Aptamerbaserad måldetektering underlättad av en 3-stegs G-quadruplex isotermisk exponentiell förstärkningsreaktion

Summary

Det nuvarande protokollet demonstrerar användningen av en snabb, 3-stegs, aptamerbaserad exponentiell förstärkningsanalys för att detektera mål. Provberedning, signalförstärkning och färgutveckling omfattas för att implementera detta system för att känna igen närvaron av teofyllin över koffein.

Abstract

Aptamerer är måligenkänningsmolekyler som binder med hög affinitet och specificitet. Dessa egenskaper kan utnyttjas för att styra andra molekyler med signalgenereringskapacitet. För det system som beskrivs häri aktiverar måligenkänning genom en aptamerisk domän, stam II av ett modifierat hammarhuvudribozym, det självklyvande ribozymet genom att stabilisera den initialt ostrukturerade konstruktionen. Cis-klyvande RNA verkar vid korsningen av stam III och stam I, vilket skapar två klyvningsprodukter. Den längre klyvningsprodukten primar en isotermisk exponentiell förstärkningsreaktion (EXPAR) av de två liknande katalytiskt aktiva G-quadruplexerna. De resulterande amplifieringsprodukterna katalyserar peroxidasreduktion, som är kopplad till reduktionen av ett kolorimetriskt substrat med en utgång som blotta ögat kan detektera. Det 3-delade systemet som beskrivs i den aktuella studien förbättrar detektionsmodaliteter såsom enzymbundna immunosorbentanalyser (ELISA) genom att producera en visuellt detekterbar signal för att indikera närvaron av så lågt som 0,5 μM teofyllin på så lite som 15 minuter.

Introduction

Aptamerer är typiskt enkelsträngat DNA eller RNA som valts genom en evolutionär process med hög bindningsaffinitet och specificitet till de önskade målen¹. Förutom bindningsförmåga kan aptamerer kopplas till och styra motiv med signalutgångsfunktioner^2,3, förstärka nämnda signal och förbättra systemets känslighet. G-quadruplex isotermisk exponentiell förstärkningsreaktion (GQ-EXPAR) -systemet är ett tredelat system (figur 1) som utvecklar en visuell signal när successiva komponenter läggs till ett enda reaktionskärl för att producera en visuell utgång⁴. Detta system möjliggör detektering av ett specifikt mål, här teofyllin, i ett givet prov inom 15 minuter med hjälp av ett strömlinjeformat arbetsflöde för att möjliggöra snabb, specifik detektering av ett mål av intresse. Denna metod måste övervägas för prover där en specifik kvantifiering av målkoncentrationen ger mindre anledning till oro än en hög specificitet hos responsen på kort tid.

En allosterisk riboswitch, en strukturomsättande RNA-molekyl (ribozym) som genomgår självklyvning, producerar den initiala signalen. Denna konstruktion är baserad på hammarhuvudet ribozym, med en aptamera domän introducerad i stam II som en regulator för klyvningsaktivitet. Dess självklyvningsfunktion aktiveras när dess aptamera domän stabiliseras vid bindning till dess mål⁵. Annars är växeln inaktiv i sitt ursprungliga tillstånd.

Den efterföljande exponentiella förstärkningsreaktionen (EXPAR) använder frisättningen av den självklyvda RNA-strängen från det första steget för att prima en isotermisk förstärkningsreaktion⁶. Förstärkningsprodukten av EXPAR har peroxidasaktivitet⁷, som fungerar som grund för det sista steget i systemet. När vissa substrat oxideras i samband med peroxidnedbrytning producerar de en fluorescerande utgång som kan mätas på olika instrument. Andra vanliga substrat kan ersättas för att producera en färgad produkt för visuell detektering. EXPAR och peroxidasaktiviteten hos dess förstärkningsprodukter fungerar som en 2-stegs signalförstärkare, vilket ökar känsligheten för högre nivåer jämfört med konventionella strategier ^7,8.

Detektionen av teofyllin kontra koffein används som ett exempel på specificiteten hos denna detektionsplattform, eftersom de skiljer sig åt med endast en enda metylgrupp (figur 2). Denna demonstration av systemet ger en kolorimetrisk utgång för visuell detektion av minst 500 nM teofyllin.

Protocol

Se kompletterande tabell 1 (reaktionsuppställningstabellen) för rörberedning, inklusive specifika volymer och koncentrationer av reaktionskomponenterna. Protokollet som visas här använder en förmonterad detekteringsplattformssats enligt beskrivningen i materialtabellen. Alla komponenter måste hållas på is om inte annat anges.

1. Beredning av ribozym

OBS: Den primära detektionskomponenten är ett allosteriskt (aptamerreglerat) ribozym som känner igen teofyllin (se kompletterande tabell 2).

1. Samla upp 5 U T4-polynukleotidkinas (0,5 μl, se materialtabell) i ett PCR-rör, som kommer att användas för att aktivera ribozymklyvningsprodukterna.
   OBS: Denna komponent läggs till först så att användaren kan se korrekt dosering av enzymet.
2. Tillsätt 1 μL förberedd 5x ribozymbuffert (se materialförteckning) till varje provrör (PCR-rör).
3. För att visuellt påvisa specificiteten, tillsätt 1,5 μl 2 mM teofyllin (mål) eller 2 mM koffein (kontroll) (se materialförteckning) till varje provrör som testprover.
   OBS: För att fastställa en standardkurva rekommenderas att man börjar med 3,125 mM analyt och testar femfaldiga utspädningar tills 0,001 mM.
4. Blanda varje provrör noggrant genom pipettering 5-10 gånger.
5. Tillsätt 2 μL 600 nM RNA innehållande en aptamera domän som är specifik för målet (se materialtabell) till varje provrör för att göra en slutlig koncentration på 240 nM i 5 μL testlösning, blanda sedan snabbt genom pipettering och placera på ett kallt block för att minimera bakgrundssignalen.
   OBS: Det är viktigt att initialt förbereda alla reaktioner utan ribozym, eftersom självklyvningsreaktionen börjar omedelbart när ribozym kombineras med ribozymbuffert och kan ge signifikant bakgrund.
6. När alla reaktionsrör har beretts, inkubera varje prov (5 μl) vid rumstemperatur (23 °C) i exakt 3 minuter med hjälp av en timer. Sätt omedelbart tillbaka provrören i is (4 °C) efter inkubation.

2. GQ-EXPAR

1. Tillsätt 3,5 μL nickas-polymerasenzymblandning (se materialförteckning) till varje provrör och blanda väl.
   OBS: De erforderliga enzymkoncentrationerna beror på igenkänningssekvenserna, typerna av enzymer och reaktionstemperaturer, vars kombination bestämdes empiriskt.
2. Tillsätt 31,5 μl EXPAR-reaktionsblandning innehållande mall, nukleotider och reaktionsbuffert (se materialförteckning) till varje provrör och pipet för att blanda.
   OBS: Komponentkoncentrationerna optimeras baserat på enzymerna och sekvenserna i polymerasprodukterna.
3. När alla prover har beretts inkuberas varje berett prov (40 μl) vid 55 °C i exakt 5 minuter med hjälp av en timer. Om möjligt, inkubera på en termocykler, även om ett uppvärmt lock är onödigt.
4. Sätt omedelbart tillbaka provrören i is (4 °C) efter inkubationssteget.

3. Färgutveckling

1. Tillsätt 2 μL Hemin-lösning (25 uM, se Materialförteckning) till varje provrör och blanda väl.
2. Tillsätt 58 μl av den kommersiellt tillgängliga TMB-lösningen (se Materialförteckning) till varje provrör och blanda väl.
3. Inkubera färgutvecklingsreaktionen (100 μl) vid rumstemperatur i minst 3 minuter och upp till 30 minuter.
   OBS: (Valfritt) Färgutveckling kan stoppas genom tillsats av 20 μL 2 M svavelsyra.
4. Läs proverna kvalitativt med ögat, eller kvantifiera resultaten med hjälp av en absorbansplattläsare vid 450 nm om färgutvecklingsreaktionerna stoppas med svavelsyra.

Representative Results

Detektionsplattformen som visas i figur 1 omvandlar aptamera måligenkänning till visuellt distinkta skillnader mellan provpreparaten (mål kontra icke-mål, figur 2) på kort tid. Ett allosteriskt ribozym identifierat av Soukup et ^al.5 fungerade som utgångspunkt för att skapa en mindre bullrig sekvens med svar på målet över kontrollen och negativa prover. Den optimerade konstruktionen kunde känna igen så lite som 500 nM teofyllin i 30 min (figur 3) - provpreparat exponerade för målet ger en blå färg i steg 3, medan prover som inte innehåller något mål förblir färglösa. Vid behov kan dessa resultat kvantifieras genom att först stoppa färgutvecklingsreaktionen enligt beskrivningen i steg 3.4 och sedan läsa av absorbansen hos den resulterande produkten vid 450 nm för att mäta den initiala koncentrationen av det närvarande målet. Typiska resultat av denna process presenteras i tabell 1, som kan anpassas till en icke-linjär regression för att kvantitativt uppskatta koncentrationen av målet i det ursprungliga provet (figur 4).

Figur 1: GQ-EXPAR-systemet. Mekanismer för detekterings- och signalförstärkningssystemet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Aptamermål och motmål. Molekylär struktur av teofyllin (mål) och koffein (motmålskontroll) som en demonstration av specificitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Visuella GQ-EXPAR-resultat. Representativa resultat av systemet för detektering av olika koncentrationer av teofyllin efter 3 min och 30 min färgutveckling. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Representativ standardkurva för teofyllin. Standardkurva för systemsignalen uppmätt vid A450 efter 30 minuters färgutveckling. Rådata presenteras i tabell 1, N = 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.

[Teofyllin] (mM)	Rättegång 1 (A450)	Prövning 2 (A450)	Prövning 3 (A450)	Genomsnitt (A450)
3.125	0.342	0.318	0.39	0,350 ± 0,0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0,314 ± 0,00772
0.125	0.263	0.264	0.287	0,271 ± 0,0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0,223 ± 0,00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0,173 ± 0,00779
0.001	0.134	0.115	0.138	0,129 ± 0,0100
0	0.107	0.104	0.117	0,109 ± 0,00556
Ingen Ribozyme	0.095	0.088	0.129	0,104 ± 0,0179

Tabell 1: Representativa rådata för teofyllinstandardkurvan. Resultat av systemet för detektering av olika koncentrationer av teofyllin efter 30 minuters färgutveckling. No-ribozymprover bedömdes också, N = 3.

Kompletterande tabell 1: GQ-EXPAR-inställning. Sammanfattning av GQ-EXPAR-reagensvolymerna och additionsordningen enligt beskrivningen i protokollet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 2: GQ-EXPAR-oligonukleotidsekvenser. Sekvenser av de DNA- och RNA-molekyler som används i detektionsreaktionerna. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Metoden som presenteras här utnyttjar övergången mellan en initialt oordnad sekundär struktur i ett allosteriskt ribozym och den ytterligare stabilitet som ges genom bindningen av målet till den aptamera domänen för att aktivera cis-klyvande hammarhuvudribozym. Ribozymets stabilitet justerades för att minimera katalytisk aktivitet i frånvaro av målet samtidigt som målbindningen kunde återställa den aktiva strukturen. Dessutom måste man vara noga med att balansera buffertarna av de flera enzymer som krävs för att underlätta EXPAR och färgutveckling. Slutligen, med tanke på att detta är ett 3-stegssystem, innebar kombinationen av inkubationstider och temperaturer tillsammans med koncentrationerna av reaktionskomponenterna att maximera signalen samtidigt som bruset minimerades inte var någon liten utmaning.

Under beredningen av ribozymet (steg 1) stabiliserar målbindningen till den aptamera domänen strukturen hos det självklyvande ribozymet. Trots detta kommer ribozymet att kunna klyva en gång introducerat till ribozymbufferten, även i frånvaro av ett mål. För att minimera bakgrundssignalen är det därför viktigt att hålla reaktionerna på is tills de är redo för den definierade inkubationen. Den framgångsrika bindningen av målet till den aptamera domänen och den resulterande klyvningshändelsen ger två klyvningsprodukter, som visas i figur 1, steg 1: ett kort segment av stam I och ett nyligen exponerat segment av stam III med ett terminalt cykliskt fosfat⁸. T4-polynukleotidkinas som finns i provblandningen avlägsnar det cykliska fosfatet från stam III-klyvningsprodukten, som fungerar som en primer för amplifieringsreaktionen i steg 2. Koncentrationerna och volymerna av reagenserna som används i detta system optimerades baserat på experiment för att utvärdera bakgrundssignalen kontra specifikt svar⁴ och måste optimeras från vilken punkt ändringar som görs. Dessutom rekommenderas 3,125 mM teofyllin som den högsta koncentrationen för att fastställa en standardkurva eftersom färgutvecklingen från detta prov ligger nära den maximala absorptionen som är möjlig vid 450 nm (figur 4). En icke-linjär regression med vanliga minsta kvadrater används för att bestämma standardkurvan för denna beredning av GQ-EXPAR-systemet.

GQ-EXPAR, som utfördes i steg 2, använder två DNA-mallar: en som grundas av stam III-klyvningsprodukten och producerar G-quadruplex, och en som grundas av G-quadruplex och producerar G-quadruplex. Den förra reaktionen är viktigare än den senare, eftersom översättning av stam III-klyvningsprodukten till G-quadruplexes är nödvändig för att producera en kolorimetrisk utgång, medan G-quadruplex självförstärkning ökar signalen som redan finns. Bst 2.0 DNA-polymeras utför den isotermiska amplifieringen och har strängförskjutningsaktivitet, medan Nt. BstNBI nickas klyver före G-quadruplex-sekvensen för att tillåta Bst 2.0 att förskjuta den tidigare genererade produkten och producera mer G-quadruplex-amplikon. Bufferten levererar också K⁺, vilket gör att förstärkningsprodukten kan vikas in i den aktiva G-quadruplex-formen. Olika nickaser har olika igenkänningssekvenser för bindning och skärning, och specifika enzymer kommer att ha olika skäreffektivitet; Att ändra sekvensen på igenkännings-/nicking-webbplatsen kräver en ändring i Nickase och omoptimering av steg 2.

I steg 3 kan G-quadruplexes fungera som DNAzymer med peroxidasaktivitet, särskilt när de är associerade med hemin⁷. Reduktionen av peroxid är kopplad till oxidation av substratet såsom TMB för att producera en detekterbar signal för visualisering eller kvantifiering.

Den viktigaste begränsningen i detta system är det brus som allosterisk ribozym kan generera. Även om den aktiva, självklyvande strukturen inte är stabil i frånvaro av målet (i detta fall teofyllin), har RNA möjlighet att prova olika konfigurationer och kan oavsiktligt komma åt den aktiva konfigurationen⁴. Detta, i kombination med förstärkningen av signalen som finns i steg 2 och steg 3, kan generera en falsk positiv signal. Det är därför viktigt att minska systemets aktivitet så mycket som möjligt genom optimering av RNA-, buffert- och enzymmängderna, samt minimera inkubationstiderna och temperaturerna för att begränsa produktionen av RNA-klyvningshändelser som inte är målmedierade.

Trots svårigheten att optimera ett GQ-EXPAR-arbetsflöde kan systemet vara ganska mångsidigt när det väl är etablerat. Olika aptamerkontrollerade allosteriska ribozymer har redan identifierats⁹ och kan optimeras för önskad funktionalitet⁵. Framsteg har också gjorts när det gäller att utveckla allosteriska DNAzymer modulerade av aptamerer¹⁰, vilket utökar kemierna som kan integreras i denna plattform. Dessa alternativ för att ändra systemets måligenkänning har inte utvärderats och kommer att vara i fokus för framtida studier. Dessutom kan nyckelkomponenter i systemet bytas ut mot likvärdiga material med olika aktivitetskrav, såsom lägre inkubationstemperaturer för polymeraset eller olika igenkänningssekvenser för nickaset. Flexibiliteten och modulariteten hos detta system gör det möjligt att anpassa sig till ett brett spektrum av ingångar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.