Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल लक्ष्यों का पता लगाने के लिए एक तेज, 3-चरण, एपटामर-आधारित घातीय प्रवर्धन परख के उपयोग को दर्शाता है। कैफीन पर थियोफिलाइन की उपस्थिति को पहचानने के लिए इस प्रणाली को लागू करने के लिए नमूना तैयार करना, संकेत प्रवर्धन और रंग विकास को कवर किया जाता है।
Abstract
एपटामर लक्ष्य-पहचान अणु हैं जो उच्च आत्मीयता और विशिष्टता के साथ बंधते हैं। सिग्नल-जनरेशन क्षमता वाले अन्य अणुओं को नियंत्रित करने के लिए इन विशेषताओं का लाभ उठाया जा सकता है। यहां वर्णित प्रणाली के लिए, एक एप्टामेरिक डोमेन के माध्यम से लक्ष्य पहचान, एक संशोधित हैमरहेड राइबोजाइम का स्टेम II, शुरू में असंरचित निर्माण को स्थिर करके स्व-क्लीवर राइबोजाइम को सक्रिय करता है। सीआईएस-क्विंग आरएनए स्टेम III और स्टेम I के जंक्शन पर कार्य करता है, जिससे दो क्लीवेज उत्पाद बनते हैं। लंबी दरार उत्पाद दो समान उत्प्रेरक रूप से सक्रिय जी-चौगुनी की इज़ोटेर्मल घातीय प्रवर्धन प्रतिक्रिया (एक्सपीएआर) को दर्शाता है। उन परिणामी प्रवर्धन उत्पाद पेरोक्सीडेज कमी को उत्प्रेरित करते हैं, जो एक आउटपुट के साथ एक रंगीन सब्सट्रेट की कमी के साथ युग्मित होता है जिसे नग्न आंखें पता लगा सकती हैं। वर्तमान अध्ययन में वर्णित 3-भाग प्रणाली 15 मिनट से भी कम समय में 0.5 μM थियोफिलाइन की उपस्थिति को इंगित करने के लिए एक नेत्रहीन पता लगाने योग्य संकेत का उत्पादन करके एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट एसेस (ईएलआईएसए) जैसे पहचान के तौर-तरीकों में सुधार करती है।
Introduction
एपटामर आमतौर पर एकल-फंसे हुए डीएनए या आरएनए होते हैं जिन्हें वांछितलक्ष्यों के लिए उच्च बाध्यकारी आत्मीयता और विशिष्टता के साथ एक विकासवादी प्रक्रिया के माध्यम से चुना जाता है। बाध्यकारी क्षमता के अलावा, एपटामर को सिग्नल-आउटपुट फ़ंक्शन 2,3 के साथ रूपांकनों से जोड़ा और नियंत्रित किया जा सकता है, उक्त सिग्नल को बढ़ाता है और सिस्टम की संवेदनशीलता में सुधार करता है। जी-चौगुनी आइसोथर्मल घातीय प्रवर्धन प्रतिक्रिया (जीक्यू-एक्सपीआर) प्रणाली एक तीन-भाग प्रणाली (चित्रा 1) है जो एक दृश्य संकेत विकसित करती है क्योंकि दृश्य आउटपुट4 का उत्पादन करने के लिए एक एकल प्रतिक्रिया पोत में क्रमिक घटक जोड़े जाते हैं। यह प्रणाली एक सुव्यवस्थित वर्कफ़्लो का उपयोग करके किसी दिए गए नमूने में एक विशिष्ट लक्ष्य का पता लगाने की अनुमति देती है, यहां थियोफिलाइन में, एक सुव्यवस्थित वर्कफ़्लो का उपयोग करके रुचि के लक्ष्य का तेजी से, विशिष्ट पता लगाने की अनुमति देता है। इस विधि को उन नमूनों के लिए माना जाना चाहिए जहां लक्ष्य एकाग्रता की विशिष्ट मात्रा कम समय में प्रतिक्रिया की उच्च विशिष्टता की तुलना में कम चिंता का विषय है।
एक एलोस्टेरिक राइबोस्विच, एक संरचना-स्विचिंग आरएनए अणु (राइबोजाइम) जो आत्म-दरार से गुजरता है, प्रारंभिक संकेत पैदा करता है। यह निर्माण हैमरहेड राइबोजाइम पर आधारित है, जिसमें दरार गतिविधि के नियामक के रूप में स्टेम II में एक एप्टामेरिक डोमेन पेश किया गया है। इसका स्व-दरार फ़ंक्शन सक्रिय होता है जब इसका एप्टामेरिक डोमेन अपने लक्ष्य5 से बंधन पर स्थिर हो जाता है। अन्यथा, स्विच अपनी मूल स्थिति में निष्क्रिय है।
बाद की घातीय प्रवर्धन प्रतिक्रिया (एक्सपीएआर) पहले चरण से इज़ोटेर्मल प्रवर्धन प्रतिक्रिया6 तक स्व-क्लीवर आरएनए स्ट्रैंड की रिहाई का उपयोग करती है। एक्सपीआर के प्रवर्धन उत्पाद में पेरोक्सीडेज गतिविधि7 है, जो सिस्टम के अंतिम चरण के आधार के रूप में कार्य करता है। जब कुछ सब्सट्रेट्स को पेरोक्साइड ब्रेकडाउन के साथ ऑक्सीकरण किया जाता है, तो वे एक फ्लोरोसेंट आउटपुट का उत्पादन करते हैं जिसे विभिन्न इंस्ट्रूमेंटेशन पर मापा जा सकता है। दृश्य पहचान के लिए रंगीन उत्पाद का उत्पादन करने के लिए अन्य सामान्य सब्सट्रेट्स को प्रतिस्थापित किया जा सकता है। एक्सपीआर और इसके प्रवर्धन उत्पादों की पेरोक्सीडेज गतिविधि 2-चरण सिग्नल-एन्हांसर के रूप में कार्य करती है,पारंपरिक रणनीतियों 7,8 की तुलना में अधिक स्तर तक संवेदनशीलता बढ़ाती है।
थियोफिलाइन बनाम कैफीन का पता लगाने का उपयोग इस पहचान मंच की विशिष्टता के उदाहरण के रूप में किया जाता है, क्योंकि वे केवल एक मिथाइल समूह (चित्रा 2) से भिन्न होते हैं। सिस्टम का यह प्रदर्शन कम से कम 500 एनएम थियोफिलाइन के दृश्य का पता लगाने के लिए एक रंगीन आउटपुट पैदा करता है।
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Protocol
ट्यूब तैयारी के लिए पूरक तालिका 1 (प्रतिक्रिया सेट-अप तालिका) देखें, जिसमें प्रतिक्रिया घटकों की विशिष्ट मात्रा और सांद्रता शामिल है। यहां प्रदर्शित प्रोटोकॉल सामग्री की तालिका में वर्णित एक पूर्वअसंयुधित पहचान मंच किट का उपयोग करता है। सभी घटकों को बर्फ पर रखा जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए।
1. राइबोजाइम की तैयारी
नोट: प्राथमिक पहचान घटक एक एलोस्टेरिक (एपटामर-विनियमित) राइबोजाइम है जो थियोफिलाइन को पहचानता है ( पूरक तालिका 2 देखें)।
- एक पीसीआर ट्यूब में टी 4 पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज के 5 यू (0.5 μL, सामग्री की तालिका देखें) एकत्र करें, जिसका उपयोग राइबोजाइम दरार उत्पादों को सक्रिय करने के लिए किया जाएगा।
नोट: यह घटक पहले जोड़ा जाता है ताकि उपयोगकर्ता एंजाइम के सही वितरण को देख सके। - प्रत्येक नमूना ट्यूब (पीसीआर ट्यूब) में पूर्व तैयार 5x राइबोजाइम बफर ( सामग्री की तालिका देखें) का 1 μL जोड़ें।
- दृष्टि से विशिष्टता का प्रदर्शन करने के प्रयोजनों के लिए, परीक्षण नमूने के रूप में प्रत्येक नमूना ट्यूब में 2 एमएम थियोफिलाइन (लक्ष्य) या 2 एमएम कैफीन (नियंत्रण) का 1.5 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: एक मानक वक्र स्थापित करने के लिए, 3.125 एमएम विश्लेषण से शुरू करने और 0.001 एमएम तक पांच गुना कमजोर पड़ने का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। - प्रत्येक नमूना ट्यूब को 5-10 बार पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं।
- परीक्षण समाधान के 5 μL में 240 nM की अंतिम सांद्रता बनाने के लिए प्रत्येक नमूना ट्यूब में लक्ष्य के लिए विशिष्ट एक एप्टामेरिक डोमेन युक्त 600 nM RNA का 2 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), फिर पाइपिंग द्वारा जल्दी से मिलाएं और पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए ठंडे ब्लॉक पर रखें।
नोट: शुरू में राइबोजाइम के बिना सभी प्रतिक्रियाओं को तैयार करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि राइबोजाइम को राइबोजाइम बफर के साथ जोड़े जाने पर स्व-दरार प्रतिक्रिया तुरंत शुरू हो जाएगी और महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि का उत्पादन कर सकती है। - एक बार सभी प्रतिक्रिया ट्यूब तैयार हो जाने के बाद, टाइमर का उपयोग करके ठीक 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर प्रत्येक नमूने (5 μL) को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद नमूना ट्यूबों को तुरंत बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर वापस करें।
2. जीक्यू-एक्सपीआर
- प्रत्येक नमूना ट्यूब में निकेस-पोलीमरेज़ एंजाइम मिश्रण का 3.5 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और अच्छी तरह मिलाएं।
नोट: आवश्यक एंजाइम सांद्रता पहचान अनुक्रमों, एंजाइमों के प्रकार और प्रतिक्रिया तापमान पर निर्भर करती है, जिनमें से संयोजन अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया गया था। - मिश्रण करने के लिए प्रत्येक नमूना ट्यूब और पिपेट में टेम्पलेट, न्यूक्लियोटाइड और प्रतिक्रिया बफर ( सामग्री की तालिका देखें) युक्त एक्सपीआर प्रतिक्रिया मिश्रण का 31.5 μL जोड़ें।
नोट: घटक सांद्रता पोलीमरेज़ उत्पादों के एंजाइमों और अनुक्रमों के आधार पर अनुकूलित की जाती है। - एक बार सभी नमूने तैयार हो जाने के बाद, टाइमर का उपयोग करके ठीक 5 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक तैयार नमूने (40 μL) को इनक्यूबेट करें। यदि संभव हो, तो थर्मोसाइक्लर पर इनक्यूबेट करें, हालांकि एक गर्म ढक्कन अनावश्यक है।
- इनक्यूबेशन चरण के बाद नमूना ट्यूबों को तुरंत बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर वापस करें।
3. रंग विकास
- प्रत्येक नमूना ट्यूब में 2 μL Hemin समाधान (25 uM, सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।
- प्रत्येक नमूना ट्यूब में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध टीएमबी समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) का 58 μL जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।
- कम से कम 3 मिनट और 30 मिनट तक कमरे के तापमान पर रंग विकास प्रतिक्रिया (100 μL) को इनक्यूबेट करें।
नोट: (वैकल्पिक) रंग विकास को 2 एम सल्फ्यूरिक एसिड के 20 μL जोड़कर रोका जा सकता है। - नमूनों को आंखों से गुणात्मक रूप से पढ़ें, या 450 एनएम पर अवशोषण प्लेट रीडर का उपयोग करके परिणामों की मात्रा निर्धारित करें यदि रंग विकास प्रतिक्रियाओं को सल्फ्यूरिक एसिड का उपयोग करके रोक दिया जाता है।
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Representative Results
चित्रा 1 में दर्शाया गया डिटेक्शन प्लेटफॉर्म एप्टामेरिक लक्ष्य पहचान को थोड़े समय में नमूना तैयारी (लक्ष्य बनाम गैर-लक्ष्य, चित्रा 2) के बीच नेत्रहीन अलग-अलग अंतरों में परिवर्तित करता है। सौकुप एट अल.5 द्वारा पहचाने गए एक एलोस्टेरिक राइबोजाइम ने नियंत्रण और नकारात्मक नमूनों पर लक्ष्य की प्रतिक्रिया के साथ कम शोर अनुक्रम बनाने के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में कार्य किया। अनुकूलित निर्माण 30 मिनट (चित्रा 3) में 500 एनएम थियोफिलाइन के रूप में कम पहचानने में सक्षम था - लक्ष्य के संपर्क में आने वाली नमूना तैयारी चरण 3 में नीले रंग का उत्पादन करती है, जबकि बिना लक्ष्य वाले नमूने रंगहीन रहते हैं। यदि आवश्यक हो, तो इन परिणामों को पहले चरण 3.4 में वर्णित रंग विकास प्रतिक्रिया को रोककर निर्धारित किया जा सकता है, और फिर मौजूद लक्ष्य की प्रारंभिक एकाग्रता को मापने के लिए 450 एनएम पर परिणामी उत्पाद के अवशोषण को पढ़कर। इस प्रक्रिया के विशिष्ट परिणाम तालिका 1 में प्रस्तुत किए गए हैं, जिसे प्रारंभिक नमूने में मौजूद लक्ष्य की एकाग्रता का मात्रात्मक अनुमान लगाने के लिए नॉनलाइनियर प्रतिगमन में फिट किया जा सकता है (चित्रा 4)।
चित्र 1: जीक्यू-एक्सपीआर प्रणाली। पहचान और सिग्नल प्रवर्धन प्रणाली के तंत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एपटामर लक्ष्य और प्रति-लक्ष्य। विशिष्टता के प्रदर्शन के रूप में थियोफिलाइन (लक्ष्य) और कैफीन (काउंटर-टारगेट कंट्रोल) की आणविक संरचना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: जीक्यू-एक्सपीआर दृश्य परिणाम। रंग विकास के 3 मिनट और 30 मिनट के बाद थियोफिलाइन की विभिन्न सांद्रता का पता लगाने के लिए सिस्टम के प्रतिनिधि परिणाम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: प्रतिनिधि थियोफिलाइन मानक वक्र। रंग विकास के 30 मिनट के बाद ए 450 पर मापा गया सिस्टम सिग्नल का मानक वक्र। कच्चे डेटा तालिका 1, एन = 3 में प्रस्तुत किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| [थियोफिलाइन] (mM) | परीक्षण 1 (ए450) | परीक्षण 2 (ए450) | परीक्षण 3 (ए450) | औसत (A450) |
| 3.125 | 0.342 | 0.318 | 0.39 | 0.350 ± 0.0299 |
| 0.625 | 0.321 | 0.303 | 0.317 | 0.314 ± 0.00772 |
| 0.125 | 0.263 | 0.264 | 0.287 | 0.271 ± 0.0111 |
| 0.025 | 0.221 | 0.215 | 0.234 | 0.223 ± 0.00793 |
| 0.005 | 0.168 | 0.167 | 0.184 | 0.173 ± 0.00779 |
| 0.001 | 0.134 | 0.115 | 0.138 | 0.129 ± 0.0100 |
| 0 | 0.107 | 0.104 | 0.117 | 0.109 ± 0.00556 |
| कोई राइबोजाइम नहीं | 0.095 | 0.088 | 0.129 | 0.104 ± 0.0179 |
तालिका 1: प्रतिनिधि थियोफिलाइन मानक वक्र कच्चे डेटा। रंग विकास के 30 मिनट के बाद थियोफिलाइन की विभिन्न सांद्रता का पता लगाने के लिए सिस्टम के परिणाम। नो-राइबोजाइम नमूनों का भी मूल्यांकन किया गया था, एन = 3।
पूरक तालिका 1: जीक्यू-एक्सपीआर सेटअप। प्रोटोकॉल में वर्णित जीक्यू-एक्सपीआर अभिकर्मक वॉल्यूम और अतिरिक्त के क्रम का सारांश। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक तालिका 2: जीक्यू-एक्सपीआर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम। पहचान प्रतिक्रियाओं में उपयोग किए जाने वाले डीएनए और आरएनए अणुओं के अनुक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहां प्रस्तुत विधि एक एलोस्टेरिक राइबोजाइम में शुरू में अव्यवस्थित माध्यमिक संरचना के बीच संक्रमण का लाभ उठाती है और सीआईएस-क्लीवरिंग हैमरहेड राइबोजाइम को सक्रिय करने के लिए लक्ष्य को एप्टामेरिक डोमेन में बांधने के माध्यम से प्रदान की जाने वाली अतिरिक्त स्थिरता का लाभ उठाती है। राइबोजाइम की स्थिरता को लक्ष्य की अनुपस्थिति में उत्प्रेरक गतिविधि को कम करने के लिए समायोजित किया गया था, जबकि सक्रिय संरचना को बहाल करने के लिए लक्ष्य बंधन की अनुमति दी गई थी। इसके अतिरिक्त, एक्सपीआर और रंग विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए आवश्यक कई एंजाइमों के बफर को संतुलित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। अंत में, यह देखते हुए कि यह एक 3-चरण प्रणाली है, प्रतिक्रिया घटकों की सांद्रता के साथ इनक्यूबेशन समय और तापमान के संयोजन का मतलब था कि शोर को कम करते हुए सिग्नल को अधिकतम करना कोई छोटी चुनौती नहीं थी।
राइबोजाइम (चरण 1) की तैयारी के दौरान, एप्टामेरिक डोमेन के लिए लक्ष्य बंधन स्व-क्लीवर राइबोजाइम की संरचना को स्थिर करता है। इसके बावजूद, राइबोजाइम एक बार राइबोजाइम बफर में पेश किए जाने के बाद छोड़ने में सक्षम होगा, यहां तक कि लक्ष्य की अनुपस्थिति में भी। इस प्रकार, पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए, बर्फ पर प्रतिक्रियाओं को रखना महत्वपूर्ण है जब तक कि वे परिभाषित इनक्यूबेशन के लिए तैयार न हों। एप्टामेरिक डोमेन के लिए लक्ष्य का सफल बंधन और परिणामस्वरूप दरार घटना दो दरार उत्पादों का उत्पादन करती है, जैसा कि चित्र 1, चरण 1 में दर्शाया गया है: स्टेम I का एक छोटा खंड और टर्मिनल चक्रीय फॉस्फेट8 के साथ स्टेम III का एक नया उजागर खंड। नमूना मिश्रण में मौजूद टी 4 पॉलीन्यूक्लियोटाइड काइनेज स्टेम III दरार उत्पाद से चक्रीय फॉस्फेट को हटा देता है, जो चरण 2 में प्रवर्धन प्रतिक्रिया के लिए प्राइमर के रूप में कार्य करता है। इस प्रणाली में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों की सांद्रता और मात्रा को पृष्ठभूमि संकेत बनाम विशिष्ट प्रतिक्रिया4 का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोगों के आधार पर अनुकूलित किया गया था और जो भी बिंदु परिवर्तन किए जाते हैं, उससे शुरू करने की आवश्यकता होगी। इसके अतिरिक्त, 3.125 एमएम थियोफिलाइन को मानक वक्र स्थापित करने के लिए उच्चतम एकाग्रता के रूप में अनुशंसित किया जाता है क्योंकि इस नमूने से उत्पन्न रंग विकास 450 एनएम (चित्रा 4) पर संभव अधिकतम अवशोषण के करीब है। सामान्य कम से कम वर्गों द्वारा एक नॉनलाइनियर प्रतिगमन का उपयोग जीक्यू-एक्सपीआर प्रणाली की इस तैयारी के लिए मानक वक्र निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
चरण 2 में किए गए जीक्यू-एक्सपीआर, दो डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करता है: एक जो स्टेम III क्लीवेज उत्पाद द्वारा प्रधान है और जी-चौगुनी का उत्पादन करता है, और एक जो जी-चौगुनी द्वारा प्रधान है और जी-चौगुनी पैदा करता है। पूर्व प्रतिक्रिया उत्तरार्द्ध की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण है, क्योंकि स्टेम III दरार उत्पाद को जी-चौगुनी में अनुवाद करना एक वर्णमिति आउटपुट का उत्पादन करने के लिए आवश्यक है, जबकि जी-चौगुनी आत्म-प्रवर्धन पहले से मौजूद सिग्नल को बढ़ाता है। बीएसटी 2.0 डीएनए पोलीमरेज़ आइसोथर्मल प्रवर्धन करता है और इसमें स्ट्रैंड-विस्थापन गतिविधि होती है, जबकि एनटी बीएसटीएनबीआई निकेस जी-चौगुनी अनुक्रम से पहले निकलता है ताकि बीएसटी 2.0 को पहले से उत्पन्न उत्पाद को विस्थापित करने और अधिक जी-चौगुनी एम्प्लिकॉन का उत्पादन करने की अनुमति मिल सके। बफर के + की आपूर्ति भी करता है, जो प्रवर्धन उत्पाद को सक्रिय जी-चौगुनी रूप में मोड़ने की अनुमति देता है। विभिन्न निकेस में बंधन और काटने के लिए अलग-अलग पहचान अनुक्रम होते हैं, और विशिष्ट एंजाइमों में अलग-अलग काटने की क्षमता होगी; निकिंग साइट में अनुक्रम को बदलने के लिए निकेस में बदलाव और चरण 2 को फिर से अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी।
चरण 3 में, जी-चौगुनी पेरोक्सीडेज गतिविधि के साथ डीएनएजाइम के रूप में कार्य कर सकते हैं, खासकर जब हेमिन7 से जुड़ा होता है। पेरोक्साइड की कमी को टीएमबी जैसे सब्सट्रेट के ऑक्सीकरण के साथ जोड़ा जाता है ताकि विज़ुअलाइज़ेशन या परिमाणीकरण के लिए एक पता लगाने योग्य संकेत का उत्पादन किया जा सके।
इस प्रणाली में मुख्य सीमा वह शोर है जो एलोस्टेरिक राइबोजाइम उत्पन्न कर सकता है। यद्यपि लक्ष्य की अनुपस्थिति में सक्रिय, स्व-क्विंग संरचना स्थिर नहीं है (इस मामले में, थियोफिलाइन), आरएनए के पास विभिन्न कॉन्फ़िगरेशन का नमूना लेने का अवसर है और अनजाने में सक्रियकॉन्फ़िगरेशन 4 तक पहुंच सकता है। यह, चरण 2 और चरण 3 में पाए जाने वाले सिग्नल के प्रवर्धन के साथ मिलकर, एक गलत सकारात्मक संकेत उत्पन्न कर सकता है। इस प्रकार, आरएनए, बफर और एंजाइम मात्रा के अनुकूलन के माध्यम से सिस्टम की गतिविधि को यथासंभव कम करना महत्वपूर्ण है, साथ ही आरएनए दरार घटनाओं के उत्पादन को सीमित करने के लिए इनक्यूबेशन समय और तापमान को कम करना है जो लक्ष्य-मध्यस्थता नहीं हैं।
जीक्यू-एक्सपीआर वर्कफ़्लो को अनुकूलित करने में कठिनाई के बावजूद, सिस्टम एक बार स्थापित होने के बाद काफी बहुमुखी हो सकता है। विभिन्न एपटामर-नियंत्रित एलोस्टेरिक राइबोजाइम की पहले ही पहचान की जा चुकी है9 और वांछित कार्यक्षमता 5 के लिए अनुकूलित किया जा सकताहै। एपटामर10 द्वारा मॉड्यूलेटेड एलोस्टेरिक डीएनएजाइम विकसित करने में भी प्रगति हुई है, जो इस मंच में एकीकृत किए जा सकने वाले रसायनज्ञों का विस्तार करती है। सिस्टम की लक्ष्य पहचान को बदलने के लिए इन विकल्पों का मूल्यांकन नहीं किया गया है और भविष्य के अध्ययनों का ध्यान केंद्रित किया जाएगा। इसके अतिरिक्त, सिस्टम के प्रमुख घटकों को विभिन्न गतिविधि आवश्यकताओं के साथ समकक्ष सामग्रियों के लिए आदान-प्रदान किया जा सकता है, जैसे कि पोलीमरेज़ के लिए कम इनक्यूबेशन तापमान या निकेज़ के लिए अलग-अलग पहचान अनुक्रम। इस प्रणाली का लचीलापन और मॉड्यूलरिटी इसे इनपुट की एक विस्तृत श्रृंखला के अनुकूल होने की अनुमति देती है।
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Disclosures
एप्टाजेन, एलएलसी उन लोगों के लिए एक जीक्यू-एक्सपीआर प्रदर्शन किट का निर्माण और विपणन करता है जो एपटामर-आधारित पहचान प्रणाली के साथ प्रत्यक्ष अनुभव चाहते हैं।
Acknowledgments
इस शोध को एप्टाजेन एलएलसी से अनुसंधान और विकास फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
References
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