Détection de cible basée sur des aptamères facilitée par une réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex en 3 étapes

Summary

Le présent protocole démontre l’utilisation d’un test d’amplification exponentielle rapide en 3 étapes, basé sur des aptamères, pour détecter des cibles. La préparation des échantillons, l’amplification du signal et le développement de la couleur sont couverts pour mettre en œuvre ce système afin de reconnaître la présence de théophylline par rapport à celle de la caféine.

Abstract

Les aptamères sont des molécules de reconnaissance de cibles qui se lient avec une affinité et une spécificité élevées. Ces caractéristiques peuvent être exploitées pour contrôler d’autres molécules ayant une capacité de génération de signal. Pour le système décrit ici, la reconnaissance de cible par un domaine aptamérique, Stem II d’un ribozyme à tête de marteau modifié, active le ribozyme auto-clivant en stabilisant la construction initialement non structurée. L’ARN clivant le cis agit à la jonction de la tige III et de la tige I, créant deux produits de clivage. Le produit de clivage plus long amorce une réaction d’amplification exponentielle isotherme (EXPAR) des deux G-quadruplexes catalytiquement actifs similaires. Ces produits d’amplification qui en résultent catalysent la réduction de la peroxydase, qui est couplée à la réduction d’un substrat colorimétrique avec une sortie que l’œil nu peut détecter. Le système en 3 parties décrit dans la présente étude améliore les modalités de détection telles que les tests immuno-enzymatiques (ELISA) en produisant un signal visuellement détectable pour indiquer la présence de théophylline aussi faible que 0,5 μM en aussi peu que 15 minutes.

Introduction

Les aptamères sont généralement de l’ADN ou de l’ARN simple brin sélectionnés par un processus évolutif avec une affinité et une spécificité de liaison élevées pour les cibles souhaitées¹. En plus de la capacité de liaison, les aptamères peuvent être reliés et contrôler des motifs avec des fonctions signal-sortie^2,3, amplifiant ledit signal et améliorant la sensibilité du système. Le système de réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex (GQ-EXPAR) est un système en trois parties (Figure 1) qui développe un signal visuel lorsque des composants successifs sont ajoutés à une seule cuve de réaction pour produire une sortie visuelle⁴. Ce système permet la détection d’une cible spécifique, la théophylline, dans un échantillon donné en 15 minutes en utilisant un flux de travail rationalisé pour permettre une détection rapide et spécifique d’une cible d’intérêt. Cette méthode doit être envisagée pour les échantillons pour lesquels la quantification spécifique de la concentration cible est moins préoccupante que la spécificité élevée de la réponse dans un court laps de temps.

Un riboswitch allostérique, une molécule d’ARN à changement de structure (ribozyme) qui subit un auto-clivage, produit le signal initial. Cette construction est basée sur le ribozyme requin-marteau, avec un domaine aptamique introduit dans Stem II comme régulateur de l’activité de clivage. Sa fonction d’auto-clivage est activée lorsque son domaine aptamique est stabilisé lors de la liaison à sa cible⁵. Sinon, le commutateur est inactif dans son état natif.

La réaction d’amplification exponentielle suivante (EXPAR) utilise la libération du brin d’ARN auto-clivé du premier étage pour amorcer une réaction d’amplification isotherme⁶. Le produit d’amplification d’EXPAR a une activité peroxydase⁷, servant de base à la dernière étape du système. Lorsque certains substrats sont oxydés en conjonction avec la dégradation du peroxyde, ils produisent une sortie fluorescente qui peut être mesurée sur divers instruments. D’autres substrats courants peuvent être substitués pour produire un produit coloré pour la détection visuelle. EXPAR et l’activité peroxydase de ses produits d’amplification agissent comme un amplificateur de signal à 2 étages, augmentant la sensibilité à des niveaux plus élevés par rapport aux stratégies conventionnelles ^7,8.

La détection de la théophylline par rapport à la caféine est utilisée comme exemple de la spécificité de cette plateforme de détection, car ils ne diffèrent que par un seul groupe méthyle (Figure 2). Cette démonstration du système produit une sortie colorimétrique pour la détection visuelle d’au moins 500 nM de théophylline.

Protocol

Voir le tableau supplémentaire 1 (tableau de configuration de la réaction) pour la préparation des tubes, y compris les volumes et concentrations spécifiques des composants de la réaction. Le protocole illustré ici utilise un kit de plate-forme de détection préassemblé tel que décrit dans le tableau des matériaux. Tous les composants doivent être conservés sur la glace, sauf indication contraire.

1. Préparation du ribozyme

REMARQUE : La principale composante de détection est un ribozyme allostérique (régulé par aptamère) reconnaissant la théophylline (voir le tableau supplémentaire 2).

1. Recueillir 5 U de polynucléotide kinase T4 (0,5 μL, voir le tableau des matériaux) dans un tube de PCR, qui sera utilisé pour activer les produits de clivage du ribozyme.
   REMARQUE: Ce composant est ajouté en premier afin que l’utilisateur puisse voir la distribution correcte de l’enzyme.
2. Ajouter 1 μL de tampon de ribozyme 5x prépréparé (voir le tableau des matériaux) à chaque tube à échantillon (tube PCR).
3. Afin de démontrer visuellement la spécificité, ajouter 1,5 μL de théophylline 2 mM (cible) ou 2 mM de caféine (témoin) (voir le tableau des matériaux) à chaque tube à échantillon comme échantillons d’essai.
   NOTA: Pour établir une courbe standard, il est recommandé de commencer à 3,125 mM d’analyte et d’effectuer des essais de dilutions quintuples jusqu’à 0,001 mM.
4. Bien mélanger chaque tube d’échantillon en pipetant 5 à 10 fois.
5. Ajouter 2 μL d’ARN de 600 nM contenant un domaine aptamique spécifique à la cible (voir le tableau des matériaux) à chaque tube d’échantillon pour obtenir une concentration finale de 240 nM dans 5 μL de solution d’essai, puis mélanger rapidement par pipetage et placer sur un bloc froid pour minimiser le signal de fond.
   NOTE: il est important de préparer initialement toutes les réactions sans ribozyme, car la réaction d’auto-clivage commencera immédiatement lorsque le ribozyme est combiné avec le tampon ribozyme et peut produire un fond significatif.
6. Une fois tous les tubes de réaction préparés, incuber chaque échantillon (5 μL) à température ambiante (23 °C) pendant exactement 3 minutes à l’aide d’une minuterie. Remettre immédiatement les tubes à échantillon dans la glace (4 °C) après l’incubation.

2. GQ-EXPAR

1. Ajouter 3,5 μL de mélange enzymatique nickase-polymérase (voir le tableau des matières) à chaque tube à échantillon et bien mélanger.
   NOTE: Les concentrations enzymatiques requises dépendent des séquences de reconnaissance, des types d’enzymes et des températures de réaction, dont la combinaison a été déterminée empiriquement.
2. Ajouter 31,5 μL de mélange réactionnel EXPAR contenant un gabarit, des nucléotides et un tampon de réaction (voir le tableau des matériaux) à chaque tube d’échantillon et pipette à mélanger.
   NOTE: Les concentrations des composants sont optimisées en fonction des enzymes et des séquences des produits polymérases.
3. Une fois tous les échantillons préparés, incuber chaque échantillon préparé (40 μL) à 55 °C pendant exactement 5 minutes à l’aide d’une minuterie. Si possible, incuber sur un thermocycleur, bien qu’un couvercle chauffant ne soit pas nécessaire.
4. Remettre immédiatement les tubes à échantillon dans la glace (4 °C) après l’étape d’incubation.

3. Développement des couleurs

1. Ajouter 2 μL de solution d’Hemin (25 uM, voir le tableau des matériaux) à chaque tube à échantillon et bien mélanger.
2. Ajouter 58 μL de la solution de TMB disponible dans le commerce (voir le tableau des matières) à chaque tube d’échantillon et bien mélanger.
3. Incuber la réaction de développement de la couleur (100 μL) à température ambiante pendant au moins 3 min et jusqu’à 30 min.
   REMARQUE: (Facultatif) Le développement de la couleur peut être arrêté en ajoutant 20 μL d’acide sulfurique 2 M.
4. Lire les échantillons qualitativement à l’œil nu, ou quantifier les résultats à l’aide d’un lecteur de plaque d’absorbance à 450 nm si les réactions de développement de la couleur sont arrêtées à l’aide d’acide sulfurique.

Representative Results

La plate-forme de détection représentée à la figure 1 convertit la reconnaissance de cibles aptamériques en différences visuellement distinctes entre les préparations d’échantillons (cibles et non cibles, figure 2) dans un court laps de temps. Un ribozyme allostérique identifié par Soukup et ^al.5 a servi de point de départ pour créer une séquence moins bruyante avec une réponse à la cible sur les échantillons témoins et négatifs. La construction optimisée a été capable de reconnaître aussi peu que 500 nM de théophylline en 30 min (Figure 3) - les préparations d’échantillons exposées à la cible produisent une couleur bleue à l’étape 3, tandis que les échantillons ne contenant aucune cible restent incolores. Si nécessaire, ces résultats peuvent être quantifiés en arrêtant d’abord la réaction de développement de la couleur décrite à l’étape 3.4, puis en lisant l’absorbance du produit résultant à 450 nm pour évaluer la concentration initiale de la cible présente. Les résultats typiques de ce processus sont présentés dans le tableau 1, qui peut être ajusté à une régression non linéaire pour estimer quantitativement la concentration de la cible présente dans l’échantillon initial (Figure 4).

Figure 1 : Le système GQ-EXPAR. Mécanismes du système de détection et d’amplification du signal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Cible et contre-cible aptamère. Structure moléculaire de la théophylline (cible) et de la caféine (contre-cible) comme démonstration de la spécificité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Résultats visuels de GQ-EXPAR. Résultats représentatifs du système de détection de diverses concentrations de théophylline après 3 min et 30 min de développement de couleur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Courbe standard représentative de la théophylline. Courbe standard du signal système mesurée à A450 après 30 min de développement des couleurs. Les données brutes sont présentées dans le tableau 1, N = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

[Théophylline] (mM)	Essai 1 (A450)	Version d’essai 2 (A450)	Version d’essai 3 (A450)	Moyenne (A450)
3.125	0.342	0.318	0.39	0,350 ± 0,0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0,314 ± 0,00772
0.125	0.263	0.264	0.287	0,271 ± 0,0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0,223 ± 0,00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0,173 ± 0,00779
0.001	0.134	0.115	0.138	0,129 ± 0,0100
0	0.107	0.104	0.117	0,109 ± 0,00556
Pas de Ribozyme	0.095	0.088	0.129	0,104 ± 0,0179

Tableau 1 : Données brutes représentatives de la courbe standard de théophylline. Résultats du système de détection de diverses concentrations de théophylline après 30 min de développement de couleur. Des échantillons sans ribozyme ont également été évalués, N = 3.

Tableau supplémentaire 1 : Configuration de GQ-EXPAR. Résumé des volumes de réactifs GQ-EXPAR et de l’ordre d’ajout tel que décrit dans le protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Séquences d’oligonucléotides GQ-EXPAR. Séquences des molécules d’ADN et d’ARN utilisées dans les réactions de détection. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La méthode présentée ici tire parti de la transition entre une structure secondaire initialement désordonnée dans un ribozyme allostérique et la stabilité supplémentaire conférée par la liaison de la cible au domaine aptamique pour activer le ribozyme à tête marteau clivant cis. La stabilité du ribozyme a été ajustée pour minimiser l’activité catalytique en l’absence de la cible tout en permettant à la liaison de la cible de restaurer la structure active. De plus, il faut veiller à équilibrer les tampons des multiples enzymes nécessaires pour faciliter l’EXPAR et le développement de la couleur. Enfin, étant donné qu’il s’agit d’un système à 3 étages, la combinaison des temps d’incubation et des températures ainsi que des concentrations des composants de réaction signifiait que maximiser le signal tout en minimisant le bruit n’était pas un mince défi.

Lors de la préparation du ribozyme (étape 1), la liaison cible au domaine aptamique stabilise la structure du ribozyme autoclivant. Malgré cela, le ribozyme sera capable de se cliver une fois introduit dans le tampon ribozyme, même en l’absence d’une cible. Ainsi, pour minimiser le signal de fond, il est essentiel de garder les réactions sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’incubation définie. La liaison réussie de la cible au domaine aptamique et l’événement de clivage qui en résulte produisent deux produits de clivage, comme le montre la figure 1, stade 1 : un court segment de tige I et un segment nouvellement exposé de la tige III avec un phosphate cyclique terminal⁸. La polynucléotide kinase T4 présente dans le mélange d’échantillons élimine le phosphate cyclique du produit de clivage de la tige III, qui agit comme amorce pour la réaction d’amplification au stade 2. Les concentrations et les volumes des réactifs utilisés dans ce système ont été optimisés sur la base d’expériences visant à évaluer le signal de fond par rapport à une réponse spécifique⁴ et devront être optimisés à partir de tous les changements ponctuels apportés. De plus, la théophylline de 3,125 mM est recommandée comme concentration la plus élevée pour établir une courbe standard, car le développement de la couleur résultant de cet échantillon est proche de l’absorption maximale possible à 450 nm (Figure 4). Une régression non linéaire par moindres carrés ordinaires est utilisée pour déterminer la courbe standard pour cette préparation du système GQ-EXPAR.

GQ-EXPAR, réalisé à l’étape 2, utilise deux modèles d’ADN : l’un qui est amorcé par le produit de clivage Stem III et produit G-quadruplex, et l’autre qui est amorcé par G-quadruplex et produit G-quadruplex. La première réaction est plus importante que la seconde, car la traduction du produit de clivage Stem III en G-quadruplexes est nécessaire pour produire une sortie colorimétrique, tandis que l’auto-amplification G-quadruplex augmente le signal déjà présent. L’ADN polymérase Bst 2.0 effectue l’amplification isotherme et a une activité de déplacement de brins, tandis que la nickase Nt. BstNBI se clive avant la séquence G-quadruplex pour permettre à Bst 2.0 de déplacer le produit généré précédemment et de produire plus d’amplicon G-quadruplex. Le tampon fournit également K⁺, ce qui permet au produit d’amplification de se replier dans la forme G-quadruplex active. Différentes nickases ont des séquences de reconnaissance différentes pour la liaison et la coupe, et des enzymes spécifiques auront des efficacités de coupe différentes; La modification de la séquence dans le site de reconnaissance/pseudo nécessitera une modification de la nickase et une réoptimisation de l’étape 2.

À l’étape 3, les G-quadruplexes peuvent fonctionner comme des ADNzymes avec une activité peroxydase, en particulier lorsqu’ils sont associés à l’hémine⁷. La réduction du peroxyde est couplée à l’oxydation du substrat tel que le TMB pour produire un signal détectable pour la visualisation ou la quantification.

La principale limitation de ce système est le bruit que le ribozyme allostérique peut générer. Bien que la structure active et auto-clivante ne soit pas stable en l’absence de la cible (dans ce cas, la théophylline), l’ARN a la possibilité d’échantillonner différentes configurations et peut accéder par inadvertance à la configuration active⁴. Ceci, combiné à l’amplification du signal trouvé dans les étapes 2 et 3, peut générer un signal faussement positif. Il est donc essentiel de réduire autant que possible l’activité du système en optimisant les quantités d’ARN, de tampon et d’enzymes, ainsi qu’en minimisant les temps et les températures d’incubation pour limiter la production d’événements de clivage de l’ARN qui ne sont pas médiés par la cible.

Malgré la difficulté d’optimiser un flux de travail GQ-EXPAR, le système peut être assez polyvalent une fois établi. Divers ribozymes allostériques contrôlés par aptamères ont déjà été identifiés⁹ et peuvent être optimisés pour la fonctionnalité souhaitée⁵. Des progrès ont également été réalisés dans le développement d’ADNzymes allostériques modulés par les aptamères¹⁰, élargissant les chimies pouvant être intégrées dans cette plateforme. Ces options pour modifier la reconnaissance cible du système n’ont pas été évaluées et feront l’objet d’études futures. De plus, les composants clés du système peuvent être échangés contre des matériaux équivalents avec des exigences d’activité différentes, telles que des températures d’incubation plus basses pour la polymérase ou différentes séquences de reconnaissance pour la nickase. La flexibilité et la modularité de ce système lui permettent de s’adapter à une large gamme d’entrées.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.