directly activated by the approximately 700-kDa apoptosome complex and is released as a stable XIAP-caspase-7 approximately 200-kDa complex. Journal of Biological Chemistry. 281 (7), 3876-3888 (2006).
  13. Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Reviews of Immunology. 38, 567-595 (2020).
  14. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
  15. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: Controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (3), 231-241 (2008).
  16. Morioka, S., Maueröder, C., Ravichandran, K. S. Living on the edge: Efferocytosis at the interface of homeostasis and pathology. Immunity. 50 (5), 1149-1162 (2019).
  17. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  18. Rogers, C., et al. Cleavage of DFNA5 by caspase-3 during apoptosis mediates progression to secondary necrotic/pyroptotic cell death. Nature Communications. 8, 14128 (2017).
  19. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  20. Shi, J., Gao, W., Shao, F. Pyroptosis: Gasdermin-mediated programmed necrotic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 245-254 (2017).
  21. Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
  22. Aglietti, R. A., et al. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7858-7863 (2016).
  23. Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341 (6151), 1250-1253 (2013).
  24. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  25. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  26. Lamkanfi, M., et al. Targeted peptidecentric proteomics reveals caspase-7 as a substrate of the caspase-1 inflammasomes. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (12), 2350-2363 (2008).
  27. Kalai, M., et al. Tipping the balance between necrosis and apoptosis in human and murine cells treated with interferon and dsRNA. Cell Death & Differentiation. 9 (9), 981-994 (2002).
  28. Li, C., et al. Development of atopic dermatitis-like skin disease from the chronic loss of epidermal caspase-8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22249-22254 (2010).
  29. Kovalenko, A., et al. Caspase-8 deficiency in epidermal keratinocytes triggers an inflammatory skin disease. Journal of Experimental Medicine. 206 (10), 2161-2177 (2009).
  30. Kang, T. B., et al. Caspase-8 serves both apoptotic and nonapoptotic roles. Journal of Immunology. 173 (5), 2976-2984 (2004).
  31. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  32. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  33. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  34. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  35. Hitomi, J., et al. Identification of a molecular signaling network that regulates a cellular necrotic cell death pathway. Cell. 135 (7), 1311-1323 (2008).
  36. Malireddi, R. K., Ippagunta, S., Lamkanfi, M., Kanneganti, T. D. Cutting edge: Proteolytic inactivation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 by the Nlrp3 and Nlrc4 inflammasomes. Journal of Immunology. 185 (6), 3127-3130 (2010).
  37. Tsuchiya, K., et al. Caspase-1 initiates apoptosis in the absence of gasdermin D. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  38. Taabazuing, C. Y., Okondo, M. C., Bachovchin, D. A. Pyroptosis and apoptosis pathways engage in bidirectional crosstalk in monocytes and macrophages. Cell Chemical Biology. 24 (4), 507-514 (2017).
  39. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. Journal of Immunology. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  40. Man, S. M., et al. Inflammasome activation causes dual recruitment of NLRC4 and NLRP3 to the same macromolecular complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7403-7408 (2014).
  41. Man, S. M., et al. Salmonella infection induces recruitment of Caspase-8 to the inflammasome to modulate IL-1beta production. Journal of Immunology. 191 (10), 5239-5246 (2013).
  42. Van Opdenbosch, N., et al. Caspase-1 engagement and TLR-induced c-FLIP expression suppress ASC/caspase-8-dependent apoptosis by inflammasome sensors NLRP1b and NLRC4. Cell Reports. 21 (12), 3427-3444 (2017).
  43. Pierini, R., et al. AIM2/ASC triggers caspase-8-dependent apoptosis in Francisella-infected caspase-1-deficient macrophages. Cell Death & Differentiation. 19 (10), 1709-1721 (2012).
  44. Lee, S., et al. AIM2 forms a complex with pyrin and ZBP1 to drive PANoptosis and host defence. Nature. 597 (7876), 415-419 (2021).
  45. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death & Differentiation. 20 (9), 1149-1160 (2013).
  46. Lukens, J. R., et al. Dietary modulation of the microbiome affects autoinflammatory disease. Nature. 516 (7530), 246-249 (2014).
  47. Gurung, P., Burton, A., Kanneganti, T. D. NLRP3 inflammasome plays a redundant role with caspase 8 to promote IL-1beta-mediated osteomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4452-4457 (2016).
  48. Kuriakose, T., et al. ZBP1/DAI is an innate sensor of influenza virus triggering the NLRP3 inflammasome and programmed cell death pathways. Science Immunology. 1 (2), (2016).
  49. Malireddi, R. K. S., et al. TAK1 restricts spontaneous NLRP3 activation and cell death to control myeloid proliferation. Journal of Experimental Medicine. 215 (4), 1023-1034 (2018).
  50. Malireddi, R. K. S., et al. Innate immune priming in the absence of TAK1 drives RIPK1 kinase activity-independent pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and inflammatory disease. Journal of Experimental Medicine. 217 (3), (2020).
  51. Christgen, S., et al. Identification of the PANoptosome: A molecular platform triggering pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 237 (2020).
  52. Malireddi, R. K. S., et al. RIPK1 distinctly regulates Yersinia-induced inflammatory cell death, PANoptosis. Immunohorizons. 4 (12), 789-796 (2020).
  53. Zheng, M., Karki, R., Vogel, P., Kanneganti, T. D. Caspase-6 is a key regulator of innate immunity, inflammasome activation, and host defense. Cell. 181 (3), 674-687 (2020).
  54. Karki, R., et al. ADAR1 restricts ZBP1-mediated immune response and PANoptosis to promote tumorigenesis. Cell Reports. 37 (3), 109858 (2021).
  55. Wang, Y., et al. Single cell analysis of PANoptosome cell death complexes through an expansion microscopy method. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (10), 531 (2022).
  56. Malireddi, R. K. S., et al. Inflammatory cell death, PANoptosis, mediated by cytokines in diverse cancer lineages inhibits tumor growth. Immunohorizons. 5 (7), 568-580 (2021).
  57. Kesavardhana, S., et al. The Zα2 domain of ZBP1 is a molecular switch regulating influenza-induced PANoptosis and perinatal lethality during development. Journal of Biological Chemistry. 295 (24), 8325-8330 (2020).
  58. Banoth, B., et al. ZBP1 promotes fungi-induced inflammasome activation and pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 18276-18283 (2020).
  59. Karki, R., et al. Interferon regulatory factor 1 regulates PANoptosis to prevent colorectal cancer. JCI Insight. 5 (12), 136720 (2020).
  60. Zheng, M., et al. Impaired NLRP3 inflammasome activation/pyroptosis leads to robust inflammatory cell death via caspase-8/RIPK3 during coronavirus infection. Journal of Biological Chemistry. 295 (41), 14040-14052 (2020).
  61. Karki, R., et al. Synergism of TNF-α and IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 184 (1), 149-168 (2021).
  62. Karki, R., et al. ZBP1-dependent inflammatory cell death, PANoptosis, and cytokine storm disrupt IFN therapeutic efficacy during coronavirus infection. Science Immunology. 7 (74), (2022).
  63. Jiang, W., Deng, Z., Dai, X., Zhao, W. PANoptosis: A new insight into oral infectious diseases. Frontiers in Immunology. 12, 789610 (2021).
  64. Chi, D., et al. Real-time induction of macrophage apoptosis, pyroptosis, and necroptosis by Enterococcus faecalis OG1RF and two root canal isolated strains. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 720147 (2021).
  65. Lin, J. F., et al. Phosphorylated NFS1 weakens oxaliplatin-based chemosensitivity of colorectal cancer by preventing PANoptosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 54 (2022).
  66. Song, M., et al. Self-assembled polymeric nanocarrier-mediated co-delivery of metformin and doxorubicin for melanoma therapy. Drug Delivery. 28 (1), 594-606 (2021).
  67. Boucher, D., Chan, A., Ross, C., Schroder, K. Quantifying caspase-1 activity in murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 1725, 163-176 (2018).
  68. Boucher, D., Duclos, C., Denault, J. B. General in vitro caspase assay procedures. Methods in Molecular Biology. 1133, 3-39 (2014).
  69. Kaushal, V., Herzog, C., Haun, R. S., Kaushal, G. P. Caspase protocols in mice. Methods in Molecular Biology. 1133, 141-154 (2014).
  70. Swacha, P., Gekara, N. O., Erttmann, S. F. Biochemical and microscopic analysis of inflammasome complex formation. Methods in Enzymology. 625, 287-298 (2019).
  71. Talley, S., et al. A caspase-1 biosensor to monitor the progression of inflammation in vivo. Journal of Immunology. 203 (9), 2497-2507 (2019).
  72. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 receptor differentially couples to distinct release pathways for IL-1beta in mouse macrophage. Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  73. Yu, J. W., et al. Cryopyrin and pyrin activate caspase-1, but not NF-kappaB, via ASC oligomerization. Cell Death & Differentiation. 13 (2), 236-249 (2006).
  74. Henry, C. M., Martin, S. J. Caspase-8 acts in a non-enzymatic role as a scaffold for assembly of a pro-inflammatory "FADDosome" complex upon TRAIL stimulation. Molecular Cell. 65 (4), 715-729 (2017).
  75. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  76. Simpson, R. J. Homogenization of mammalian tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 191
Evaluering av kaspaseaktivering for å vurdere medfødt immuncelledød
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, J. H., Tweedell, R. E.,… More

Han, J. H., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter