3段階G四重鎖等温指数増幅反応によるアプタマーベースのターゲット検出(英語)

Summary

本プロトコルは、標的を検出するための高速3段階のアプタマーベースの指数増幅アッセイの使用を実証する。サンプル調製、シグナル増幅、および発色をカバーして、カフェインよりもテオフィリンの存在を認識するこのシステムを実装します。

Abstract

アプタマーは、高い親和性と特異性で結合する標的認識分子です。これらの特性を利用して、シグナル生成能力を持つ他の分子を制御することができます。本明細書に記載のシステムの場合、アプタメアドメインを介した標的認識は、修飾ハンマーヘッドリボザイムのステムIIが、最初は非構造化構築物を安定化させることによって自己切断リボザイムを活性化する。シス切断RNAは、ステムIIIとステムIの接合部で作用し、2つの切断産物を生成します。より長い切断生成物は、2つの類似した触媒活性G四重鎖の等温指数増幅反応(EXPAR)をプライミングします。得られた増幅産物は、ペルオキシダーゼ還元を触媒し、これは肉眼で検出できる出力を有する比色基質の還元に共役される。本研究で説明した3部構成のシステムは、わずか15分で0.5μMのテオフィリンの存在を示す視覚的に検出可能なシグナルを生成することにより、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの検出モダリティを改善します。

Introduction

アプタマーは、典型的には、所望の標的に対する高い結合親和性および特異性を有する進化過程を通じて選択された一本鎖DNAまたはRNA^である1。結合能に加えて、アプタマーは、シグナル出力機能^2,3を有するモチーフに連結および制御することができ、該シグナルを増幅し、システムの感度を向上させることができる。G-quadruplex等温指数増幅反応(GQ-EXPAR)システムは、連続する成分が1つの反応容器に追加されて視覚出力^{を生成する}ときに視覚信号を現像する3つの部分からなるシステム(図1)です4。このシステムは、合理化されたワークフローを使用して、所与のサンプル中の特定の標的、ここではテオフィリンを15分以内に検出することを可能にし、目的の標的の迅速で特異的な検出を可能にする。この方法は、標的濃度の特異的定量が短時間での応答の高い特異性よりも低い懸念事項であるサンプルに対して考慮する必要があります。

自己切断を受ける構造切り替えRNA分子(リボザイム)であるアロステリックリボスイッチが初期シグナルを生成します。この構築物はハンマーヘッドリボザイムに基づいており、切断活性の調節因子としてStem IIに導入されたアプタメアドメインがあります。その自己切断機能は、そのアプタメアドメインがその標的への結合で安定化されると活性化される⁵。それ以外の場合、スイッチはネイティブ状態で非アクティブです。

後続の指数増幅反応(EXPAR)は、第1段階からの自己切断されたRNA鎖の放出を使用して、等温増幅反応⁶をプライミングします。EXPARの増幅産物はペルオキシダーゼ活性⁷を有し、システムの最終段階の基礎として作用する。一部の基質が過酸化物分解と連動して酸化されると、さまざまな機器で測定できる蛍光出力が生成されます。他の一般的な基質を代用して、視覚的検出用の着色生成物を製造することができる。EXPARとその増幅産物のペルオキシダーゼ活性は、2段階のシグナルエンハンサーとして作用し、従来の戦略と比較してより高いレベルへの感度を高めます^7,8。

テオフィリンとカフェインの検出は、メチル基が1つしかないため、この検出プラットフォームの特異性の例として使用されています(図2)。このシステムのデモンストレーションは、少なくとも500nMのテオフィリンを視覚的に検出するための比色出力を生成します。

Protocol

反応成分の比容積および濃度を含むチューブ調製については、 補足表1 (反応セットアップ表)を参照してください。ここで示すプロトコルは、 材料の表で説明されているように、組み立て済みの検出プラットフォームキットを使用します。特に明記されていない限り、すべてのコンポーネントは氷上に保管する必要があります。

1.リボザイムの調製

注:主要な検出成分は、テオフィリンを認識するアロステリック(アプタマー調節)リボザイムです( 補足表2を参照)。

1. 5 UのT4ポリヌクレオチドキナーゼ(0.5 μL、 材料の表を参照)をPCRチューブに集め、リボザイム切断産物を活性化するために使用されます。
   注:この成分は、ユーザーが酵素の正しい分注を確認できるように、最初に追加されます。
2. 事前に調製した5xリボザイムバッファー( 材料の表を参照)1 μLを各サンプルチューブ(PCRチューブ)に追加します。
3. 特異性を視覚的に示すために、1.5 μLの2 mMテオフィリン(ターゲット)または2 mMカフェイン(コントロール)( 材料の表を参照)を試験サンプルとして各サンプルチューブに追加します。
   注:検量線を確立するには、3.125 mMの分析対象物から始めて、0.001 mMまで5倍希釈をテストすることをお勧めします。
4. 各サンプルチューブを5〜10回ピペッティングして完全に混合します。
5. ターゲットに特異的なアプタメアドメインを含む600 nM RNAを2 μL加え( 材料の表を参照)、各サンプルチューブに2 μLを加えて、5 μLの試験溶液中に240 nMの最終濃度を作り、ピペッティングですばやく混合し、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えるためにコールドブロックに置きます。
   注:リボザイムがリボザイムバッファーと結合するとすぐに自己切断反応が始まり、重要なバックグラウンドを生成する可能性があるため、リボザイムなしですべての反応を最初に準備することが重要です。.
6. すべての反応チューブを準備したら、各サンプル(5 μL)を室温(23°C)でタイマーを使用して正確に3分間インキュベートします。インキュベーション後すぐにサンプルチューブを氷(4°C)に戻します。

2. GQ-EXPAR

1. 3.5 μLのニッカーゼ-ポリメラーゼ酵素混合物( 材料の表を参照)を各サンプルチューブに加え、よく混合します。
   注:必要な酵素濃度は、認識配列、酵素の種類、および反応温度に依存し、それらの組み合わせは経験的に決定されました。
2. 鋳型、ヌクレオチド、および反応バッファーを含む31.5 μLのEXPAR反応混合物( 材料表を参照)を各サンプルチューブとピペットに加えて混合します。
   注:成分濃度は、ポリメラーゼ生成物の酵素と配列に基づいて最適化されています。
3. すべてのサンプルを調製したら、準備した各サンプル(40 μL)をタイマーを使用して55°Cで正確に5分間インキュベートします。可能であれば、サーモサイクラーでインキュベートしますが、加熱された蓋は不要です。
4. インキュベーションステップ後直ちにサンプルチューブを氷(4°C)に戻します。

3.発色

1. 2 μLのHemin溶液(25 uM、 材料表を参照)を各サンプルチューブに加え、よく混合します。
2. 市販のTMB溶液58 μL( 材料表を参照)を各サンプルチューブに加え、よく混合します。
3. 発色反応(100 μL)を室温で少なくとも3分間から最大30分間インキュベートします。
   注:(オプション)20 μLの2 M硫酸を加えることで発色を停止できます。
4. 目でサンプルを定性的に読み取るか、硫酸を使用して発色反応を停止した場合は、450 nmの吸光プレートリーダーを使用して結果を定量します。

Representative Results

図 1 に示す検出プラットフォームは、アプタメアターゲット認識をサンプル調製物間の視覚的に明確な違い(ターゲットと非ターゲット、 図2)に短時間で変換します。Soukupら⁵ によって同定されたアロステリックリボザイムは、対照および陰性サンプルに対する標的への応答を伴うノイズの少ない配列を作成するための出発点として役立った。最適化されたコンストラクトは、30分でわずか500 nMのテオフィリンを認識することができました(図3)-ターゲットに曝露されたサンプル調製物はステップ3で青色を生成しますが、ターゲットを含まないサンプルは無色のままです。必要に応じて、これらの結果は、最初にステップ3.4に記載されているように発色反応を停止し、次に450nmで得られた生成物の吸光度を読み取って、存在するターゲットの初期濃度を測定することによって定量化できます。このプロセスの典型的な結果を 表1に示しており、これを非線形回帰に適合させて、初期サンプルに存在するターゲットの濃度を定量的に推定することができます(図4)。

図1:GQ-EXPARシステム。 検出および信号増幅システムのメカニズム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:アプタマーターゲットとカウンターターゲット。 特異性の実証としてのテオフィリン(標的)とカフェイン(カウンターターゲットコントロール)の分子構造。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:GQ-EXPARの視覚的結果。 発色3分および30分後に様々な濃度のテオフィリンを検出するためのシステムの代表的な結果。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:代表的なテオフィリン標準曲線。 発色30分後にA450で測定したシステム信号の標準曲線。生データは 表1に提示され、N=3である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

[テオフィリン](ミリエム)	トライアル 1 (A450)	トライアル 2 (A450)	トライアル 3 (A450)	平均 (A450)
3.125	0.342	0.318	0.39	0.350± 0.0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0.314 ± 0.00772
0.125	0.263	0.264	0.287	±0.271± 0.0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0.223 ± 0.00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0.173 ± 0.00779
0.001	0.134	0.115	0.138	±0.129± 0.0100
0	0.107	0.104	0.117	0.109 ± 0.00556
リボザイムなし	0.095	0.088	0.129	0.104± 0.0179

表1:代表的なテオフィリン標準曲線生データ。 発色30分後に様々な濃度のテオフィリンを検出するシステムの結果。無リボザイムサンプルも評価し、N = 3。

補足表1:GQ-EXPARのセットアップ。 プロトコルに記載されているGQ-EXPAR試薬量および添加順序の要約。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表2:GQ-EXPARオリゴヌクレオチド配列。 検出反応に用いたDNAおよびRNA分子の配列。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

ここで提示する方法は、アロステリックリボザイムにおける最初に無秩序な二次構造との間の遷移と、シス切断ハンマーヘッドリボザイムを活性化するためにアプタメアドメインへの標的の結合によって与えられる追加の安定性を利用する。リボザイムの安定性は、標的の非存在下での触媒活性を最小化しながら、標的結合が活性構造を回復できるように調整した。さらに、EXPARと発色を促進するために必要な複数の酵素のバッファーのバランスをとるように注意する必要があります。最後に、これが3段階システムであることを考えると、インキュベーション時間と温度、および反応成分の濃度の組み合わせは、ノイズを最小限に抑えながらシグナルを最大化することは小さな課題ではないことを意味しました。

リボザイムの調製中(工程1)、アプタメアドメインへの標的結合は、自己切断リボザイムの構造を安定化させる。それにもかかわらず、リボザイムは、標的が存在しない場合でも、リボザイム緩衝液に導入されると切断することができるであろう。したがって、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えるには、定義されたインキュベーションの準備が整うまで反応を氷上に保つことが重要です。標的のアプタメアドメインへの結合に成功し、その結果生じる切断イベントにより、図1のステージ 1に示すように、ステムIの短いセグメントと末端環状リン酸⁸を含むステムIIIの新たに露出したセグメントの2つの切断産物が生成されます。サンプルミックス中に存在するT4ポリヌクレオチドキナーゼは、ステージ2の増幅反応のプライマーとして機能するStem III切断産物から環状リン酸を除去します。このシステムで使用される試薬の濃度と量は、バックグラウンドシグナルと比応答を評価するための実験に基づいて最適化されており^、 どのような変更が行われた場合でも最適化する必要があります。さらに、このサンプルから生じる発色が450 nmで可能な最大吸収に近いため、標準曲線を確立するための最高濃度として3.125 mMのテオフィリンが推奨されます(図4)。通常の最小二乗法による非線形回帰を使用して、GQ-EXPARシステムのこの準備の標準曲線を決定します。

ステップ2で実施するGQ-EXPARは、ステムIII切断産物によってプライミングされてG-四重鎖を生成するものと、G-四重鎖によってプライミングされてG-四重鎖を生成するものの2つのDNAテンプレートを使用します。比色出力を生成するにはステムIII切断産物をG-四重鎖に変換する必要があるため、前者の反応は後者よりも重要ですが、G-四重鎖自己増幅はすでに存在するシグナルを増加させます。Bst 2.0 DNAポリメラーゼは等温増幅を行い、鎖置換活性を有するが、Nt. BstNBIニッカーゼはG-quadruplex配列の前に切断し、Bst 2.0が以前に生成された産物を置換し、より多くのG-quadruplexアンプリコンを生成することを可能にする。バッファはK⁺も供給するため、増幅産物をアクティブなG四重鎖形態に折りたたむことができます。ニッカーゼが異なれば、結合と切断の認識配列も異なり、特定の酵素は切断効率も異なります。認識/ニッキング部位のシーケンスを変更するには、ニッカーゼの変更とステップ2の再最適化が必要になります。

ステップ3では、G-quadruplexは、特にヘミン⁷に関連する場合、ペルオキシダーゼ活性を有するDNAザイムとして機能することができる。過酸化物の還元は、TMBなどの基質の酸化と結合して、視覚化または定量のための検出可能なシグナルを生成します。

このシステムの主な制限は、アロステリックリボザイムが生成する可能性のあるノイズです。活性な自己切断構造は、標的(この場合はテオフィリン)の非存在下では安定しないが、RNAは異なる立体配置をサンプリングする機会があり、不注意に活性配置にアクセスする可能性がある⁴。これは、ステージ2とステージ3で見つかった信号の増幅と組み合わせると、偽陽性信号を生成する可能性があります。したがって、RNA、バッファー、酵素の量を最適化し、インキュベーション時間と温度を最小限に抑えて、標的媒介ではないRNA切断イベントの生成を制限することにより、システムの活性を可能な限り低下させることが不可欠です。

GQ-EXPAR ワークフローの最適化は困難ですが、一度確立されると、システムは非常に用途が広くなります。様々なアプタマー制御アロステリックリボザイムが既に同定されており⁹ 、所望の機能性のために最適化することができる⁵。また、アプタ^マー10によって調節されるアロステリックDNAザイムの開発も進展しており、このプラットフォームに統合できる化学物質が拡大しています。システムのターゲット認識を変更するためのこれらのオプションは評価されておらず、将来の研究の焦点となるでしょう。さらに、システムの主要コンポーネントは、ポリメラーゼのインキュベーション温度の低下やニッカーゼの認識配列の違いなど、活性要件が異なる同等の材料と交換できます。このシステムの柔軟性とモジュール性により、幅広い入力に適応できます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.