Rilevamento del bersaglio basato su aptamero facilitato da una reazione di amplificazione esponenziale isoterma G-quadruplex a 3 stadi

Summary

Il presente protocollo dimostra l'uso di un saggio di amplificazione esponenziale veloce, a 3 stadi, basato su aptamero per rilevare bersagli. La preparazione del campione, l'amplificazione del segnale e lo sviluppo del colore sono coperti per implementare questo sistema per riconoscere la presenza di teofillina rispetto a quella della caffeina.

Abstract

Gli aptameri sono molecole di riconoscimento del bersaglio che si legano con alta affinità e specificità. Queste caratteristiche possono essere sfruttate per controllare altre molecole con capacità di generazione del segnale. Per il sistema qui descritto, il riconoscimento del bersaglio attraverso un dominio aptamerico, Stem II di un ribozima martello modificato, attiva il ribozima auto-scisso stabilizzando il costrutto inizialmente non strutturato. L'RNA cis-cscissione agisce alla giunzione di Stem III e Stem I, creando due prodotti di scissione. Il prodotto di scissione più lungo innesca una reazione di amplificazione esponenziale isotermica (EXPAR) dei due G-quadruplex cataliticamente attivi simili. I prodotti di amplificazione risultanti catalizzano la riduzione della perossidasi, che è accoppiata alla riduzione di un substrato colorimetrico con un output che l'occhio nudo può rilevare. Il sistema in 3 parti descritto nel presente studio migliora le modalità di rilevamento come i saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) producendo un segnale visivamente rilevabile per indicare la presenza di una minima parte di 0,5 μM di teofillina in appena 15 minuti.

Introduction

Gli aptameri sono tipicamente DNA o RNA a singolo filamento selezionati attraverso un processo evolutivo con elevata affinità di legame e specificità ai bersagli desiderati¹. Oltre alla capacità di legame, gli aptameri possono essere collegati e controllare motivi con funzioni di uscita del segnale^2,3, amplificando detto segnale e migliorando la sensibilità del sistema. Il sistema G-quadruplex isothermal exponential amplification reaction (GQ-EXPAR) è un sistema in tre parti (Figura 1) che sviluppa un segnale visivo quando componenti successivi vengono aggiunti a un singolo recipiente di reazione per produrre un output visivo⁴. Questo sistema consente di rilevare un bersaglio specifico, qui teofillina, in un dato campione entro 15 minuti utilizzando un flusso di lavoro semplificato per consentire un rilevamento rapido e specifico di un target di interesse. Questo metodo deve essere preso in considerazione per i campioni in cui la quantificazione specifica della concentrazione target è una preoccupazione inferiore rispetto all'elevata specificità della risposta in un breve lasso di tempo.

Un ribointerruttore allosterico, una molecola di RNA a commutazione di struttura (ribozima) che subisce l'auto-scissione, produce il segnale iniziale. Questo costrutto è basato sul ribozima martello, con un dominio aptamerico introdotto nello Stem II come regolatore dell'attività di scissione. La sua funzione di autoscissione si attiva quando il suo dominio aptamerico è stabilizzato legandosi al suo bersaglio⁵. In caso contrario, l'opzione è inattiva nello stato nativo.

La successiva reazione di amplificazione esponenziale (EXPAR) utilizza il rilascio del filamento di RNA auto-scisso dal primo stadio per innescare una reazione di amplificazione isoterma⁶. Il prodotto di amplificazione di EXPAR ha attività perossidasi⁷, che funge da base per l'ultimo stadio del sistema. Quando alcuni substrati vengono ossidati in concomitanza con la rottura del perossido, producono un'uscita fluorescente che può essere misurata su vari strumenti. Altri substrati comuni possono essere sostituiti per produrre un prodotto colorato per il rilevamento visivo. EXPAR e l'attività perossidasica dei suoi prodotti di amplificazione agiscono come un potenziatore del segnale a 2 stadi, aumentando la sensibilità a livelli maggiori rispetto alle strategie convenzionali ^7,8.

La rilevazione della teofillina rispetto alla caffeina è usata come esempio della specificità di questa piattaforma di rilevazione, in quanto differiscono solo per un singolo gruppo metilico (Figura 2). Questa dimostrazione del sistema produce un output colorimetrico per il rilevamento visivo di almeno 500 nM di teofillina.

Protocol

Vedere la tabella supplementare 1 (tabella di impostazione della reazione) per la preparazione del tubo, compresi i volumi e le concentrazioni specifici dei componenti della reazione. Il protocollo qui illustrato utilizza un kit di piattaforma di rilevamento preassemblato come descritto nella tabella dei materiali. Tutti i componenti devono essere tenuti sul ghiaccio se non diversamente indicato.

1. Preparazione del ribozima

NOTA: Il componente di rilevamento primario è un ribozima allosterico (regolato dall'aptamero) che riconosce la teofillina (vedere Tabella supplementare 2).

1. Raccogliere 5 U di polinucleotide chinasi T4 (0,5 μL, vedere Tabella dei materiali) in un tubo PCR, che verrà utilizzato per attivare i prodotti di scissione del ribozima.
   NOTA: questo componente viene aggiunto per primo in modo che l'utente possa vedere la corretta erogazione dell'enzima.
2. Aggiungere 1 μL di tampone ribozima 5x prepreparato (vedere Tabella dei materiali) a ciascuna provetta (provetta PCR).
3. Al fine di dimostrare visivamente la specificità, aggiungere 1,5 μL di 2 mM di teofillina (bersaglio) o 2 mM di caffeina (controllo) (cfr. tabella dei materiali) a ciascuna provetta come campioni di prova.
   NOTA: Per stabilire una curva standard, si consiglia di iniziare con un analita di 3,125 mM e testare diluizioni di cinque volte fino a 0,001 mM.
4. Mescolare accuratamente ogni provetta pipettando 5-10 volte.
5. Aggiungere 2 μL di 600 nM di RNA contenente un dominio aptamerico specifico per il bersaglio (vedere Tabella dei materiali) a ciascuna provetta per ottenere una concentrazione finale di 240 nM in 5 μL di soluzione di prova, quindi miscelare rapidamente mediante pipettaggio e posizionare su un blocco freddo per ridurre al minimo il segnale di fondo.
   NOTA: è importante preparare inizialmente tutte le reazioni senza ribozima, poiché la reazione di auto-scissione inizierà immediatamente quando il ribozima è combinato con tampone ribozima e può produrre uno sfondo significativo.
6. Una volta preparate tutte le provette di reazione, incubare ogni campione (5 μL) a temperatura ambiente (23 °C) per esattamente 3 minuti utilizzando un timer. Riportare immediatamente le provette nel ghiaccio (4 °C) dopo l'incubazione.

2. GQ-EXPAR

1. Aggiungere 3,5 μL di miscela enzimatica nickasi-polimerasi (vedere Tabella dei materiali) a ciascuna provetta del campione e mescolare bene.
   NOTA: Le concentrazioni enzimatiche richieste dipendono dalle sequenze di riconoscimento, dai tipi di enzimi e dalle temperature di reazione, la cui combinazione è stata determinata empiricamente.
2. Aggiungere 31,5 μL di miscela di reazione EXPAR contenente dima, nucleotidi e tampone di reazione (vedere la tabella dei materiali) a ciascuna provetta e pipetta da miscelare.
   NOTA: Le concentrazioni dei componenti sono ottimizzate in base agli enzimi e alle sequenze dei prodotti della polimerasi.
3. Una volta preparati tutti i campioni, incubare ogni campione preparato (40 μL) a 55 °C per esattamente 5 minuti utilizzando un timer. Se possibile, incubare su un termociclatore, anche se non è necessario un coperchio riscaldato.
4. Riportare immediatamente le provette di campione sul ghiaccio (4 °C) dopo la fase di incubazione.

3. Sviluppo del colore

1. Aggiungere 2 μL di soluzione di emina (25 uM; vedere Tabella dei materiali) a ciascuna provetta e mescolare bene.
2. Aggiungere 58 μL della soluzione TMB disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) a ciascuna provetta e miscelare bene.
3. Incubare la reazione di sviluppo del colore (100 μL) a temperatura ambiente per almeno 3 minuti e fino a 30 minuti.
   NOTA: (Opzionale) Lo sviluppo del colore può essere interrotto aggiungendo 20 μL di acido solforico 2 M.
4. Leggere i campioni qualitativamente ad occhio o quantificare i risultati utilizzando un lettore di piastre assorbenti a 450 nm se le reazioni di sviluppo del colore vengono interrotte usando acido solforico.

Representative Results

La piattaforma di rilevamento illustrata nella Figura 1 converte il riconoscimento del bersaglio aptamerico in differenze visivamente distinte tra i preparati del campione (bersaglio o non bersaglio, Figura 2) in un breve periodo di tempo. Un ribozima allosterico identificato da Soukup et ^al.5 è servito come punto di partenza per creare una sequenza meno rumorosa con risposta al bersaglio rispetto ai campioni di controllo e negativi. Il costrutto ottimizzato è stato in grado di riconoscere un minimo di 500 nM di teofillina in 30 minuti (Figura 3): i preparati di campioni esposti al bersaglio producono un colore blu nella fase 3, mentre i campioni che non contengono alcun bersaglio rimangono incolori. Se necessario, questi risultati possono essere quantificati arrestando prima la reazione di sviluppo del colore come descritto al punto 3.4 e quindi leggendo l'assorbanza del prodotto risultante a 450 nm per misurare la concentrazione iniziale del target presente. I risultati tipici di questo processo sono presentati nella Tabella 1, che può essere adattata ad una regressione non lineare per stimare quantitativamente la concentrazione del bersaglio presente nel campione iniziale (Figura 4).

Figura 1: Il sistema GQ-EXPAR. Meccanismi del sistema di rilevazione e amplificazione del segnale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Aptamer target e counter-target. Struttura molecolare della teofillina (bersaglio) e della caffeina (controllo contro-target) come dimostrazione di specificità. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Risultati visivi di GQ-EXPAR. Risultati rappresentativi del sistema per rilevare varie concentrazioni di teofillina dopo 3 minuti e 30 minuti di sviluppo del colore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Curva standard rappresentativa della teofillina. Curva standard del segnale di sistema misurata ad A450 dopo 30 minuti di sviluppo del colore. I dati grezzi sono presentati nella tabella 1, N = 3. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

[Teofillina] (mM)	Prova 1 (A450)	Prova 2 (A450)	Prova 3 (A450)	Media (A450)
3.125	0.342	0.318	0.39	0,350 ± 0,0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0,314 ± 0,00772
0.125	0.263	0.264	0.287	0,271 ± 0,0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0,223 ± 0,00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0,173 ± 0,00779
0.001	0.134	0.115	0.138	0,129 ± 0,0100
0	0.107	0.104	0.117	0,109 ± 0,00556
Nessun Ribozima	0.095	0.088	0.129	0,104 ± 0,0179

Tabella 1: Dati grezzi rappresentativi della curva standard teofillina. Risultati del sistema per rilevare varie concentrazioni di teofillina dopo 30 minuti di sviluppo del colore. Sono stati valutati anche campioni di no-ribozima, N = 3.

Tabella supplementare 1: configurazione GQ-EXPAR. Riepilogo dei volumi del reagente GQ-EXPAR e ordine di aggiunta come descritto nel protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Sequenze oligonucleotidiche GQ-EXPAR. Sequenze delle molecole di DNA e RNA utilizzate nelle reazioni di rivelazione. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Il metodo qui presentato sfrutta la transizione tra una struttura secondaria inizialmente disordinata in un ribozima allosterico e la stabilità aggiuntiva conferita attraverso il legame del bersaglio al dominio aptamerico per attivare il ribozima martello cis-scissione. La stabilità del ribozima è stata regolata per ridurre al minimo l'attività catalitica in assenza del bersaglio, consentendo al contempo il legame del bersaglio per ripristinare la struttura attiva. Inoltre, è necessario prestare attenzione a bilanciare i buffer dei molteplici enzimi necessari per facilitare l'EXPAR e lo sviluppo del colore. Infine, considerando che si tratta di un sistema a 3 stadi, la combinazione di tempi di incubazione e temperature insieme alle concentrazioni dei componenti della reazione ha fatto sì che massimizzare il segnale riducendo al minimo il rumore non fosse una sfida da poco.

Durante la preparazione del ribozima (fase 1), il legame target al dominio aptamerico stabilizza la struttura del ribozima auto-scisso. Nonostante ciò, il ribozima sarà in grado di scindersi una volta introdotto nel tampone ribozima, anche in assenza di un bersaglio. Pertanto, per ridurre al minimo il segnale di fondo, è fondamentale mantenere le reazioni sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per l'incubazione definita. Il legame riuscito del bersaglio al dominio aptamerico e il conseguente evento di scissione producono due prodotti di scissione, come illustrato nella Figura 1, fase 1: un breve segmento di Stem I e un segmento recentemente esposto di Stem III con un fosfato ciclico terminale⁸. La polinucleotide chinasi T4 presente nella miscela campione rimuove il fosfato ciclico dal prodotto di scissione Stem III, che funge da primer per la reazione di amplificazione nello stadio 2. Le concentrazioni e i volumi dei reagenti utilizzati in questo sistema sono stati ottimizzati sulla base di esperimenti per valutare il segnale di fondo rispetto alla risposta specifica⁴ e dovranno essere ottimizzati a partire da qualsiasi punto vengano apportate modifiche. Inoltre, 3,125 mM di teofillina sono raccomandati come la concentrazione più alta per stabilire una curva standard poiché lo sviluppo del colore risultante da questo campione è vicino al massimo assorbimento possibile a 450 nm (Figura 4). Una regressione non lineare per minimi quadrati ordinari viene utilizzata per determinare la curva standard per questa preparazione del sistema GQ-EXPAR.

GQ-EXPAR, eseguito nella fase 2, utilizza due modelli di DNA: uno che è innescato dal prodotto di scissione Stem III e produce G-quadruplex, e uno che è innescato da G-quadruplex e produce G-quadruplex. La prima reazione è più importante della seconda, in quanto è necessario tradurre il prodotto di scissione Stem III in G-quadruplex per produrre un'uscita colorimetrica, mentre l'autoamplificazione G-quadruplex aumenta il segnale già presente. La DNA polimerasi Bst 2.0 esegue l'amplificazione isotermica e ha attività di spostamento del filamento, mentre la nickasi Nt. BstNBI si scinde prima della sequenza G-quadruplex per consentire a Bst 2.0 di spostare il prodotto precedentemente generato e produrre più amplicone G-quadruplex. Il buffer fornisce anche K⁺, che consente al prodotto di amplificazione di piegarsi nella forma G-quadruplex attiva. Diverse nickasi hanno diverse sequenze di riconoscimento per la legatura e il taglio, e enzimi specifici avranno diverse efficienze di taglio; La modifica della sequenza nel sito di riconoscimento/nicking richiederà una modifica del nickase e la riottimizzazione del passaggio 2.

Nella fase 3, i G-quadruplex possono funzionare come DNAzimi con attività perossidasi, specialmente se associati all'emina⁷. La riduzione del perossido è accoppiata con l'ossidazione del substrato come TMB per produrre un segnale rilevabile per la visualizzazione o la quantificazione.

La limitazione chiave in questo sistema è il rumore che il ribozima allosterico può generare. Sebbene la struttura attiva e auto-scissione non sia stabile in assenza del bersaglio (in questo caso, teofillina), l'RNA ha l'opportunità di campionare diverse configurazioni e può inavvertitamente accedere alla configurazione attiva⁴. Questo, combinato con l'amplificazione del segnale trovato nello stadio 2 e nello stadio 3, può generare un segnale falso positivo. È quindi fondamentale ridurre il più possibile l'attività del sistema attraverso l'ottimizzazione delle quantità di RNA, tampone ed enzima, nonché minimizzando i tempi di incubazione e le temperature per limitare la produzione di eventi di scissione dell'RNA che non sono mediati dal bersaglio.

Nonostante la difficoltà di ottimizzare un flusso di lavoro GQ-EXPAR, il sistema può essere abbastanza versatile una volta stabilito. Sono già stati identificati vari ribozimi allosterici controllati da aptamero⁹ e possono essere ottimizzati per la funzionalità desiderata⁵. Sono stati fatti progressi anche nello sviluppo di DNAzimi allosterici modulati da aptameri¹⁰, espandendo le sostanze chimiche che possono essere integrate in questa piattaforma. Queste opzioni per modificare il riconoscimento del target del sistema non sono state valutate e saranno al centro di studi futuri. Inoltre, i componenti chiave del sistema possono essere scambiati con materiali equivalenti con requisiti di attività diversi, come temperature di incubazione più basse per la polimerasi o diverse sequenze di riconoscimento per la nickasi. La flessibilità e la modularità di questo sistema gli permettono di adattarsi ad una vasta gamma di ingressi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.