يتم تسهيل الكشف عن الهدف القائم على Aptamer بواسطة تفاعل تضخيم أسي متساوي الحرارة G-quadruplex من 3 مراحل

Summary

يوضح البروتوكول الحالي استخدام مقايسة تضخيم أسي سريعة من 3 مراحل قائمة على aptamer للكشف عن الأهداف. يتم تغطية تحضير العينة وتضخيم الإشارة وتطوير اللون لتنفيذ هذا النظام للتعرف على وجود الثيوفيلين على الكافيين.

Abstract

الأبتامير هي جزيئات التعرف على الهدف التي ترتبط بتقارب وخصوصية عالية. يمكن الاستفادة من هذه الخصائص للتحكم في الجزيئات الأخرى ذات القدرة على توليد الإشارة. بالنسبة للنظام الموصوف هنا ، فإن التعرف على الهدف من خلال مجال aptameric ، Stem II من ريبوزيم رأس المطرقة المعدل ، ينشط الريبوزيم ذاتي الشق عن طريق تثبيت البنية غير المنظمة في البداية. يعمل الحمض النووي الريبي المشقوق لرابطة الدول المستقلة عند تقاطع الجذع الثالث والجذع الأول ، مما يخلق منتجين للانقسام. يقوم منتج الانقسام الأطول بإعداد تفاعل تضخيم أسي متساوي الحرارة (EXPAR) لاثنين من رباعيات G النشطة تحفيزيا المتشابهة. تحفز منتجات التضخيم الناتجة عن ذلك تقليل البيروكسيديز ، والذي يقترن بتقليل الركيزة اللونية بإخراج يمكن للعين المجردة اكتشافه. يعمل النظام المكون من 3 أجزاء الموصوف في الدراسة الحالية على تحسين طرق الكشف مثل مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) من خلال إنتاج إشارة يمكن اكتشافها بصريا للإشارة إلى وجود ما يصل إلى 0.5 ميكرومتر من الثيوفيلين في أقل من 15 دقيقة.

Introduction

عادة ما تكون الأبتامير عبارة عن حمض نووي أو حمض نووي ريبوزي أحادي الشريط يتم اختياره من خلال عملية تطورية ذات تقارب ارتباط عالي وخصوصية للأهداف المرجوة¹. بالإضافة إلى القدرة على الربط ، يمكن ربط aptamers بالزخارف والتحكم فيها باستخدام وظائف خرج الإشارة ^2,3 ، مما يؤدي إلى تضخيم الإشارة المذكورة وتحسين حساسية النظام. نظام تفاعل التضخيم الأسي متساوي الحرارة G-quadruplex (GQ-EXPAR) هو نظام من ثلاثة أجزاء (الشكل 1) يطور إشارة مرئية حيث تتم إضافة مكونات متتالية إلى وعاء تفاعل واحد لإنتاج ناتج مرئي⁴. يسمح هذا النظام بالكشف عن هدف محدد ، هنا الثيوفيلين ، في عينة معينة في غضون 15 دقيقة باستخدام سير عمل مبسط للسماح بالكشف السريع والمحدد عن هدف الاهتمام. يجب النظر في هذه الطريقة للعينات التي يكون فيها التحديد الكمي المحدد للتركيز المستهدف أقل إثارة للقلق من الخصوصية العالية للاستجابة في فترة زمنية قصيرة.

ينتج الريبوسويتش الخيفي ، وهو جزيء RNA لتبديل البنية (ريبوزيم) يخضع للانقسام الذاتي ، الإشارة الأولية. يعتمد هذا البناء على ريبوزيم رأس المطرقة ، مع إدخال مجال أبتاميري في Stem II كمنظم لنشاط الانقسام. يتم تنشيط وظيفة الانقسام الذاتي عندما يستقر مجاله aptameric عند الارتباط بهدفه⁵. خلاف ذلك ، يكون المفتاح غير نشط في حالته الأصلية.

يستخدم تفاعل التضخيم الأسي اللاحق (EXPAR) إطلاق شريط الحمض النووي الريبي المشقوق ذاتيا من المرحلة الأولى لتجهيز تفاعل تضخيم متساوي الحرارة⁶. يحتوي منتج التضخيم الخاص ب EXPAR على نشاط البيروكسيديز⁷ ، حيث يعمل كأساس للمرحلة الأخيرة من النظام. عندما تتأكسد بعض الركائز بالتزامن مع انهيار البيروكسيد ، فإنها تنتج ناتج فلورسنت يمكن قياسه على أجهزة مختلفة. يمكن استبدال الركائز الشائعة الأخرى لإنتاج منتج ملون للكشف البصري. EXPAR ونشاط البيروكسيديز لمنتجات التضخيم الخاصة به بمثابة محسن إشارة 2-stage ، وزيادة الحساسية لمستويات أعلى مقارنة بالاستراتيجيات التقليدية ^7,8.

يستخدم الكشف عن الثيوفيلين مقابل الكافيين كمثال على خصوصية منصة الكشف هذه ، حيث تختلف عن طريق مجموعة ميثيل واحدة فقط (الشكل 2). ينتج هذا العرض التوضيحي للنظام ناتجا لونيا للكشف البصري عن 500 نانومتر ثيوفيلين على الأقل.

Protocol

انظر الجدول التكميلي 1 (جدول إعداد التفاعل) لتحضير الأنبوب، بما في ذلك الأحجام والتركيزات المحددة لمكونات التفاعل. يستخدم البروتوكول الموضح هنا مجموعة منصات الكشف المجمعة مسبقا كما هو موضح في جدول المواد. يجب حفظ جميع المكونات على الجليد ما لم يذكر خلاف ذلك.

1. إعداد ريبوزيم

ملاحظة: مكون الكشف الأساسي هو ريبوزيم خيفي (منظم بالتامير) يتعرف على الثيوفيلين (انظر الجدول التكميلي 2).

1. اجمع 5 U من كيناز البولي نيوكليوتيد T4 (0.5 ميكرولتر ، انظر جدول المواد) في أنبوب PCR ، والذي سيتم استخدامه لتنشيط منتجات انقسام الريبوزيم.
   ملاحظة: تتم إضافة هذا المكون أولا حتى يتمكن المستخدم من رؤية التوزيع الصحيح للإنزيم.
2. أضف 1 ميكرولتر من محلول الريبوزيم 5x المعد مسبقا (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة (أنبوب PCR).
3. لأغراض إظهار الخصوصية بصريا ، أضف 1.5 ميكرولتر من 2 مللي مول ثيوفيلين (هدف) أو 2 مللي مول كافيين (تحكم) (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة كعينات اختبار.
   ملاحظة: لإنشاء منحنى قياسي ، يوصى بالبدء عند تحليل 3.125 mM واختبار التخفيفات بخمسة أضعاف حتى 0.001 mM.
4. امزج كل أنبوب عينة جيدا عن طريق سحب 5-10 مرات.
5. أضف 2 ميكرولتر من 600 نانومتر من الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على مجال aptameric خاص بالهدف (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة لعمل تركيز نهائي قدره 240 نانومتر في 5 ميكرولتر من محلول الاختبار ، ثم اخلطه بسرعة عن طريق السحب ووضعه على كتلة باردة لتقليل إشارة الخلفية.
   ملاحظة: من المهم في البداية تحضير جميع التفاعلات بدون ريبوزيم ، حيث سيبدأ تفاعل الانقسام الذاتي على الفور عندما يتم دمج الريبوزيم مع محلول الريبوزيم وقد ينتج خلفية مهمة.
6. بمجرد تحضير جميع أنابيب التفاعل ، احتضان كل عينة (5 ميكرولتر) في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) لمدة 3 دقائق بالضبط باستخدام جهاز توقيت. أعد أنابيب العينة على الفور إلى الثلج (4 درجات مئوية) بعد الحضانة.

2. جي كيو إكسبار

1. أضف 3.5 ميكرولتر من خليط إنزيم نيكاز بوليميراز (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة واخلطه جيدا.
   ملاحظة: تعتمد تركيزات الإنزيم المطلوبة على تسلسل التعرف وأنواع الإنزيمات ودرجات حرارة التفاعل ، والتي تم تحديد مزيجها تجريبيا.
2. أضف 31.5 ميكرولتر من خليط تفاعل EXPAR الذي يحتوي على قالب ونيوكليوتيدات ومخزن تفاعل (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة وماصة للخلط.
   ملاحظة: يتم تحسين تركيزات المكونات بناء على إنزيمات وتسلسلات منتجات البلمرة.
3. بمجرد تحضير جميع العينات ، احتضان كل عينة محضرة (40 ميكرولتر) عند 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق بالضبط باستخدام جهاز توقيت. إذا أمكن ، احتضان على thermocycler ، على الرغم من أن غطاء ساخن غير ضروري.
4. أعد أنابيب العينة على الفور إلى الثلج (4 درجات مئوية) بعد خطوة الحضانة.

3. تطوير اللون

1. أضف 2 ميكرولتر من محلول Hemin (25 ميكرومتر ، انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة واخلطه جيدا.
2. أضف 58 ميكرولتر من محلول TMB المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة واخلطه جيدا.
3. احتضان تفاعل تطور اللون (100 ميكرولتر) في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق على الأقل وحتى 30 دقيقة.
   ملاحظة: (اختياري) يمكن إيقاف تطور اللون بإضافة 20 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 2 متر.
4. اقرأ العينات نوعيا بالعين ، أو حدد النتائج باستخدام قارئ لوحة الامتصاص عند 450 نانومتر إذا تم إيقاف تفاعلات تطور اللون باستخدام حمض الكبريتيك.

Representative Results

تقوم منصة الكشف الموضحة في الشكل 1 بتحويل التعرف على الهدف aptameric إلى اختلافات متميزة بصريا بين مستحضرات العينة (الهدف مقابل غير الهدف ، الشكل 2) في فترة زمنية قصيرة. كان الريبوزيم الخيفي الذي حدده Soukup et ^al.5 بمثابة نقطة انطلاق لإنشاء تسلسل أقل ضوضاء مع الاستجابة للهدف على العينات الضابطة والسالبة. كان البناء الأمثل قادرا على التعرف على أقل من 500 نانومتر من الثيوفيلين في 30 دقيقة (الشكل 3) - تنتج مستحضرات العينة المعرضة للهدف لونا أزرق في الخطوة 3 ، بينما تظل العينات التي لا تحتوي على هدف عديمة اللون. إذا لزم الأمر ، يمكن قياس هذه النتائج عن طريق إيقاف تفاعل تطور اللون أولا كما هو موضح في الخطوة 3.4 ، ثم قراءة امتصاص المنتج الناتج عند 450 نانومتر لقياس التركيز الأولي للهدف الحالي. يتم عرض النتائج النموذجية لهذه العملية في الجدول 1 ، والتي يمكن تركيبها على الانحدار غير الخطي لتقدير تركيز الهدف الموجود في العينة الأولية كميا (الشكل 4).

الشكل 1: نظام GQ-EXPAR. آليات نظام الكشف وتضخيم الإشارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: هدف أبتامير والهدف المضاد. التركيب الجزيئي للثيوفيلين (الهدف) والكافيين (التحكم في الهدف المضاد) كدليل على الخصوصية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: النتائج المرئية ل GQ-EXPAR. النتائج التمثيلية للنظام للكشف عن تركيزات مختلفة من الثيوفيلين بعد 3 دقائق و 30 دقيقة من تطور اللون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: منحنى الثيوفيلين القياسي التمثيلي. تم قياس المنحنى القياسي لإشارة النظام عند A450 بعد 30 دقيقة من تطور اللون. يتم عرض البيانات الأولية في الجدول 1 ، N = 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

[ثيوفيلين] (ط م)	نسخة تجريبية مؤقتة 1 (A450)	نسخة تجريبية مؤقتة 2 (A450)	نسخة تجريبية مؤقتة 3 (A450)	المعدل (أ450)
3.125	0.342	0.318	0.39	0.350 ± 0.0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0.314 ± 0.00772
0.125	0.263	0.264	0.287	0.271 ± 0.0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0.223 ± 0.00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0.173 ± 0.00779
0.001	0.134	0.115	0.138	0.129 ± 0.0100
0	0.107	0.104	0.117	0.109 ± 0.00556
لا ريبوزيم	0.095	0.088	0.129	0.104 ± 0.0179

الجدول 1: البيانات الخام لمنحنى الثيوفيلين القياسي التمثيلي. نتائج نظام الكشف عن تركيزات مختلفة من الثيوفيلين بعد 30 دقيقة من تطور اللون. كما تم تقييم عينات خالية من الريبوزيم ، N = 3.

الجدول التكميلي 1: إعداد GQ-EXPAR. ملخص لأحجام كاشف GQ-EXPAR وترتيب الإضافة كما هو موضح في البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: تسلسل قليل النوكليوتيدات GQ-EXPAR. تسلسل جزيئات الحمض النووي والحمض النووي الريبي المستخدمة في تفاعلات الكشف. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تستفيد الطريقة المعروضة هنا من الانتقال بين بنية ثانوية مضطربة في البداية في ريبوزيم خيفي والاستقرار الإضافي الممنوح من خلال ربط الهدف بالمجال الأبتاميري لتنشيط ريبوزيم رأس المطرقة المشقوق لرابطة الدول المستقلة. تم تعديل استقرار الريبوزيم لتقليل النشاط التحفيزي في غياب الهدف مع السماح لربط الهدف باستعادة البنية النشطة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب توخي الحذر لتحقيق التوازن بين المخازن المؤقتة للإنزيمات المتعددة المطلوبة لتسهيل EXPAR وتطوير اللون. أخيرا ، بالنظر إلى أن هذا نظام من 3 مراحل ، فإن الجمع بين أوقات الحضانة ودرجات الحرارة جنبا إلى جنب مع تركيزات مكونات التفاعل يعني أن تعظيم الإشارة مع تقليل الضوضاء لم يكن تحديا صغيرا.

أثناء تحضير الريبوزيم (الخطوة 1) ، يعمل الارتباط المستهدف بمجال aptameric على استقرار بنية الريبوزيم ذاتي الشق. على الرغم من ذلك ، سيكون الريبوزيم قادرا على الشق بمجرد إدخاله إلى المخزن المؤقت للريبوزيم ، حتى في حالة عدم وجود هدف. وبالتالي ، لتقليل إشارة الخلفية ، من الضروري الحفاظ على التفاعلات على الجليد حتى تصبح جاهزة للحضانة المحددة. ينتج عن الارتباط الناجح للهدف بالمجال الأبتاميري وحدث الانقسام الناتج ناتجين من الانقسام ، كما هو موضح في الشكل 1 ، المرحلة 1: جزء قصير من الجذع الأول وجزء مكشوف حديثا من الجذع الثالث مع فوسفات دوري طرفي⁸. يزيل كيناز بولي نيوكليوتيد T4 الموجود في مزيج العينة الفوسفات الدوري من منتج الانقسام Stem III ، والذي يعمل كأساس لتفاعل التضخيم في المرحلة 2. تم تحسين تركيزات وأحجام الكواشف المستخدمة في هذا النظام بناء على تجارب لتقييم إشارة الخلفية مقابل الاستجابة المحددة⁴ وستحتاج إلى تحسينها بدءا من أي نقطة يتم إجراء تغييرات. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى باستخدام 3.125 mM Theophylline كأعلى تركيز لإنشاء منحنى قياسي حيث أن تطور اللون الناتج عن هذه العينة قريب من أقصى امتصاص ممكن عند 450 نانومتر (الشكل 4). يتم استخدام الانحدار غير الخطي بواسطة المربعات الصغرى العادية لتحديد المنحنى القياسي لهذا الإعداد لنظام GQ-EXPAR.

يستخدم GQ-EXPAR ، الذي تم تنفيذه في الخطوة 2 ، نموذجين للحمض النووي: أحدهما يتم تحضيره بواسطة منتج الانقسام Stem III وينتج G-quadruplex ، والآخر يتم تحضيره بواسطة G-quadruplex وينتج G-quadruplex. التفاعل الأول أكثر أهمية من الأخير ، حيث أن ترجمة منتج الانقسام Stem III إلى G-quadruplexes ضروري لإنتاج ناتج قياس لوني ، بينما يزيد التضخيم الذاتي G-quadruplex من الإشارة الموجودة بالفعل. يقوم بوليميراز الحمض النووي Bst 2.0 بالتضخيم متساوي الحرارة وله نشاط إزاحة الشريط ، بينما يشق Nt. BstNBI nickase قبل تسلسل G-quadruplex للسماح ل Bst 2.0 بإزاحة المنتج الذي تم إنشاؤه مسبقا وإنتاج المزيد من G-quadruplex amplicon. يوفر المخزن المؤقت أيضا K ⁺ ، مما يسمح لمنتج التضخيم بالطي في شكل G-quadruplex النشط. تحتوي النيكات المختلفة على تسلسلات التعرف المختلفة للربط والقطع ، وسيكون للإنزيمات المحددة كفاءات قطع مختلفة ؛ سيتطلب تغيير التسلسل في موقع التعرف / النك تغييرا في Nickase وإعادة تحسين الخطوة 2.

في الخطوة 3 ، يمكن أن تعمل G-quadruplexes كإنزيمات DNAzymes مع نشاط البيروكسيديز ، خاصة عندما ترتبط بالهيمين⁷. يقترن اختزال البيروكسيد بأكسدة الركيزة مثل TMB لإنتاج إشارة يمكن اكتشافها للتصور أو القياس الكمي.

القيد الرئيسي في هذا النظام هو الضوضاء التي يمكن أن يولدها الريبوزيم الخيفي. على الرغم من أن البنية النشطة ذاتية الشق غير مستقرة في غياب الهدف (في هذه الحالة ، الثيوفيلين) ، فإن الحمض النووي الريبي لديه الفرصة لأخذ عينات من تكوينات مختلفة ويمكنه الوصول عن غير قصد إلى التكوين النشط⁴. هذا ، جنبا إلى جنب مع تضخيم الإشارة الموجودة في المرحلة 2 والمرحلة 3 ، يمكن أن يولد إشارة إيجابية خاطئة. وبالتالي ، من الضروري تقليل نشاط النظام قدر الإمكان من خلال تحسين كميات الحمض النووي الريبي والمخزن المؤقت والإنزيم ، بالإضافة إلى تقليل أوقات الحضانة ودرجات الحرارة للحد من إنتاج أحداث انقسام الحمض النووي الريبي التي لا يتم التوسط فيها بالهدف.

على الرغم من صعوبة تحسين سير عمل GQ-EXPAR ، يمكن أن يكون النظام متعدد الاستخدامات بمجرد إنشائه. تم بالفعل تحديد العديد من الريبوزيمات الخيفية التي يتم التحكم فيها بواسطة aptamer⁹ ويمكن تحسينها للوظيفة المطلوبة⁵. كما تم إحراز تقدم في تطوير إنزيمات الحمض النووي الخيفي المعدلة بواسطة aptamers¹⁰ ، مما أدى إلى توسيع الكيمياء التي يمكن دمجها في هذه المنصة. لم يتم تقييم هذه الخيارات لتغيير التعرف على الهدف للنظام وستكون محور الدراسات المستقبلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استبدال المكونات الرئيسية للنظام بمواد مكافئة ذات متطلبات نشاط مختلفة ، مثل درجات حرارة حضانة أقل للبوليميراز أو تسلسلات التعرف المختلفة للنيكاز. تسمح مرونة ونمطية هذا النظام بالتكيف مع مجموعة واسعة من المدخلات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.